专利名称：：在柔性容器中利用紫外光辐射血小板浓缩物的方法在柔性容器中利用紫外光辐射血小板浓缩物的方法
技术领域：
：本发明的主题是灭活血小板浓缩物(TK)中病原体，例如细菌和病毒，和/或白细胞的方法，所述方法通过利用紫外光辐射进行。已知的是，血液制品在治疗上的应用具有风险，即血液制品的受体感染病毒和细菌。可提及例如病毒性乙型肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV)以及艾滋病病原体HIV-1和HIV-2。如果在制备所述制品时没有进行灭活或消除所述病原体的步骤，这类风险一直存在。紫外(UV)光根据波长不同而有差异。在本申请意义上采用下列定义UVA:小于400至320nm,UVB:小于320至280nm和UVC:小于280至200nm。已知的是，通过短波紫外(UV)光的辐射，即低于约320nm波长范围的紫外光(UVB和UVC)，既可以灭活病毒也可以灭活细菌，例如血浆或细胞血液制品中。超过320nm则辐射的能量太低，不能灭活微生物和病毒。与病原体灭活的化学、光化学和光动力学方法相比，仅仅利用UV光辐射原则上具有本身单独有效，而不需要添加反应性化学品或光敏物质的优点。这类添加物或它们的分裂产物或光产物通常需要后续的除去过程，因为它们是有毒的或者是诱变剂。除此之外，如果它们结合到血浆蛋白和细胞表面上，还可能在所处理制品中导致产生新抗原结构。一般来说，这类添加物不能完全除去，除去它们至少需要额外的花费。这种额外的操作步骤可能由此损害已消毒的制品的质量。用于直接病原体灭活UVC是最有效的。然而，它也有缺点，即穿透含蛋白质溶液例如血浆或混浊的悬浮液(例如TK)只至极低的穿透深度。UVC在第二次世界大战期间和其后不久被用于进行血浆和白蛋白溶液消毒，尤其灭活肝炎病毒。那时采用的方法是，溶液在流过装置(Durchflussapparatur)中作为薄膜经过UVC光源。所述方法被证实不够安全并被放弃(KallenbachNR,CorneliusPA,NegusD，etal.Inactivationofvirusesbyultravioletlight.Curr.Stud.Hematol.BloodTransfus.1989，56，70-82)。目前使用根据相同的原理运行的改进的方法，以进行治疗用血浆蛋白制品的消毒。在所有情况下，以前和现在都是处理较大体积，即血浆库或者高达几百升或更多的蛋白质溶液(HartH.ReidK，HartW.Inactivationofvirusesduringultravioletlighttreatmentofhumanintravenousimmunoglobulinandalbumin.VoxSang1993;64(2):82-8和ChinS.WilliamsB,GottliebP,etal.VirucidalshortwavelengthultravioletlighttreatmentofplasmaandfactorVIIIconcentrate:protectionofproteinsbyantioxidants;Blood1995;86(11):4331-6)。用于消毒多个单一单元的TK,所述TK来自供血或通过机器单采血液成分术而得到，体积最多高达几百ml,上述流过装置并不适合。然而，这正是血库每天实际需要的。UVB既是杀微生物剂又是杀病毒剂，尽管和UVC相比在程度上不同。UVB穿透含蛋白质溶液和混浊悬浮液比UVC稍好，然而，其穿透深度，例如在血浆或TK中的穿透深度也被确定只在几个毫米的范围内。尝试利用UVB的辐射来灭活TK中的T淋巴细胞，其明显比病毒或细菌对UV更敏感。由此应该避免了接受所述制品时对外来HLA抗原的同种异体免疫，所述同种异体免疫可能引起受体耐进一步的TK输入(AndreuGBoccaccioC，LecrubierC，etal.Ultravioletirradiationofplateletconcentrates:feasibilityintransfusionpractice.Transfusion1990;30(5):401-6和PamphilonDH.Therationaleanduseofplateletconcentratesirradiatedwithultraviolet-Blight.TransfusMedRev1999:13(4):323-33)。然而，所述方法没有获得成功，因为几乎同时开发出了白细胞过滤法，它是具有类似的有效性并且在花费和操作上更有利的替代方法(LeukocytereductionandultravioletBirradiationofplateletstopreventalloimmunizationandrefractorinesstoplatelettransfusions.TheTrialtoReduceAlloimmunizationtoPlateletsStudyGroup.NEnglJMed1997;337(26):1861-9;)。同样描述了，通过利用单色UVB光(波长308nm)的辐射可以灭活血小板悬浮液中的病毒。在此使用了准分子激光；样品体积为几个ml(ProdouzKN,FratantoniJC，BooneEJ，BonnerRF.Useoflaser-UVforinactivationofvirusinbloodproducts.Blood1987;70(2);589-92)。显然人们不能超越这一基点。实际上，文献中没有已知的方法，可以仅仅通过利用UV光的辐射(即UVB或UVC)来净化全TK中的病毒或细菌。TK通过单个供体的机器血小板单采血液成分术(Thrombapherese)得到或者也从供血中分离，其中血小板由多份供血(通常4到6份)合并得来。由此得到的TK的体积通常为约200至350ml。还可以由单个供血制备TK，得到的体积相应较小(约40至80ml)。合并的和单采血液成分术的TK都是悬浮在血浆或含有约30至40%剩余血浆的特殊储藏介质中的。TK在扁平透气性塑料袋中在20至241C下保存。期望的是利用UV光消毒这类袋中的TK。然而，在此存在上述问题，即所述制品几乎不透过UV光。通过下面的计算实施例应该解释清楚这一点如果计划用UVB消毒并且假定约300ml的TK体积，此外，UVB辐射的穿透深度为lmm，以及在袋的两侧曝光，适合的曝光袋必须具有至少1500cm2的表面。常规地处理较大量这类尺寸的袋，如果不排除可能性，看起来也4艮难。如果使用UVC消毒代替UVB消毒，问题将会更大得多，因为UVC的穿透深度更小。出人意料地发现，上面的问题通过根据权利要求1的方法得以解决。优选的实施方案是从属权利要求的主题，或者在下文中描述。根据本发明，TK在其曝光袋中以适合的方式运动。所述运动在此如此强烈，使得在TK内部形成区域性的层，所述层如此薄，使得可以被UV辐射穿透。所述运动必须同时使得袋中的TK悬浮液被有效混合。如果满足下列前提，则两者都实现1.所述曝光袋高度柔性，并且在膝光期间不固定所述曝光袋，例如不夹在石英板之间。因此，其适应所述袋运动时所产生地TK悬浮液的任何形状改变。2.所述袋的运动或者水平(来回线性或者圆形或椭圆形)或者垂直(摇摆)进行。3.所述曝光袋被填充至其最大填充体积的最多30%，尤其最多20%。无论如何，运动方向的逆转应该如此突然，使得TK悬浮液的较大部分由于惯性继续向原来的方向运动，因此剩余部分可以形成薄层，该薄层可以被UV辐射穿透。结合辐射期间由于袋的运动而产生的不断混合，最后使全部TK(和其中包含的病毒和/或细菌)经受UV辐射。由此将TK消毒。所述膝光袋由UV可穿透的塑料材料制成。适合的塑料例如是乙烯醋酸乙烯酯和聚烯烃，其膜厚度为1mm和更小，尤其膜厚度小于0.5mm。所述曝光袋构造成扁平状并且优选在200至320nm范围内没有最大吸收。所述曝光袋在水平的填充状态下只有几个mm厚，例如小于10mm,尤其小于5mm，优选甚至小于3mm，并且打算容纳例如最高200或最高300ml的样品体积。然而，所述曝光袋的最大容量(体积)为其中实际包含的待处理样品体积的至少3倍，通常至少5倍大，优选至少10倍或者甚至至少20倍大。试验研究所述实验说明方法的有效性，但是不限于下面所述细菌和/或病毒的灭活。对于所述实验中使用的"随机供体"TK也没有限制，根据本发明的方法还可以用于血小板单采血液成分术制品。所有实验均进行了3至6次。给出的结果分别表示平均值土标准偏差。j&小我求裙參TK由分别5个血沉棕黄层(BuffyCoat)合并制备，其本身来自常规的供血。所述TK的体积为约300至350ml;血小板浓度约109/ml。血小板悬浮在储藏介质SSP+(MacoPharma公司的产品)中。剩余血浆含量为约30至40%。在所述灭活实验中使用下列细菌菌林表皮葡萄球菌(X鄉/r卢c0ccM51(51.)e/wV/e簡/s)金黄色葡萄球菌(iS鄉/l卢COCC"S1(IS1.)flwrews1)蜡状芽孢杆菌(5""7/"s(及))肺炎克雷伯氏菌((X)戸CM柳0W/fle)细菌浓度通过集落生成测试法确定并且作为集落生成单元(CFU)/ml来表示。所述用于灭活细菌的实验中，在具有10"至l()5CFU/inl的全TK或TK的等分试样中掺入前面给出的菌种，随后利用UV光辐射。向TK的等分试样掺入猪疱渗病毒(SuidHerpesvirus)(SHV-1，伪狂犬病病毒，Aujeszky林)或水泡性口炎病毒(VesicularStomatitisvirus)(VSV，Indiana林)。通过CPE测试法(CPE-致细胞病变效应)确定病毒滴度。以TCID5。(TCID"且织培养感染剂量)给出。非洲绿猴肾细胞林系(Vero)细胞作为指示细胞。所实施的实验中原始病毒浓度为约105至107TCID50。錄絲f两种所用的曝光装置中的一种装备有发射UVB光的管。辐射在水平放置的曝光袋的两侧进行，即从顶侧和底侧。所述瀑光装置安装有震荡设备，所述震荡设备水平往复运动，频率为60次方向变化/分钟。第二种啄光装置同样装备有发射UVB光的管。辐射同样在两侧进行。第三种装置(与第二种同样的构建方式)装备有发射UVC光(波长254nm)的管。两种装置可以以2种不同的震荡方向运行一个水平振荡器，做椭圆形往复运动，另一个摇摆式振荡器。貼炎所用的曝光袋由UV透过性乙烯醋酸乙烯酯(EVA)构成。使用两种袋尺寸1.14.5x18.5cm(外部袋面积约268cm2)2.22.5x38cm(外部袋面积约855cm2)在利用小的EVA袋的实验中，样品体积为80ml，在利用大的EVA袋的实验中，样品体积为约300至350ml(处理全TK)。实验实施例1:遞过C/K5W4发葡萄球,义承，l遂痴银血小我產孕遂々由运动4者发^"々由适訪实验中样品体积为80ml。通过将曝光袋牢固地夹在两块石英板之间，避免了样品震荡期间血小板悬浮液的自由运动性和因此薄层的形成。得到的层厚度为约3mm。对于第二个样品，将石英板之间的距离扩大，使得所述血小板悬浮液在震荡期间可以基本上自由运动。两种样品用1J/cm2辐射。如表1所示，被固定样品中细菌滴度减少约2l0gK)，与此相反，松散放置的样品中，减少超过41ogw。表l样品描述_^细菌滴度fl0ginCFU/ml)未处理的对照4，1±0,03牢固夹住的样品1,4±1,29松散放置的样品-0,40+0,35实验实施例2:遞过t/Ffi对全n#4发薪毐球萝义承，在、我放！^举萄关住錄龙袭，这个实验中TK体积为330ml,大的EVA袋中平均层厚度相应地约3.9mm。所述TK在下列条件下利用3种UVB剂量(0.8、1.0和1.2J/cm2)辐射1.没有震荡，松散放置在石英板之间2.震荡，压在石英板之间。如实验结果所示(表2)，在震荡期间牢固夹住的TK中，通过UVB处理细菌滴度减少高达约21ogl。，与此相反，在松散放置的样品中，根据剂量减少约3.4至大于4logl0。样品放置表，2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实验实施例3:if过t/K5考《由适动减萄定辨爭》试#它勿萝辨义承从前面两个实验实施例得出，TK中的表皮葡萄球菌在TK悬浮液可以在UV辐射期间自由运动的前提下被有效的灭活。下面的实验另外试验下列细菌菌株金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌。条件与实验实施例i中所述相同。在所有三种情况下与利用表皮葡萄球菌的结果类似松散放置的TK样品中，细菌被灭活约3.9至4.25log1Q,而在固定样品中滴度只减少约2至3.41ogK)(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实验实施例4:遞过#riT爭分试摔*的4发薪萄球,在不/^复苈务伴7义活如果使用与实施例l至3中所用的如所述往复运动的水平震荡器不同的震荡器，研究松散放置的TK等分试样中表皮葡萄球菌的灭活是否也升高。下面的实验使用轨道式震荡器，它进行圆形的运动(半径3cm，转数50/分钟)，另外，使用每分钟上下摇摆50次的倾斜台。两个样品(80ml)中一个还是牢固地夹在两块石英板之间，而另一个松散放置。从表l中显示的结果得出，这次细菌灭活的程度在松散放置的TK样品中比牢固夹住样品高3至4log10。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验实施例5:遞过c/1^;^^^症^^病毒义话，震苈痴河n爭》试#々由适动4者沒才^由运动为了检验利用UV光辐射期间没有固定的TK中病原体灭活的升高，是否不仅对细菌，而且也涉及病毒，进行下列实验向80mlTK等分试样掺入猪疱渗病毒(SHV-1),如实验实施例1所述利用UVB处理。在自由放置的样品中，病毒滴度减少几乎41ogw,与此相反，牢固夹住的样品中只减少约31ogl。。这证明了，在所述条件下病毒的灭活也明显得到改善。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验实施例6:遞过卩K5口^病毒义承，震遂痴A7re爭#试#々由运訪减者^才《由运^如实验实施例5所述进行实验，只是利用VSV代替SHV-1掺入TK等分试样中。松散放置的样品中病毒灭活的程度超过辐射期间固定在石英板之间的对比样品中大于6.46logKi(表6)。可注意到的是，在此病毒滴度的降低也相对多(约5.41ogn))。可见VSV比SHV-1对UV更敏感'表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验实施例样口口口脏病毒滴度化og,nTCTD^未处理的对照6，7±1,05牢固夹住的样品1,29±1,05中^敎放置的样品^0，24±0，00^过i7FC>^《发薪萄球,义泽，l苈^/塚n爭为、试捧^由运动减者沒l々由运动这个实验利用UVC代替UVB进行辐射。UV剂量为0.3J/cm2(辐射时间60秒)。其它条件与实验实施例l所述相同。从表7得出，固定样品中的细菌滴度只减少了约1logl。。这当然反应了UVC在血小板悬浮液中极小的穿透深度。与此相反，松散放置的样品中没有检查到细菌；灭活系数大于41og10。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验实施例8:遞过t/KC#K9K义活，貫多痴/Vn爭#试#々洽运动4者发才^洽运动如实验实施例6中使用VSV作为试验病毒。条件与实验实施例7相同。表8中的结果显示出，在这种情况下，松散放置的样品中病原体灭活的程度也比固定样品中的大得多固定样品中病毒滴度只减少约1.5log1()，而未固定样品中减少约6.2log10。表8细菌滴度OogmCFU/mr>4,08±0，042,99±0,1350,24样品描述病毒滴度fLog，QTCID^)未处理的对照6，92±0,22牢固夹住的样品5,47±0,21爭嫂放置的样品0，74±0，7权利要求1.用于灭活血小板浓缩物(TK)中病原体和/或白细胞的方法，所述方法包括下列步骤-提供从供血和/或通过机器单采血液成分术得到的TK，-利用紫外(UV)光辐射TK，-其中TK由多个可单独操作并且分开储藏的单元组成，和-TK单元分别位于柔性的、UV穿透性扁平曝光袋中，其特征在于，-所述曝光袋被填充了曝光袋最大填充体积的小于30体积％，和-使所述曝光袋在利用UV光辐射期间这样运动，使得曝光袋中的内含物被循环并且通过运动形成层厚度变化的地带。2.根据权利要求l的方法，其特征在于，所述病原体是病毒和/或细菌。3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述地带通过运动具有受到辐射的区域，所述区域有规律地暂时得到小于1mm的层厚度。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述运动，尤其运动的幅度这样实现，以使得在TK内部形成层厚度有规律地暂时小于0.5mm的受到辐射区域。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋具有底侧和顶侧，并且与袋内物质接触或可以接触的底侧和顶侧面积总和合计大于袋内含物内总表面积的90面积百分比，优选大于99面积百分比。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述辐射是或包含小于320nm至280nm的UVB和/或小于280nm至200nm的UVC，尤其小于280nm至200nm的UVC，优选仅仅由具有上述范围波长的辐射构成。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，每个单元由来源于最多8个供体，优选最多6个供体的样品制备。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，每个单元来源于1个供体。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，TK包含每ml至少lxl()S血小板，优选每ml至少5xl()S血小板。10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述辐射利用光能为0.3至5J/cm2,优选0.5至2.5J/cm2的UVB来进行。11.根据权利要求1~9中任一项的方法，其特征在于，所述辐射利用光能为0.01至2J/cm2，优选0.1至1J/cm2的UVC来进行。12.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述TK包含血浆和任选地适合的储藏介质，其中血浆含量优选大于20重量％。13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述TK包含緩沖的含水储藏介质。14.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，灭活病毒、细菌和/或白细胞，而血小板的功能保持基本不变。15.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋的体积为最高5000ml。16.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋可移动地保持在装置中并且尤其不是夹在两个平面，例如UV穿透性玻璃板或塑料板之间，所述曝光袋在所述装置中被运动并且辐射。17.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，在总曝光持续时间的至少四分之三时间内所述曝光袋是运动的。18.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋通过震荡来运动。19.根据权利要求in中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋通过倾斜来运动。20.根据权利要求1~17中任一项的方法，其特征在于，所述膝光袋通过旋转来运动。21.根据前述权利要求中至少一项的方法，其特征在于，所述震荡利用轨道震荡器、平台震荡器、摇摆式震荡器或翻滚式振荡器来进行。22.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述膝光袋在一侧放置，使得在运动或震荡期间或者通过运动或震荡，所述啄光袋的高度不断变化，所述高度基于在其上放置所述曝光袋的平面和与曝光袋的上表面相交点之间沿平面法线的距离计，考虑与所述袋内含物接触的所述啄光袋的整个上表面。23.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋的平均填充高度为10，优选小于5mm,并且通过运动不断产生波谷，它具有小于平均填充高度的一半，优选小于1mm或者甚至小于0.1mm的层厚度。24.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，使所述曝光袋在辐射期间不断地至少在x方向和任选地也在y方向(y方向与x方向成直角)以0.2至8cm的幅度运动，并且与之无关地，所述震荡运动的方向变化频率为0.5至10Hz。25.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述曝光袋在辐射期间已被填充至其最大填充体积的最多20%。全文摘要本发明涉及灭活血小板浓缩物中病原体，例如细菌和病毒，和/或白细胞的方法，所述方法通过在柔性曝光袋中在运动下利用紫外光辐射进行。血液产品在此包装在柔性袋中，从而可以通过运动(倾斜、旋转、平移)充分混合所述流体。这通过填充袋的总填充容量的最多30％来进一步促进。文档编号A61L2/00GK101340936SQ200680048365公开日2009年1月7日申请日期2006年12月21日优先权日2005年12月23日发明者哈拉尔德·莫尔,沃尔费拉姆·H·瓦尔克申请人:德国红十字会供血服务站研究协会;马可制药股份公司