肉毒梭菌神经毒素复合物的稳定化的制作方法

专利名称：：肉毒梭菌神经毒素复合物的稳定化的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包含肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素的药物组合物和稳定它的方法。特别地，本发明涉及包括肉毒梭菌(C.botulinum)A型和环糊精的稳定化的药物组合物。
背景技术：
：由厌氧菌肉毒梭菌生产肉毒杆菌神经毒素。用不同芽孢杆菌属(bacillus)菌林生产称作A-G血清型的7种相关蛋白神经毒素。肉毒杆菌神经毒素的7种血清型各自为大蛋白质，它们具有约150kDa的分子量和通过至少一个二硫键偶联的lOOkDa的氨基酸残基重链和50kDa的氨基酸残基轻链。通过阻断神经递质乙酰胆碱在神经肌肉连接处释放导致肉毒中毒疾病的肉毒梭菌神经毒素为目前已知对人类的最具有毒性的蛋白质。食物传播的肉毒中度因消耗不适当的储存食物所致，其中厌氧肉毒梭菌生长并且释放毒素。在其它形式的肉毒中毒中，肉毒梭菌还产生导致毒素产生的神经毒素。例如，在肉毒梭菌孢子导入开放皮肤损害时产生伤口型肉毒中毒。在伤口中定居后发生肉毒杆菌毒素释放。类似地，嬰儿型肉毒中毒因消耗肉毒梭菌孢子，随后在肠中定居和毒素产生所致。尽管已知肉毒杆菌神经毒素为公知对人最具有致命性的天然毒素，但是这些致命性毒物已经作为药物用于具有许多适应征的医学群体中。在这方面，肉毒杆菌神经毒素一直用于治疗斜视，且目前认为局部注射肉毒杆菌神经毒素为用于许多神经和非神经疾病的安全且有效的治疗手段。近来已经观察到肉毒杆菌神经毒素用作胃肠道疾病的治疗手段。肉毒杆菌神经毒素不仅有效地阻断骨骼神经肌肉传递，而且阻断自主神经系统中的胆碱能神经末梢。首先基于体外观察结果提示了抑制胃肠道平滑肌收缩的能力且随后在体内得以证实，还证实肉毒杆菌神经毒素不会阻断由一氧化氮介导的非肾上腺素能非胆碱能反应。这进一步促进了对使用肉毒杆菌神经毒素作为平滑肌和括约肌活动过度的兴趣，诸如食道下端括约肌，以便治疗食管失弛症，或肛门内括约肌，以便治疗肛门裂缝。包含肉毒杆菌毒素的商购药物组合物在如下商标下销售，包括BOTOX(Allergan，Inc.IrvineCA.),Dysport(IpsenLtd.Berkshire,U.K.)和Myobloc(ElanCorp.DublinIreland)。一般而言，该药物组合物作为必须在实际应用前用稀释剂再构建的真空干燥形式销售。使用商购肉毒杆菌毒素制剂的一个主要缺陷在于该组合物的贮存期限极短。在这方面，应在再溶解后约4小时内给予实际应用的药物组合物，因为肉毒杆菌毒素对因表面变性，加热和碱性条件造成的变性极为敏感。肉毒杆菌神经毒素再溶解的敏感性变性迫切需要保存肉毒杆菌神经毒素的方法。已经发现肉毒梭菌分泌神经毒素和一组与神经毒素相关的蛋白质("NAPs")。研究证实NAPs不仅在肉毒杆菌神经毒素的毒性感染中具有关键作用，而且NAPs在肉毒杆茵神经毒素毒性方面具有重要作用。特别地，已经证实A型神经毒素的口服毒性在除去NAPs时下降了43，000-倍。还证实NAPs起防止神经毒素受到各种环境情况影响的作用，包括暴露于蛋白酶，酸性和加热。参见Kitamura，M.,Sakaguchi，S.;和Sakaguchi，G.(1969):Significanceofthe12StoxinofClostridiumbotulinumtypeE.Bacteriol.98，1173-1178;Sugii，S.，0hishi，L，和Sakagch，G.，(1977)Botulogenicpropertiesofvegetableswithspecialreferencetomolecularsizeofthetoxininthem,J.FoodSafety1,53-65。因此，提示NAPs与神经毒素发生相互作用以防止其受到不良环境情况的影响。这种保护作用产生了如下推定NAPs对保护神经毒素的结构完整性和保护其活性而言具有重要性。环糊精为通过a-(l-4)键连接的环状多环状吡喃糖单元。最广泛已知的环糊精为A,B，G-环糊精及其衍生物。环糊精的环状性质，其腔的疏水性及其外表面的亲水性使它们能够与其它化学品发生相互作用并且产生特征在于溶解度和稳定性改善的包合物。例如，Ito等的美闺专利US6,818,662中披露了磺基丁基醚B-环糊精增加了N-(3-氯-4-吗啉-4-基)苯基-r-羟基亚氨基甲脒的溶解度和光稳定性。尽管已知环糊精与药物形成包合复合物，但是尚未披露或提示环糊精可以使肉毒杆菌神经毒素保持稳定。实际上，认为包括环糊精在内的环状聚合物不能有用保护或稳定肉毒杆菌神经毒素。参见Hunt的美国专利申请公开号US2003/0118598,其中教导了肉毒杆菌神经毒素不能使用环糊精腔，因为该腔远小于神经毒素的大小。因此，环糊精不能与肉毒杆菌神经毒素形成包合复合物。对制备包含肉毒杆菌神经毒素的药物组合物的有效和经济方法和系统以及稳定和保护肉毒杆菌神经毒素的方法仍然存在需求。本发明满足了这些需求。发明概述本发明的目的和优点如下所述并且从如下的描述中显而易见，与通过实施本发明得知的一样。本发明的额外优点可以通过特别在本文的书面描述和权利要求中指出的方法和组合物以及根据附图得以实现和达到。本发明寻求通过提供表现出改善的稳定性的新组合物来緩解与肉毒杆菌神经毒素快速降解或变性相关的问题。特别地，本发明寻求提供以有效和经济的有利方式生产具有改善的稳定性的肉毒杆菌神经毒素组合物的方法。为了实现如本文所述的本发明的这些和其它优点，本发明包括新的肉毒杆菌神经毒素包合复合物，它们表现出改善的稳定性。本发明还包括使肉毒杆菌神经毒素稳定的方法。优选通过形成环糊精包合复合物使神经毒素稳定。根据本发明，提供一种组合物，其包含肉毒杆菌神经毒素和环糊精或其衍生物。肉毒杆菌神经毒素可以为纯的或纯化的并且可以为A,B，C，D，E，F或G型。优选肉毒杆菌神经毒素为A型。环糊精可以为a，(3或y环糊精。可选择地，环糊精可以为环糊精衍生物，诸如，但不限于a-环糊精，P-环糊精或y-环糊精的羟基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧甲基或二羟基烷基的衍生物。有利的是，环糊精以足以与肉毒杆菌神经毒素形成复合物的用量存在以便提供稳定的肉毒杆菌神经毒素。正如本领域中公知的，一般肉毒杆菌神经毒素对降解或变性极为敏感。一般而言，商购肉毒杆菌神经毒素，诸如BOTOX,DYSP0RT⑧和MY0BL0C⑧在约4小时内失去其功效。令人意外地发现形成环糊精-肉毒杆菌神经毒素复合物可以将肉毒杆菌神经毒素的功效保护至少约23周。在一个实施方案中，药物组合物包含A型肉毒杆菌神经毒素和a-环糊精。在4'C时仅约4%的肉毒杆菌神经毒素在23-周期限内降解，而在25。C下约52-48%的神经毒素在23-周期限内降解。在另一个实施方案中，組合物包含A型肉毒杆菌神经毒素和p-环糊精。在4。C下低于7°/。的肉毒杆菌神经毒素在23-周期限内降解，而在25'C下低于65%的肉毒杆菌神经毒素在相同时间期限内降解。在另一个实施方案中，組合物包含A型肉毒杆菌神经毒素和Y-环糊精。在该实施方案中，在23-周期限内，神经毒素在4'C时的降解低于2%,而神经毒素在25'C下的降解低于55%。因此，该组合物具有随时间增加的稳定性。在一个优选的实施方案中，将本发明的肉毒杆菌神经毒素包合复合物与药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂(包括其组合)混合形成药物组合物。该药物组合物可以用于人和兽药中的人或动物应用，并且一般包含药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂中的任意一种或多种。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂为制药领域众所周知的，并且，例如描述在Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)中。可以根据计划的给药途径和标准制药实践选择药用载体，赋形剂或稀释剂。药物组合物可以包含或还包含任意合适的粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包衣剂，增溶剂作为载体，赋形剂或稀释剂。合适的载体的实例包括乳糖，淀粉，葡萄糖，曱基纤维素，硬脂酸镁，甘露糖醇，山梨醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇，甘油和水。合适的粘合剂的实例包括淀粉；明胶；天然糖类，诸如葡萄糖，无水乳糖，自由流动的乳糖，乳糖；玉米甜味剂，天然和合成树胶，诸如阿拉伯糖.，黄蓍胶或藻酸钠，羧曱基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯曱酸钠，乙酸钠，氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂，稳定剂，染料乃至矫味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠，山梨酸和对-羟基苯甲酸酯类。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。本发明组合物还可以包括，例如，但不限于可注射溶液，真空干燥制剂或冷冻干燥制剂形式。根据本发明的另一个方面，提供了增加肉毒杆菌神经毒素稳定性的方法，包含将肉毒杆菌神经毒素与环糊精制成包合复合物。优选环糊精与肉毒杆菌神经毒素的摩尔比至少为25:1-50:1，且最优选39:1。本文所用的术语"环糊精"意旨具有多个环吡喃糖单元的化合物并且包括于a，P或y-环糊精，其任意的衍生物或盐及其任意的组合。本发明的方法提供了具有显著改善的稳定性的环糊精-肉毒杆菌神经毒素包合复合物。因此，这种改善的稳定性用于提供具有增加的贮存期限的肉毒杆菌神经毒素。优选使肉毒杆菌神经毒素在含水系统中接触环糊精。含水系统具有约6.8-7.6的pH，并且可以包含3-25mM环糊精，5-25nM磷酸盐緩冲液。最优选含水系统包含lOmM环糊精，lOmM磷酸钠緩冲液并且具有pH7.4。在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明肉毒杆菌神经毒素的环糊精包合制品的水溶液可以以各种形式使用。例如，正如本领域中公知的，可以将该复合物制备成可注射药物或可以将其干燥成可再构建的粉末。应理解上述一般性描述和如下详细描述为典型的并且指定用于对请求保护的本发明提供进一步解释。包括引入本说明书并且构成其组成部分的附图，以便解释和提供对本发明方法和系统的进一步理解。附图与本说明书一起用于解释部分的原理。附图简述图1为例示了本发明A型神经毒素与a，P或Y环糊精的复合物在4'C下孵育的23-周研究结构的棒形图2和2a为例示本发明来自在4TC下Y-环糊精孵育的A型神经毒素的光谦的色i普图3,3a和3b为例示本发明来自在4匸下oc-环糊精孵育的A型神经毒素的光语的色谱图4，4a和4b为例示本发明来自在4'C下(3-环糊精孵育的A型神经毒素的光镨的色镨图5为例示了本发明A型神经毒素与a，(3或y环糊精的复合物在室温下孵育的23-周研究结构的棒形图6，6a，6b和6c为例示来自本发明在室温下A型神经毒素对照品的光镨的色镨图7，7a，7b,7c和7d为例示来自本发明在室温下a-环糊精孵育的A型神经毒素的光语的色镨图8，8a，8b和8c为例示来自本发明在室温下p-环糊精孵育的A型神经毒素的光镨的色谱图9，9a和9b为例示来自本发明在室温下y-环糊精孵育的A型神经毒素的光镨的色镨图10例示了6周时A型复合物的SNAP25裂解；且图11例示了6周储存后TANC的内肽酶活性。优选实施方案的详细描述现在详细提及本发明的优选实施方案，其实施例例示在附图。结合对系统的详细描述来描述本发明的方法和相应步骤。本文提供的方法和组合物可以用于緩解与肉毒杆菌神经毒素不稳定性相关的问题。本发明特别适合于提供表现出改善的稳定性的肉毒杆菌神经毒素的新的包合复合物和制备包合复合物的方法。为了解释和例证而非限制，本发明系统的典型实施方案如图1-11中所示。特别地且按照本发明，组合物包含肉毒杆菌神经毒素和环糊精。肉毒杆菌神经毒素和环糊精形成表现出明显改善的稳定性的包合复合物。本文为典型的肉毒杆菌神经毒包括A，B，C，D,E，F和G型。在优选的实施方案中，肉毒杆菌神经毒素为A型。本文中典型的环糊精包括a,P或Y-环糊精及其任意的衍生物或盐。根据本发明的另一个实施方案，提供了稳定肉毒杆菌神经毒素的方法。该方法包括使肉毒杆菌神经毒素与环糊精形成稳定的包合复合物。对比研究对A型肉毒杆菌神经毒素和环糊精包合物("TANC/CD")的稳定性和保存进行一系列研究。在系列研究中，将来自芽孢杆菌属(bacillus)的肉毒梭菌的A型神经毒素("TANC")与ot，P或y环糊精各自孵育23-周，并且通过如本领域中公知的HPLC-Gel过滤("HPLC-GF")方法分析。正如图1中所示，23-周TANC/CD研究结果例示了在4t)下测定为未降解的TANC的总峰面积。本文所用的术语"总峰面积"意旨通过洗脱时间峰表示的蛋白质的量。总峰面积减小可以反映出在该峰处的蛋白质的量减少，从而提示复合物降解或分解成较小的碎片或成分。正如所示的，对照品的总峰面积在整个23-周期限内为100%。因此，对照品在23-周时间期限内未发生TANC降解。在本研究中使用的对照品包含10mM环糊精和10mMpH7.4的磷酸钠緩冲液。图l描述了a，P或y环糊精各自孵育的TANC具有表示至少少量降解的峰。正如所示的，Y-环糊精孵育的TANC在4X:下表现出约2%的最少降解。P-环糊精孵育的TANC具有超过6%的最大降解(与其它环糊精相比)。Y-环糊精孵育的TANC样品的少量降解最可能是少量包合物结构变性的结果。正如图5中所示和描述的，在室温(25'C)下观察到了10mM磷酸钠緩沖液的稳定作用的进一步控制，并且描述复合物降解了约42%。如图2中所示在280nm处提取的色i瞽图表示TANC峰具有约7.4分钟的相对稳定的保留时间。然而，降解峰具有约18.3分钟的保留时间。因此，较小的蛋白质碎片或成分在凝胶过滤柱上保留较长的时间期限。较长的保留时间意旨可以通过复合物降解或其成分解离产生的较小大小的蛋白质。此外，正如图2a中所示，从y-孵育的TANC样品色谱图中提取的200nm-400nm波长扫描表示18.3分钟峰在约225和280nm处具有入max值，由此表示存在蛋白质。因此，y-环糊精孵育的TANC降解是对复合物结构的破坏并且不是TANC周围的环糊精复合物的降解。a-和(3-环糊精孵育的TANC样品各自显示了两个降解峰。从a和P环糊精孵育的TANC样品的首批降解峰中提取的光谱展示出与y-环糊精峰的光谦类似的结果，正如分别如图3a和4a中例示的。特别地，如图3a中所示，从oc-环糊精孵育的TANC样品色语图中提取的200nm-400nm波长扫描表示16.9分钟峰在约280nm处具有Xmax值，由此表示存在蛋白质。另外并且如图4a中所示，从p-环糊精孵育的TANC样品中提取的200nm-400nm波长扫描表示17.4分钟峰在约280nm处具有入max值，由此表示存在蛋白质。此外，图4a中所示的光镨还表示在约265nm处的Xmax值，由此表示p-环糊精不再与TANC复合。分别如图3b和4b中所示的a-环糊精孵育的TANC和p-环糊精孵育的TANC的第二个降解峰为未复合的环糊精的特征。图3b和4b中例示的光谦各自在约225nm和约265nm具有Xmax值。正如可以从图3和4中观察到的，a-环糊精TANC包合物的7.4分钟峰和P-环糊精TANC的7.6分钟峰各自在约9分钟处具有特征肩峰。对这些肩峰各自提取的光谱例示了各肩产生TANC自身的峰代表。该数据表示大部分TANC复合物(a-约22%;p约31%吸收)从TANC/CD复合物中脱离。正如图5中所示和本文为典型的，23-周TANC/CD研究结果例示了在室温下测定为未降解TANC的总峰面积。正如所示的，包括对照品的环糊精TANC样品各自表示高于在4'C下孵育的对比样品的降解量。正如在4'C下孵育的结果，室温对照样品在23周期限内具有约44%降解的最低程度的TANC降解。图5还表示与p-和y-环糊精孵育的TANC复合物相比，a-环糊精孵育的TANC样品在23-周期限内具有最少的降解。a-环糊精TANC降解为约52-48%,而P-环糊精孵育的TANC具有65%的降解，并且y-环糊精孵育的TANC具有55%的降解。正如图5中所示，在室温下对照品的总峰面积在1周内为100%。然而，对照品在第2周内表现出约23%的一些降解并且在23周期限内持续降解至第23周内的约44%的降解。其它环糊精孵育的TANC具有较高程度的TANC降解。特别地，在室温下P-环糊精孵育的TANC降解了约65%,并且在室温下y-环糊精孵育的TANC在23-周期限内降解了约55%。a-环糊精孵育的TANC在室温下具有低于p和Y-环糊精孵育的TANC的降解(约52-48°/。)。图6，6a，6b和6c各自表示在室温下对照品环糊精孵育的TANC的色谱图和提取的光谱。图7，7a，7b和7c各自表示在室温下ot-环糊精孵育的TANC的色谱图和提取的光谱，图8，8a，8b和8c各自例示了在室温下p-环糊精孵育的TANC的色i普图和提取的光谙，且图9,9a和9b各自例示了在室温下Y-环糊精孵育的TANC的色镨图和提取的光语。在每个色i脊图中，代表环糊精孵育的TANC复合物各自的降解产物的峰的波长扫描与在4'C下环糊精孵育的TANC复合物的降解产物的峰的波长扫描类似，正如图2-4b并且包括4b中例示的。图6-9中代表的的波长扫描表示蛋白质复合物，环糊精复合物或它们两者的变性。图7a，7b和8a中分别在约15.3分钟，17.1分钟和17.3分钟的早期降解峰各自描绘了稍高于300nm的max值。降解产物分子量使用从该柱生成的标准曲线(y--1.667x+7.409)尝试测定降解产物的分子量。BlueDextrin的洗脱时间(5.115分钟)用作用于Rr计算(Vet/V。t)的空体积(V。t)。下表1和2各自表示来自计算的值。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*表示低于GF柱的线性范围的值。表2室温降解产物分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*表示低于GF柱的线性范围的值。正如上述表1和2中所示，数值表示主要TANC蛋白质中没有一种从包合物结构中脱离。ANC包合物降解部分的小分子量明显低于GF柱线性范围的下限。根据极小分子量计算的分子量表示包合物仍然完整。DNA/RNA的存在Rnases添加到TANC溶液显示丕存在RNAs或DNAs。在260nm处按照分光光度法监测添加的核酸酶的吸收度增加，因为包含任意存在的RNA/DNA的核苷酸从其三级结构中释放。尽管观察到吸收度增加(3小时内增加0.002)，但是不能确定这类小的增加说明存在任何较大浓度的RNAs或DNAs。实施例A型肉毒梭菌的制备通过Cai等EnhancementoftheEndopeptidaseActivityofBotulinumNeurotoxinsbyItsAssociatedProteinsandDithiothreitol,Biochemistry,1999，38，6903-6910中所示的方法制备A型肉毒梭菌(菌林Hall)复合物，将该文献的全部内容引入本文作为参考。使用用IO个柱体积的pH7.4的lOmM磷酸钠平衡的5mLSephadexG-25柱使纯化的A型复合物进行緩冲液交换。通过SDS-PAGE分析测定A型复合物具有典型亚单位结构。将A型复合物在7.4的生理pH下稀释至0.75mg/mL浓度，并且将1mL等分部分放入8支1.5mL微量离心管。通过高效液相色谱法，在溶液中的0.1mMa-，p-或y-环糊精存在下使用凝胶过滤(大小排阻)柱(HPLC-GF)分析25°C和4°C下A型肉毒杆菌神经毒素复合物的1.5mgmL—1溶液。给WATERSHPLC系统安装Waters996光敏二极管阵列(PDA)检测器和双Waters515HPLC泵。将Waters泵系统与WatersPumpControlModule整合并且用WatersMillenniumSoftware控制。将样品通过Rheodyne77251ManualInjectionSystem导入该系统。用于分离样品的柱为WatersProteinPak300SW(4.6x300mm)。用于各分离尝试的緩冲液条件如下所示。标准曲线生成凝胶过滤标准品(SigmaChemicalCo.)用于确定ProteinPak柱的分子量标准曲线。用于标准曲线确定的緩冲系统为pH7.4的10mM磷酸钠緩冲氣来自标准曲线测定的结果如下表1中所示。将根据Log分子量与Vst/V。t关系的图确定的线性方程计算为y=-1.7417x+7.399，R2=0.9398。神经毒素A复合物分析来自HPLC-GF分析的结果表明能够在生理pH下稳定肉毒杆菌神经毒素及其复合物NAPs。在pH6.8的50mM磷酸钠緩沖液中，85°/。蛋白质以复合形式保留。在pH7.4的10mM磷酸钠緩沖液中发现了较低9/。的复合物(70%)。在pH7.4下复合物的％较低是因直接将包合物导入新緩冲系统所致。如果在导入HPLC-GF系统前将肉毒杆菌毒素和NAPs透析入pH7.4緩冲液中，将会是与pH6.8緩冲系统类似的结果。此外，在5X:和25。C下在有和没有a-环糊精存在下进行A型神经毒素包合物(TANC)的内肽酶活性的稳定性研究。研究结果提示6-周期限内，TANC在5'C和25。C下在有和没有0.1mMa环糊精存在下仍然保留酶活性。A型肉毒杆菌神经毒素底物SNAP-25(泳道2中的箭头所示的完整SNAP-25)的蛋白水解(内肽酶)产物的电泳分析如图10中所示。在用150nMTANC(泳道3)处理后，完整SNAP-25带消失。对在5'C下pH7.4的10mM磷酸钠緩沖液中储存的TANC，获得了与(泳道6)或没有任何a-环糊精(泳道5)类似的结果。在25'C下也保留了内肽酶活性(泳道7&8)。图11描述了在不同储存条件下内肽酶活性的图解表示。正如所示的，在每种储存条件下TANC内肽酶活性仍然保持较高。在5C下緩沖液中储存的TANC和在TANC中SNAP-25强度的负强度表明在相当于SNAP-25的蛋白质带的强度测定中的误差。在每种条件中测试的TANC的内肽酶活性由此与实验误差相同。如上所述和附图中所示的本发明方法和系统提供了稳定的肉毒梭菌神经毒素复合物。本领域技术人员显而易见可以在不脱离本发明精神或范围的情况下对本发明的方法和系统进行各种变型和变化。因此，指定本发明包括在附属的权利要求及其等价物范围内的变型和变化。权利要求1.组合物，包含肉毒杆菌神经毒素；和环糊精或其衍生物，其中所述环糊精与所述肉毒杆菌神经毒素形成包合复合物。2.权利要求1所述的制剂，其中所述环糊精与肉毒杆菌神经毒素以摩尔比至少为25:1-50:1存在，以使肉毒杆菌神经毒素表现出改善的稳定性。3.权利要求1所述的组合物，具有至少4周的贮存期限，并且约55%-约80%的所述肉毒杆菌神经毒素作为所述复合物保持至少2周的期限。4.权利要求1所述的组合物，其中所述肉毒杆菌神经毒素在4'C-25'C的储存温度下在约23周的期限内具有约2%-低于65%的降解。5.权利要求l所述的组合物，其中所述肉毒杆菌毒素选自A,B，C，D，E，F和G型肉毒杆菌毒素。6.权利要求1所述的组合物，其中在形成所述复合物之前纯化所述肉毒杆菌毒素。7.权利要求l所述的组合物，其中所述环糊精包含a环糊精，P-环糊精，y-环糊精，或者a环糊精、p-环糊精或y-环糊精的羟基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧甲基或二羟基烷基的衍生物。8.权利要求1所述的组合物，其中所述环糊精存在于进一步包含磷酸盐緩冲液的稳定溶液中。9.权利要求8所述的组合物，其中所述緩沖液为磷酸钠并且该溶液的pH为约6.8-约7.6。10.权利要求1所述的组合物，为可注射溶液或干燥制剂的形式。11.稳定肉毒杆菌神经毒素的方法，该方法包含提供肉毒杆菌神经毒素；和使所述肉毒杆菌神经毒素经历环糊精处理，其中以足以与所述肉毒杆菌神经毒素形成包合复合物的量来提供所述环糊精。12.权利要求11所述的方法，进一步包括通过以至少25:1-50:1的摩尔比提供所述环糊精与肉毒杆菌神经毒素，将改善的稳定性传递给所述肉毒杆菌神经毒素。13.权利要求11所述的方法，进一步包括提供一定量的环糊精，以便赋予所述复合物至少4周的贮存期限，其中作为所述复合物的约55%-约80%的肉毒杆菌神经毒素保持至少2周的期限。14.权利要求11所述的方法，其中所述肉毒杆菌神经毒素在4'C-25。C的储存温度下在约23周的期限内具有约2%-低于65%的降解。15.权利要求ll所述的方法，其中所述肉毒杆菌毒素选自A，B，C，D，E,F和G型肉毒杆菌毒素。16.权利要求11所述的方法，其中在形成所述复合物前纯化所述肉毒杆菌毒素。17.权利要求11所述的方法，其中所述环糊精包含a环糊精，P-环糊精，y-环糊精，或在a环糊精、p-环糊精或r"环糊精的羟基烷基，曱酰胺，二乙氨基乙基，羧曱基或二羟基烷基的衍生物。18.权利要求11所述的方法，进一步包括提供所述环糊精的稳定溶液，其中该溶液进一步包含磷酸盐緩冲液。19.权利要求18所述的方法，其中所述緩沖液为磷酸钠且该溶液的pH为约6.8-约7.6。20.权利要求11所述的方法，进一步包括提供可注射溶液或干燥制剂形式的所述复合物。全文摘要本发明涉及包括肉毒杆菌神经毒素和环糊精的稳定的组合物以及保存肉毒杆菌神经毒素和以有效和经济上有利的方式生产具有改善的稳定性的肉毒杆菌神经毒素组合物的方法。本发明寻求通过提供表现出改善的稳定性的新组合物缓解与肉毒杆菌神经毒素快速降解或变性相关的问题。优选通过形成环糊精包合复合物稳定肉毒杆菌神经毒素。文档编号A61K39/02GK101316612SQ200680044226公开日2008年12月3日申请日期2006年9月22日优先权日2005年9月26日发明者A·M·里斯,B·R·辛申请人:B.B.科学有限责任公司