专利名称：：用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的抗cd52单克隆抗体的重组生产方法用于治疗慢性淋巴细胞性白血病的抗CD52单克隆抗体的重组生产方法发明领域本发明涉及用于生产结合CD52的可溶形式单克隆抗体的重组方法。该方法描述从头合成编码抗CD52的核酸序列，将已构建的核酸序列转化到感受态细菌中，以及将该核酸序列亚克隆到哺乳动物表达载体中以表达所需要的蛋白质。本发明公开了包含与目标基因相关的调控元件的DNA构建体。为了允许在合适的哺乳动物宿主细胞中表达，已将目标核酸序列进行了密码子优化。发明背景抗体是我们免疫系统的一部分。当抗原(例如病菌中的外源蛋白)进入到机体时，机体就会产生天然抗体抵抗它。这些抗体附着并标记抗原从而被我们的免疫系统摧毁。抗体，即免疫球蛋白，包含2条通过二硫键连接在一起的重链和2条轻链，每条轻链通过二硫键与各自的重链相连接。每条重链的一端有一可变区(VH)，可变区与若千恒定区(CHl,CH2，CH3)连接。每条轻链的一端有一可变区(VL)，另一端有一恒定区(CL),重链的轻链可变区(VH)和轻链恒定区一直与重链的笫一恒定区结合。轻链和重链的恒定区(Fc)不直接参与抗体与抗原的结合。每对轻链和重链的可变区(Fab)形成抗原结合位点。轻链和重链各区具有相同的通用结构，并且每个区都包含四个构架区，其序列相对保守、通过三个互补区(CDR)连接在一起。这四个构架区主要采用p-折叠构象，并且CDR形成环，该环与P-折叠结构连接，在某些情况下构成(3-折叠结构部分。CDR通过构架区被紧密靠近约束，并且与来源于其它区的CDR—起影响抗原结合位点的形成。当Kohler和Milstein在1975年报道了来自抗原免疫的小鼠脾细胞与鼠骨髓瘤系的细胞的成功融合(Kohler和Milstein,Nature,1975,256,495-497)时，就向前迈进了一大步。所得杂交细胞，称为杂交瘤，具有源于脾细胞的抗体产生特性和源于骨髓瘤细胞的持续生长特性。每种杂交瘤都合成和分泌针对原始抗原特定决定簇的单一抗体。为确保培养物中的所有细胞都是相同的，也就是说，确保它们都含有合成独特抗体种类所必需的遗传信息，应当将从细胞融合得到的杂交瘤进行克隆或亚克隆。这样，克隆的杂交瘤就能产生同种抗体即单克隆抗体。细胞系的无限增殖性可确保得到均一、充分表征的抗体的无限供应，用于多种用途，具体地讲包括疾病的诊断和免疫治疗。令人遗撼的是，所开发的单克隆抗体由于其可能干扰治疗或者引起变态反应或免疫复合物过敏反应而无法用于临床，因此使人抗d、鼠抗体的研发受到严重阻碍。为产生足够量的抗体用于完全临床用途，最好是使用有效的重组表达系统。因为骨髓瘤细胞是一种专门用于产生和分泌抗体的天然宿主，所以来源于这些骨髓瘤细胞的细胞系一直用于重组抗体的表达。通常，需要基于免疫球蛋白基因调节元件的复合载体设计，但是最终的表达水平据报道变化非常大(Winter等，Nature,1988,332,323-327;Weidle等，Gene,1987,60,205-216;Nakatani等，Bio/Technology,1989，7,805-810;Gillies等，Bio/Technology,1989,7,799-804)。一种可选择的哺乳动物表达系统由使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞提供。应用这些细胞已能产生数种大量的用于研究和临床的治疗蛋白(Kaufman等，Mol.Cell.Biol,1985,5,1750-1759;Zettlmeissl等，Bio/Technology,1987,5,720-725)。然而，几乎没有应用这些细胞表达抗体的实例，并且已才艮道的鼠抗体表达水平一直很低，约为0.01-O.lp/ml(Weidle等，Gene,1987,51,21-29;Feys等，Int.丄Cancer,1988,2,26-27)。事实上，CD52在所有人淋巴细胞和单核细胞中强表达，但不在其它血细胞(包括造血干细胞)中表达，该抗原在Hale等，Blood1983，62,873-882中已有描述。已先后开发出抗CD52特异性小鼠单克隆抗体YTH66.9和抗CD52特异性大鼠单克隆抗体YTH34.5HL。由于抗球蛋白反应，因此这些抗体在临床上的应用受到限制。CD52在正常和恶性B淋巴细胞以及正常和恶性T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞的表面表达，也在男性生殖系统组织中表达。本发明涉及一种方法，该方法中阐明了与CD25结合的抗体可用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。该抗体也可用于治疗已经过烷化剂治疗的患者和经氟达拉滨治疗无效的患者。本发明的抗体是IgGlk，其具有人可变构架区和恒定区，以及源于鼠(大鼠)单克隆抗体的互补性决定区。该抗体的分子量大约为150千道尔顿。本发明通过掺入包含编码具有抗CD52活性的多肽的核酸序列的重组载体，使得在哺乳动物表达系统中产生抗CD52抗体成为可能。抗CD52抗体将用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病(简称B-CLL)。该抗体也将用于治疗已经接受和/或已对其它癌症化疗药物(例如烷化剂、氟达拉滨)无反应的患者。该抗体还可用于非霍奇金淋巴瘤、某些自身免疫性疾病的治疗、肾移植患者。另一方面，抗CD52抗体将用于癌症病人、特别是淋巴瘤病人的治疗，或者用于免疫抑制目的。图1.编码抗CD52抗体轻链的DNA核苷酸序列的未优化形式和密码子优化形式的配对序列比对图。图2.编码抗CD52抗体重链的DNA核苷酸序列的未优化形式和密码子优化形式的配对序列比对图。图3.抗CD20抗体(利妥昔单抗(Rituximab))和抗CD52抗体(坎帕斯(Campath))的轻链恒定区的序列比对图。图4.抗CD20抗体(利妥昔单抗(Rituximab))和抗CD52抗体(坎帕斯(Campath))的重链恒定区的序列比对图。图5.用BglIIBsiWI限制酶切消化pBSKII/ALZ-VLC克隆(第3泳道)和pBSKII/RTX-LC克隆(第1泳道)。第2泳道一lkbDNA梯。图6.用BglII和EcoRI限制酶切消化pBSKII/ALZ-LC克隆，以鉴定含有插入片段的转化子。对于所有测试过的克隆，观察到结果片段与ALZ-LC抗体片段的大小相符。图7.用BamHI限制酶切消化pBSKII/ALZ-LC克隆，以区别含有ALZ-LC插入片段的克隆和含有RTX-LC插入片段的克隆。图8.限制酶切消化pBSKII/ALZ-VHC全长克隆，以确定插入片段的存在。图9.抗CD20抗体重链(RTX-HC)克隆与进行了定点诱变的抗CD52抗体重链(ALZ-HC)克隆的序列比对图。CA变为TT用蓝色突出显示。图10.用于连接反应的经限制酶切消化的和凝胶纯化的ALZ-LC和pCAIN。图11.用BglII和EcoRI限制酶切消化pCAIN/ALZ-LC克隆，以鉴定含有插入片段的转化子。对于所有测试过的克隆，观察到结果片段与ALZ-LC抗体片段的大小相符(700bp)。图12.用于连接反应的经限制酶切消化的和凝胶纯化的ALZ-HC和pCAID。图13.用Bamffl和EcoRI限制酶切消化pCAID/ALZ-HC克隆，以鉴定含有插入片段的转化子。对于所有测试过的克隆，观察到结果片段与ALZ-HC抗体片段的大小相符(1420bp)。图14.通过DNA核苷酸测序证实了pCAID/ALZ-HC的b克隆。测序反应中使用了三种不同的引物(camp246，523和CHC845)。发现整个序列与才莫;〖反序列(C2)匹配。序列表SEQID1.抗CD52抗体轻链的核苷酸序列。SEQID2.抗CD52抗体重链的核香酸序列。SEQID3.抗CD52抗体肽的氨基酸序列。SEQID4.抗CD52抗体肽的氨基酸序列。SEQID5.抗CD52抗体轻链的密码子优化序列。SEQID6.抗CD52抗体重链的密码子优化序列。发明概述本发明涉及将编码抗CD52多肽的核酸序列转化到感受态细菌中，以及将所述核酸序列亚克隆到哺乳动物表达载体中，更优选亚克隆到CHO细胞中，以稳定表达所述单克隆抗体。本发明的一个方面，提供编码抗CD52分子重链和轻链的核酸序列。本发明的另一个方面，提供由所述核酸序列编码的相应氨基酸序列。本发明的一个具体方面，涉及从头合成抗CD52分子重链和轻链的可变区。还公开了构建携带目标核酸序列的载体构建体，将所述载体构建体转化到感受态细菌中，以及将所述抗CD52链亚克隆到哺乳动物表达载体中。发明详述下文概述的方法适用于生产具有生物活性的可溶性重组抗CD52抗体。实施例1从头合成的抗CD52抗体cDNA将包括以下组件Kozak共有序列(GCCACC)3,后接起始密码子(ATG)。三个"保护"核苷酸，位于cDNA的5'端和3，端。合适的限制酶切位点，位于cDNA的5，端和3，端，以克隆到表达载体中。编码抗CD52抗体轻链的核苷酸序列如SEQID1所示。编码抗CD52抗体重链的核苷酸序列如SEQID2所示。为确保重组蛋白在哺乳动物细胞系(例如CHOKl和HEK293)中的最佳表达，抗CD52抗体重链编码DNA序列的密码子，已在密码子优化过程中:f皮改变。相应的密码子优化序列如SEQID4和SEQID5所示。实施例2表达系统的选择设计表达重组抗CD52抗体的哺乳动物表达载体，可基于一种市售载体(例如/7cDA^或p/^E"S，分别得自Invitrogen或BDBiosciences公司)，修饰后包括下列特征具有多克隆位点以插入编码抗CD52抗体轻链和重链的cDNA以及天然信号肽。将抗CD52抗体轻链和重链克隆到两个独立的、带有不同选择标记的质粒DNA载体中。设计的载体也可为所述轻链和重链两者都提供独立的(双顺反子)IRES介导的选择标记共表达。设计的表达载体也可为抗CD52抗体轻链和重链两者以及天然信号肽都提供独立的(双顺反子)IRES介导的共表达。实施例3抗CD52抗体可变区的从头合成抗CD52抗体的轻链可变区和重链可变区交由美国Epoch实验室从头合成。抗CD52抗体链没有合成恒定区；而是从抗CD20抗体链中切下k和IgGl恒定区，并将其与抗CD52抗体可变区连接，从而产生全长纟元体链。抗CD52抗体的k恒定区与抗CD20抗体的k恒定区有100%同源性，^旦两者的重链恒定区仍相差2个核苷酸。这两个核苷酸的变化导致第240位的缬氨酸变为丙氨酸。实施例4全长抗CD52抗体重链和轻链的构建将从头合成的可变区克隆到包含全长抗CD20抗体重链和轻链的pBSK载体中。抗CD20抗体的可变区与抗CD52抗体的可变区交换后产生全长抗CD52抗体片段。作为克隆到pBSKII中的片段得到抗CD52抗体的可变区，所得到的构建体称为pBSKII/ALZ-VLC。将该DNA转化到大肠杆菌DH10b中，再接种到含有氨千青霉素的LB琼脂平板上。将平板上的一个菌落接种到液体培养基中，进行DNA小量制备。通过测序证实了这两个可变区的序列。全长抗CD52抗体K轻链的构建pBSKII/ALZ-VLC和pBSKII/RTX-LC(表达抗CD20抗体轻链的构建体)克隆用限制性内切酶BglII和BsiWI消化(图5)。对来自前者的394bp大小的插入片段和来自后者的载体+K恒定区进行凝胶纯化。载体和插入片段连接后产生全长抗CD52抗体K轻链。将热激过的感受态细胞DHIO转化获得的菌落接种到含有氨千青霉素的LB培养基中，这样就完成了DNA小量制备。通过限制酶切消化鉴定克隆中存在的全长抗CD52抗体轻链(图6)。还通过测序证实了由限制酶切消化得到的阳性克隆。pBSKII/ALZ-LC克隆也用限制性内切酶BamHI消化，以区别含有ALZ-LC插入片段的克隆和含有RTX-LC的克隆。实质上这是因为用pBSKII/RTX-LC作为载体主链，而且RTX-LC和ALZ-LC大小是一样的。两条轻链的限制性内切酶谱是不同的。当pBSKII/ALZ-LC克隆用BamHI消化时，将仅使pBSKII/RTX-LC克隆线性化，产生700bp的结果片段(图7)。第6、9和13号克隆是RTX-HC克隆。全长抗CD52抗体IgGl重链的构建携带抗CD52抗体重链可变区的构建体pBSKII/ALZ-VHC克隆和携带抗CD20抗体重链的构建体pBSKII/RTX-HC克隆用限制性内切酶HindIII和Nhel消化。对来自前者的426bp大小的插入片段和来自后者的载体+IgGl恒定区进行凝胶纯化。载体和插入片段连接后产生全长抗CD52抗体IgGl重链。将热激过的感受态细胞DH10转化获得的菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，这样就完成了DNA小量制备。通过限制酶切消化鉴定克隆中存在的全长抗CD52抗体重链(图8)。还通过测序证实了由限制酶切消化得到的阳性克隆。pBSKII/ALZ-HC克隆的定点诱变抗CD52抗体重链片段的恒定区与抗CD20抗体重链片段的恒定区有2个核苷酸不相同。在序列确证后，将含有抗CDS2抗体的可变区及与之拼接的抗CD20抗体重链恒定区的克隆进行定点诱变。材料与方法酶和试剂Pfu高保真性Taq聚合酶(Stratagene)Dpnl限制性内切酶(Stratagene)DNA模板pBSKII/ALZ-HC-克隆(a)引物所有要合成的寡核苷酸都交给SIGMA公司合成。所合成的寡核苷酸由Sigma公司用HPLC纯化两次，然后转给Avesthagen公司。PCR反应中所使用的寡核苷酸见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>突变链合成反应(热循环)下列成分/试剂按以下指定顺序加入到灭菌的0.2mlPCR管中。所有PCR反应的终体积都是50|Lil。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>QuickChange定点诱变方法的循环参数步骤1(1个循环)95°C/30秒步骤295。C/30秒步骤355。C/30秒步骤468。C/7分钟步骤5转到步骤2并重复步骤2-4共16次。扩增产物的D/wI消化将1iLilD/^I(10U/^il)加入到扩增反应的反应混合物中。将所得混合物轻轻地充分混匀，离心，37。C保温l小时。感受态细胞DH10b的转化按生产商(Stratagene)推荐的方法进行转化。用4plPCR反应产物进行转化。结果将已进行过定点诱变的抗CD20抗体重链(RTX-HC)克隆与抗CD52抗体重链(ALZ-HC)克隆进行序列比对。CA转变为TT用蓝色突出显示。将已进行过定点诱变的抗CD20抗体重链(RTX-HC)克隆与抗CD52抗体重链(ALZ-HC)克隆进行序列比对。结果见图9。抗CD52抗体链亚克隆到哺乳动物表达载体中全长抗CD52抗体重链抗体轻链和重链分别克隆或亚克隆到哺乳动物表达载体pCAIN和pCAID中。pBSKII/ALZ-LC克隆和pCAIN载体用BglII和EcoRI消化，所得构建体称为pCAIN/ALZ-LC。将来自前者的插入片段(700bp)和来自后者的载体主链进行凝胶纯化和连接(图10)。将连接混合物转化到热激过的感受态细胞DH10b中，再接种到含有氨苄青霉素作为选择抗生素的LB琼脂平板上。挑取少量转化子并进行DNA小量制备。通过限制酶切消化鉴定克隆(图11)。pBSKII/ALZ-HC-SDM克隆(I.4)和pCAID载体用BamHI和EcoRI消化。所得构建体称为pCAID/ALZ-HC。将来自前者的插入片段(1429bp)和来自后者的载体主链进行凝胶纯化和连接(图12)。将连接混合物转化到热激过的感受态细胞DH10b,再接种到含有氨千青霉素作为选捧抗生素的LB琼脂平板上。挑取少量转化子并进行DNA小量制备。通过限制酶切消化鉴定克隆(图13)。DNA测序和分析分别克隆到哺乳动物表达载体pCAID和pCAIN中的最终克隆ALZ-HC和ALZ-LC经测序，其序列正确性得到证实。参见序列分析的比对图。通过DNA核苷酸测序，pCAID/ALZ-HC的b克隆获得证实。测序反应中使用了三种不同的引物(camp246、523和CHC845)。发现整个序列与坤莫板序列(C2)匹配。6.抗CD52抗体的纯化抗CD52抗体是一种人源化抗体，可分泌到细胞上清液中。按照管理机构对于过量表达所需重组蛋白的指导方针，后续确定无污染的细胞培养系统，可利用一系列步骤对抗CD52抗体蛋白进行纯化，包括透析-过滤和柱色谱法(包括亲和色谱法)。回收洗脱后的抗体以使体内活性最大化。乙抗CD52抗体体外活性和体内活性的测定:抗CD52抗体ELISA测定。补体介导的B细胞淋巴细胞性白血病细胞(Karpas422细胞)溶胞作用。抗CD52抗体体内功效研究已基于当前数据，在那些先前已用烷化剂治疗和用氟达拉比滨治疗无效的B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)患者中进行。纯化方法的最优化根据以上提及的受推荐的功能/结合测定，后续确定可重现的生物活性，将努力使所用纯化方法最佳化。纯化策略将针对产品的工艺过程经济学、上市速度、规3莫性、重复性和最高纯度，以及功能稳定性和结构整体性为主要目的。为实现这一目的，将探索由过滤(常规过滤和切向流过滤)和色谱两者组合的方法。所述方法的合格要求和接受标准研究将实施3批。因此，本发明在纯化过程中拟定以下的步骤a.初步澄清，用COHC/A1HC/O.45p深度滤器；b.浓缩，用PelliconXLBiomax滤器，临界值为50千道尔顿，基于切向流过滤；c.色谱步骤I:亲和色谱，用ProsepVAUltra(对基于血清(2%胎牛血清[FCS])的上清液)/ProsepVA(对无血清培养物上清液)；d.色谱步骤II:强阳离子交换剂，例如SPS印harose;e.色谱步骤III:基于流通的强阴离子交换剂，例如CellufineQ(—种基于纤维素的介质)，用于去除宿主细胞蛋白和核酸；f.去除病毒，用大小排阻过滤和用硫酸Cellufine沥滤A蛋白；g.过滤除菌；h.去除内毒素，用Remtox或CellufineET色谱；h.配制。权利要求1.一种制备有体内生物活性的抗CD52单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤■从头合成抗CD52单克隆抗体轻链和重链的步骤；■构建全长抗CD52抗体κ轻链的步骤；■构建全长抗CD52抗体IgG1重链的步骤；■构建包含编码抗CD52分子轻多肽链和重多肽链的核酸序列的载体的步骤；■将抗CD52抗体链亚克隆到在哺乳动物表达载体中以生产生物活性抗体分子的步骤。2.权利要求1的方法，其中编码抗CD52抗体轻链的核苷酸序列如SEQID1所示。3.权利要求1的方法，其中编码抗CD52抗体重链的核苷酸序列如SEQID2所示。4.权利要求1的方法，其中抗CD52抗体轻链的氨基酸序列如SEQID3所示。5.权利要求1的方法，其中抗CD52抗体重链的氨基酸序列如SEQID4所示。6.权利要求1的方法，其中将包含编码抗CD52重链的核酸片段的载体进行定点诱变。7.权利要求1的方法，其中全长抗CD52重链和轻链已分别亚克隆到哺乳动物载体pCAIN和pCAID中。8.—种制备有体内生物活性的抗CD52单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤用附图所示的载体构建体转化宿主细胞，从所述宿主细胞或其生长的培养基中分离出所述产品。9.一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的抗CD52抗体以及药学上可接受的稀释剂、辅剂或载体，其中所述抗体是从培养物生长的哺乳动物细胞中纯化出来的。全文摘要本发明涉及用于生产结合CD52的可溶形式单克隆抗体的重组方法。该方法描述从头合成编码抗CD52的核酸序列，将已构建的核酸序列转化到感受态细菌中，以及将该核酸序列亚克隆到哺乳动物表达载体中以表达所需要的蛋白质。本发明公开了包含与目标基因相关的调控元件的DNA构建体。为了允许在合适的哺乳动物宿主细胞中表达，已将目标核酸序列进行了密码子优化。文档编号A61K39/395GK101238150SQ200680026667公开日2008年8月6日申请日期2006年5月24日优先权日2005年5月24日发明者V·莫拉瓦拉帕特尔申请人:阿维斯塔金格兰技术有限公司