重组单价抗体及其制备方法

专利名称：：重组单价抗体及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及可用于治疗应用的单价抗体。本发明还涉及用于制备该单价抗体的方法、包含这种单价抗体的药物组合物、及其在不同的治疗应用方面的用途。
背景技术：
：自然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二疏键与重链相连，而不同免疫球蛋白亚型重链间的二疏键联结数目不同。每条轻链由轻链可变区(缩写为VO和轻链恒定区(缩写为QJ构成。每条重链由重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区(缩写为Q0构成，重链恒定区由3个结构域CH1,Ch2和CH3构成。重链的CH1和CH2通过所谓的铰链区彼此分离。铰链区通常含有1个或多个半胱氨酸残基，其可以和抗体分子中其它重链铰链区的半胱氨酸残基形成二硫桥。最近，抗体成为了治疗应用的主要焦点领域，许多抗体药物已经获得批准或者正在受理批准用作治疗性药物。治疗性抗体的理想特征可#4居待治疗的特殊病症而不同。对于某些适应症，仅需要抗原结合，例如抗体的治疗效果是阻断抗原与一种或多种本来可结合该抗原的特定分子间的相互作用。对于这类适应症，优选使用Fab片段，其唯一功能是与抗原结合。就其他的适应症而言，可能还需要进一步的作用，例如诱导补体激活的能力和/或结合Fc受体、保护免受分解代谢、募集免疫细胞等的能力。对于这类应用，可能需要抗体分子的其它部分，例如Fc区。一些全长抗体在与靶抗原结合时可显示激动剂作用(其可能被认为是不利的)，即使在该抗体作为Fab片段使用时起拮抗剂作用。在一些情况下，该作用会导致二价抗体的"交联"，进而促使靶二聚体化，可能导致激活，特别是当耙标是受体时。在可溶性抗原的情况下，二聚体化可能形成不利的免疫复合物。在一些情况下，与抗原的单价结合，例如在FcaRI的情况下，会诱发细胞凋亡信号(Kanamura等，2006年9月25日《Blood》在线公布)。因而对于一些适应症，单价抗体可能是优选的。目前可获得的Fab片段显示较差的药物代谢动力学，这是由于它们尺寸较小而在肾中被滤出，并且不能够与Brambell受体FcRn相互作用(JunghansRPetal.，ProcNatlAcadSciUSA21(11),5512-6(1996)),因此在体内不稳定，施用后会非常快速地被清除。二聚体单价抗体(Fab/c),其中Fc区包含两条Fc多肽，也已经有过描述(Genentech的WO200563816和ParhamP,JImmunol.13跳2895-902(1983)。因此，需要有稳定的单价抗体用作治疗剂。删除全长抗体的一个或多个结构域，包括例如含有在抗体中形成二碌u桥或提供非共价重链间接触所必需的氨基酸的区域，可能是一种构建单价4元体的方法。Igarashi等(Igarashi，TM.etal.,Biochemistry22,5727(1990))描述了一种小鼠IgG2a分子的结构，其中删除了整个CHl结构域，但铰链区保持完整。删除了CH1的抗体显示以一种铰链角(hingeangle)相对较小的伸长结构存在。然而该分子保留了IgG的预期的由两条轻链和两条重链构成的规则四聚体构型，因此仍然为二价，并且Ch1的删除不影响突变抗体的亲和性。Larson等(Larson，SB.etal.，JMolBiol，，1177(2005))描述了一种人源化IgGl抗体的结构，其中删除了CH2结构域。这种抗体以两种分子形式存在，称为A型和B型。A型在铰链中含有两个链间二辟^建，而B型不含有链间二碌i^建。B型作为122kDa的分子存在，其似乎通过CH3结构域内的非共价相互作用而保持在一起。该抗体显示较快的血清清除，因为它不能结合FcRn受体并通过它们再循环。Ig半分子也已有描述，其具有由仅一个轻链和仅一个重链构成的二聚体构型，是人类和鼠科动物浆细胞瘤中的罕见缺失(raredeletion)导致的。一些患骨髓外软组织浆细胞瘤、Waldenstr6m巨球蛋白血症、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤的患者在其尿中分泌IgG半分子。还发现半分子存在于其血清中。对于这些半分子生物化学性质的研究显示，它们由IgGl分子构成，其中重链CH1、铰链区和CH2区似乎正常，而在CH3区中发现缺失。据Spiegelberg分析，IgGl半分子中CH3恒定区的缺失包含5，000-8，000道尔顿，铰链肽序列与野生型IgGl相同。突变显示位于CH3,铰链肽显示正常(Hobbs，JRetal.,ClinExpImmunol丄199(1969);Hobbs,JR,BrMedJ2,67(1971);Spiegelberg,HLetal.,Blood41,305(1975);Spiegelberg,HLetal.，Biochemistry14,2157(1975);SeligmannMEetal.，AnnImmunol(Paris)129C,855-870(1978);Gallango,MLetal.,Blut4^，91(1983))。另有显示，该人IgGl半分子会快速分解代谢(人体内半衰期为4.3天)，呈单体型，不能结合人类淋巴细胞、单核细胞或中性白细胞上的C1q或Fc受体(Spiegelberg，HL.JClinInvest588(1975))。从这些研究可得出结论，IgGl半分子缺少IgG重链Fc部分的特征性的非共价相互作用，这使分子不稳定，并且Ch3区在維持IgG重链间相互作用中特别重要。通过体细胞突变产生的鼠IgA半分子也已有描述(Mushinski，JF,JImmunol巡41(1971);Mushinski，JFetal.，JImmunolU2，1668(1976);Potter,Metal.，JMolBiol21，537(1964);Robinson,EAetal.,JBiolChem證:6605(1974);Zack,DJetal.，JExpMed1M，1554(1981))。这些分子显示均含有Ch3区的缺失，或者在CH2-CH3边界处具有突变。人IgA半分子也在患有多发性骨髓瘤的患者体内有发现。这些分子也发现在CH3区有缺失(Spiegelberg,HLetal.,JClinInvest迅1259(1976);Kawai,T.etal.，AnnAcadMedSingapore2，50(1980);Sakurabayashi，I.etal.,Blood2,269(1979);Biewenga，J.etal.，ClinExpImmunolii，395(1983》。具有铰链缺失的人IgGl突变体已有描述并获得结晶(Saphire,EO.etal.,JMolBiol11^，95(2002))。Dob和Meg是人IgGl亚类的人类骨髓瘤蛋白，具有铰链区缺失。这些缺失铰链的IgGl分子形成的稳定的Ig具有由两条重链和两条轻链构成的结构，这是典型的抗体异源四聚体结构，但是在轻链之间形成链间二硫键，导致分子构型强烈受限制，从而显示很少直至没有效应物功能(BurtonDRetal.，JMolBiolli￡9(2002);Steiner,Aetal.,Biochemistry迅4068(1979);Silverton,EWetal.,ProcNatlAcadSciUSAH，5140(1977);Rajan,SSetal.，MolImmunol2a787(1983);Guddat,Wetal.ProcNatlAcadSciUSA巡4271(1993);Sa誰，R.etal.,J.AppliedCryst.U，476(1982);Klein,M.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA524(1981))。已经设计了一种IgG3分子，其中铰链区上部或中部或整个铰链区缺失(Brekke,OHetal.,Nature巡628(1993);Brekke，OHetal.,Nature巡，103(1996))。完全缺失铰链的分子在非还原SDS-PAGE分析中显示有半分子存在。另一种铰链缺失的分子中整个上部和下部IgG3铰链被单个半胱氨酸取代并且下部IgG3铰链含有单个Ala缺失，其在SDS-PAGE分析中也含有半分子。然而，结果显示，在生理条件下，这两种重-轻链半分子通过IgG3CH3结构域之间的非共价相互作用结合在一起；从而形成完整的IgG分子。还已经制备了一系列相匹配的嵌合IgGl和IgG4抗体(Horgan,C.etal.JImmunol透，5400(1993))。为了研究IgG铰链区在抗体结合抗原中的作用，制备了缺失铰链区的IgGl和IgG4突变体。突变体是通过删除IgGl和IgG4重链基因的铰链区外显子而在DNA水平上产生的。根据报道，IgG3和IgG4铰链缺失分子都是二价的，因此具有典型的异源四聚体结构。一个支持性证据是，铰链缺失的IgG4的功能亲和力显示了优于野生型IgG4的抗原结合作用，表明铰链缺失分子的亲和力没有受到所产生的铰链缺失的影响。.人lgG4分子以多种分子形式存在，它们因在铰链区存在或不存在重链间二碌"建而不同。因此，存在形成有2个、1个或者没有重链间二好^建的IgG4分子(Schuurman,J.etal.,MolImmunol1^，1(2001))。在生理条件下，IgG4的这些分子形式可能彼此平衡。人lgG4在溶液中以四聚体形式存在，由两条Ig重链和两条Ig轻链构成，像所有的免疫球蛋白G分子一样，不管有或是没有这些链间二硫键(Schuurman2001(见前文)；Gregory,L.etal.MolImmunol24,821(1987))。大小测定分才斤(size-determinationanalysis):^SDS-PAGE显示，只有在非还原条件下变性时，两个非共价结合的半分子方才解离(Schuu腿n，J.etal.MolImmunol^，1(2001);Deng，L.etal.BiotechnolApplBiochem迎，261(2004))。已证明，铰链区内参与链间二疏键形成的残基的突变或者铰链区的缺失导致在溶液中产生均一的IgG4分子库，该库由四聚体分子构成，这些四聚体由两条轻链和两条重链构成(Schuurman,J.etal.MolImmunol1(2001);Horgan,C.etal.JImmunol150.5400(1993))。与天然IgG4分子相比，IgG4铰链缺失和突变的抗体还显示具有更好的抗原交联能力(Horgan，C.(1993)(见前文))。大量的研究显示，IgG恒定区结构域CH1和CH2的突变或缺失不影响IgG分子组装成其自然的2重链和2轻链异源四聚体构型。已显示，在重链恒定区含有不同缺失的重组抗体分子，其效应物功能受到影响，例如它们不能激活补体，然而它们保留交联抗原的能力。进一步，已经证实，含有一条重链和一条轻链的抗体半分子在体内不稳定和/或体内半衰期降低。CH3区中的缺失或CH3区的缺失产生代谢迅速的半分子，从而不适于大多数的治疗目的。因此，需要有一种简单程序来产生适用于如下所述的治疗应用的稳定的单价抗体在所述治疗应用中，阻断抗原介导活性需要单价抗体的结合(不存在交联)。发明概要本发明提供了用于产生单价抗体的方法，所述方法包括A)i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码Ig之恒定d区的核苷酸序列，其中编码选定的抗原特异性抗体之VL区的所述核苦酸序列和编码Ig之Ct区的所述核苷酸序列可操作地连接，并且其中，在IgGl亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列经过修饰，使得所述Cl区不含有任何如下所述的氨基酸当存在多克隆人IgG时或者施用于动物或人类时，所述氨基酸能够与其它包含与该Ct区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价键；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人Ig之恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，使得相应于下列区域4交链区，以及如Ig亚型所要求的，Ch区的其它区域，如Ch3区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与人IgCH区相同的氨基酸序列的肽形成二碌a建或者共价或稳定非共价的重链间键，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苦酸序列和该编码所述Ig之CH区的核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。在该方法的一个实施方案中，人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。B)进一步，提供一种方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl,其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)被Gln(Q)替换；239位的Asp(D)被Glu(E)替换；292位的Lys(K)被Arg(R)替换；302位的Gin(Q)被Glu(E)替换；和328位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据B)的方法，其中238位的Arg(R)被Gln(Q)替换。根据B)的方法，其中238位的Arg(R)被Gin(Q)替换，且328位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据B)的方法，其中发生了全部5种替换。C)根据A)或B)的方法，其中人Ig是IgGl，并且CL区是具有如SEQIDNO:18所示之氨基酸序列的k轻链Cl，其中CL区经过修饰而使得106位的末端半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。D)根据A)或B)的方法，其中人Ig是IgGl,并且CL区是具有如SEQIDNO:17所示之氨基酸序列的入轻链CL，其中CL区经过修饰而使得104位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。F)根据A)或B),C)或D)的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl，其中CH1区经过修饰而使得14位的Ser(S)被半胱氨酸残基替换。G)根据A)的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:20所示之氨基酸CH区的IgG2，其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)被Gin(Q)替换；276位的Met(M)被Val(V)替换；288位的Lys(K)被Arg(R)替换；298位的Gin(Q)被Glu(E)替换；和324位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据G)的方法，其中234位的Arg(R)被Gin(Q)替换。根据G)的方法，其中其中234位的Arg(R)被Gin(Q)替换；324位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据G)的方法，其中发生了全部5种替换。H)根据A)的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:21所示之氨基酸CH区的IgG3，其中CH3区经过修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)被Gln(Q)替换；314位的Ser(S)被Asn(N)替换；322位的Asn(N)被Lys(K)替换；327位的Met(M)被Val(V)替换；339位的Lys(K)被Arg(R)替换；349位的Gin(Q)被Glu(E)替换；352位的lie(I)被Val(V)替换；365位的Arg(R)被His(H)替换；366位的Phe(F)被Tyr(Y)替换；和375位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据H)的方法，其中285位的Arg(R)被Gin(Q)替换。根据H)的方法，其中285位的Arg(R)被Gin(Q)替换；375位的Pro(P)被Leu(L)替换。根据H)的方法，其中发生了全部IO种替换。本发明还提供了用于产生单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苦酸序列和编码Ig之恒定(QJ区的核酸序列，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核香酸序列和该编码Ig之CL区的核酸序列可操作地连接在一起；ii)提供编码所述单价抗体之重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人类IgG4之CH区的核酸序列，其中编码重链的核酸序列经过修饰，使得相应于重链铰链区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基所述氨基酸残基能够参与同其它包含与人IgG4恒定(ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核酸和该编码IgG4之CH区的核酸可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞内共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。本发明还提供了通过使用根据本发明的方法获得的单价抗体。本发明还提供了包含轻链和重链的单价抗体，其中a)所述轻链包括选定的抗原特异性抗体可变(VO区的氨基酸序列和Ig之恒定(QJ区的氨基酸序列，和b)所述重链包括选定的抗原特异性抗体之可变(Va)区的氨基酸序列和人Ig4之恒定(Ch)区的氨基酸序列，其中恒定(Ch)区的氨基酸序列经够参与同其它包含与人Ig4之恒定(Ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键。本发明还提供了用于制备根据本发明的单价抗体的方法，该方法包括如下步骤a)培养含有编码所述单价抗体的核酸的宿主细胞；和b)从宿主细胞培养物中回收单价抗体。本发明还提供了含有编码IgG4之CH区的核酸序列的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过》务饰，vt人而^f吏相应于所述CH区中4交链区的区域不含有任何能够参与同包含与所述Ch区的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽形成二疏键的氨基酸残基；或者与其互补的序列。本发明还提供了用于制备根据本发明的单价抗体的方法，包括培养宿主细胞，所述宿主细胞包括根据本发明的核酸构建体的宿主细胞，并且如果所述核酸构建体不编码所述抗体的轻链，还包括含有编码所述抗体轻链的核酸序列的核酸构建体，从而使多肽表达，并从细胞培养物中回收单价抗体。本发明还提供了根据本发明的核酸构建体用于产生根据本发明的单价抗体的用途。本发明还提供了含有根据本发明的核酸的宿主细胞。本发明还提供了制备根据本发明的单价抗体的方法，包括培养根据本发明的宿主细胞，该宿主细胞含有编码所述抗体之轻链的核酸序列，从而使多肽表达，并从细胞培养物中回收单价抗体。体的用途。本发明还提供了免疫偶联物，其包含与治疗性模块(therapeuticmoiety)偶联的根据本发明的单价抗体。本发明还提供了用作药物的根据本发明的单价抗体。本发明还提供了根据本发明的单价抗体作为药物的用途。本发明还提供了根据本发明的抗体在制备用于治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症病症、变应性病症(哮喘)和/或血管新生病症的药物组合物中的用途，其中抗体特异地与给定的靶标或輩巴表位结合，该抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。与所述靶标或耙表位的结合对治疗所述疾病有效。本发明还提供了使用根据本发明的抗体制备用于治疗疾病或病症的药物组合物，该疾病或病症可通过施用针对特定耙标的抗体得到治疗，其中免疫系统介导的活性的参与对于实现抗体施用效果不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。组合物中的用途，该疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化可以形成不利的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。本发明还提供了根据本发明的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。本发明还提供了用于抑制罹患疾病或病症的受试者中抗原的方法，在所述疾病或病症中所述抗原的活性是不利的，该方法包括向受试者施用根据本发明的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或根据本发明的核酸构建体，从而使受试者体内该抗原的活性受到抑制。本发明还提供了用于治疗疾病或病症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据本发明的单价抗体、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的免疫偶联物、或者根据本发明的核酸构建体，借此对疾病或病症进4亍治疗。本发明还提供了药物组合物，其包含根据本发明的单价抗体以及一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本发明还提供了含有根据本发明的核酸构建体的转基因动物。附图简述图1:在非还原SDS-PAGE上对CD20特异抗体7D8-IgGl，7D8-IgG4和7D8-HG进行估计。泳道1:SeuBlueplus2预染标记物(InvitrogenBV,TheNetherlands),泳道2:内部对照，泳道3:7D8-IgGl，泳道4:7D8-IgG4，和泳道5:7D8-HG。图2:7D8-HG的还原CNBr/胰蛋白酶消化物在TIC时间39.3min洗脱的[M+3H]3十和[M+2H]2+离子(m/z分别为676.4和1014.l)的提取离子流色i普图(Extractedionchromatogram)。图3:由纳米喷雾-MS/MS分析获得的m/z信号的原始数据，其与7D8-HG的还原CNBr/胰蛋白酶消化物中覆盖220-238位氨基酸残基(22。VAPEFLGGPSVFLFPPKPK23s)的肽一致。图4A和B:由纳米喷雾-MS/MS分析获得的m/z信号的原始数据的判读，其与7D8-HG的还原CNBr/胰蛋白酶消化物中覆盖220-238位氨基酸残基(22。VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238)的肽一致。图5:根据对CD20转染细胞的结合对CD20特异抗体7D8-IgGl，7D8-IgG4和7D8-HG进行评估。图6:将CD20特异抗体7D8-IgGl，7D8-IgG4和7D8-HG包被在ELISA板上(浓度范围在x轴上表示)。对Clq结合(2pg/ml)进行估计。图7:A)用一定浓度范围的CD20特异抗体将Daudi细胞预染10分钟，然后添加NHS。CDC温育45分钟之后，将细胞在PI溶液中重悬。通过流式细胞仪测量细胞裂解(PI阳性细胞数)。数据显示PI阳性(死)细胞的平均萸光强度。B)为评价所测裂解物中补体的作用，向与10pgantistof温育的细胞添加热灭活血清(血清AT)。数据显示PI阳性(死)细胞的平均焚光强度。图8:在非还原SDS-PAGE上测试针对Betv1(Betvl-HG)的无铰链IgG4抗体。泳道1:SeuBlueplus2预染标记物(InvitrogenBV,TheNetherlands),泳道2:内标，泳道3:BetVl-HG，泳道4:IgGl对照。图9:Betvl-HG(抗-Betv1无铰链IgG4)的凝胶过滤。将含有无铰链rlgG4Betvl-HG的HEK细胞的条件培养基在Superdex200柱上分级。向柱施加总共1pg的Betvl-HG。在这些级分中，通过在Betv1结合试-验中温育每种级分10jal来测量Betv1特异IgG()。数据表达为放射标记的Betv1结合相对于总添加量的百分比。虚线表示纯化Betvl-IgG4(10ng)的洗脱，通过在HPLC上测量214nm吸收(A214nm)对其进行追踪。图10:用放射免疫测定检验Betvl-IgGl、Betvl-IgG4和Betvl-HG的结合。对1251-标记的Betvl与和ProteinGSepharose结合抗体的连续稀释物的结合进行4企测。图11:用放射免疫测定检验Betvl-IgGl、Betvl-IgG4和Betvl-HG使结合于Sepharose的Betv1与放射标记Betv1交联的能力。对1251-标记的Betvl与和Betv1Sepharose结合的抗体的连续稀释物的结合进行;险测。图12:每只小鼠静脉内给药100吗之后，7D8-HG与正常7D8-IgG4、完整7D8-IgGl、7D8-IgGl、F(ab，)2和7D8-IgGlFab片段的小鼠血浆浓度半对数作图的比较。图13:以剂量/浓度-时间曲线算出的曲线下面积(D/AUC)表示的血浆清除速率的对数作图。数据表示单只小鼠，并以ml.天"kg"表示。图14:剂量响应曲线，显示抗EGFrmAb2F8-HG对A431细胞中EGF诱导EGFr磷酸化的抑制，与2F8-IgG4和2F8-Fab片段进行比较。上图显示无血清培养基中的抑制曲线，中图和下图是分别向培养基中添加浓度为100fxg/ml和1000pg/ml的IVIG时的抑制。y-轴表示用抗-磷酸-酪氨酸mAb检测的磷酸化EGFr，并用时间-分辨焚光单位(resolvedfluorescenceunit)(TRF单位)表示。x-轴上，mAb浓度用pg/ml表示。数据点是4次重复的平均值和SEM。图15:时间-浓度的半对数图示。最初血浆浓度均为100pg/ml左右，与小鼠血浆室(plasmacompartment)内的初始分布一致。无4交《连IgG4变体的清除仅比正常IgG4略快。重要的是，无铰链变体的清除比具有相似的分子大小的F(ab，)2片段慢得多。这个实验表明，Fc部分对于在具有正常免疫系统的小鼠体内的血浆保留时间产生有利的影响，并且提示在内源IgG存在下，与新生儿Fc受体(FcRn)也有功能相互作用。图16:ELISA试验中，在浓度为100pg/ml的多克隆人IgG(IVIG)存在下，2F8-HG对EGFr蛋白包被的结合作用与2F8-IgG4，2F8-IgGl和2F8-IgGl的Fab片段对EGFr蛋白包被的结合作用的比较。图17:2F8-HG的ADCC诱导与2F8-IgGl和2F8-IgG4的ADCC诱导的比较。使用A431细胞作为靶细胞，以人类外周血单个核细胞作为效应细胞。图18:实施例中使用的引物序列。图19:实施例中使用的引物序列。图20:在补充了IVIG的SCID小鼠体内7D8变体的清除。图的上图显示了mAb7D8变体的浓度随随时间的半对数图，下图是总人IgG浓度。图21:7D8变体在FcRnV-小鼠和野生型小鼠体内的清除。附图显示了浓度随时间的半对数作图。初始血浆浓度均为100(ig/ml左右，这与小鼠血浆室内的初始分布一致。在模型中对无铰链IgG4变体(7D8-HG)、正常人IgG4(7D8-IgG4)和来自7D8IgGl的F(ab,)2片段(7D8-Gl画F(ab,)2)进行比较。图22:培养DU-145细胞，并用(A)cMet-Fab、cMet-Fab与IVIG、cMet-Fab与HGF、cMet画Fab与IVIG和HGF(B)cMet-HG、cMet-HG与IVIG、cMet國HG与HGF、cMet-HG与IVIG与HGF的连续稀释物进行温育。48h后，用显微镜对散射(scattering)进行双盲观察(由14人打分)，对平均分数士SEM进行作图。图23:培养DU-145细胞，并用10pg/ml的(A)cMet-Fab、cMet-Fab与IVIG、cMet-Fab与HGF、cMet-Fab与IVIG与HGF;(B)cMet-HG、cMet-HG与IVIG、cMet-HG与HGF、cMet-HG与IVIG与HGF进行温育。48h后，用显微镜对散射(scattering)进行双盲观察(由14人打分)。有和没有IVIG的cMet-Fab以及用IVIG预温育的cMet-HG显著抑制了HGF诱导的散射(scattering)。统计分析用假定中值3(最大散射(scattering))进行双尾Wilcoxon符号等级检验。图24:在4-20%Tris-HClCriterionPrecast凝胶上对从与下述物质温育后的A549细胞制备的提取物进行SDS-PAGE分离，并在硝酸纤维素膜上进行Western印迹cMet-HG(泳道1);cMet-HG与IVIG(泳道2);cMet-HG与HGF(泳道3);cMet-HG、IVIG与HGF(泳道4);cMet-IgGl(泳道5);cMet-IgGl与IVIG(泳道6)。将膜在4°C用抗-磷酸-Met(pYpYpY123012341235)-兔IgG(Abeam,ab5662)温育过夜。用TBST清洗后，用第二抗体——羊抗兔HRP，CellSignalling,7074在封闭试剂中在摇床上室温温育60分钟。将膜用TBST清洗6次。最后用鲁米诺增强终止溶液对条带进行显色，并在Lumiimager上进行分析。Western印迹显示一条代表磷酸-Met(pYpYpY123012341235)的169Kd条带。图25:向体外HIV-1中和测定添加HuMax-CD4或HuMax-CD4Fab片段的起始浓度。对每一个病毒构建体，通过四参数逻辑斯谛曲线拟合计算HuMax-CD4和HuMax-CD4Fab片^殳抑制的IC50值，并标示出来。图26:用HuMax-CD4或IgG对照腹腔内处理或无处理，并用HIV-1感染的单个PBMC重建小鼠的％人T细胞、％鼠细胞和％CD4和％CD8细胞、以及CD4/CD8比值。图27:以萤光素酶活性(三次重复测量平均值)量度的HuMax-CD4和HuMax-CD4的Fab片段对数种HIV-1病毒抹对CD4-CCR5或CD4-CXCR4阳性细胞的感染的抑制曲线。图28:用HuMax-CD4腹腔内处理或无处理，并用HIV-1感染的单个PBMC重建小鼠随时间的血浆HuMax-CD4浓度。图29:用HuMax-CD4或IgG对照腹腔内处理或无处理，并用HIV-1感染的单个PBMC重建小鼠随时间测得的HIV-1RNA拷贝数。序列表的详细描述SEQIDNo:1:人Ig之dk的核酸序列SEQIDNo:2:人Ig之k轻链的氨基酸序列SEQIDNo:3:人Ig之CLi的核酸序列SEQIDNo:4:人Ig之人轻链的氨基酸序列SEQIDNo:5:HuMab-7D8之VH区的核酸序列SEQIDNo:6:HuMab-7D8之VH区的氨基酸序列SEQIDNo:7:小鼠抗-Betv-l之VH区的核酸序列SEQIDNo:8:小鼠抗-Betv-l之VH区的氨基酸序列SEQIDNo:9:HuMab-7D8之区的核酸序列SEQIDNo:10:HuMab-7D8之VL区的氨基酸序列SEQIDNo:l1:小鼠抗-Betv-l之VL区的核酸序列SEQIDNo:12:小鼠抗-Betv-l之VL区的氨基酸序列SEQIDNo:13:人IgG4野生型CH区的核酸序列SEQIDNo:14:人IgG4野生型CH区的氨基酸序列SEQIDNo:15:在714和722位发生突变的人IgG4CH区(SEQIDNo:13)的核酸序列SEQIDNo:16:通过表达SEQIDNo:15所示的核酸序列而产生的人IgG4Ch区的氛基酸序列SEQIDNO:17:人类X链恒定区的氨基酸序歹U(登录号S25751)SEQIDNO:18:人类K链恒定区的氨基酸序歹'J(登录号P01834)SEQIDNO:19:IgGl恒定区的氨基酸序列(登录号P01857)SEQIDNO:20:IgG2恒定区的氨基酸序歹'J(登录号P01859)SEQIDNO:21:IgG3恒定区的氨基酸序歹'J(登录号A23511)发明详细描述为了使本发明更容易理解，首先对一些术语进行定义。在整个详细说明书中提出了额外的定义。术语"抗体"在这里是包括整个抗体分子、抗原结合片段、单价抗体、以及其单条链。抗体分子属于被称作免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基本构件(basicbuildingblock),免疫球蛋白折叠或结构域，以各种形式在免疫系统和其它生物识别系统的许多分子中被使用。天然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型重链之间的二硫键联结数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条轻链由轻链可变区(这里缩写为vo和轻链恒定区(这里缩写QJ构成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成，其中重链恒定区由三个结构域CHl,CH2和CH3及铰链区构成。轻链恒定区与重链第一恒定区(CHl)对准，轻链可变区与重链可变区对准，形成所谓的"Fab片段"。重链的CH1和CH2彼此被过所谓的铰链区隔开，该铰链区允许抗体分子的Fab"臂"旋转一定程度。铰链区通常包含一个或多个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与抗体分子内另一重链的铰链区的半胱氨酸形成二硫桥。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其中宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归为不同的类型。至少有五(5)种主要的免疫球蛋白类型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4;IgAl和lgA2。相应于不同的免疫球蛋白类型的重链恒定区的基因分别称作alpha(a)，delta(S),epsilon(e),gamma(力和mu(n)。免疫球蛋白亚型由不同的基因，例如yl，y2，Y3和y4编码。根据其恒定区的氨基酸序列，抗体轻链的基因可归为两种迥然不同类型一称作kappa(k)和lambda(X)—中的一种。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是人们熟知的。人类群体中存在迥异的同种异型(allotype)免疫球蛋白，例如IgGl重链的Glm(a)，Glm(x)，Glm(f)和Glm(z),k轻链的Kml,Kml,2和Km3。这些同种异型的区别在于其编码恒定区的区域内迥异的氨基酸。术语"抗体"还包括抗体的"衍生物"，其中一个或多个氨基酸残基被衍生化，例如酰化或糖基化，但不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性。在本发明的语境中，单价抗体的衍生物可以是，例如，如下的单价抗体其中单价抗体的一个或多个氨基酸残基被化学修饰(例如通过烷基化、酰化、成酯、或成酰胺)或者与一个或多个非氨基酸有机和/或无机原子或分子取代基结合(例如聚乙二醇(PEG)基团、亲脂性取代基(其可以任选地通过间隔残基或间隔基团如|3-丙氨酸、，氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等与肽的氨基酸序列连接)、荧光团、生物素、放射性核素等)，并且/或者含有非必需、非天然存在和/或非L氨基酸残基，除非在上下文中另有说明或与上下文矛盾(然而，还应当认识到，这些衍生物其本身可以认为是本发明的独立特征，将这些分子包含在肽的含义中是为了便于说明本发明，而不是暗示在棵肽与这些衍生物之间有任何类型的等同性)。这些氨基酸残基的非限制性实例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、p-丙氨酸、p-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟基赖氨酸、别羟赖氨酸(allohydroxylysine)、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素(desmosine)、别异亮氨酸、N-曱基甘氨酸、N-曱基异亮氨酸、6-N-曱基赖氨酸、N-曱基缬氨酸、戊氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸和statine卣化氨基酸(statinehalogenatedaminoacids)。抗体的体内半衰期可通过例如修饰Ig恒定区或类Ig恒定区的清道夫受体表位(salvagereceptorepitope)，使分子不含有完整的CH2结构域或完整的IgFc区，而加以提高，参考US6121022和US6194551。体内半衰期可通过在Fc区内进行突变而进一步提高，例如在相应于完整抗体分子252位的位置用苏氨酸替换亮氨酸，在相应于完整分子254位的位置用苏氨酸替换丝氨酸，或者在相应于完整分子256位的位置用苏氨酸替换苯丙氨酸，参考US6277375。进一步，对于抗体，特别是Fab或其他片段，可以加以聚乙二醇化以提高半衰期。这可以通过本领域已知的聚乙二醇化反应来实现，如下列文献所述FocusonGrowthFactors2，4-10(1992)，EP154316和EP401384。突变可以沿着整个或部分的抗体编码序列通过例如饱和诱变随机地引入，并且对所得的修饰抗体进行结合活性和/或其他特性的筛选。术语"抗体衍生物，，是指抗体的任意修饰形式，例如使抗体与另一种试剂或抗体偶联。如在这里使用的，术语"抗体"，例如单价抗体的"抗原结合部分"或"抗原结合结构域"是指抗体具有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已经显示，全长抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的"抗原结合部分"包含的结合片#殳实例包括(i)Fab或Fab，片段，其是由VL,VH,Cl和CHi结构域构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是由两条通过在铰链区的二硫桥连接的Fab，片段的二价片段；(iii)Fd片段，其是基本上由VH和Cm结构域构成的片段；(iv)Fv片段，其是基本上由抗体单臂的V^和VH结构域构成的片段；(v)dAb片段(Wardetal.,NatureMi,544-546(1989)),其基本上由VH结构域构成；(vi)单独的互补决定区(CDR)，和(vii)两个或多个单独的CDR的组合，它们可以任意地通过人工接头相连。此外，尽管Fv片段的两个结构域Vt和VH由分别的基因编码，但可以用重组方法通过人工接头将它们连接在一起，通过该接头，可以将它们制成单条蛋白链，其中Vl与VH区配对形成单价分子(称作单链抗体或单链Fv(scFv)，见例如Birdetal.,Science■，423-426(1988)和Hustonetal.,PNASUSA5879-5883(1988))。除非另外iJL明或者在上下文中明确指出，这种单链抗体包含在术语抗体的范围内。另一个实例是抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，包含与如下各项融合的抗原结合结构域多肽(i)免疫球蛋白铰链区多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。抗原结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区、scFv或任何能够特异结合抗原的其它多肽。这种结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US2003/0133939中有进一步公开。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，筛选有用片段的方式与完整抗体相同。这里使用的术语"抗体半分子"的意思是如上所述的抗体分子，但包含不超过一条轻链和不超过一条重链，其在水溶液中以所述单条轻链和单条重链的异源二聚体形式存在。所述抗体在本质上是单价的，因为只存在一个抗原结合部分。在核苷酸或氨基酸序列的语境下，术语"保守序列修饰"是不显著影响或改变由该核苷酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体之结合特性的相应核苦酸或氨基酸修饰。这种保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替换、添加和删除。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入到序列内，例如定点诱变和PCR介导诱变(PCR-mediatedmutagenesis)。保守氨基酸替换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸)，具有P-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)。因此，可以将人源抗体中预计对某抗原特异性而言非必要的氨基酸残基用属于相同侧链家族的另一种氨基酸残基加以替换。如本文中使用的，如果抗体是用人免疫球蛋白序列从系统中获得的，例如通过对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫处理或者筛选人免疫球蛋白基因文库，并且其中选定的人源抗体的可变基因编码区(不包括重链或轻链CDR3)与胚系免疫球蛋白基因在核酸序列上至少90%,更优选地至少95%，甚至更优选至少96°/。、97%、98%或99%相同，则称人源抗体"源于，，该胚系序歹ij(germlines叫uence)。典型地，源于特定人胚系序列的人源抗体与该胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的差异不超过10个氨基酸，更优选地不超过5个，甚至更优选地不超过4、3、2或1个氨基酸。术语"表位"是指能够特异结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链构成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特殊的电荷特征。构象和非构象表位(nonconformationalepitope)的区别在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合消失。用于本文时，术语"不连续表位"是指蛋白抗原上的构象表位，其由蛋白质一级序列中的至少两个分离的区域形成。对于核苦酸和氨基酸序列，术语"同源性"是指当通过合适地插入或删除实现最佳比对时，两条核酸或氨基酸序列之间同一性的程度。或者，当DNA片段可以在选择性杂交条件下与该链的互补体杂交时，则存在实质的同源性。两条序列间的百分比同一性是序列共有相同位置数的函数(也就是，％同源性-相同位置数/总位置数x100)，并考虑为实现两条序列最佳比对而引入的缺口的数目、每个缺口的长度。序列的比较和两条序列间百分比同一性的确定可以用数学算法实现，如下文所述。两条核苷酸序列间的百分比同一性可以用GCG软件包(可以在http:〃www.gcg.com获得)中的GAP程序确定使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。两条核苷酸或氨基酸序列间的百分比同一性还可以用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4，11-17(1988))确定，其收纳在ALIGN程序(version2.0)中，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12，缺口罚分4。此外，两条氨基酸序列间的百分比同一性可以用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.4§，444_453(1W0))算法确定，其收纳在GCG软件包(可以在http:〃www.gcg.com获得)的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重16、14、12、10、8、6或4，长度4又重1、2、3、4、5或6。术语"宿主细胞"(或"重组宿主细胞")，用于本文时，是指引入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅表示特殊的对象细胞，还指这些细胞的后代。因为在连续传代中可能由于突变或环境影响而出现一些修饰，所以这些后代实际上可能不与母细胞相同，但仍然包含在这里所使用的术语"宿主细胞"的范围内。重组细胞包括，例如，转染瘤细胞(transfectomas),如转染的CHO细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。单数形式的术语"宿主"还表示特定种类宿主细胞的培养物。术语"人源抗体"，用于本文时，意图包括具有源于人胚系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人源抗体可以包括非由人胚系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过随机或体外定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语"人源抗体"，用于本文时，不意图包括如下的抗体，其中CDR1或CDR2序列源自于其它哺乳动物((例如小鼠)的胚系，或者源自于来自其他物种(例如小鼠)的抗体的CDR3区嫁接到人框架序列内。术语"KD"(M),用于本文时，是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。术语"单克隆抗体，，或"单克隆抗体组合物"，用于本文时，是指具有单一分子构成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示对特殊表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语"人单克隆抗体，，是指具有来自于人胚系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的显示单一结合特异性的抗体。术语"单价抗体"在本文中的意思是，抗体分子能够与抗原的单个分子结合，因而不能交联抗原。术语"核酸"、"核酸构建体"或"核酸分子"，用于本文时，意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链。术语"分离的核酸"、"分离的核酸构建体"或"分离的核酸分子"，在本文中用来指编码抗体的核酸或其片段时，是指这样的核酸分子，其中编码完整抗体的核苷酸序列或其片段不含有其他核苷酸序列。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl成带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域众所周知的技术加以提纯，去除了其他细胞组分或其他杂质(例如其他细胞核酸或蛋白质)后，可以将核酸分离或者使其基本上纯。见F.Ausubel等，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingand>^ileyInterscience,NewYork(1987)。当使核酸与另一条核酸序列处于功能关系中时，核酸是"可操作连接"的。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它们与编码序列可操作连接。对于开关序列(switchs叫uence)，可操作连接是指该序列能够影响开关重组(switchrecombination)。当提到"生理条件"时，它的意思是指生物体体内存在的条件，或者通过完全或部分模拟所述体内条件而再现的体内条件，例如具有与血液相当的渗透压值的水溶液。术语"重组人源抗体"，用于本文时，包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人源抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体动物(例如小鼠)或者从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化表达抗体的宿主细胞(例如转染瘤)分离的抗体，(c)从重组体、组合人源抗体文库(combinatorialhumanantibodylibrary)分离的抗体，和(d)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的方法而制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人源抗体具有源于人类胚系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。可对这些重组人源抗体进行体外突变(或者，当使用人Ig序列转基因动物时，进行体内体细胞突变)，使得重組抗体Vh和Vl区的氛基酸序列是这样的序列它们源于或者关联于人胚系Vh和V^序列，但在天然条件下可能不存在于体内的人抗体胚系库中。用于本文时，"特异结合"是指抗体或其抗原结合片段与预定的抗原结合。典型地，抗体的结合亲和力，例如在BIAcore上用磺酰等离子体共振(sulfonplasmonresonance)测量时的结合亲和力或者作为基于FACS或ELISA中ICso值的表观亲和力，其相应的Ko为大约10々M或者更小，例如大约1(^M或者更小，例如大约10力M或者更小，大约10"GM或者更小，或者大约10"'M或者更小，并且与预定抗原的结合亲和力的相应KD,比与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异抗原(例如BSA、酪蛋白)的结合亲和力的相应Kd低至少IO倍，例如至少低100倍，例如至少低1000倍，例如至少低10,000倍，例如至少低IOO，OOO倍。亲和力低的多少取决于抗原结合肽的Ko，因此当抗原结合肽的KD非常低(也就是说，抗原结合肽具有高度特异性)时，对该抗原的亲和力低于对非特异性抗原可为至少IO,OOO倍。用于本文时，术语"受试者"包括任何人或非人类动物。术语"非人类动物，，包括所有脊推动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、山羊、狗、牛、小鼠、大鼠、家兔、鸡、两栖动物、爬行动物等。当提到"治疗，，有效剂量或者"治疗有效量"时，应当理解为指可以在一定时间周期内有效实现期望治疗结果的剂量或量。本发明单价抗体的治疗有效剂量当然随着抗体的靶标而变化，并可随如下因素改变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及单价抗体在个体中引起期望应答的能力。治疗有效剂量或量还可以是单价抗体的有利治疗效果超出其毒性或有害效果的多少。术语"转基因、非人类动物"是指这样的非人类动物，其基因组含有一个或多个人类重链和/或轻链转基因或转染色体(transchromosome)(整合或非整合到动物天然基因组DNA中)，并且能够表达人类抗体。例如，转基因小鼠可以具有人类轻链转基因和人类重链转基因或人类重链转染色体，从而在用抗原和/或表达抗原的细胞免疫小鼠时，小鼠可产生人源抗体。人类重链转基因可以整合到小鼠的染色体DNA中，例如转基因HuMAb小鼠(如HCo7或HCo12小鼠)；或者人类重链转基因可以保持在染色体外，例如在WO02/43478中描述的转染色体KM小鼠中。这样的转基因和转染色体小鼠能够通过V-D-J重组和同种型转换而产生针对给定抗体的多个类型和同种型的单价抗体(例如IgM、IgE、IgA和/或IgE)。术语"转染瘤，，(transfectoma),用于本文时，包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、植物细胞，或真菌，包括酵母细胞。术语"治疗"的意思是减轻、改善或根除(治愈)症状或疾病状态。术语"抗体的价"的意思是抗体可以与之反应的抗原决定蔟(antigenicdeterminate)的最大数目。例如，IgG抗体含有2个Fab区，并且能够结合两个抗原分子或者在同一个粒子上的两个相同的位点，因此具有二价。用于本文时，术语"载体"意思是指能够转运与其连接的另一种核酸并诱导其复制的核酸分子。一种载体类型是"质粒"，其是指可连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA或RNA片段可以连接进入病毒基因组。某些载体能够在导入了该载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)能够在引入到宿主细胞内时整合到宿主细胞的基因组中，藉此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这种载体在这里称作"重组表达载体"(或者简称作"表达载体")。大体上，重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最经常使用的载体形式。然而，本发明也意图包括起等同作用的其他类型的表达载体，例如病毒栽体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)。本文中有若干处提到了水溶液或生理条件。当提到"水溶液"时，它表示任何化学物质的水溶液，例如盐溶液，如磷酸盐緩冲盐水(PBS)。水溶液可以依目的设计并含有若千不同的化学物质，或者可以是自然体液，例如血液。存在5种不同类型的免疫球蛋白，也就是IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，这些类型可通过其C区加以区分。在IgG类抗体中，存在多种亚类，即人IgGl、IgG2、IgG3和lgG4(Jefferis,R.1990.MolecularstructureofhumanIgGsubclasses.InTTze/zw脂w/gGst^c/osses.F.Shakib,ed.PergamonPress,Oxford,p.15)。每条IgG重链由不同基因片段或外显子编码的、结构相关的肽序列(也就是可变和恒定区结构域)组成。連接Ch1和CH2结构域的铰链区由单独的外显子编码。四种IgG亚类重链的每一种都可以和k或X轻链相组合而表达，生成由两条相同的重链和两条相同的k或X轻链构成的基本上对称的分子。重链内部的比较定义了CH1、Ch2和Ch3同源区。比较4个亚类中每一个的可能同源区可显示>95%的序列同一性(Jefferis，R.1990.F.Shakib，ed.PergamonPress,Oxford,p.15)。CH1和CH2结构域之间的序列称作铰链区，因为它使得分子具有柔性。CH3结构域配对，并且非共价相互作用足以使IgG分子在温和条件下重链间二硫桥被还原之后仍保持其结构完整性。CH3结构域配对紧密，与Fab中的配对相似，在两个结构域之间形成接近精确的二分体(dyad)(Saphire,etal.，2002.JMo/5/o/37S^)。而CH2结构域与之形成对照，(^2结构域之间的关联不紧密，它们的接触主要由两个连接于Asn297残基的糖链介导(Saphire,etal.,2002.JMo/所o/3/义力)。因此，典型的IgG结构，其中两条重-轻链异源二聚体相连，通过铰链44区的重链间二硫桥和CH3结构域的非共价相互作用得以保持。已证明，CH3结构域内的相互作用在IgGl中是重要的。Ig半分子具有由仅一条轻链和仅一条重链组成的二聚体构型，有报道称Ig半分子是人类和鼠类浆细胞瘤中稀有缺失的结果。一些罹患髓外软组织浆细胞瘤、Waldenstr6m巨球蛋白血症、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤的患者将IgG半分子分泌到尿中。还发现半分子存在于他们的血清中。对于这些半分子生物化学性质的研究显示，它们由IgGl分子组成，其中重链CHl、铰链和CH2区似乎正常，而缺失发现位于CH3区(已见于本专利申请；第3页)。在本专利申请中，我们显示，除去IgG4的铰链区导致如下单价抗体的形成，其中两个重-轻链异源二聚体之间的连接丧失或减少。因此，其他IgG亚家族铰链区二硫桥的改变(独自地或者与CH3结构域相互作用的突变相结合)也会导致这些亚家族单抗体的形成。按照本领域技术人员的能力，利用熟悉的Ig亚家族结构知识以及本发明提供的知识，很容易选择并对选定的氨基酸进行修饰，从而防止轻链的相互作用。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种单价抗体，其包含轻链和重链，其中a)所述轻链包含选定的抗原特异抗体的可变(VO区氨基酸序列和Ig的恒定(CO区氨基酸序列，和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体的可交(Vh)区氨基酸序列和人Ig的恒定(Ch)区氛基酸序列，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内不存在任何能够参与和其它包含与人Ig恒定(Ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键的氨基酸残基，c)所述重链或轻链，根据Ig同种型，通过点突变或删除修饰除去或改变任何能够导致抗体联结的氨基酸，即半胱氨酸，或者通过点突变或删除形式的修饰使得重链恒定区具有与IgG4重链恒定区相似的形成二硫^:的能力或使分子与其对应物共价连接形成二聚体的能力。本发明单价抗体轻链的氨基酸序列包含选定的抗原特异性抗体可变(Vh)区的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定(CO区的氨基酸序列。根据本发明，单价抗体Vl区的氨基酸序列对于所述抗体分子受本发明关注的分子性质一一特别是单价抗体形成异源四聚体("正常，，抗体)能力的阙如——没有贡献，因此本发明不限于任何具体的v^区氨基酸序列。VL区的氨基酸序列可以源于任何按照本领域技术人员已知的许多方法中的任意一种产生的抗原特异性抗体的氨基酸序列。根据本发明，单价抗体VH区的氨基酸序列对所述抗体分子受本发明关注的分子性质一一特别是单价抗体形成异源四聚体("正常，，抗体)能力的阙如一一没有贡献，因此本发明不限于任何具体的Vh区氛基酸序列。Vh区的氨基酸序列可以源于任何按照本领域技术人员已知的许多方法中的任意一种产生的抗原特异性抗体的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的单价抗体不与合成抗原(Tyr，Glu),Ala，Lys结合(Pi腿setal.1985，MolecularImmunolog,vol22，4;pp.455-461)。在另一个实施方案中，本发明的抗体是人源抗体。在另一个实施方案中，本发明的抗体以人源抗体为基础。在一个实施方案中，本发明涉及一种单价抗体，其包含轻链和重链，其中a)所述轻链包含选定的抗原特异性抗体的可变(VO区氨基酸序列和Ig的恒定(QJ区氨基酸序列，和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体的可交(Vh)区氨基酸序列和人IgG4的恒定(Ca)区氨基酸序列，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内不存在任何能够参与和其它包含与人IgG4恒定(Ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二石克《建的氨基酸残基。本发明单价抗体的轻链氨基酸序列包含选定的抗原特异性抗体的可变(VO区氨基酸序列和免疫球蛋白的恒定(QJ区氨基酸序列。根据本发明，单价抗体Vl区的氨基酸序列对于所述抗体分子受本发明关注的分子性质一一特别是单价抗体形成异源四聚体("正常，，抗体)能力的阙如——没有贡献，因此本发明不限于任何具体的V^区氨基酸序列。VL区的氨基酸序列可以源于任何按照本领域技术人员已知的许多方法中的任意一种产生的抗原特异性抗体的氨基酸序列。根据本发明，单价抗体VH区的氨基酸序列对所述抗体分子受本发明关注的分子性质一一特别是单价抗体形成异源四聚体("正常，，抗体)能力的阙如一一没有贡献，因此本发明不限于任何具体的Vh区氛基酸序列。Vh区的氨基酸序列可以源于任何按照本领域技术人员已知的许多方法中的任意一种产生的抗原特异性抗体的氨基酸序列。本发明提供了如下抗体的实例1)含有如下Vh区的羊价抗体，拔Vh区包含HuMab-7D8之VH区的氨基酸序歹'j(标示为SEQIDNo:6)和编码IgG4无铰链CH的氨基酸序歹'j(标示为SEQIDNo:16),其中所述序列可#:作地连接在一起；和2)含有如下VH区的单价抗体该VH区包含的鼠抗Betv-l之VH区的氨基酸序列(标示为SEQIDNo:8)和编码IgG4无铰链CH的氨基酸序列(标示为SEQIDNo:16),其中所述序列可l喿作地连接在一起。在一个实施方案中，本发明抗体分子的Vl和Vh区源于相同的抗原特异性抗体。根据本发明，抗体分子轻链的Cl区序列可以源于免疫球蛋白的区序列。在一个实施方案中，q区是人IgG之k轻链的恒定区。在一个实施方案中，Q区包含SEQIDNo:2的氨基酸序列。在一个实施方案中，CL区是人IgG之X轻链的恒定区。在一个实施方案中，Cl区包含SEQIDNo:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明单价抗体的轻链和重链通过一个或多二硫键相互连接。显然，对于这些二硫4建而言，二硫^:的任一结合配偶(bindingpartner)都不存在于相应于铰链区的区域内。在一个实施方案中，轻链和重链通过酰胺键相互连接，例如在单链Fv中所见到的。铰链区是抗体位于重链恒定区CH1和CH2区之间的区域。铰链区的范围由编码铰链区的单独外显子决定。铰链区通常参与保障抗体的四条肽链通过在其中一条重链铰链区内的一个或多个半胱氨酸残基与另一条重链铰链区内的一个或多个半胱氨酸残基之间形成二硫4建或桥正确组装成传统的四聚体形式。因此，使得铰链区的氨基酸残基均不能参与二硫键形成的铰链区修饰，可以包括例如删除和/或替换未修饰铰链区内存在的半胱氨酸残基。为本说明书的目的，"相应于铰链区的区域"应当理解为抗体重链CHl和Qi2区之间的区域。在本发明的上下文中，这种区域也可以不包含任何氨基酸残基，即对应于铰链区的缺失，从而CH1和Ch2区相互连接而中间不插入任何氨基酸残基。这种区域还可以包括仅一个或少数几个氨基酸残基，这些残基不需要是原始铰链区N或C端的氨基酸残基。二硫键是某些蛋白(例如抗体)的众所周知的特征，其中一个半胱氨酸与蛋白质的同一链(链内二硫键)或其它链(链间二硫键)上的半胱氨酸残基形成二硫键。在给定蛋白质内可以有数个这样的二硫键。对于抗体，二硫键(包括链内和链间)的形成是完整成熟野生型抗体的正确组装的必不可少的部分，而且，抗体高度有序和规则的外观以及抗体的稳定性通常至少在一定程度上是二硫键作用的结果。在本发明的单价抗体中，铰链区的氨基酸均不能参与形成这种二石克键。铰链区氨基酸序列的修饰可以使用重组技术在DNA水平上进行，通过对核酸的删除和/或替换实现表达蛋白中氨基酸的删除和/或替换，这在本领域是众所周知的，在本文中另有描述，并且在实施例中有举例说明。也可以对由未修饰的核酸表达的抗体进行修饰，例如通过将铰链区中能够形成二碌L键的氨基酸残基衍生化。可以如本领域已知的那样使半胱氨酸残基衍生化从而阻止该残基与其他半胱氨酸残基形成二硫键。还可以通过使用除半胱氨酸之外的氨基酸(例如天然存在或非天然存在的氨基酸，如衍生化的半胱氨酸)代替半胱氨酸来合成制备抗体链，而进行修饰。本发明的IgG4单价抗体还可以是IgG4变体。这类变体抗体是这样的多个CDR)中)一个或多个合适氨基酸残基的改变，即替换、删除、插入或末端序列添加，而与IgG4抗体不同。通常，氨基酸序列改变，例如保守替换改变，最好不实质性地改变母序列的结构特征(例如，替换上的氨基酸不应倾向于破坏作为母序列功能特征的二级结构)，而是关联着有利的性质，例如改变抗体的功能或药物动力学性质，例如延长半衰期，改变免疫原性，提供与其他分子的共价或非共价结合位点，降低蛋白水解倾向，降低氧化倾向，或者改变糖基化模式。抗体的这些氨基酸序列变体可以按照上述对相应于铰链区的区域的修饰来实现。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰从而使相应于铰链区的区域中的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其他氨基酸残基替换。因此，可以对本发明抗体的铰链区除正常半胱氨酸残基所在位置之外的其他位置进行修饰，正如在上文关于本发明IgG4变体抗体中描述的。这些修饰可以按照上文或者任何本领域已知的其他方法进行。在本发明的上下文中，可以将相应于铰链区的区域的半胱氨酸残基替换为除半胱氨酸之外的天然存在或非天然存在氨基酸残基和/或非L-氨基酸残基，或者这些氨基酸残基的衍生物，包括不能参与二硫键形成的半胱氨酸残基衍生物。在一个实施方案中，重链的氨基酸残基经过修饰，从而使重链包括这样的ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列之第106和109位氨基酸残基的氨基酸被删除。SEQIDNo:14显示人IgG4野生型CH区的氨基酸序列，并且106和109位是两个半胱氨酸残基的位置。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这祥的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列之第106-109位氨基酸残基的氨基酸残基。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列之氨基酸残基99-110的氨基酸残基。在一个实施方案中，重链包含SEQIDNo:16的氨基酸序列。SEQIDNo:16是通过表达包含序列SEQIDNo:15的核酸而产生的人IgG4CH区的氨基酸序列，SEQIDNo:15是编码人IgG4(SEQIDNo:13)之CH区的核酸序列，在位点714和722具有替换突变。该核酸序列的剪接供体位点中的这些替换具有这样的效果涉及铰链区编码外显子的剪接将不能正确进行，结果产生不含该外显子编码的氨基酸残基的重链。在一个实施方案中，ch区的整个铰链区被删除。当重链中不存在编码CH区铰链区的外显子编码的氨基酸时即是如此。对于如SEQIDNo:14所示的IgG4而言，这相应于具有SEQIDNo:16氨基酸序列的Ch区。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被不同于半胱氨酸残基的氨基酸残基替换。在一个实施方案中，重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的CH区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基之一被替换为不同于半胱氨酸残基的氨基酸残基，而相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基中的另一个氨基酸残基被删除。在进一步的实施方案中，相应于氨基酸残基106的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，而相应于氨基酸残基109的氨基酸残基被删除。在另一个进一步的实施方案中，相应于氨基酸残基106的氨基酸残基被删除，而相应于氨基酸残基109的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以通过包括在细胞表达系统中体外重组表达抗体的方法获得，如本文其他地方描述的。在一个实施方案中，该方法包括i)提供编码所述抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VL区的核苷酸序列和编码IgGCL区的核苷酸序列；ii)提供编码所述抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苷酸序列和编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何能够参与二石克键形成的氨基酸残基；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达所述核酸构建体，来产生包含(i)的核酸构建体编码的轻链和(ii)的核酸构建体编码的重链的所述单价抗体。在一个实施方案中，通过SCID小鼠的药物动力学研究测量，本发明的单价抗体在以4mg/kg的剂量体内给药时，可维持血浆浓度在10pg/ml以上超过7天(例如实施例32所示)。本发明单价抗体的清除率可以用本领域已知的药物动力学方法测量。抗体可以例如静脉内注射(也可以使用其他途径，例如i.p.或i.m.)到人类或动物体内，之后在数个时间点，例如在最初注射后l小时、4小时、24小时、3天、7天、14天、21天和28天，通过静脉穿刺抽取血液样品。通过合适的测定方法例如ELISA确定血清中抗体的浓度。以本领域已知的方式进行药物动力学分析，实施例32中有描述。本发明单价抗体可以具有比常用作单价抗体的Fab片段的血浆保留时间长达100倍50的血浆保留时间。在一个实施方案中，本发明单价抗体的血浆清除比具有相当分子大小的F(ab，)2片段的血浆清除慢10倍以上。这可能是本发明抗体结合FcRn的能力的指示。FcRn是主要组织相容性复合物I型相关受体，在免疫球蛋白(Ig)Gs从母亲向孩子(frommothertoyoung)的被动输送和通过保护IgG免于细胞内降解调节血清IgG水平中发挥作用(GhetieVetal.,AnnuRevImmunolJl，739-66(2000))。在一个实施方案中，F(ab，)2片段与本发明单价抗体针对相同的抗原。在一个实施方案中，F(ab，)2片段与本发明单价抗体针对相同的表位。在一个实施方案中，F(ab，)2片段的Vh区和Vt区与本发明单价抗体的Vh区和V^区相同。在一个实施方案中，在体内给药时，本发明单价抗体的半衰期至少为5天。本发明单价抗体的半衰期可以用任何本领域已知的方法测量，例如如上文所述。在一个实施方案中，在体内给药时，本发明单价抗体的半衰期至少为5天，多至14天。在一个实施方案中，在体内给药时，本发明单价抗体的半衰期至少为5天，多至21天。在一个实施方案中，本发明的单价抗体能够结合FcRn。这种结合可以使用本领域已知的测定结合的方法来加以确定，例如使用ELISA测定法。例如，可以将本发明单价抗体与FcRn的结合同具有与本发明单价抗体的VH区和VL区相同的VH区和VL区的F(ab，)2片段在相同测定中与FcRn的结合进行比较。在一个实施方案中，本发明单价抗体与FcRn的结合比F(ab，)2片段与FcRn的结合强IO倍以上。在一个实施方案中，本发明的单价抗体特异结合肿瘤抗原。不受限于具体的肿瘤抗原，这类肿瘤抗原的实例可以是cMet和VEGF-R。在一个实施方案中，本发明的单价抗体特异结合细胞表面受体，该细胞表面受体在受体二聚体化时激活。单价抗体，例如本发明的单价抗体，经常可用于其中治疗受体的激活是不利的疾病或病症，因为本发明的抗体分子由于其单价的本质，不能诱发这种二聚体化，从而不能诱发这种激活。不受限于具体的受体，这类受体的实例可以是erb-B1、erb-B2、erb-B3、erb-B4和肝配蛋白以及肝配蛋白受体的成员，例如肝配蛋白-Al至A6，ephAl至A8，肝配蛋白B1至B3，以及eph-Bl至B6。在一个实施方案中，本发明的单价抗体在与靶分子结合时，抑制靶分子多聚体化(例如二聚体化)。同样，单价抗体，例如本发明的单价抗体，经常可用于治疗靶抗原的多聚体化是不利的疾病或病症，因为本发明的抗体分子由于其单价本质不能诱发这种多聚体化。在可溶抗原的场合，多聚体化可能形成不利的免疫复合物。不受限于具体的靶标，这类靶标的实例可以是Toll样受体，例如TLR-3和TLR-9，或者血管形成素-1，或血管形成素-2,或者TNF受体家族成员，如CD30，CD40和CD95。在一个实施方案中，本发明的单价抗体是TNF-a的抑制剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的单价抗体是阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)或英夫利昔单抗(infliximab)的单价形式。在一个实施方案中，本发明的单价抗体不能与效应物结合。本文中的表达"不能与效应物结合"或"效应物结合能力的阙如"的意思是本发明的IgG4单价抗体不能与补体(Cl)第一组分的Clq组分结合，因此不能激活经典的补体介导的细胞毒途径。此外，本发明的单价抗体不能与Fc受体相互作用，因此不能触发Fc受体介导的效应物功能，例如吞噬作用、细胞激活、诱发细胞因子释放。在一个实施方案中，本发明的单价抗体通过使用重组DNA技术产生。抗体可以使用重组真核宿主细胞产生，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌包括酵母细胞。稳定和瞬时系统均可用于本目的。转染可以使用质粒表达载体通过多种已建立的方法实现，例如电穿孔、脂质体转染或核染(nucleofection)。或者，可利用感染表达由重组病毒例如腺病毒、痘苗病毒或杆状病毒编码的蛋白质。另一种方法可以使用转基因动物产生抗体。编码抗体的DNA序列可以通过已建立的标准方法合成制备，例如Beaucageetal.,,TetrahedronLett,1859-1869(1981)描述的磷酸脒(phosphoamidine)法或Matthesetal.,EMBOJ.2,801-805(1984)描述的方法。根据磷酸脒法，寡核苷酸在例如自动DNA合成仪上合成、纯化、退火、连接和克隆在合适的栽体内。编码的DNA序列也可以是来源于基因组或cDNA，例如根据标准技术(参见Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor,1989)通过制备基因组或cDNA文库，并使用合成的寡核苷酸探针杂交筛选编码全部或部分抗体的DNA序列而获得。DNA序列还可以用特异引物通过聚合酶链式反应制备，例如US4683202或Saikietal.Science212，487-491(1988)所述。然后，可以将DNA序列插入到重组表达载体中，该载体可以是任何方便进行重组DNA生产的栽体。载体的选择经常依赖于待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在，其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是在引入到宿主细胞后整合到宿主细胞基因组内，并与所整合的染色体一起复制的载体。接。启动子可以是在选定的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并可以源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于在哺乳动物细启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子或腺病毒2主要晚期启动子。其他合适的启动子在本领域是已知的。用于昆虫细胞内的合适启动子有例如多角体蛋白启动子。用于酵母宿主细胞内的合适启动子包括来自酵母糖分解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子，或者TPIl或ADH2-4c启动子。用于丝状真菌宿主细胞内的合适启动子是例如ADH3启动子或tpiA启动子。编码DNA序列还可以与合适的终止子可操作连接，例如人类生长激素终止子或(对于真菌宿主)TPIl或ADH3终止子。其他合适的终止子是本领域已知的。载体还可以进一步包括其他元件，例如多聚酰香化信号(例如来自SV40或腺病毒5Elb区)、转录增强序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA的序列)。其他这类信号和增强子是本领域已知的。重组表达载体可以进一步包括使载体能够在所研究的宿主细胞内复制的载体。这种序列的一个实例(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起点。其他的复制起点是本领域已知的。载体还可含有选择标记，例如其产物可补全宿主细胞缺陷的基因，例如编码二氬叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)的基因，或者提供药物耐受性的基因，例如耐受新霉素、潮霉素或曱氨蝶呤。其他的选择标记是本领域已知的。用于分别连接编码肽或全长蛋白质的DNA序列、启动子和终止子，并将它们插入到合适的含有复制所需信息的载体内的流程是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，见前文引用)。为了获得本发明的重组单价抗体，可以将编码抗体多肽链不同部分的DNA序列在宿主细胞内单独表达，或者融合在一起而产生编码融合多肽(例如同时含有轻链和重链的多肽)的DNA构建体，将该构建体插入到重组表达栽体中，并在宿主细胞内表达。可引入表达载体的宿主细胞可以是任何能够表达全长蛋白质的细胞，并且可以是例如真核细胞，如无脊推动物(昆虫)细胞或脊推动物细胞，例如爪蟾卵母细胞或哺乳动物细胞，例如昆虫和哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系的实例是HEK293(ATCCCRL-1573),COS(ATCCCRL-1650),BHK(ATCCCRL-1632,ATCCCCL画IO)，NS/0(ECACC85110503)或CHO(ATCCCCL-61)细胞系。其他合适的细胞系是本领域已知的。在一个实施方案中，表达系统是哺乳动物表达系统，例如含有HEK293细胞的各种克隆变异的哺乳动物表达系统。转染哺乳动物细胞和表达引入到细胞内的DNA序列的方法在如下文献中有描述，例如Kaufmanetal.,,J.Mol.Biol,ii^,601-621(1982);Southernetal"J.Mol.Appl.Genet.J_，327-341(1982);Loyteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA22，422-426(1982);Wigleretal.，Cell14，725(1978);Corsaroetal.,SomaticCellGenetics2,603(1981);Grahametal.,Virol.2,456(1973);和Neumannetal.，EMBOJ.1,841-845(1982)。为了获得本发明的单价抗体，在一个实施方案中，可以同时用两种表达载体共转染表达系统的宿主细胞，其中所述两个表达载体的第一个包含编码抗体重链的DNA序列，所述两个表达载体的第二个包含编码抗体轻链的DNA序列。两条序列还可以存在于同一个表达载体中，或者它们可以融合在一起，形成编码融合多肽，例如同时包含轻链和重链的多肽的DNA构建体。在一个实施方案中，可以使用真菌细胞(包括酵母细胞)作为宿主细胞。合适酵母细胞的实例包括酵母属某些种(Saccharomycesspp.)或裂殖酵母属某些种(Schizosaccharomycesspp.)的细月包，净争另ll是酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌林。其他真菌细胞的实例是丝状真菌例如曲霉属某些种(Aspergillusspp.)或脉孢菌属某些种(Neurosporaspp.)的细胞，特别是米曲霉(Aspergillusoryzae)或黑曲霉(Aspergillusniger)的菌抹。使用曲霉属某些种表达蛋白在例如EP238023中有描述。用于培养细胞的培养基可以是任何适于培育哺乳动物细胞的常规培养基，例如含有合适补充物的含血清或无血清培养基，或者用于培育昆虫、酵母或真菌细胞的合适培养基。合适的培养基可以从供应商获得，或者可以根据z^开的配方制备(例如见AmericanTypeCultureCollection的目录)。然后可通过常规流程从培养基回收重组产生的单价抗体，包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，用盐例如石克酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白质成分，通过各种色谱方法如HPLC、离子交换色镨、亲和色谱、蛋白A色语、蛋白G色语等进行纯化。本发明还涉及制备本发明单价抗体的方法，其中所述方法包括如下步骤(a)培养含有编码所述单价抗体的核酸的宿主细胞，和(b)从宿主细胞培养物回收单价抗体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞是内源蛋白酶活性缺陷菌林。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是HEK-293F细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，单价抗体从培养物中回收。在另一个实施方案中，单价抗体从细胞裂解产物中回收。本发明的抗体具有体内半衰期长的优点，从而相比于例如相同抗体的Fab片段(该Fab片段的体内半衰期短得多)具有更长的治疗窗口。进一步，由于半衰期长和尺寸小，本发明的单价抗体潜在地具有更好的体内分布，比如能够渗透实体瘤。这使得本发明的单价抗体具有巨大的使用潜力，例如用于治疗癌症，因为本发明的抗体可用于抑制靶分子，或者作为其他治疗疾病的药物的靶特异输送机制。由于本发明单价抗体不会激活免疫系统，所以本发明的抗体是靶细胞抑制性但不是靶细胞杀伤性的。这在期望治疗各种如下的疾病时可能具有优势，即希望有抑制机制，但不希望细胞被杀死。在一个实施方案中，抗-VEGF单价抗体用于治疗AMD(急性黄斑变性)和其他疾病。在一个实施方案中，所用的抗-VEGF单价抗体是贝伐单抗(Bevacizumab)(Avastin)的单价形式。本发明的抗体是单价的，在生理条件下稳定，不能激活补体，因此适合于治疗如下的病症和疾病，其中多价抗体，例如二价抗体的使用不是必需的或者是有害的，或者其中补体激活不是必需的或者是有害的。本发明的单价抗体可通过由一条轻链和一条重链的异源二聚体在水溶液中再现(represented)。本文中的表达语"在生理条件下稳定"或"在生理条件下的稳定性，，的意思是，在所述分子以l-10mg/kg的剂量体内施用于受试者后，单价抗体可保持其主要结构特征和功能特征不变，并以治疗上有意义的浓度存在达1周以上。5jig/ml的血浆浓度被认为是对大多数治疗性抗体有意义的，因为抗体在此水平可显示靶结合的饱和。在此语境下，7天的时间间隔被认为是相对较长的。在免疫缺陷和免疫正常(immune-competent)小鼠中，无铰链变体的清除都比具有相当分子大小的F(ab，)2片段的清除慢得多。这表明，Fc-部分对于血浆保留时间具有有利的作用，并表明与保护被内吞的IgG免于细胞内降解的新生儿Fc受体(FcRn)有功能相互作用。无铰链变体的清除率比Fab片段慢大约300倍，表明它可以用低300倍的剂量实现相等持续的血浆浓度。本发明还涉及本发明单价抗体的免疫偶联物。本发明突出地描述一种与治疗部分偶联的本发明的单价抗体，所述治疗部分例如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。这些偶联物在这里称作"免疫偶联物"。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害(例如杀死)的作用剂。实例包括紫杉醇(taxol)、松胞菌素B(cytochalasinB)、短杆菌肽D(gramicidinD)、溴化乙4走(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依才乇泊芬(etoposide)、鬼臼p塞吩普(tenoposide)、长春#斤石威(vincristine)、长春石咸(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二#5炭疽菌素二酉同(dihydroxyanthracindione)、米4乇蒽、S昆(mitoxantrone)、普卡霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycinD)、1-去氢睾酮(l隱dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)，以及其类似物或同系物。用于形成本发明免疫偶联物的合适化疗剂包括，但不仅限于，抗代谢物(例如曱氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-疏鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿嘧咬、氮烯咪胺(decarbazine)、轻基脲、azathiprin、吉西他滨(gemcitabin)和克拉屈滨(cladribin))，烷基化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、thioepa、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BS而)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脈霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺柏(cis-dichlorodiamineplatinum)(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如柔红霉素(曾用名道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)，抗生素(例如放线菌素D(曾用名actinomycin)、博来霉素、普卡霉素和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、多西他瘗(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)和长春瑞滨(vinorelbin))。合适的放射性同位素是例如碘-131、钇-90或铟-111。治疗部分的其它例子可以是具有期望生物学活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括，例如，酶活性毒素(enzymaticallyactivetoxin)或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素i;或生物响应调节物(biologicalresponsemodifier),例如淋巴因子、白细胞介素-l(IL-l)、白细胞介素-2(11^2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或者其他生长因子。在一个实施方案中，治疗性模块是多柔比星、顺铂、博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺或蓖麻毒蛋白A。使这些治疗性模块(therapeuticmoiety)与抗体偶联的技术是本领域已知的，见例^口Arnonetal.，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeldetal.(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrometal.，"AntibodiesForDrugDelivery",ControlledDrugDelivery(2ndEd.)，Robinsonetal.(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",MonoclonalAntibodies1984:BiologicalAndClinicalApplications,Pincheraetal.(eds.),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwinetal.(eds.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，和Thorpeetal""ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev"62:119-58(1982)。在一个实施方案中，本发明的单价抗体附着在接头-螯合剂上，例如tiuxetan，其允许抗体与放射性同位素偶联。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明单价抗体的药物组合物。该药物组合物可以用药物可接受的载体或稀释剂以及其他已知的辅助剂和赋形剂根据常规的技术配制，制备技术例如在下文中公开的Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版，Gennaro,Ed.，MackPublishingCo.，Easton，PA，1995。药物组合物可以通过任何合适的途径和模式施用。本领域技术人员可以意识到，给药的途径和/或模式可根据期望的结果而改变。本发明的药物组合物包括适合于经口、鼻、局部(包括含服和舌下)、直肠、阴道、和/或肠胃外给药的组合物。本发明适合于阴道给药的剂型包括阴道栓剂(pessaries)、棉塞(tampon)、乳剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂，并含有本领域已知的合适载体。本发明组合物局部或透皮给药的剂量形式包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂(patch)和吸入剂。在一个实施方案中，药物组合物适合于肠胃外给药。这里使用的术语"肠胃外给药(或施用)"和"肠胃外地给药(或施用)"是指除经肠和局部给药之外的给药模式，通常通过注射，包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、嚢内、0匡内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、嚢下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和灌注。在一个实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或灌注给药。在一个实施方案中，本发明的单价抗体以晶体形式通过皮下注射给药，参见Yangetal.PNAS,巡(12)，6934-6939(2003)。不考虑选定的给药途径，本发明的单价抗体可以以药物可接受的盐的形式，或者合适的水合形式使用，和/或本发明的药物组合物可以本领域技术人员已知的传统方法配制成药物可接受的剂量形式。用于本文时，"药物可接受的载体"包括任何和全部生理相容的溶剂、分散介质、包衣(coating)、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。药物可接受的载体包括用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌水溶液或分散剂和无菌粉末。使用这些介质和试剂用于药物活性物质是本领域已知的。预期任何常规介质或试剂在本发明药物组合物的使用，除非它们与单价抗体不相容。在一个实施方案中，载体适合于肠胃外给药，例如静脉内或皮下注射或灌注。药物组合物典型地必须是无菌的并且在制造和保存条件下稳定。组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射有机酯，例如油酸乙酯。通过例如使用涂层材料，例如卵磷脂，在分散液中保持需要的微粒大小和使用表面活性剂可以保持适当的流动性。药物组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序，也可以通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯曱酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等，来确保防止微生物存在。组合物中最好还含有等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。还可以包含药物可接受的抗氧化剂，例如(l)水溶抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、碌u酸氢钠、焦亚石克酸氢钠、亚碌b酸钠等；(2)油溶抗氧化剂，例如抗坏血酸椋榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基曱苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。通过含有延緩吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。无菌的可注射溶液的制备可以通过将需要量的单价抗体与根据需要的一种或多种成分(例如上面列举的)的组合加入合适的溶剂中，随后微过滤灭菌。一般地，分散物的制备是通过将单价抗体加入到无菌媒介物中，其中该媒介物含有基本(basic)分散介质和需要的其他成分，例如上面列举的那些。对用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例是从其先前灭菌过滤的溶液进行真空干燥和冻干(冷冻干燥法)，产生含有活性成分与任何附加期望成分的粉末。如果合适，单价抗体可以合适的水合形式或药物可接受的盐的形式使用。"药物可接受的盐"是指保留母化合物的期望生物学活性且不产生任何不良毒理作用的盐(见例如Berge,S.M""a/.(1977)J尸A画.5W.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氬碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒有机酸的盐，例如脂族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括源于碱土金属，如钠、钾、镁、钙等的盐，以及源于无毒有机胺的盐，例如N，N'-二千基乙二胺、N-曱基-葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。根据给药途径，可以用某种材料包被单价抗体，以保护化合物免于酸和其他使化合物失活的自然条件的作用。例如，可以将处于合适的载体例如脂质体中的化合物施用于受试者。脂质体包括水包油包水型CGF乳剂以及常规的脂质体(Strejanetal.,J.Neuroimmunol.2,27(1984))。单价抗体可以用保护单价抗体免于快速释放的载体制备，例如可控释放制剂，包括植入物、透皮贴、和微胶嚢输送系统。可以使用生物可降解、生物相容聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。制备这些制剂的方法是本领域技术人员众所周知的，见例^口SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。药物组合物可以用本领域已知的医学器件给药。在一个实施方案中，本发明的治疗組合物可以用无针头皮下注射器给药，例如在US5399163;US5383851;US5312335;US5064413;US4941880;US4790824;或US4596556中公开的装置。本发明可用的众所周知的植入物和模块的实例包括US4487603,其公开了以可控的速度分散药物的可植入微注入泵；US4486194,其^^开了透过皮肤给药的治疗装置；US4447233，其/>开了以精确的输注速度输送药物的药物注入泵；US4447224，其爿〉开了用于连续药物输送的可变流速植入输注器件；US4439196，其公开了具有多个室分区的渗透药物输送系统；和US4475196，其公开了一种渗透药物输送系统。许多其他的这类输注、输送系统和模块是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以通过例如使用脂质体配制，从而确保适当的体内分布。对于制备脂质体的方法见例如US4522811;US5374548;和US5399331。脂质体可以包含一种或多种部分，其可选择输送到特殊的细胞或器官，从而提高靶向药物输送(见例如V.V.Ranade，J.Clin.Pharmacol.22,685(1989))。靶向性部分的实例包括叶酸或生物素(见例如US5416016);甘露并唐苷(Umezawaetal"Biochem.Biophys.Res.Commun.j^l,1038(1988));其他抗体(Bloemanetal.，FEBSLett.Ml,140(1995);Owaisetal.，Antimicrob.AgentsChemother.12,180(1995));表面活性蛋白A受体(Briscoeetal.,Am.J.Physiol.1233,134(1995)),不同种类的表面活性蛋白A受体可以包含本发明的制剂以及本发明分子的成分；p120(Schreieretal.，J.Biol.Chem.巡，9090(1994》；另见Keinanenetal.，FEBSLett.，，123(1994);Killionetal.，Immunomethods生273(1994)。组合物必须具有一定程度的流动性，使其可容易地通过注射器施用。它还必须在制造和保存条件下稳定，必须保持其不受微生物，例如细菌和真菌的污染。在一个实施方案中，可以配制本发明的单价抗体以防止或减少其转运通过胎盘。这可以通过本领域已知的方法实现，例如通过使单价抗体PEG化。进一步的参考可见Cunningham-Rundlesetal.,JImmunolMethods.152,177-190(1992);和Landoretal.，Ann.AllergyAsthmaImmunol.24,279-283(1995)。调节剂量范围以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以给予单次推注，在一段时间内给予数个分剂量，或者根据治疗状态紧急情况的指示按比例降低或增加剂量。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式从而易于给药和使剂量均匀。这里使用的剂量单位形式是指物理上离散的多个单位，这些单位适合作为单位剂量(unitarydosage)用于待治受试者；每个单位含有经过计算可产生期望治疗效果的预定量的单价抗体和需要的药物载体。本发明剂量单位形式的规格由下列方面所决定并且直接依赖于它们:(a)单价抗体的独特性质和待实现的具体治疗效果，和(b)在配制此类单价抗体用于治疗个体的敏感性(sensitivity)的方面现有技术的固有限制。针对特定的患者、组合物和给药模式，可以对本发明药物组合物中单价抗体的实际剂量水平加以改变，以便获得可有效实现期望治疗响应的活性成分量。剂量水平的选择将取决于各种药物动力学因素，包括具体应用的本发明单价抗体的活性、给药途径、给药时间、所用具体单价抗体的排泄速度、治疗持续时间、与所用具体组合物联用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和先前病史等医学领域众所周知的因素。具有本领域一般技能的医师或兽医师可以容易地确定所述药物组合物的所需有效量并开出处方。例如，对于药物组合物中所用的本发明化合物的剂量，医师或兽医师可以使用比实现期望治疗效果所需的剂量水平更低的起始剂量，并逐渐提高剂量直到获得期望的效果。一般地，本发明药物组合物的合适剂量是对于治疗效果的产生有效的单价抗体的最低量。这种有效剂量一般取决于上述因素。作为另一个实例，医师或兽医师可以用高负荷剂量开始，随后重复给予较低的剂量，以快速建立治疗有效剂量，并且保持它更长的时间。本发明的药物组合物可以含有一种本发明单价抗体或不同的本发明单价抗体的组合。因此，在进一步的实施方案中，药物组合物包括以不同的机制发挥作用的多种(例如两种或更多种)本发明单价抗体的组合。因此，单价抗体还可以和二价抗体组合。本发明还涉及编码本发明单价抗体重链CH区氨基酸序列的核酸构建体。在一个实施方案中，本发明提供一种核酸构建体，其包含编码IgG4的Ch区的核酸序列，其中编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于所述CH区的铰链区的区域不含有任何能够参与同包含与所述CH区的氨基酸序列或其互补序列相同的氨基酸序列的肽形成二硫键的氨基酸残基。编码本发明单价抗体CH区的核酸构建体可以源于编码IgG4CH区的核酸。编码IgG4CH区全长氨基酸序列的核酸构建体可以用本文中(例如在实施例中)讨论的任何方法制备，或者用其他本领域已知的方法制备。重组DNA序列操作方法是本领域众所周知的，可以通过例如定点突变来实现，例如在本说明书中描述的。然而，定点突变只是可以采用的技术的一个非限制性的例子。编码CH区的核酸序列的修饰可以如同上文对本发明单价抗体的构建62的描述来进行。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过》务饰，从而使相应于铰链区的区域的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其他氨基酸残基替换。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于SEQIDNo:14序列之氨基酸106和109的氨基酸残基被删除。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过》务饰，从而使相应于SEQIDNo:14序列之氨基酸106-109的氨基酸残基被删除。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过修饰，从而至少使相应于SEQIDNo:14序列之氨基酸99-110的氨基酸残基被删除。在一个实施方案中，编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使整个铰链区净皮删除。在一个实施方案中，相应于编码IgG4之CH区序列铰链区(本文中标示为SEQIDNo:13)的剪接供体位点的核苷酸的突变(替换)，导致包含无铰链IgG4Qi区的多肽的表达。因此，在一个实施方案中，本发明的核酸构建体经过修饰，从而使编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点的至少一个核普酸被替换为不同于该位置上原始存在的核苷酸的核香酸。在一个实施方案中，相应于SEQIDNo:13序列之714和722位核苷酸的核苷酸被替换为不同于SEQIDNo:13中该位置上核苷酸的核苷酸。在一个实施方案中，编码本发明核酸构建体CH区的核酸序列包含SEQIDNo:13的序列，其中SEQIDNo:13序列之714和722位核苦酸被不同于SEQIDNo:13该位置核香酸的核苷酸替换。在一个实施方案中，编码本发明核酸构建体CH区的核酸序列包含SEQIDNo:15的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码本发明核酸构建体CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于SEQIDNo:14序列之氨基酸残基106和109的氨基酸残基被替换不同于半胱氨酸残基的氨基酸残基。在一个实施方案中，编码本发明核酸构建体CH区的核酸序列的被替换的核苷酸是使用定点突变替换的。在一个实施方案中，核酸构建体包含编码IgG4之CH区的核酸序列，其中编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何能够参与二硫键形成的氨基酸残基，该核酸构建体与包含编码本发明单价抗体vH区的核酸序列的核酸融合在一起。这样，在一个实施方案中，该核酸构建体包含编码抗原特异性抗体VH区的核酸序列，或其互补序列。在一个实施方案中，编码核酸构建体VH区的核酸序列与编码CH区的核酸序列或其互补序列可操作地连接。在一个实施方案中，该核酸构建体包含编码本发明单价抗体重链的核普酸序列。这可以通过众所周知的技术实现，获得核酸构建体，其中两个不同的编码序列可操作地连接在一起。编码本发明单^f介抗体VH区的核酸序列可以源于编码任何抗原特异性抗体Vh区的核酸。在一个实施方案中，Vh区源于与单价抗体Vl区来源相同的抗体。本发明提供了制备核酸构建体的实例，所述核酸构建体包括1)编码HuMab-7D8之VH的核酸序列(标示为SEQIDNo:5)和编码IgG4无铰链CH的核酸序歹U(标示为SEQIDNo:15)，其中所述序列可操作地连接在一起，和2)编码小鼠抗-Betv-l之VH的核酸序歹J(标示为SEQIDNo:7)和编码IgG4无铰链CH的核酸序列(标示为SEQIDNo:15)，其中所述序列可操作地连接在一起。通过使用本发明上述的方法可以产生大量不同的编码能够结合不同特异抗原的单价抗体的核酸构建体，因此特异单价抗体的实例对这里所描述的抗体例子无限制。在一个实施方案中，本发明的核酸构建体还包括编码本发明单价抗体轻链的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包括编码本发明单价抗体Vl区的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包括编码本发明单价抗体CL区的核酸序列。在一个实施方案中，d区是Ig轻链K的a区。在一个实施方案中，Cl区具有SEQIDNO:l的序列。在另一个实施方案中，Cl区是Ig轻链K的Ct区。在一个实施方案中，Cl区具有SEQIDNo:3的序列。这种核酸构建体可通过本文中讨论的任何已知重组技术制备，或者根据在本专利申请实施例中描述的程序制备。编码本发明单价抗体VL区的核酸序列可以源于编码任何抗原特异性抗体Vh区的核酸。在一个实施方案中，Vl区源于与羊价抗体Vh区来源的抗体相同的抗体。本发明提供了如何制备如下核酸构建体的实例1)包含编码HuMab-7D8之VL的核酸序歹'J(标示为SEQIDNo:9)和编码lg之C^K的核酸序歹。(标示为SEQIDNo.'l)的核酸构建体，其中所述序列可操作地连接在一起，和2)包含编码小鼠抗-Betv-l之VL的核酸序列(标示为SEQIDNo:ll)和编码Ig之QK的核酸序列(标示为SEQIDNo:l)的核酸构建体，其中所述序列可操作地连接在一起。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或者以部分纯化或基本纯化的形式存在。源于cDNA、基因组或其混合物的本发明的核酸构建体，尽管往往是天然序列(除了经过修饰的限制位点等)，但可以根据标准技术加以突变，从而提供基因序列。对于编码序列，这些突变会如期望的那样影响氨基酸序列。特别地，我们预期与天然V、D、J、恒定、转换变体(switchvariant)以"来源"表示序列与另一条序列相同或从其修饰而来)。在一个实施方案中，核酸构建体是DNA构建体。在一个实施方案中，核酸构建体是双链DNA构建体。在一个实施方案中，核酸构建体是RNA构建体。在一个实施方案中，本发明的单价抗体通过使上述的核酸构建体在细胞内表达而制备。因此，本发明涉及如上所述的核酸构建体，其是表达载体。在一个实施方案中，该表达载体是原核表达载体。在一个实施方案中，该表达载体是真核表达载体。在一个实施方案中，该表达载体是哺乳动物表达载体。可用于本发明目的的不同表达载体的实例在本文其他部分有讨论，并且在实施例部分中对具体的实例进行了描述。本发明提供了制备本发明单价抗体的方法，包括培养含有本发明核酸构建体的宿主细胞，并且如果所述核酸构建体不编码所述抗体的轻链，还包括含有编码所述抗体轻链的核酸序列的核酸构建体，从而使多肽表达，并从细胞培养物中回收单价抗体。在一个实施方案中，单价抗体从细胞裂解物中回收。在另一个实施方案中，单价抗体从细胞培养基中回收。本发明还提供了本发明的核酸构建体用于生产本发明的单价抗体的用途。在一个实施方案中，所述生产包括使用在下文有更详细描述的方法。因此，本发明的单价抗体可以例如通过在宿主细胞中表达含有编码本发明抗体轻链的核酸序列的表达载体和含有编码本发明抗体重链的核酸序列的表达载体，或者同时含有两者的表达载体加以制备。宿主细胞可以从任何适合于表达外源蛋白质的细胞中选择，例如哺乳动物细胞，如本文其他地方描述的。本发明同时涉及体内和体外表达。为了瞬时体外表达，可以使用哺乳动物HEK293细胞。在这种情况下，通过任何本领域众所周知的用于细胞转染的合适方法用上述的表达栽体转染培养中的细胞，例如可以从供应商(例如Stratagene或Invitrogene)购买合适的细胞转染试剂盒。对于体内表达，通过任何为本目的开发的合适施用方法体内给予表达载体。体内施用表达载体的方法也是本领域众所周知的。因此，本发明提供了含有如上所述核酸构建体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是HEK-293F细胞。本发明提供了制备本发明单价抗体的方法，包括培养本发明的宿主细胞，该宿主细胞含有编码所述抗体重链的核酸序列和编码所述抗体轻链的核酸序列，从而使多肽表达，并从细胞培养物中回收单价抗体。本发明还提供了本发明的宿主细胞用于生产本发明的单价抗体的用途。在一个实施方案中，所述生产包括使用将在下文进一步描述的方法。核酸序列可以存在于编码重链的核酸序列所存在的相同核酸构建体中，或者存在于不同的核酸构建体中。在一个实施方案中，单价抗体从细胞裂解物中回收。在另一个实施方案中，单价抗体从细胞培养基中回收。本发明还提供了含有如上所述核酸构建体的转基因动物。本发明提供了用于重组产生单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VL区的核香酸序列和编码Ig恒定(Cl)区的核苦酸序列，其中所述编码选定的抗原特异性抗体VL区的核苷酸序列和所述编码IgCL区的核苷酸序列可操作地连接在一起；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苦酸序列和编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中编码重链的核苷酸序列经过修饰，从而使相应于重链铰链区的区域不含有任何能够参与和其它包含与人IgG4恒定(Ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键的氨基酸残基，其中编码选定的抗原特异性抗体VH区的所述核苷酸序列和编码所述IgG4CH区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞内共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。在步骤(iv)之后，单价抗体可以根据期望纯化和配制(formulated)。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于重链4交链区的区域不含有任何半胱氨酸残基，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其他氨基酸残基替换，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的CH区，其中删除了相应于SEQIDNo:14所示序列之106和109位氨基酸残基的氨基酸残基，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列之106-109位氨基酸残基的氨基酸残基，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列之99-110位氨基酸残基的氨基酸残基，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而使整个铰链区被删除，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点中至少一个核苷酸被另一种核苷酸替换，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中相应于SEQIDNo:13所示序列之714和722位核苷酸的核苷酸^^皮与SEQIDNo:13中该位置上存在的核苷酸不同的核苷酸替换，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含编码人IgG4之CH区的核香酸序列，其包含SEQIDNo:13所示序列，其中SEQID置上存在的核苦酸不同的核普酸，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含SEQIDNo:15的核苷酸序列，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码重链的核酸序列经过修饰，从而重链包括这样的CH区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列之106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被不同于半胱氨酸的氨基酸残基替换，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码CH区铰链区的核酸序列的替换核苷酸是通过定点突变替换的，如上文所述的那样。在一个实施方案中，编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包含编码人IgG之K链Ct区的序列，如上文所述的那样。在一个实施方案中，该核酸构建体包含SEQIDNo:l的核苷酸序列，如上文所述的那才羊。在一个实施方案中，编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包含编码人IgG之X链Ct区的序列，如上所述。在一个实施方案中，该核酸构建体包含SEQIDNo:3的核苷酸序列，如上所述。在一个实施方案中，该核酸构建体是如上所述的DNA构建体。在一个实施方案中，(i),(ii),(iii)和/或(iv)的核酸构建体是如上所述的原核表达载体。在进一步的实施方案中，该细胞表达系统包含如上所述的原核细胞表达系统。在进一步的实施方案中，该原核细胞表达系统包含如上所述的大肠杆菌细胞。在进一步的实施方案中，大肠杆菌细胞是如上所述的内源蛋白酶活性缺陷菌株的细胞。在一个实施方案中，(i),(ii)，(iii)和/或(iv)的核酸构建体是如上所述的真核表达载体。在进一步的实施方案中，该细胞表达系统是如上所述的真核细胞表达系统。在进一步的实施方案中，该细胞表达系统是如上所述的哺乳动物细胞表达系统。在进一步的实施方案中，该哺乳动物细胞表达系统包含CHO细胞，如上所述。在另一个进一步的实施方案中，该哺乳动物细胞表达系统包含HEK-293F细胞，如上所述。本发明还提供了能够通过使用本发明的方法获得的单价抗体。本发明还提供了通过使用本发明的方法获得的单价抗体。根据本发明，本发明的任何抗原特异单价抗体均可以通过使用如上所述的方法制备。本发明的单价抗体具有众多体外和体内诊断和治疗应用，包括诊断和治疗涉及表达抗体能够识别和结合的抗原的细胞的病症。本发明不涉及导向于任何特异抗原的单价抗体，因为根据本发明，本说明书中描述的单价抗体可制备成针对任意的特异抗原。本发明公开了两种不同的单价抗体，7D8-HG(HuMab7D8，或筒称为7D8，是在WO04/035607中描述的抗CD20抗体，和HuMab7D8-HQ或简称为7D8-HG，是具有IgG4重链的上述抗体，其中该IgG4重链包括由氨基酸序列SEQIDNo:16组成的CH区)，抗-Betvl-HG(抗-Betvl是由克隆2H8表达的小鼠抗体，参见(AkkerdaasJHetal.Allergy^(3),215-20(1995))和抗-Betvl-HG是具有如下所述的IgG4重链的上述抗体其中该IgG4重链包括由SEQIDNo:16的氨基酸序列组成的CH区)，它们通过本专利申请中描述的方法制备，然而，本发明并不仅限于这两种单价抗体。在一个实施方案中，根据本发明的CD20单价抗体是WO2005/103081中公开的抗体的单价抗体。在某些病理条件下，单价抗体的使用是必需的和/或理想的。同样，在一些情况下，优选的是治疗抗体发挥其治疗作用而不涉及免疫系统介导的活性，例如效应物功能、ADCC、吞噬作用和CDC。在这些情况下，希望产生如下形式的抗体，其中这些活性被实质性降低或者消除。如果抗体采取可高效、高产率制备的形式，也是有利的。本发明提供了这类抗体，其可用于各种目的，例如作为治疗剂、预防剂和诊断剂。本发明单价抗体的具体用途天然地取决于抗体的特异靶标。根据施用对靶标特异性的或者靶标上给定表位特异性的(这些信息在有关不同靶标的宿主的文献中大量存在)抗体的治疗价值和使用特异靶标的稳定单价抗体的优势，可以选择这样的靶标，对它们而言本发明的单价抗体是治疗、预防和诊断上有用的抗体。这些考虑因素是本领域技术人员可实现的。本发明的单价抗体可以用作拮抗剂在体外、离体和/或体内部分或完全阻断特异抗原活性。而且，由于具有相同表位的不同抗原导致交叉结合，本发明的单价抗体可以抑制来自其他物种的抗原活性。因此，本发明的单价抗体可用于抑制特异抗原活性，例如在含有该抗原的细胞培养物中、在人类受试者中、或在其他具有本发明抗体可与之发生交叉反应的抗原的哺乳动物受试者中(例如黑猩猩、狒狒、狨猴、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可用于抑制抗原活性，即通过使抗体与抗原结合从而抑制抗原的活性。在一个实施方案中，抗原是人类蛋白质分子。在一个实施方案中，本发明的单价抗体特异针对配体抗原，通过阻断或干扰配体抗原参与的配体-受体相互作用抑制抗原活性，藉此抑制相应的信号通路和其他分子事件或细胞事件。在一个实施方案中，本发明的单价抗体特异针对可通过与配体接触而被激活的受体抗原，并通过阻断或干扰配体-受体相互作用抑制抗原活性，藉此抑制相应的信号通路和其他分子事件或细胞事件。在一个实施方案中，本发明的单价抗体针对CD74，并抑制MIF诱导的信号传导，但是没有Fc介导的效应物功能。本发明还特别提供了受体特异性的单价抗体，其不一定阻止配体结合，但是干扰受体激活，藉此抑制任何通常会由配体结合引发的响应。本发明还包括优选地或排他地结合配体-受体复合物的单价抗体。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以发挥特定抗原的激动剂的作用，藉此加强、提高或激活配体介导的受体激活的全部或部分活性在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以防止病毒或其他病原体与其受体结合，例如抑制HIV与CD4或辅助受体例如CCR5或CXCR4的结合。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可用于治疗、抑制、减轻或预防如下所述的疾病、病症或症候，延迟它们的发展，或防止/延迟它们的发生；所述疾病、病症或症候与一种或多种抗原分子正常表达和/或活性有关，例如^f旦不限于，非白血病和'淋巴系恶性肿瘤(non-leukemiasandlymphoidmalignancies);神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其他腺体、巨噬细胞(macrophagal)、上皮、基质和嚢胚腔(blastocoelic)的病症；和炎症性、血管新生性和免疫病症。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可用于治疗(例如抑制、延迟其发展、预防/延迟其复发、或者减轻或预防)如下疾病、病症或病症例如癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症。这依赖于单价抗体能够通过其抗原特异性干扰细胞增殖、细胞生长、细胞活力、细胞凋亡、坏死、细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用、细胞信号传导、细胞-表面分子表达、细胞-表面分子相互作用、配体-受体相互作用。本发明提供了用作药物的本发明单价抗体。本发明提供了用作治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症的药物的本发明单价抗体，其中抗体特异结合给定的靶或耙表位，抗体与所述靶或靶表位的结合对治疗所述疾病是有效的。本发明提供了用作治疗疾病或病症的药物的本发明单价抗体，其中疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原加以治疗，其中所述抗原的多聚体化(例如二聚体化)可形成不希望的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。本发明提供了用作治疗疾病或病症的药物的本发明单价抗体，其中疾病或病症可通过施用针对某些靶的抗体得到治疗，其中免疫系统介导的活性对于实现施用抗体的效果不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。本发明提供了用作治疗疾病或病症的药物的本发明单价抗体，其中疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体加以治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。本发明提供了本发明的单价抗体作为药物的用途。本发明提供了本发明的单价抗体作为治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症的药物的用途，其中抗体特异结合给定的靶或靶表位，抗体与所述靶或靶表位的结合对所述疾病治疗有效。71本发明提供了本发明的单价抗体作为治疗疾病或病症的药物的用途，其中疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化(例如二聚体化)可形成不希望的免疫复合物。本发明提供了本发明单价抗体用作治疗疾病或病症的药物的用途，其中疾病或病症可通过施用针对特定靶的抗体得到治疗，其中免疫系统介导抗体与所述抗原特异结合。本发明提供了本发明的单价抗体作为治疗疾病或病症的药物的用途，所述疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。本发明提供了本发明的单价抗体在制备用于治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症和/或血管新生病症的药物组合物中的用途，其中该抗体特异结合给定的靶或靶表位，抗体与所述耙或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。本发明提供了本发明的单价抗体制备用于治疗疾病或病症的药物组合物，该疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化(例如二聚体化)可形成不希望的免疫复合物。本发明提供了本发明的单价抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物方面的用途，其中疾病或病症可通过施用针对某些靶的抗体得到治疗，其中免疫系统介导的活性对于实现施用抗体的效果不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。本发明提供了本发明的单价抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，其中疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。本发明提供了治疗疾病或病症的方法，其中所述方法包括向需要用本发明单价抗体治疗的受试者施用本发明的单价抗体、含有所述抗体的药物组合物、含有所述抗体的免疫偶联物、或本发明的核酸构建体，藉此治疗疾病或病症。本发明提供了罹患疾病或病症的受试者体内抗原的方法，其中抗原的活性是不利的，该方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与所述抗原特异结合的本发明单价抗体、含有所述抗体的药物组合物、含有所述抗体的免疫偶联物、或本发明的核酸构建体，从而抑制受试者体内抗原的活性。本发明提供了治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本发明单^f介抗体，含有所述抗体的药物组合物，含有所述抗体的免疫偶联物，或本发明的核酸构建体，并且其中该抗体与给定的靶或靶表位特异结合，抗体与所述靶或靶表位的结合可有效治疗所述疾病。在一个实施方案中，这类疾病或病症是可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗的疾病或病症，其中所述抗原的多聚体化(例如二聚体化)会形成不希望的免疫复合物，治疗方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的针对所述抗原的本发明单价抗体，含有所述抗体的药物组合物，含有所述抗体的免疫偶联物，或本发明的核酸构建体。在一个实施方案中，这类疾病或病症是可通过施用针对某耙标的抗体得到治疗的疾病或病症，其中免疫系统介导的活性对于实现所施用抗体的效果而言不是必需的或者是不利的，治疗方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与所述抗原特异结合的本发明单价抗体，含有所述抗体的药物组合物，含有所述抗体的免疫偶联物，或本发明的核酸构建体。在一个实施方案中，这类疾病或病症是可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗的疾病或病症，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化激活，治疗方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的与所述受体特异结合的本发明单价抗体，含有所述抗体的药物组合物，含有所述抗体的免疫偶联物，或本发明的核酸构建体。科学文献中有大量这样的靶标实例，其中抗体与所述靶标或所述耙标特异表位的结合显示具有或者预期具有治疗作用。通过本说明书教导的内容或者本文其他地方描述的内容，本领域的技术人员在其能力范围之内能够确定，使用针对这些靶标的单价抗体，例如本发明的单价抗体，是否可预期产生治疗作用。在下文，给出了这类靶标的数个实例；然而，这些实例不能理解为本发明的范围没有限制意义。本发明的单价抗体与可溶抗原特异结合，其中所述抗原的多聚体化(例如二聚体化)可形成不希望的免疫复合物，例如导致凝集(例如，当该可溶抗原由多个相同的亚单位构成时)。可与受体特异结合的本发明单价抗体一一其中该受体可通过所述受体的二聚体化而激活——可以针对例如cmet、FcsRI、乙酰胆碱受体、fas或fasL、TRAIL、或VEGF受体。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过干扰经由FcaRI的细胞激活，干扰FcaRI的功能，抑制随后FcaRI激活的IgE介导的响应，或者与可溶FcaRI结合得到治疗。在本发明的一个实施方案中，单价抗体针对FcaRI，并诱导FcaRI表达细胞的凋亡。在一个实施方案中，这类疾病或病症可以是例如变应性哞喘或者其他变应性疾病，例如变应性鼻炎、季节性/终年性变态反应、枯草热、鼻变态反应(nasaUllergies)、特应性皮炎、湿渗、荨麻渗(hives)、荨麻渗(urticaria)、接触性变态反应(contactallergies)、变应性结膜炎、眼变态反应、食物和药物过敏、乳胶过敏、或昆虫过敏，或者IgA肾病，例如IgA天疱疮。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对FcaRI。这种单价抗体还可用于在样品或患者内或者在用于治疗这些疾病和病症的免疫毒素或放射标记方法中体外或体内筛选FcaRI。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过下调Fc受体y-链介导的借助FcsRl或Fcy受体的信号通路得到治疗。已知抗体与FcaRI单体结合可实现这种抑制。因此，单价抗体可用于抑制多种Fc受体造成的免疫激活，包4舌Fcy、Fca和Fcs受体。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过直接或间接阻断激活的T细胞或表达CD25的细胞抑制、杀死表达CD25的细胞和/或调节其活性和/或生长(例如增殖)。在一个实施方案中，这些疾病或病症可以是例i口移植排斥,包括同种异体移植和异种移植排斥,z发生在正经历或已经历器官或组织移植的病人体内的，例如心脏、肺、心肺联合、气管、肾脏、肝脏、胰腺、食道、肠、皮肤、四肢、脐带、干细胞、胰岛细胞移植等，其中本发明的单价抗体可用于预防同种异体移植和异种移植排斥，或者用于逆转(reverse)、治疗或者以其它方式减轻急性同种异体移植和异种移植排斥发病，移才直物抗宿主病,例如输血移植物抗宿主病和骨髓移才直物:阮宿主病，炎症性、免疫或自身免疫疾病,例如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、l型糖尿病、需胰岛素型2型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、重症肌无力、炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、皮肤-多^L炎(dermato-polymyositis)、舍格伦综合征(Sj6gren，ssyndrome)、动脉炎，包括巨细胞性动脉炎、再生障碍性贫血、哞喘、硬皮病和葡萄膜炎，炎症性或过度增殖性(hyperproliferative)皮肤病,例如银屑病，包括斑块状银屑病(plaquepsoriasis)、掌跖脓疱症(PPP)、糜烂性扁平莒藓(erosivelichenpla皿s)、大疱性天疱痴(pemphigusbullosa)、大疱性表皮松解(epidermolysisbullosa)、接触性皮炎和特应性皮炎，、淋巴才羊肿瘤(lymphoidneoplasms),例々口T细月包白血病、何杰金氏病、毛细胞白血病、或皮肤T细胞淋巴瘤，包括蕈样肉芽肺病和塞扎里综合征，恶性肿瘤,例如胃癌、食道癌、恶性黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、和肾细胞癌，血液病症,例如成年T细胞白血病/'淋巴瘤、间变性大细月包'淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma)、t曼性'淋巴细月包性白血病(CLL)/小淋巴细胞性白血病(SLL)、外周T细胞淋巴瘤、和继发性淀粉样变性(secondaryamyloidosis),皮月夫病症,例如坏疽性脓皮病(pyodermagangraenosum)、环状肉芽肿(granulomaannulare)、变应性接触寸生皮炎、應痕寸生类天疱疳(cicatricialpemphigoid)、和妊娠疱渗，肝-胃肠病症，例如胶原性结肠炎(collagencolitis)、硬化性胆管炎、慢性活动性肝炎、狼疮样肝炎(lupoidhepatitis)、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、慢性胰腺炎、和急性胰腺炎，心脏病症，例如心肌炎和心包炎，血管病症,例如动脉硬化、大细胞动脉炎/风湿性多肌痛、大动脉炎、结节性多动脉炎、川崎综合征、韦格纳肉芽肺、显樣t镜性多血管炎(microscopicpolyangiitis)、丘-斯综合征、白细胞石皮裂性血管炎(leukocytoclasticangiitis)和继发性白细胞石皮裂性脉管炎(secondaryleukocytoclasticvasculitis),肾病症,例如急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、轻孩史病变性肾炎(minimalchangenephritis)和古德帕斯丘综合征，肺病症,例如肺泡炎、细支气管炎(bronchiolitisobliterans)、珪沉着病、和铍中毒，神经疾病,例如多发性硬化、阿尔茨海默病、重症肌无力、慢性脱髓鞘性多神经病(chronicdemyelinatingpolyneuropathy)、和多神经根炎，包括吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barr6syndrome),结締组织病，例如复发性多软骨炎、结节病、全身性红斑狼疱、CNS狼痴、盘状狼痴(discoidlupus)、狼裔性肾炎、慢性疲劳综合症、和纤维肌痛综合征(fibromyalgiasyndrome),内分泌病症，例如格雷夫斯病、桥本氏曱状腺炎、和亚急性曱状腺炎，病毒感染,例如HIV-1/AIDS和热带痉挛性下肢轻瘫(tropicalspasticparaparesis)。在一个实施方案中，本发明的单价抗体针对CD25。这种单价抗体还可用于在样品或患者内或者在用于治疗这些疾病和病症的免疫毒素或放射标记方法中体外或体内筛选CD25。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过拮抗和/或抑制IL-15或IL15受体的功能得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病或病症可以是例如动脉炎、痛风、结締组织病、神经疾病、胃肠病症、肝病症、变应性疾病、血液病症、皮月夫病症、肺病症、恶性疾病、内分泌病症、血管病症、感染病症、肾病症、心脏病症、循环病症、代谢病症、骨病症、和肌肉疾病。在其中一种这样的实施方案中，本发明的单^f介抗体针对IL-15。这类单价抗体还可用于在样品或患者内或者在用于治疗这些疾病和病症的免疫毒素或力文射标记方法中体外或体内筛选IL-15。在本发明的一个实施方案中，疾病或病症可通过防止IL-8与其受体结合或通过阻断IL-8的功能得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病或病症可以是例如掌跖脓疱症(PPP)、银屑病或其他皮肤病，炎症性、自身免疫或免疫疾病,例如银屑病关节炎、系统性石更皮病和^5更化症、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、急性肺损伤，例如急性呼吸窘迫综合征或成年呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、多发性骨髓瘤、肾小球肾炎、肾炎、哮喘、动脉硬化、白细胞粘附缺陷(leukocyteadhesiondeficiency)、多发性硬化症、雷诺氏综合征(Raynaud，ssyndrome)、舍格伦综合征、青少年型糖尿病、莱特尔氏病(Reiter，sdisease)、贝赫切特氏病(Behcet'sdisease)、免疫复合物肾炎(immunecomplexnephritis)、IgA肾病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少，例如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、格雷夫斯病病、桥本氏曱状腺炎、小血管炎，例如韦格纳肉芽肿、Omen综合征(Omen，ssyndrome)、慢性肾衰竭、自身免疫性曱状腺病、急性感染性单核细胞增多症、HIV、疱渗病毒相关疾病、人类病毒感染，例如由人类鼻病毒、冠状病毒、其4也肠道病毒、疱渗病毒、；危感病毒、副;克感病毒、呼吸道合胞病毒、或腺病毒感染导致的普通感冒，细菌性肺炎、创伤、败血症、脑卒中/脑水肿、缺血再灌注损伤和丙型肝炎C，酒精性肝炎和急性胰腺炎，涉及IL-8介导的血管新生的疾病,例如肿瘤和癌症，例如黑素瘤、曱状腺癌、移行细胞癌、毛根鞘瘤(trichilemmona)、鳞状细胞癌和乳腺癌。在其中一个这类实施方案中，本发明的单价抗体针对IL-8。这类单价抗体还可用于在样品或患者内或者在用于治疗这些疾病和病症的免疫毒素或放射标记方法中体外或体内筛选IL-8。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过干扰CD20的活性，通过例如免疫毒素或放射标记方法损耗B细胞、干扰B细胞生长和/或增殖而得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病或病症可以是例如类风湿性关节炎、(自身)免疫和炎症性疾病(例如在IL-8相关疾病和病症中所述)、非霍奇金氏淋巴瘤、B-CLL、淋巴组织肿瘤、恶性肿瘤和血液病症、感染性疾病和结締组织病症、神经疾病、胃肠病症、肝病症、变应性疾病、血液病症、皮肤病症、肺病症、恶性疾病、内分泌病症、血管病症、感染性病症、肾病症、心脏病症、循环病症、代谢病症、骨病症、和肌肉疾病，以及免疫介导6勺血纟田月包;咸少、症(immunemediatedcytopenia)。在其中一个这类实施方案中，本发明的单价抗体针对CD20。这类单价抗体还可用于在样品或患者内或者在用于治疗这些疾病和病症的免疫毒素或放射标记方法中体外或体内筛选CD20。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病和病症可通过干扰CD38的活性，通过例如免疫毒素或放射标记方法损耗CD38表达细胞、干扰CD38+细胞生长和/或增殖得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病或病症可以是例》口肿瘤发生(tumorigenic)疾病,例如B细胞淋巴瘤、浆细胞恶化(plasmacellmalignancies)、T/NK细胞淋巴瘤和骨髓恶化(myeloidmalignancies),涉及CD38表达性B细胞、浆细胞、单核细胞和T细月包的免疫疾病,例如自身免疫疾病，如银屑病、银屑病关节炎、皮炎、系统性硬皮病和硬化症、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、肾小球肾炎、湿渗、哮喘、动脉硬化、白细胞粘附缺陷、多发性硬化、雷诺氏综合症、舍格伦综合征、青少年型糖尿病、莱特尔氏病、贝赫切特氏病、免疫复合物肾炎、IgA肾病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少，例如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、重症肌无力、狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、特应性皮炎、天疱疮、格雷夫斯病、桥本氏曱状腺炎、韦格纳肉芽肺、Omen综合征、慢性肾衰竭、急性感染性单核细胞增多症、HIV、和疱渗病毒相关疾病，急性呼吸窘迫综合症和脉络膜视网膜炎(choreoretinitis)，由例如病毒如EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)造成的B细胞感染导致的或介导的疾病或病症，类风湿性关节炎，自身抗体和/或过多的B和T淋巴细胞活性突出的炎症性、免疫和/或自身免疫疾病，例如血管炎以及其他血管病变，如显微镜性多血管炎、丘-斯综合征综合征以及其他ANCA相关血管炎、结节性多动脉炎、原发性冷球蛋白血症性血管炎(essentialcryoglobulinaemicvasculitis)、皮跌白纟田月包石皮碎小生血管炎(cutaneousleukocytoclasticangiitis),川崎病、大动脉炎、大细胞动脉炎、过敏性紫癜(Henoch-Sch加leinpurpum)、原发性或单一性脑血管炎、结节性红斑、血栓闭塞性脉管炎(thrombangiitisobliterans)、血栓性血小板减少性紫癜(包括溶血性尿毒症综合征)、和继发性血管炎，包括皮肤白细胞破碎性血管炎(例如继发于乙型肝炎、丙型肝炎、Waldenstr6m巨J求蛋白血症、B细胞瘤形成(B-cellneoplasias)、类风湿性关节炎、舍格伦综合征、或系统性红斑狼疮)；进一步的实例是结节性红斑、变应性血管炎、脂膜炎、韦勃-克莱斯坦病、高球蛋白血症性紫癜(purpurahyperglobulinaemica)和4白格病(Buerger，sdisease),皮肤病症,例如接触性皮炎、线性IgA皮肤病、白癜风、坏疽性脓皮病、后天性大疱性表皮^"解症(epidermolysisbullosaacquisita)、寻常性天疱瘙(包括瘢痕性类天疱齊和大疱性类天疱疮)、斑壳(包括普先和全壳)、疱渗样皮炎(dermatitisherpetiformis)、多形红斑和慢性自身免疫性荨麻渗(包括血管神经性水肿和荨麻療性血管炎)，免疫介导的血细胞减少,例如自身免疫性嗜中性白细胞减少症和纯红细胞再生障碍，结締组织病症,例如CNS狼痴、盘状红斑狼疳、CREST综合征、混合性结締组织病、多肌炎/皮肌炎，包括体肌炎(bodymyositis)、继发性淀粉样变性、I型和II型冷球蛋白血症、纤维月几痛、磷脂抗体综合征、继发性血友病、复发性多软骨炎(relapsingpolychondritis)、结节病、僵人综合征、和风湿热；进一步的实例是嗜酸细胞性筋膜炎(eosinophilfasciitis)，动脉炎(arthritides).例如强直性脊柱炎、青少年慢性关节炎、成人Still病和SAPHO综合征；进一步的实例是骶骨关节炎(sacroileitis)、反应性关节炎、斯蒂尔病和痛风，血液病症,例如再生障碍性贫血、原发性溶血性贫血(包括冷凝集素综合征)、继发于CLL或系统性红斑狼疮的溶血性贫血、POEMS综合征、恶性贫血和Waldemstr6m高血球蛋白血性紫瘋；进一步的实例是粒细胞缺乏、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、富兰克林氏病(Franklin'sdisease)、塞利才各曼病Seligmann病、(Seligmann，sdisease)、-链病，继发于胸腺瘤和淋巴瘤的癌旁综合征，和因子vin抑制剂形成，内分泌病，例如多内分泌腺病和艾迪生病;进一步的实例有自身免疫性低血糖、自身免疫性曱状腺^a能减退症、自身免疫性胰岛素综合征、德奎尔万氏曱状腺炎(deQuervain，sthyroiditis)和胰岛素受体抗体介导的胰岛素抵抗；肝-胃肠病,例如乳糜泻、惠普尔病、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、和原发硬化性胆管炎；进一步的实例是自身免疫性胃炎，肾病，例如快速进行性肾小球肾炎、链球菌感染后肾炎、古德帕斯丘综合征、膜性肾小球肾炎、和冷球蛋白血症性肾炎；进一步的实例是微小病变疾病(minimalchangedissas6),神经疾病，例如自身免疫性神经病、多神经炎(mononeuritismultiplex)、兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-Eaton'smyasthenicsyndrome)、西登哈姆舞蹈病(Sydenham'schorea)、脊髓痨、和吉兰-巴雷综合征；进一步的实例是脊髓病/热带痉挛性轻截瘫、重症肌无力、急性炎症性脱髓鞘性多神经炎、和慢性炎症性脱髓鞘性多神经炎、多发性硬化症、HIV诱发的痴呆，心肺疾病,例如COPD、纤维化肺泡炎、阻塞性细支气管炎、变应性曲霉病、嚢性纤维变性、吕弗勒综合征(L(3ffler，ssyndrome)、心肌炎和心包炎；进一步的实例是过敏性肺炎和继发于肺癌的瘤外综合征，变应性病症,例如支气管哮喘和高IgE综合征；进一步的实例是一过性黑矇，眼科疾病,例如特发性脉络膜视网膜炎，感染性病症,例如细小病毒B感染(包括手-袜综合征(hands-and-sockssyndrome))，妇产科疾病,例如习惯性流产，习惯性胎儿丧失(recurrentfetalloss)和宫内生长迟緩；进一步的实例是继发于妇科胂瘤的癌旁综合征，男性生殖系统病症,例如继发于睾丸肿瘤的癌旁综合征^和移植衍生疾病,例如.同种异体移植和异种移植排斥和移才直物4元宿主病。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对CD38。这种单价抗体还可以用于对样品或患者中的CD38进行体外或体内筛选。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过阻断配体-EGFr相互作用、阻断EGFr功能、通过例如免疫毒素或^L射标记方法损库毛EGFr表达细胞/干扰EGFr+细胞的生长和/或增殖而得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病和病症可以是例如(过)表达EGFr的癌症,例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、鳞状细胞癌、肺(非小细胞)癌和头颈癌，以及神经胶质瘤，其他EGFr相关疾病,例如自身免疫性疾病、银屑病、炎性关节炎。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对EGFr。这类单价抗体还可用于在样品或患者中对EGFr进行体外或体内筛选。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过干扰CD4的功能、通过例如免疫毒素或放射标记方法损耗CD4表达细胞/干扰CD4+细胞的生长和/或增殖而得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病和病症可以是例如类风湿性关节炎、(自身)免疫性和炎性病症(如上文关于IL-8相关疾病和病症的描述)、皮肤T细胞淋巴瘤、非皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴样肿瘤、恶性和血液疾病、感染性疾病和结締组织病症、神经病症、胃肠病症、肝病症、变应性病症、血液病症、皮月夫病症、肺病症、恶'f生病症、内分泌病症、血管病症、感染病症、肾病症、心病症、循环病症、代谢病症、骨病症和肌肉病症，以及免疫介导的血细胞减少。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对CD4。这类单价抗体还可用于在样品或患者中对CD4进行体外或体内筛选。在本发明的一个实施方案中，针对CD4的单价抗体用于治疗HIV感染或AIDS治疗。在本发明的一个实施方案中，本发明的单价抗体是W097/13852中公开的CD4抗体的单价抗体。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过拮抗和/或抑制CD28的功能，例如防止T细胞激活中需要的共刺激信号，而得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病和病症可以是例如炎症性、自身免疫性和免疫性病症，如上文所述。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对CD28。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过改变组织因子功能，例如改变凝结或抑制组织因子信号传导，而得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病和病症可以是例如血管疾病，例如心血管病、脑血管病、-f见网膜和黄斑变性，和炎症性病症，如前所述。在本发明的一个实施方案中，单价抗体针对组织因子或者因子VII和组织因子复合物。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过干扰丙型肝炎病毒(HCV)感染而得到治疗。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体针对HCV或HCV受体，例如CD81。在本发明的一个实施方案中，单价抗体是WO2000/05266中公开的抗体的根据本发明的单价抗体。在本发明的一个实施方案中，待治疗的疾病或病症可通过防止过敏原与肥大细胞上激活IgE的结合得到治疗。在一个实施方案中，这类疾病和病症可以是例如可用过敏原免疫治疗的变应性疾病，例如哞喘、变应性鼻炎、季节性/常年性过敏、干草热、鼻变态反应、特应性皮炎、湿疹、荨麻疹、荨麻渗、接触性过敏、变应性结膜炎、眼过敏、食物和药物过敏、乳胶过敏、和昆虫过敏。在一个这样的实施方案中，本发明的单价抗体是针对变应原的IgG4无铰链抗体。在某些实施方案中，向患者施用包含与细胞毒素偶联的单价抗体的免疫偶联物。在一些实施方案中，免疫偶联物和/或与之其结合的抗原被细胞内化，使得偶联物杀死其结合的靶细胞的治疗效力提高。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞内的核酸。这些细胞毒剂的实例包括本文提到的任何化学治疗剂(例如美登木素生物碱(maytansinoid)或力n利车霉素(calicheamicin))、放射性同位素、或者核糖核酸酶或DNA核酸内切酶。在一个实施方案中，抗原是人类蛋白分子，受试者是人受试者。在一个实施方案中，受试者可以是非人类哺乳动物，其表达本发明的抗体所结合的抗原。在一个实施方案中，受试者是可以已导入了抗原的哺乳动物(例如通过施用抗原或通过表达抗原转基因)。而且，本发明的单价抗体可以施用给表达与免疫球蛋白交联反应的抗原的非人类哺乳动物(例如灵长动物、猪或小鼠)，用于兽医目的或者作为人类疾病的动物模型。关于后者，这些动物模型对于本发明抗体的治疗效力的评价(例如剂量和给药时程的测试)可能是有用的。在治疗方法中，本发明的单价抗体可以单独使用或者与其他组合物联用。例如，根据待治疗的疾病或症候，本发明的单价抗体可以和一种或多种其它的抗体共同给药，例如本发明的单价抗体、一种或多种化学治疗剂(包括化学治疗剂的合剂(cocktail))、一种或多种其他细胞毒剂、一种或多种抗血管新生剂、一种或多种细胞因子、一种或多种生长抑制剂、一种或多种抗炎剂、一种或多种緩解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，或一种或多种免疫抑制剂。当本发明的单价抗体抑制肺瘤生长时，将它与一种或多种能抑制肿瘤生长的其他治疗剂联用可能是特别理想的。例如，在治疗转移的乳腺癌时，可以将阻断VEGF活性的抗VEGF抗体和抗ErbB抗体(例如曲妥单抗(Trastuzumab)(Herceptin)，一种抗HER2抗体)联用。或者/并且，患者可以接受联合放射治疗(例如体外射束照射或者用放射性标记的试剂例如抗体治疗)。上面提到的联合治疗包括联合给药(其中两种或更多种试剂包含在同一或不同的制剂中)和分别给药，其中本发明抗体的给药可以在施加辅助治疗之前和/或之后发生。在一个实施方案中，本发明的单价抗体是用于治疗Her2阳性癌症的曲妥单抗的单价形式。本发明的单价抗体组合物可以是按配方(formulated)、分剂量(dosed)、和按照与优良医疗实践(goodmedicalpractice)—致的方式给药。在此语境下要考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的特殊哺乳动物、患者个人的临床状况、疾病的起因、试剂的输送部位、给药方法、给药时间安排、和医疗从业人员已知的其他因素。在一个实施方案中，单价抗体可以和一种或多种目前用于预防或治疗目标疾病的试剂一起配制。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明单价抗体的量、待治疗的疾病类型和上面讨论的其他因素。本发明的单价抗体(和辅助治疗剂)可以用任何合适的方法给药，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且如果期望局部治疗，还包括损害内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下给药。此外，单价抗体可以适当地通过脉冲输注，特别是以逐渐降低的剂量给药84单价抗体。剂量给药可以是任何合适的途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于给药是短暂的还是长时间的。为了预防或治疗疾病，本发明单价抗体的合适剂量(单独使用或与其他试剂如化学治疗剂联用)将取决于待治疗的疾病类型，抗体类型，疾病的严重程度和进程，单价抗体是为预防、治疗还是诊断目的给药，先前的治疗方法，患者的病史和对抗体的响应，以及诊断医师的裁量。单价抗体可以适当地向患者一次性给药或通过一系列治疗给药。这些剂量可以间歇给药，例如每周或每三周(例如使患者接受大约2个隱大约20个，例如大约6个剂量的单价抗体)。也可以开始用较高的负荷剂量，随后用一个或多个较低的剂量。一个剂量方案实例包括单价抗体的初始负荷剂量为大约4mg/kg，随后每周一个大约2mg/kg的维持剂量。然而，也可以使用其他的剂量方案。在一个实施方案中，本发明单价抗体的每周给药剂量为50mg画4000mg，例如250mg-2000mg,例如300mg、500mg、700mg、1000mg、1500mg或2000mg，最高达8次，例如4-6次。每周剂量可以分成2或3个亚剂量，在超过l天的时间内给药。例如300mg的剂量可以分为2天给药，第一(l)天100mg，第二(2)天200mg。500mg的剂量可以分成3天给药，第一(l)天100mg，第二(2)天200mg，第三(3)天200mg,700mg的剂量可以分成3天给药，第一(l)天100mg，第二(2)天300mg，第三(3)天300mg。在例如6个月或12个月后，根据需要，可以重复1次或多次该方案。剂量可以通过测量给药时生物样品中的循环中的(circulating)本发明单价抗体的量来加以确定或调节，例如通过使用靶向所述单价抗体的抗独特型抗体。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以通过维持治疗给药(maintenancetherapy),例如每周一次，持续6个月或者更长。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可以根据如下方案给药，包括输注本发明的单价抗体，随后输注与放射性同位素偶联的相同单价抗体。可以在例如7-9天后重复该方案。该治疗的过程通过常规的技术和测定方法进行监控。本发明提供了一种制品，它含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。本发明的一种制品包括容器和该容器上或与该容器一起的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以用多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器装有组合物，其本身或者与其他组合物联合时可有效地用于治疗、预防和/或诊断病症；容器可以有一个无菌通道(accessport)(例如该容器可以是静脉内溶液袋或者具有可被皮下注射针头刺透的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的单价抗体。标签或包装说明书标明组合物用于治疗选定的病症，例如癌症。而且，制品可以包括(a)内含组合物的第一容器，其中该组合物含有本发明的单价抗体；和(b)内含组合物的第二容器，其中该组合物含有其它细胞毒制剂。本发明的这个实施方案的制品可以进一步包括包装说明书，其标明第一和第二组合物可用于治疗特定的病症，例如癌症。或者/并且，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，其含有药物可接受的緩沖液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐緩沖盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以进一步包括从其他商业和用户立场上期望的材料，包括其他緩冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。本发明的范围还包括含有本发明的药物组合物和使用说明书的试剂盒，该药物组合物含有一种或多种本发明的单价抗体。该试剂盒可以进一步包括一种或多种额外的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒剂或放射性毒剂，这取决于待治疗的疾病或病症，或者一种或多种额外的本发明单价抗体(例如具有互补的活性的单价抗体)。在一个实施方案中，本发明提供了检测样品中单价抗体所结合的特异抗原的存在，或者测量所述特异抗原的量的方法，包括在允许在抗体或其部分与所述抗原之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异结合所述抗原的单价抗体接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比形成不同的复合物表明样品中存在所述抗原。在一个实施方案中，本发明的单价抗体可用于检测单价抗体所结合的循环中的特异抗原的水平，或者在膜表面上含有所述特异抗原的细胞的水平，而后可以将上述水平与特定疾病症状联系起来。或者，抗体可用于损耗表达所述抗原的细胞或干扰其功能，从而提示这些细胞是疾病的重要介导物。这可以通过在允许抗体与所述特异抗原之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与单价抗体接触而实现。检测并比较样品与对照品中抗体与所述抗原之间形成的任何复合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于体外或体内检测表达单价抗体所结合的特异抗原的细胞的存在和确定所述细胞的量的方法。该方法包括(i)向受试者施用与可^r测标记偶联的本发明单价抗体；(ii)使受试者暴露于用于检测所述可检测标记的装置，以确定含有表达所述抗原的细胞的区域。在一个实施方案中，可利用本发明的单价抗体与化合物(例如治疗剂、标签、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)连接，使所述化合物靶向表面上表达有单价抗体所结合的特异抗原的细胞。因此，本发明还提供了用于离体或体外定位表达所述抗原的细胞，例如Reed-Sternberg细胞(例如具有可检测标签如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子)的方法。下面列举了本发明选出的实施方案。实施方案1:制造单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VL区的核苷酸序列和编码Ig恒定区的核苷酸序列，其中所述编码选定的抗原特异性抗体Vx^区的核苷酸序列和所述编码IgCL区的核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgGl亚型的情况下，编码CL区的核苦酸序列经过修饰，从而使CL区不含有任何能够和其它包含与Cl区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价结合的氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苦酸序列和编码人Ig恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，从而使相应于CH区4交链区，以及如Ig亚型所需的，Ch区的其它区域(如Ch3区)的区域不含有任何参与同其它包含与所述人IgCH区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价或非共价重链间键的氨基酸残基，其中所述编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苷酸序列和编码所述IgCH区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。实施方案2:4艮据实施方案1的方法，其中人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。实施方案3:才艮据实施方案1的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氛基酸Ch区的IgGl，其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换2!38位的Arg(R)被Gln(Q)替换；239位的Asp(D)被Glu(E)替换；292位的Lys(K)被Arg(R)替换；302位的Gin(Q)被Glu(E)替换；和328位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案4:根据实施方案3的方法，其中238位的Arg(R)被Gln(Q)替换。实施方案5:根据实施方案3的方法，其中238位的Arg(R)被Gln(Q)替换，328位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案6:根据实施方案3的方法，其中发生了全部5种替换。实施方案7:^f艮据实施方案1或3的方法，其中人Ig是IgGl，并且Cl区是具有如SEQIDNO:18所示之氨基酸序列的k轻链CL,其中C^区经过修饰，从而使106位的末端半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。在一个实施方案中其被删除。实施方案8:根据实施方案1或3的方法，其中人Ig是IgGl，并且Q区是具有如SEQIDNO:17所示之氨基酸序列的X轻链CL，其中CL区经过修饰，从而使104位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。在一个实施方案中其被删除。实施方案9:根据实施方案1、3、7或8的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl,其中CH1区经过修饰，从而使14位的Ser(S)被半胱氨酸残基替换。实施方案10:根据实施方案1的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:20所示之氨基酸CH区的IgG2，其中CH3区经过修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)被Gln(Q)替换；276位的Met(M)被Val(V)替换；288位的Lys(K)被Arg(R)替换；298位的Gln(Q)被Glu(E)替换；和324位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案ll:根据实施方案IO的方法，其中234位的Arg(R)被Gln(Q)替换。实施方案12:根据实施方案10的方法，其中234位的Arg(R)被Gln(Q)替换；324位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案13:根据实施方案10的方法，其中发生了全部5种替换。实施方案14:根据实施方案1的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:21所示之氨基酸CH区的IgG3，其中CH3区经过修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)被Gln(Q)替换；314位的Ser(S)被Asn(N)替换；322位的Asn(N)被Lys(K)替换；327位的Met(M)被Val(V)替换；339位的Lys(K)被Arg(R)替换；349位的Gin(Q)被Glu(E)替换；352位的lie(I)被Val(V)替换；365位的Arg(R)被His(H)替换；366位的Phe(F)被Tyr(Y)替换；和375位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案15:根据实施方案14的方法，其中285位的Arg(R)被Gln(Q)替换。实施方案16:根据实施方案14的方法，其中285位的Arg(R)被Gln(Q)替换；375位的Pro(P)被Leu(L)替换。实施方案17:根据实施方案14的方法，其中发生了全部IO种替换。实施方案18:用于产生单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体区的核苦酸序列和编码Ig恒定(CO区的核苷酸序列，其中编码选定的抗原特异性抗体Vl区的所述核苷酸序列和编码IgCL区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苷酸序列和编码人IgG4CH区的核苦酸序列，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而相应于重链铰链区的区域不含有任何能够参与同其它包含与该人IgG4恒定(Q0区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键的氨基酸残基，其中所述编码选定的抗原特异性抗体VH区的核酸和所述编码所述IgG4CH区的核酸可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。实施方案19:根据实施方案l-18任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于重链铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。实施方案20:根据实施方案l-19任一项的方法，其中所产生的单价抗体是人源抗体。实施方案21:根据实施方案l-20任一项的方法，其中所产生的单价抗体不与合成抗原(Tyr,Glu)-Ala-Lys结合。实施方案22:根据实施方案1-21任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其他氨基酸残基替换。实施方案23:根据实施方案22的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使铰链区的半胱氨酸残基被具有不带电荷极性侧链或非极性侧链的氨基酸替换。实施方案24:根据实施方案22或23的方法，其中具有不带电荷极性侧链的氨基酸独立地从下组选择甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，具有非极性侧链的氨基酸独立地从下组选择丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和曱硫氨酸。实施方案25:根据实施方案22的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括IgG4CH区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸的氨基酸被删除。实施方案26:才艮据实施方案22或实施方案25的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括IgG4CH区，其中至少有相应于SEQIDNo:14所示序列第106-109位氨基酸残基的氨基酸残基被删除。实施方案27:根据实施方案22-26中人一个实施方案的方法，其中该编码重链的核酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的Ch区，其中至少有相应于SEQIDNo:14所示序列第99-110位氨基酸残基的氨基酸残基^皮删除。实施方案28:4艮据实施方案22-27任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰从而使整个铰链区被删除。实施方案29:根据实施方案l-28任一项的方法，其中编码所述单价抗体重链的核酸构建体包括编码人IgG4CH区的核苷酸序列，其中编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点的至少一个核芬酸被另一种核苷酸替换。实施方案30:根据实施方案29的方法，其中编码所述单价抗体重链的核酸构建体包括编码人IgG4CH区的核苷酸序列，其中相应于SEQIDNo:13所示序列第714和722位核苷酸的核苷酸分别被替换为与SEQIDNo:13该位置上的核苷酸不同的核苷酸。实施方案31:根据实施方案30的方法，其中该编码所述单价抗体重链的核酸构建体包括编码包含SEQIDNo:13的人IgG4CH区的核苷酸序列，其中SEQIDNo:13所示序列第714和722位的核苷酸的每一个^^皮与SEQIDNo:13该位置的核苷酸不同的核苷酸替换。实施方案32:根据实施方案31的方法，其中该编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含SEQIDNo:15的核苷酸序列。实施方案33:根据实施方案22的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使该重链包括ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被不同于半胱氨酸的氨基酸残基替换。实施方案34:根据实施方案29-33任一项的方法，其中编码ch区铰链区的核酸序列的替换核苷酸是用定点诱变替换的。实施方案35:根据实施方案l-34任一项的方法，其中编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包括编码人IgG之k链CL区的序列。实施方案36:根据实施方案35的方法，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:l的核苷酸序列。实施方案37:根据实施方案l-34任一项的方法，其中编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包括编码人IgG之X链CL区的序列。实施方案38:才艮据实施方案37的方法，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:3的核苷酸序列。实施方案39:根据实施方案l-38任一项的方法，其中该核酸构建体是DNA构建体。实施方案40:才艮据实施方案l-39任一项的方法，其中(i)，(ii)，(iii)和/或(iv)的核酸构建体是原核表达载体。实施方案41:根据实施方案l-40任一项的方法，其中该细胞表达系统是原核细胞表达系统。实施方案42:根据实施方案41的方法，其中该原核细胞表达系统包含大肠杆菌细胞。实施方案43:根据实施方案42的方法，其中大肠杆菌细胞是内源蛋白酶活性缺陷菌抹的大肠杆菌细胞。实施方案44:根据实施方案l-39任一项的方法，其中(i)，(ii)，(iii)和/或(iv)的核酸构建体是真核表达载体。实施方案45:才艮据实施方案44的方法，其中该细胞表达系统是真核细胞表达系统。实施方案46:根据实施方案45的方法，其中该细胞表达系统是哺乳动物细胞表达系统。实施方案47:才艮据实施方案46的方法，其中该哺乳动物细胞表达系统包含CHO细胞。实施方案48:才艮据实施方案46的方法，其中该哺乳动物细胞表达系统包含HEK-293F细胞。实施方案49:根据实施方案l-39任一项的方法，其中表达系统的i)和ii)包含适合于基因治疗的DNA构建体。实施方案50:根据实施方案l-39任一项的方法，其中表达系统的i)和ii)是适合于基因治疗的病毒构建体。实施方案51:根据实施方案l-39任一项的方法，其中哺乳动物细胞表达系统的iii)是包含i)和ii)的人类细胞，并且其适合于植入到需要用所产生的单价抗体治疗的患者体内。实施方案52:才艮据实施方案51的方法，其中该人类细胞源于患者。实施方案53:根据实施方案1-51任一项的方法，其中所产生的单价抗体是用于药物用途的。实施方案53a:根据实施方案l-53任一项的方法，其中i)和ii)的核酸构建体在同一质粒中。实施方案53b:根据实施方案l-53任一项的方法，其中在两种不同的细胞系中产生抗体，并在体外表达后组装抗体。实施方案54:—种单价抗体，通过使用根据实施方案1-50和53任一项的方法获得。实施方案55:—种单价抗体，可通过使用根据实施方案1-50和53任一项的方法获得。实施方案56:—种单价抗体，包含轻链和重链，其中a)所述轻链包含选定的抗原特异性抗体可变(VO区的氨基酸序列和Ig恒定(CO区的氨基酸序列，并且其中，在IgGl亚型的情况下，恒定(Ct)区的氨基酸序列经过修饰，从而不含有任何能够参与和其它包含与该Ig恒定(QJ区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价键的氨基酸；和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体可变(VH)区的氨基酸序列和人Ig恒定(CH)区的氨基酸序列，其中恒定(CH)区的氨基酸序列经过修饰，从而使CH区铰链区以及例如Ig亚型所需的其它区域，如CH3区，不含有任何参与和其它包含与人Ig恒定(QO区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或者形成共价或稳定非共价的重链间键的氨基酸残基。实施方案57:根据实施方案56的单价抗体，其中该人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、或IgGA抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。实施方案58:—种单价抗体，包含轻链和重链，其中a)所述轻链由选定的抗原特异性抗体可变(VL)区的氨基酸序列和Ig恒定(CO区的氨基酸序列，和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体可变(VH)区的氨基酸序列和人IgG4恒定(CH)区的氨基酸序列，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内的任何氨基酸残基均不能参与同其它包含与人IgG4恒定(CH)区相同的氨基酸序列的肽形成稳定的二硫键。实施方案59:根据实施方案56-58任一项的单价抗体，其中Cl区是人IgG之k轻链的恒定区。实施方案60:根据实施方案59的单价抗体，其中CL区包含SEQIDNo:2的氨基酸序列。实施方案61:根据实施方案56-58任一项的单价抗体，其中Cl区是人IgG之X轻链的恒定区。实施方案62:根据实施方案61的单价抗体，其中Cl区包含SEQIDNo:4的氨基酸序列。实施方案63:根据实施方案54-62任一项的单价抗体，其中该轻链和重链通过一个或多个二辟d建相互连接。实施方案64:根据实施方案54-63任一项的单价抗体，其中该轻链和重链通过酰胺键相互连接。实施方案65:根据实施方案54-64任一项的单价抗体，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。实施方案66:根据实施方案54-65任一项的单价抗体，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其他氨基酸残基替换。实施方案67:根据实施方案54-66任一项的单价抗体，其中铰链区的半胱氨酸残基被具有不带电荷极性侧链或非极性侧链的氨基酸替换。实施方案68:根据实施方案67的单价抗体，其中具有不带电荷极性侧链的氨基酸独立地从下组选择甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，具有非极性侧链的氨基酸独立地从下组选择丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸。实施方案69:根据实施方案68的单价抗体，其中重链的氨基酸序列经过修饰从而使重链包含这样的ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸的氨基酸被删除。实施方案70:根据实施方案66或69的单价抗体，其中该重链的氨基酸序列经过修饰从而使重链包括这样的IgG4ch区，其中至少有相应于SEQIDNo:14所示序列第106-109位氨基酸残基的氨残基被删除。实施方案71:根据实施方案66-70的单价抗体，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的IgG4CH区，其中至少有相应于SEQIDNo:14所示序列第99-110位氨基酸残基的氨基酸残基被删除。实施方案72:根据实施方案66-71任一项的单价抗体，其中整个铰链区净皮删除。实施方案73:根据实施方案66-72任一项的单价抗体，其中该重链包含SEQIDNo:16的氨基酸序列。实施方案74:根据实施方案66的单价抗体，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的IgG4Ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。实施方案75:根据实施方案66的单价抗体，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包括这样的Ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基之一被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，例如实施方式67或68中公开的氨基酸残基；而相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的另一氨基酸残基被删除。实施方案76:根据实施方案75的单价抗体，其中相应于氨基酸残基106的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，相应于氨基酸残基109的氨基酸残基被删除。实施方案77:根据实施方案75的单价抗体，其中相应于氨基酸残基106的氨基酸残基被删除，而相应于氨基酸残基109的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，例如实施方式67或68中公开的氨基酸残基。实施方案78:才艮据实施方案54-77任一项的单〗介抗体，其中所述抗体可以通过包括在细胞表达系统中体外重组表达该抗体的方法获得。实施方案79:根据实施方案78的单价抗体，其中该方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VL区的核苷酸序列和编码IgGCL区的核苷酸序列，ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苦酸序列和编码人IgG4CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，从而使得相应于铰链区的区域不含有任何参与形成二碌J建的氨基酸残基；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。实施方案80:根据实施方案79的单价抗体，其中人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2、IgG4抗体。实施方案81:根据实施方案78的单价抗体，其中该方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VL区的核苷酸序列和编码IgGd区的核苷酸序列；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体VH区的核苷酸序列和编码人IgG4CH区的核苷酸序列，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何能够参与形成二疏键的氨基酸残基；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达所述核酸构建体产生所述单价抗体，该抗体包括由(i)的核酸构建体编码的轻链和由(ii)的核酸构建体编码的重链。实施方案82:根据实施方案54-81任一项的单价抗体，该单价抗体在以4mg/kg的剂量体内施用时，其血浆浓度在10pg/ml以上超过7天。实施方案83:根据实施方案82的单价抗体，其中在以4mg/kg的剂量体内施用于SCID小鼠时，单价抗体的血浆浓度在10pg/ml以上超过7天。实施方案84:才艮据实施方案54-83任一项的单价抗体，该单价抗体的血浆清除比F(ab，)2片段的血浆清除慢10倍。实施方案85:根据实施方案84的单价抗体，其中F(ab，)2片段的序列与单价抗体相应区域的序列相同。实施方案86:根据实施方案84的单价抗体，其中血浆清除用SCID小鼠测量。实施方案87:根据实施方案86的单价抗体，其中F(ab，)2片段的Vh区和区与单价抗体的VH区和区相同。实施方案88:根据实施方案54-87任一项的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用时，其半衰期至少为5天。实施方案89:根据实施方案54-87任一项的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用时，其半衰期至少为5天，最高达21天。实施方案90:根据实施方案54-87任一项的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用时，其半衰期至少为5天，最高达14天。实施方案91:根据实施方案54-87任一项的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用时，其半衰期至少为14天。实施方案92:根据实施方案54-87任一项的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用时，其半衰期至少为21天。实施方案93:根据实施方案88的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用于SCID小鼠时，其半衰期至少为5天。实施方案94:根据实施方案54-93任一项的单价抗体，其中所述抗体能够与FcRn结合。实施方案95:根据实施方案54-94任一项的单价抗体，其特异结合肿瘤抗原。实施方案96:根据实施方案54-95任一项的单价抗体，其特异结合在受体二聚体化时激活的细胞表面受体。实施方案97:根据实施方案54-96任一项的单价抗体，其中该单价抗体在与靶分子结合时，抑制靶分子多聚体化和/或聚集。实施方案98:根据实施方案54-97任一项的单价抗体，其中该单价抗体与从下组选择的靶标结合VEGF,cMet,CD20，CD38,IL-8，CD25，CD74,FcalphaRI,FcepsilonRI,乙酰胆碱受体，fas，fasL，TRAIL,肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒的被膜E2，组织因子，组织因子与因子VII的复合物，EGFr,CD4，和CD28。实施方案99:根据实施方案54-97任一项的单价抗体，其中该单价抗体与从下组选择的靶标特异结合VEGF,cMet，CD20,CD38,IL-8,CD25，CD74，FcalphaRI,FcepsilonRI,乙酰胆碱受体，fas,fasL，TRAIL,肝炎病毒,丙型肝炎病毒，组织因子，组织因子与因子VII的复合物，EGFr，CD4,和CD28。实施方案100:4艮据实施方案56-97任一项的单价IgG4抗-cMet抗体。实施方案101:根据实施方案54-100任一项的单价抗体，其在存在多克隆人IgG时处于单价形式。实施方案102:根据实施方案54-100任一项的单价抗体，其在施用给人类时处于单价形式。实施方案103:根据实施方案54-100任一项的单价抗体，其在存在多克隆人IgG时解离成单价形式。实施方案104:根据实施方案54-100任一项的单价抗体，其在施用给人类时解离成单价形式。实施方案105:根据实施方案56-104任一项的单价抗体，其中所述抗体不能与效应物结合。实施方案106:根据实施方案54-104任一项的单价抗体，其中该抗体生产用于药物用途。实施方案107:制备实施方案54-106任一项的单价抗体的方法，该方法包括如下步骤a)培养包含编码所述单价抗体的核酸的宿主细胞；和97b)从宿主细胞培养物中回收单价抗体。实施方案108:根据实施方案107的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。实施方案109:根据实施方案108的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。实施方案110:根据实施方案109的方法，其中大肠杆菌细胞是内源蛋白酶活性缺陷菌抹的细胞。实施方案111:根据实施方案107的方法，其中所述宿主细胞是真核的。实施方案112:4艮据实施方案111的方法，其中所述宿主细胞是HEK-293F细胞。实施方案113:根据实施方案111的方法，其中该宿主细胞是CHO细胞。实施方案114:根据实施方案111的方法，其中该宿主细胞是人类细胞。实施方案115:根据实施方案107-114任一项的方法，其中该单价抗体从培养基回收。实施方案116:根据实施方案107-114任一项的方法，其中该单价抗体从细胞裂解物中回收。实施方案117:—种核酸构建体，包括编码IgG4CH区的核酸序列，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，使得相应于所述Ch区中铰链区的区域不含有任何能够参与和其他包含与所述CH区氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽形成稳定二硫键的氨基酸残基；或其互补序列。实施方案118:根据实施方案117的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。实施方案119:根据实施方案117或实施方案118的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域内的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被其它氨基酸残基替换。实施方案120:根据实施方案119的核酸构建体，其中该编码IgG4CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位的氨基酸被删除。实施方案121:根据实施方案119或实施方案120的核酸构建体，其中该编码IgG4CH区的核酸序列经过^务饰，从而4吏至少相应于SEQIDNo:14所示序列第106-109位氨基酸的氨基酸残基被删除。实施方案122:根据实施方案119-121任一项的核酸构建体，其中该编码IgG4CH区的核酸序列经过修饰，从而使至少相应于SEQIDNo:14所示序列第99-110位氨基酸的氨基酸残基被删除。实施方案123:根据实施方案119-122任一项的核酸构建体，其中该编码IgG4CH区的核酸序列经过修饰，从而使整个铰链区被删除。实施方案124:根据实施方案117-123任一项的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点的至少一个核苷酸被另一种核苷酸替换。实施方案125:根据实施方案124的核酸构建体，其中相应于SEQIDNo:13所示序列第714和722位核苦酸的核苷酸被替换为不同于SEQIDNo:13所示序列该位置上存在的核苷酸的核苷酸。实施方案126:#4居实施方案125的核酸构建体，其中编码IgG4CH区的核酸序列包含SEQIDNo:13所示序列，其中SEQIDNo:13所示序列的第714和722位核苷酸^皮替换为不同于序列SEQIDNo:13该位置上的核普酸的核苷酸。实施方案127:根据实施方案126的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列包含SEQIDNo:15所示的核苦酸序列。实施方案128:根据实施方案119的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于SEQIDNo:14所示序列第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被不同于半胱氨酸的残基替换。实施方案129:4艮据实施方案124-128任一项的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列的被替换核苷酸是通过定点突变替换的。实施方案130:根据实施方案117-129任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含编码抗原特异性抗体VH区的核酸序列或其互补序列。实施方案131:根据实施方案130的核酸构建体，其中编码Vpj区的核酸序列与编码CH区的核酸序列或其互补序列可操作地连接。实施方案132:根据实施方案117-131任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含编码根据实施方案54-106任一项的单价抗体的重链的核苷酸序列。实施方案133:根据实施方案132的核酸构建体，其中所述构建体包含编码4艮据实施方案54-106任一项的单价抗体VL区的核酸序列。实施方案134:根据实施方案133的核酸构建体，其中编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包含编码人IgG之k链CL区的序列。实施方案135:根据实施方案134的核酸构建体，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:l的核苷酸序列。实施方案136:根据实施方案133的核酸构建体，其中编码所述单价抗体轻链的核酸构建体包含编码人IgG之？i链CL区的序列。实施方案137:根据实施方案136的核酸构建体，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:3的核苷酸序列。实施方案138:根据实施方案117-137任一项的核酸构建体，其中该核酸构建体是DNA构建体。实施方案139:根据实施方案117-138任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体是表达载体。实施方案140:根据实施方案139的核酸构建体，原核表达载体。实施方案141:根据实施方案139的核酸构建体，真核表达载体。实施方案142:根据实施方案141的核酸构建体，哺乳动物表达载体。实施方案143:根据实施方案142的核酸构建体，合于人基因治疗。实施方案144:才艮据实施方案139的核酸构建体，适合于人基因治疗的病毒载体。实施方案145:制备根据实施方案54-106任一项的单价抗体的方法，包括培养宿主细胞，从而使多肽表达，并从细胞培养物回收单价抗体；所述宿主细胞含有根据实施方案117-144任一项的核酸构建体，并且，如果所述核酸构建体不编码所述抗体的轻链，还含有包含编码所述抗体轻链的核酸序列的核酸构建体。实施方案146:根据实施方案145的方法，其中从细胞裂解物中回收该单价抗体。实施方案147:根据实施方案145的方法，其中从细胞培养基中回收该单价抗体。实施方案148:根据实施方案117-144任一项的核酸构建体用于产生才艮据实施方案54-106任一项的单价抗体的用途。实施方案149:才艮据实施方案148或170的用途，其中单价抗体的生产包括使用根据实施方案l-53任一项的方法。实施方案150:宿主细胞，其包含才艮据实施方案117-144任一项的核酸。实施方案151:根据实施方案150的宿主细胞，该宿主细胞是原核细胞。实施方案152:根据实施方案151的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。实施方案153:根据实施方案150的宿主细胞，该宿主细胞是真核细胞。实施方案154:根据实施方案153的宿主细胞，该宿主细胞是哺乳动物细胞。实施方案155:根据实施方案154的宿主细胞，该宿主细胞是CHO细胞。实施方案156:根据实施方案154的宿主细胞，该宿主细胞是HEK-293F细胞。实施方案157:根据实施方案154的宿主细胞，该宿主细胞是人类细胞。实施方案158:根据实施方案154的宿主细胞，该宿主细胞是源于患者的人类细胞。实施方案159:根据实施方案154的宿主细胞，该宿主细胞是患者体内的人类细胞。实施方案160:宿主细胞，其包含根据实施方案132-144任一项的核酸。实施方案161:根据实施方案160的宿主细胞，该宿主细胞是原核细胞。实施方案162:根据实施方案161的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。实施方案163:#4居实施方案162的宿主细胞，该宿主细胞是真核细胞。实施方案164:才艮据实施方案163的宿主细胞，该宿主细胞是哺乳动物细胞。实施方案165:根据实施方案164的宿主细胞，该宿主细胞是CHO细胞。实施方案166:根据实施方案164的宿主细胞，该宿主细胞是HEK-293F细胞。实施方案167:制备根据实施方案54-106任一项的单价抗体的方法，包括培养根据实施方案160-166任一项的宿主细胞，该宿主细胞包含编码所述抗体轻链的核酸序列，从而表达多肽，并从细胞培养物中回收该单价抗体。实施方案168:根据实施方案167的方法，其中从细胞裂解物中回收所述单价抗体。实施方案169:根据实施方案167的方法，其中从细胞培养物中回收所述单价抗体。实施方案170:才艮据实施方案150-159任一项的宿主细胞用于产生根据实施方案54-106任一项的单价抗体的用途。实施方案171:根据实施方案170的用途，其中该单价抗体的产生包括使用根据实施方案l-53任一项的方法。实施方案172:—种免疫偶联物，包括与治疗性模块偶联的根据实施方案54-106任一项的单价抗体。实施方案173:根据实施方案172的免疫偶联物，其中该治疗性模块是细胞毒素、化学治疗剂、免疫抑制剂或放射性同位素。实施方案174:用作药物的根据实施方案54-106任一项的单价抗体。实施方案175:用作药物的根据实施方案174的单价抗体，所述药物治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症的药物，其中该抗体特异结合给定的靶标或靶表位，其中抗体与所述耙标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。实施方案176:用作药物的根据实施方案174或实施方案175的单价抗体，该疾病或病症可通过施用针对特定靶标的抗体得到治疗，其中对于实现抗体施用的效果而言，免疫系统介导活性的参与不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案177:作为治疗疾病或病症的药物的#4居实施方案174-176任一项的单〗介抗体，该疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化可以形成不希望的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案178:作为治疗疾病或病症的药物的根据实施方案174-176任一项的单价抗体，该疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。实施方案179:根据实施方案54-106任一项的单价抗体作为药物的用途。实施方案180:根据实施方案179的用途，其中该药物可用于治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症，其中该抗体特异结合给定的耙标或耙表位，抗体与所述耙标或耙表位的结合对治疗所述疾病有效。实施方案181:根据实施方案179或实施方案180的用途，其中该药物可用于治疗疾病或病症，该疾病或病症可通过施用针^f特定輩巴标的抗体得到治疗，其中对于实现该抗体施用效果而言，免疫系统介导活性的参与不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案182:根据实施方案179-181任一项的用途，其中该药物可用于治疗疾病或病症，该疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化可以形成不希望的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案183:根据实施方案179-181任一项的用途，其中该药物可用于治疗疾病或病症，该疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。实施方案184:根据实施方案54-106任一项的抗体在制备用于治疗癌症、细月包增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症的药物组合物中的用途，其中该抗体特异结合给定的耙标或靶表位，抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。实施方案185:才艮据实施方案54-106任一个或实施方案184的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症可通过施用针对特定靶标的抗体得到治疗，其中免疫系统介导活性的参与对于抗体施用效果的实现而言不是所必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案186:才艮据实施方案54-106任一个或实施方案184或实施方案185的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不希望的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异结合。实施方案187:根据实施方案54-106任一个或实施方案184或实施方案185的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异结合。实施方案188:用于抑制罹患疾病或病症的受试者体内抗原的方法，所述疾病或病症中抗原的活性是不利的，该方法包括向受试者施用根据实施方案54-106任一项的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或根据实施方案117-144任一项的核酸构建体，从而使受试者体内该抗原的活性受到抑制。实施方案189:用于治疗疾病或病症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据实施方案54-106任一项的单价抗体、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的免疫偶联物或根据实施方案117-144任一项的核酸构建体，藉此对疾病或病症进行治疗。实施方案190:才艮据实施方案189的方法，其中所述疾病或病症是癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症性病症和/或血管新生病症，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据实施方案54-106任一项的单价抗体、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的免疫偶联物或根据实施方案117-144任一项的核酸构建体，其中该抗体与所述抗原特异结合，并且其中该抗体与给定的靶标或靶表位特异结合，其中抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。实施方案191:根据实施方案189或实施方案190的方法，其中所述疾病或病症可通过施用针对特定靶标的抗体得到治疗，其中免疫系统介导活性的参与对于实现抗体施用效果不是必需的或者是不利的，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据实施方案54-106任一项的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或根据实施方案117-144任一项的核酸构建体。实施方案192:才艮据实施方案189-191任一项的方法，其中所述疾病或病症可通过阻断或抑制可溶抗原得到治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不希望的免疫复合物，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据实施方案54-106任一项的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或^4居实施方案117-144任一项的核酸构建体。实施方案193:根据实施方案189-191任一项的方法，其中所述疾病或病症可通过阻断或抑制细胞膜结合受体得到治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据实施方案54-106任一项的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或#4居实施方案117-144任一项的核酸构建体。实施方案194:才艮据实施方案189-193任一项的方法，包括向受试者施用一种或多种其它治疗剂。实施方案195:药物组合物，其包括根据实施方案56-106任一项的单价抗体，以及一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。实施方案196:—种转基因动物，其含有根据实施方案117-144任一项的核酸构建体。实施方案197:根据实施方案54-106任一项的单价抗体作为诊断剂的用途。实施方案198:—种鉴定具有长半衰期的单价抗体或单价抗体片段的方法，其中测试该单价抗体或抗体片段的FcRn保护抗清除作用。实施方案199:一种单价抗体或抗体片段，其受FcRn保护而耐清除。实施方案200:根据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天。实施方案201:根据权利要求199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天，最高达21天。实施方案202:根据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天，最高达14天。实施方案203:根据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少14天。实施方案204:根据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少21天。实施方案205:根据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在SCID小鼠体内施用时，其半衰期为至少5天。实施方案206:才艮据实施方案199的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段能够结合FcRn。本发明通过如下的实施例进行进一步的说明，这些实施例不应被解释为进一步的限制。实施例实施例1,凝芬凝々浙和尸C7,增寡核脊酸引物由IsogenBioscience(Maarssen,TheNetherlands)合成和定量。引物在1120中溶解至100pmol/nl，并保存在-20。C。全部PCR和测序引物的概要已制成表格(图1)。对于PCR，根据制造商的说明书使用PfliTurboHotstartDNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam,TheNetherlands)。每个反应混合物含有200nM混合dNTP(RocheDiagnostics,Almere，TheNetherlands),6.7pmol正向和反向引物、100ng基因组DNA或1ng质粒DNA、和1单位PfliTurboHotstartDNA聚合酶，溶于PCR反应緩沖液(与聚合酶一起提供)中，总体积为20pl。PCR反应用TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,Germany)进行，使用32个循环的程序95。C变性2min;95。C30sec、60-70°C梯度(或者其他具体的退火温度)30sec和72。C3min,进行30个循环；最后在72°C延伸10min。如果恰当，在进一步的分析或处理之前，将PCR混合物保存在4°C。实施例2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳才艮据Sambrook(SambrookJ.andRussel,D.V.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarbor,2000)进行，用50ml凝胶，在1xTris乙酸EDTA緩冲液中进行。通过在凝胶中加入溴化乙锭并在UV光下观察来显现DNA。用CCD照相机和图象分析系统(GeneGnome;Syngene，viaWestburgB.V"Leusden,TheNetherlands)i己录凝月交图象。实施例3分浙和^化尸CA,錄和凝席,參使用MinElutePCR纯4匕i式剂盒(Qiagen,viaWestburg,Leusden,TheNetherlands;产品号28006)根据制造商的说明书进行期望PCR片段的纯化。分离的DNA通过UV分光光度法定量，并通过琼脂糖凝胶电泳对质量进行评估。选择地，PCR或酶解产物通过琼脂糖凝胶电泳(例如当存在多种片段时)用l%Tris乙酸EDTA琼脂糖凝胶分离。从凝胶切下期望的片段并用QIAEXII凝胶提取试剂盒(Qiagen;产品号20051)才艮据制造商的说明书加以回收。实施例4遞迈C/F力V^充^法^DA^;C量核酸的光密度用NanoDropND-1000分光光度计(IsogenLifeScience,Maarssen,TheNetherlands)根据制造商的说明书加以确定。通过分析260nm的光密度(OD)(1个0026。腿单位=50pg/ml)测量DNA浓度。对于全部样品，使用溶解核酸的緩沖液作为参比。实施例5艰斜躇^化限制酶和附带材料从NewEnglandBiolabs(Beverly,MA,USA)或Fermetas(Vilnius,Lithuania)获得，并根据制造商的用法说明使用。DNA(100ng)用5个单位的酶在合适的緩冲液中在10pi的最终体积(反应体积根据需要按比例放大)下进行消化。将消化反应物在推荐的温度下温育最少60min。对于需要用涉及不相容的緩冲液或温度的限制酶进行双消化的片段，则顺次进行消化。如果需要，消化产物通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶切割进行纯化。107实施例6DNA片段的连接用QuickLigation试剂盒(NewEnglandBiolabs)根据制造商的说明书进行。对于每次连接，将大约过量3倍摩尔量的载体DNA与插入DNA混合。实施例7义濕许脔脊化利用热激方法，根据制造商的说明书将质粒DNA(l-5nlDNA溶液，通常2piDNA连接混合物)转化到OneShotDH5a-TlR或MACH-1TlR感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,Breda，TheNetherlands;产品号12297-016)中。接着，将细胞涂布在含有50pg/ml氨千青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂板上。平板在37。C温育16-18小时，直到细菌菌落变得明显。实施例8遞^尸C7谬逸勿麥义發使用HotStarTaqMasterMix试剂盒(Qiagen;产品号203445)和合适的正向和反向引物，通过菌落PCR筛查细菌克隆中含有期望序列的载体的存在。用20Hl移液器吸头轻轻接触选定的克隆，并短暂蘸入2mlLB中进行小规模培养，然后重新悬浮在PCR混合物中。在TGradientThermocycler96中使用35个循环的程序进行PCR:95°C变性15min;94。C30sec,55。C30sec和72。C2min进行35个循环；随后进行一个72°C10min的最终延伸步骤。如果恰当，PCR混合物在用琼脂糖凝胶电泳分析之前保存于4°C。实施例9^C义應并麥培养浙》;C^在用下列来自Qiagen的i式剂盒(viaWestburg,Leusden,TheNetherlands)才艮据制造商的说明书分离质粒DNA。对于大量质粒制备(50-150ml培养物)，使用HiSpeedPlasmidMaxi试剂盒(产品#12663)或HiSpeedPlasmidMidi试剂盒(产品#12643)。对于小规模质粒制备(士2ml培养物)，使用QiaprepSpinMiniprep试剂盒(产品弁27106)，并用50pl洗脱緩沖液(试剂盒提供)洗脱DNA。实施例10《《谬f定点i秀变用QuickChangeIIXL定点突变试剂盒(Stratagene，Amsterdam,TheNetherlands)根据制造商的说明书进行。该方法包括引入一个沉默(silent)的附加ZwaI位点，用于筛选成功的突变。简而言之，将5pll0x反应緩冲液、1|il寡核苷酸IgG4S228Pf(P16)(100pmo1/pl)、1pl寡核香酸IgG4S228Pr(P17)(100pmol/pl)、1pldNTP混合物、3Quick溶液、1pl质粒pTomG4Tom7D8(见实施例16)(50ng/pil)和1|ilPftiUltraHFDNA聚合酶混合成50jil总体积,在TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen:Germany;产品号050-801)上用18个循环的程序进^f亍扩增95。C变性1min;95°C50sec、60°C50sec和68°C10min进行18个循环；和68°C10min。将PCR混合物在进一步处理之前保存于4。C。接着，将PCR混合物与lpl在37°C温育60min以消化pTomG47D8载体，并且在进一步处理之前保存于4°C。将反应混合物用5pisMNaAc和125pi乙醇沉淀，-20。C温育20min，并在4。C以14000xg20min离心沉淀。将DNA沉淀用70%乙醇洗涤，干燥，并溶解在4pl水中。根据制造商的说明书(Invitrogen)将总共4(il反应体积转化到OneShotTop10感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,Breda,TheNetherlands)中。接着，将细胞涂布在含有50pg/ml氨千青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂板上。将平板在37°C温育16-18小时，直到细菌菌落变得明显。实施例11D福,潜将质粒DNA样品送至AGOWA(Berlin,Germany)进行序列分析。对序列用VectorNTI高级软件(Informax,Oxford,UK)进行分析。实施例12在/ffi"3F勿/gFreestyle293-F(HEK-293亚克隆，适应于悬浮生长和化学限定的自由型(Freestyle)培养基，例如HEK-293)细胞从Invitrogen获得，并用293fectin(Invitrogen)根据制造商的方案转染。实施例13种建pCo"G/Z^77:^于,^爿77-igO重链的裁'体通过双重叠延伸PCR(doubleoverlapextensionPCR)从含有小鼠抗FcaRI抗体A77之VH和VL编码区的scFv噬菌体载体中扩增该抗体的VH编码区。将它用于整合哺乳动物信号肽、理想的Kozak序列和用于在pConGlf中克隆的合适限制位点。第一PCR用引物A77VHforl和A77Vhrev以scFv噬菌体载体作为模板进行。将该第一PCR的一部分用于第二PCR，该第二PCR使用引物A77VHfor2和A77Vhrev。将VH片段凝胶纯化，并克隆到pConGlf0.4中。为此，将pConGlf0.4载体和VH片段用HindIII和Apal消化和纯化。将VH片段和pConGlf0.4HindlII-Apal消化的载体连接，并转化到感受态DH5a-TlK细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，验证序列，并命名为pConG1fA77。实施例14Y々建/Cow^477:屑于,兰」77我体轻链的我沐通过双重叠延伸PCR从含有小鼠抗FcaRI抗体A77之VH和VL的scFv噬菌体载体扩增该抗体的V^编码区。将它用于整合哺乳动物信号肽、理想Kozak序列和用于在pConKappa0.4中克隆的合适限制位点。第一PCR用引物A77VLforl和A77VLrev以scFv噬菌体载体作为模板进行。将第一PCR的一部分用于第二PCR,该第二PCR使用引物A77VLfor2和A77VLrev。将PCR产物和pConKappa0.4载体用HindIII和Pfl2311消化和纯化。连接VL片段和pConKappa0.4HindIII-Pfl23H消化的载体，并转化感受态DH5a-TlR大肠杆菌细胞。选择含有正确插入序列大小的克隆并验证序列。将该质粒命名为pConKA77。种建/7b附G^477:^f产J^」77-/gG4重链的我沐为了构建表达A77-IgG4的载体，将A77的VH区克隆到pTomG4中。为此，用HindIII和Apal消化pTomG4和pConGlfA77，并分离相关片段。连接A77VH片段和pTomG4HindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆。将该质粒命名为pTomG4A77。实施例16为了制备用于表达A77-HG的构建体，将A77的VH区克隆到pTomG47D8HG中，替换VH7D8区。为此，用HindIII和Apal消化pTomG47D8HG和pConGlfA77，并分离相关片段。连接A77VH片段和pTomG47D8HGHindIII-Apal消化的载体片段，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆。将该质粒命名为pTomG4A77HG。实施例17游建/￡￡<5.^4777^6;^于产^爿77-Fa6:T链的裁'谬为了制备用于表达A77-Fab的构建体，将A77的VH区克隆到pEE6.42F8Fab中，替换VH2F8区。为此，用HindIII和Apal消化pEE6.42F8Fab和pConG1fA77，并分离相关片段。连接A77VH片段和pEE6.42F8FabHindIII-ApaI消化载体片段，并转化感受态DH5a-T^细胞。选择含有正确插入序列大小的克隆。该质粒命名为pEE6.4A77Fab。实施例18^謦入类我-cM^戎沐的^"宽^用RNeasy试剂盒(Qiagen,Westburg,Leusden,Netherlands)才艮据制造商的方案从lxl(^个小鼠杂交瘤细胞制备总RNA。用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒(BDBiosciencesClontech,MountainView,CA，USA)按照制造商的方案从60ng总RNA制备RNA的5，-RACE-互补DNA(cDNA)。通过PCR扩增cMet抗体的VL和VH区。为此，根据制造商的说明书使用PftiTurboHotstartDNA聚合酶(Stmtagene)。每个反应混合物含有5(xl10xBDAdvantage2PCR緩沖液(Clontech)、200混合dNTPs(RocheDiagnostics),12pmol反向引物(RACEG1A1用于VH区，RACEKA1用于VL区)、7.2pmolUPM-Mix(UPM-Mix:2pMShortUP画3和0.4LongUPMH3寡核苦酸)、1^1如上所述的5'RACEcDNA模板，和1(xl50XBDAdvantage2聚合酶混合物(Clontech)，总体积为50pl。PCR反应在TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra)上进4亍，4吏用35个循环的程序95。C变性1min;95°C30sec、68°C60sec的35个循环。通过在1。/。TAE琼脂糖凝胶上的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，并用溴化乙锭染色。从凝胶上切下正确大小的条带，并用QiagenMinelute反应Cleanup试剂盒(Qiagen)从琼脂糖分离DNA。使用测序用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen)根据制造商的方案将凝胶分离的PCR片段克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中。将5pi连接混合物转化到OneShotDH5aTlR感受态大肠杆菌(Invitrogen)中，并涂布在LB/氨千青霉素板上。从6个含有插入序列的克隆确定了Vl序列，并从5个含有插入序列的克隆确定了Vh序列。实施例19沟建/Co"C^/cMw;^7于,J^cM年/gG/重链的裁'傳用HindIII和Apal将人抗cMet抗体的VH编码区从含有该区域的质粒中切下。对VH片段进行凝胶纯化并克隆到pConGlf0.4中。为此，用HindIII和Apal消化pConGlf0.4载体，并纯化。连接VH片,史和pConGlf0.4HindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，分离并命名为pConGlfcMet。实施例20一々建pCo"尺cA/^:^于Z^cMe戎谬^链的4'沐用引物shortUPMH3和RACEVLBsiWI从含有人类抗cMet抗体的VL编码区的质粒扩增该区域，同时导入用于克隆到pConKO.4中的合适限制位点。用HindIII和Pfl23H消化PCR产物和pConKappa0.4载体，并纯化。连接VL片段和pConKappa0.4HindlII-Pfl2311消化的栽体，并转化到感受态DH5a-TlK大肠杆菌中。选择含有正确插入序列大小的克隆并确认序列，将该质粒命名为pConKcMet。实施例21沟建/7b附G4cMe"于,4cM^-/gG4重链的4'伴为了构建表达cMet-IgG4的载体，将cMet的VH区克隆到pTomG4中。为此，用HindIII和Apal消化pTomG42F8和pConGlfcMet，并分离相关片段。连接cMetVH片段和pTomG42F8HindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-T^细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，该质粒并命名为pTomG4cMet。实施例22沟建/7bw(^/cMe^/G:^于Z^cM&-//G,遂的戎傳为了制备用于表达cMet-HG的构建体，将cMet的VH区克隆到pTomG42F8HG中，替换VH2F8区。为此，用HindIII和Apal消化pTomG42F8HG和pConGlfcMet，并分离相关片段。连接cMetVH片段和pTomG42F8HGHindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-T^细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，将该质粒命名为pTomG4cMetHG。实施例23种建;^^5.会M^Fa6;^f,^:cM"-Fa6J"链的戎伴为了制备用于表达cMet-Fab的构建体，将cMet的VH区克隆到pEE6.42F8Fab中，替换VH2F8区。为此，用HindIII和Apal消化pEE6.42F8Fab和pConGlfcMet,并分离相关片段。连接cMetVH片段和pEE6.42F8FabHindIII-ApaI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，将该质粒命名为pEE6.4cMetFab。实施例24用引物2f8HCexfor和2f8HCexrev通过PCR从pIESRa2F8(Medarex)扩增2F8的VH编码区(WO2002/100348)，并亚克隆到PCRscriptCam(Stratagene)中。随后将VH片段克隆到pCONglf0.4中。为此，用HindIII和Apal消化pConGlf0.4和pCRScriptCAMVH2F8载体，并纯化相关片段。连接VH片段和pConGlf0.4HindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列，将该质粒命名为pConGlf2F8。实施例25一々建pCo"尺2FS:^7于Z^2FS在谬^链的裁'沐用HindIII和BsiWI消化pIESRa2F8，乂人凝胶分离2F8(抗EGFr)的VL编码区。用HindIII和BsiWI消化pConKappa0.4载体，并纯化。连接VL片段和pConKappa0.4HindlII-BsiWI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细月包中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pConK2F8。实施例26^^^>7bwG42F&^7于/^f链的裁糸为了构建表达2F8-IgG4的载体，将2F8的VH区克隆到pTomG4中。为此，用HindIII和Apal消化pTomG4和pConGlf2F8,并分离相关片段。连接2F8VH片段和pTomG4HindlII-Apal消化载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，将该质粒命名为pTomG42F8。实施例27为了构建表达2F8-HG的载体，将2F8的VH区克隆到pTomG47D8HG中，替换VH7D8区。为此，用HindIII和Apal消化pTomG47D8HG和pConGlf2F8，并分离相关片段。连接2F8VH片段和pTomG47D8HGHindlII-Apal消化的载体，并转化到感受态DH5a-T1R细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆。将该质粒命名为pTomG42F8HG。实施例28用引物pConGlseql和2F8fabrev2通过PCR从pConGlf2F8扩增Fab编码区，同时引入合适的克隆限制位点和C末端His标签编码序列。对PCR产物进行纯化并克隆到PEE6.4中。为此，用HindIII和EcoRI消化pEE6.4和PCR片段，并分离相关片段。连接2F8Fab片段和pEE6.4HindlII-EcoRI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并通过DNA测序确认序列。将该质粒命名为pEE6.42F8Fab。实施例29游建/Co"G/y7DS:^力产jiZDS-/gG7f链的戎沐用引物7D8VHexfor(P8)和2F8HCexrev(P13)(图14)通过PCR从含有CD20特异性HuMab-7D8的VH编码区的pGemT(Promega，Madison,USA)载体扩增该区域(WO04/035607)，同时引入用于克隆到pConGlf0.4(LonzaBiologies,Slough，UK)中的合适限制位点和理想Kozak序列(GCCGCCACC，(KozakMetal.,Gene234(2),187-208(1999))，所述pConGlf0.4是一种含有人IgGl基因组恒定区(同种异型f)的哺乳动物表达载体。用PCR-ScriptCam克隆试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明书将PCR片段克隆到pPCR-ScriptCAM(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands)中。对数个克隆进行测序，并选择含有预测序列的克隆供进一步使用。凝股純化Vh片段，并克隆到pConGlf0.4中。为此，用历'wdni和^al消化并凝胶纯化后，从pPCR-ScriptCAM载体分离VH片段。///miin和y^al消化pConGlf0.4载体，从凝胶分离载体片段，随后用坏碱性磷酸酶(NewEnglandBiolabs)去磷酸化。连接VH片段和pConGlfD.4///wdIII-^7aI去磷酸化的片段，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中(Invitrogen)。通过菌落PCR(使用引物pConGls叫l(P10)和HCseq5(Pll)(图14))检查8个菌落，发现所有菌落均含有正确的插入序列大小。选择一个克隆用于进一步的研究，并命名为pConGlf7D8。实施例30沟建/Co"尺7DS:7￡)§-7^<^，7D&/gG^和7DS-i/G轻链的我伴用引物7D8VLexfor(P7)和7D8VLexrev(P6)(图14)通过PCR从含有CD20特异性HuMab-7D8的VL编码区(WO04/035607)的质粒扩增该区域，同时引入用于克隆到pConKappa0.4(LonzaBiologies)中的合适限制位点和理想Kozak序列，pConKappa0.4是含有人IgGk轻链区(同种异型km3)的哺乳动物表达载体。用///"dill和消化PCR产物和pConKappa0.4载体。纯化载体和Vl片段，并用虾碱性磷酸酶使载体去磷酸化。連接Vl片段和pConKappaO^Wwdlll-^AVI消化的载体，并转化到感受态DH5aT^大肠杆菌中。通过菌落PCR(使用引物pConKs叫l(P9)andLCseq3(P5)(图14))#r查10个菌落，发现9个菌落含有正确的插入序列大小。从4个克隆分离质粒DNA，对VL区进行测序。3个克隆含有预定序列，选择1个克隆供进一步使用，并将其命名为pConK7D8。实施例31构建pTomG4:用于表达具有人IgG4恒定区的人IgG可变重链区的载体从志愿者血液样品分离基因组DNA，以其为模板使用引物IgG4gene2f(P15)和IgG4gene2r(P14)(图14)进行PCR，扩增IgG4重链的完整基因组恒定区，并引入用于克隆到哺乳动物表达载体pEE6.4(LonzaBiologies)中的合适限制位点。纯化PCR片段并克隆到pEE6.4中。为此，用///wdlll和五coRI消化PCR产物，随后使限制酶热失活。用///"dill和五coRI消化pEE6.4载体，随后使限制酶热失活，并用蚱碱性磷酸酶使载体片段去磷酸化，随后使磷酸酶热失活。连接IgG4片段和pEE6.4/7/"dlII/五coRI去磷酸化载体，并转化感受态MACHl-TlR细胞(Invitrogen)。在LB中培养克隆，并从小量培养物(1.5ml)中分离质粒DNA。限制性消化显示了与pEE6.4栽体中IgG4片段的克隆一致的图形。将来自2个克隆的质粒DNA转化到DH5a-T^大肠杆菌中，分离质粒DNA，通过插入序列的序列分析检查构建体，发现l个克隆与来自Genbank数据库的基因组IgG4克隆相同，只是在内含子中有一些微小差异。SEQIDNo:13显示了pTomG4中IgG4区的序列。这些差异可能是多态性或Genbank序列中的序列错误导致的。将该质粒命名为pTomG4。实施例32沟建/7bmG^7Z)S:7DS-/gG4f链的戎沐用///"dill和j/al消化来自pConGlf7D8的质粒DNA,并凝胶纯化VH片段。用州'mini和^7al消化pTomG4载体，并从凝胶分离载体片段。连接VH片段和pTomG4///"dIII-^aI片段，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。通过菌落PCR(使用引物pConKseql(P9)和HCseqll(P12))检查4个菌落，发现2个菌落含有正确的插入序列大小，并通过用MspI消化菌落克隆PCR片段确认了pTomG4骨架的存在。选择其中一个克隆供进一步使用。将该质粒命名为pTomG47D8。实施例33—々建/rowC^7DS7/G:^于或这7Z)S-i/G,链的裁'沐使用定点诱变破坏pTomG47D8质粒中IgG4铰链外显子的剪接供体位点。根据QuickChangeXL定点诱变方法，使用引物IgG4S228Pf(P16)和IgG4S228Pr(P17)进行定点诱变反应。通过菌落PCR和J^m"I消化(在诱变中引入了一个额外的位点)对24个菌落进行了筛选，全部菌落均显示为含有正确的核苷酸改变。过夜培养2个阳性菌落，分离质粒DNA并测序，确认引入了正确的突变。2个菌落确实都含有正确的序列，选择一个用于进一步繁殖，并命名为pTomG47D8HG。为了防止在诱变过程中引入其他的突变，对pTomG47D8HG的整个IgG4编码区重新测序，未发现额外的突变。最终的载体命名为pTomG47D8HG。实施例34用RNeasy试剂盒(Qiagen,Westburg，Leusden，Netherlands)才艮据制造商的方案从0.3x105个小鼠杂交瘤细胞(克隆2H8，来自参考文献(AkkerdaasJHetal.,Allergy^(3)，215-20(1995》制备总RNA。使用SMARTRACEcDNA扩增试剂盒(BDBiosciencesClontech，MountainView,CA，USA)根据制造商的方案从112ng总RNA制备RNA的5'画RACE-互补DNA(cDNA)。通过PCR扩增Betvl抗体的Vl和Vh区。为此，根据制造商的说明使用PfUTurboHotstartDNA聚合酶(Stratagene)。每个反应混合物含有200|iM混合dNTPs(RocheDiagnostics)、12pmol反向引物(RACEGl讓l(P19)用于VH区，RACEKmml(P18)用于VL区)、7.2pmolUPM画Mix(UPM國Mix:2ShortUPMH3(P20)和0.4pMLongUPMH3(P21)寡核苷酸(图14))、0.65'RACEcDNA模板(如上所述)和1.5单位溶于PCR反应緩沖液(与聚合酶一起提供)的PfUTurboHotstartDNA聚合酶，总体积为30|iil。PCR反应在TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra)上进行，采用35个循环的程序95。C变性2min;95。C30秒、55。C30sec和72。C1.5min，35个循环；最后72°C延伸10min。在1%TAE琼脂糖凝胶上通过琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色分离反应产物。从凝胶切下正确大小的条带，用QiaexII凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖分离DNA。通过用200pMdATP和2.5个单位的Amplitaq(PerkinElmer)72。C温育10min给凝胶分离的PCR片段加A尾巴，并用minielute柱(Qiagen)纯化。用pGEMTeasy载体系统II试剂盒(Promega)根据制造商的方案将A加尾的PCR片段克隆到pGEMTeasy载体(Promega)中。将2pi连接混合物转化到OneShotDH5aTlR感受态大肠杆菌(Invitrogen)中，并涂布在LB/Amp/IPTG/Xgal板上。对VH和Vl片段各自挑取4个含插入序列的白色菌落，并对插入序列测序。SEQIDNo:8和SEQIDNo:12分别显示了BetvlVh和VL的推导氨基酸序列。实施例35用引物VHexbetvlfor(P4)和VHexbetvlrev(P3)进行PCR，从含有小鼠抗BetVl抗体的VH编码区的质粒(实施例18)扩增该区域，同时引入合适的用于克隆到pConGlf0.4中的限制位点和理想Kozak序列。凝胶纯化VH片段并克隆到pConGlf0.4中。为此，用///"dill和^;"I消化PCR产物和pConKappa0.4载体，并纯化。连接VH片段和pConGlf0.4///"c///-^7a/消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认正确的序列。将该质粒命名为pConGlffietvl。实施例36沟建pOw/^eW:^于Z^:5e^W轻链的4'傳用引物VLexbetvlfor(P2)和VLexbetvlrev(Pl)从含有小鼠抗BetVl抗体的Vt编码区的质粒(实施例18)扩增该区域，同时引入合适的用于克隆到pConK0.4中的限制^f立点和理想Kozak序列。用历"dIII和消化PCR产物和pConKappa0.4载体，并纯化。连接VL片段和pConKappa0.4i7/"dlII-^/WI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR大肠杆菌中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pConKBetvl。实施例37—々建pro附G4BeW;重链的4'傳为了构建表达Betvl-IgG4的载体，将BetVl的VH区克隆到pTomG4中。为此，用///"dill和」p"I消化pTomG4和pConG1ffietv1，并分离相关片段。连接BetvlVH片段和pTomG4///"dII-^paI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlR细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆并确认序列。将该质粒命名为pTomG4Betvl。实施例38游建/7bm(^^eA^7/G,^7于Zi5erW-7/G:T遂的威谬为了制备用于表达Betvl-HG的构建体，将BetVl的VH区克隆到pTomG47D8HG中，替换VH7D8区。为此，用///"dill和j/al消化pTomG47D8HG和pConG1ffietv1，并分离相关片段。连接BetvlVH片段和pTomG47D8HG///mfflK4paI消化的载体，并转化到感受态DH5a-TlK细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆并确认序列。将该质粒命名为pTomG4BetvlHG。实施例39遞it4/7e^"3F细應尹錄^4这,^7DS-/gG/，7￡>S-/gG《Se/W-i^G,5e^W-7gG《5eW画77G2FS-7gG7，Ji^-i^G^,2FS-i^6,爿77画7gG,J77-/gG《v477-//G爿77-Fa6,c^fe"gG7，cMe"gG《cMw-i/G和通过用293fectin根据制造商的说明书在HEK-293F细胞中共转染相应的120重链和轻链载体产生全部构建体的抗体。对于7D8-IgGl，共表达pConGlf7D8和pConK7D8。对于7D8-IgG4，共表达pTomG47D8和pConK7D8。对于7D8-HG,共表达pTomG47D8HG和pConK7D8。对于Betvl-IgGl，共表达pConGlBetvl和pConKBetvl。对于Betvl-IgG4，共表达pTomG4Betvl和pConKBetvl。对于Betvl-HG，共表达pTomG4BetvlHG和pConKBetvl。对于2F8-IgGl，共表达pConGlf2F8和pConK2F8。对于2F8-IgG4，共表达pTomG42F8和pConK2F8。对于2F8-HG,共表达pTomG42F8HG和pConK2F8。对于2F8-Fab，共表达pEE6.42F8-Fab和pConK2F8。对于cMet-IgGl,共表达pConGlfcMet和pConKcMet。对于cMet-IgG4，共表达pTomG4cMet和pConKcMet。对于cMet-HG，共表达pTomG4cMetHG和pConKcMet。对于cMet-Fab，共表达pEE6.4cMet國Fab和pConKcMet。对于A77-IgGl，共表达pConGlfA77和pConKA77。对于A77-IgG4，共表达pTomG4A77和pConKA77。对于A77-HG，共表达pTomG4A77HG和pConKA77。对于A77-Fab，共表达pEE6.4A77-Fab和pConKA77。实施例40^化/gG7、7gG^和/gG4-无凝链在体纯化全部的IgGl，IgG4和无铰链抗体。首先，将上清液过滤通过0.20pM盲端过滤器(dead-endfilter)。然后将上清液加载到5ml蛋白A柱(rProteinAFF,AmershamBioscience)上，用0.1M柠檬酸-NaOH,pH3洗脱。洗脱物立即用2MTris-HCl,pH9中和，并对12.6mM磷酸钠，140mMNaCl，pH7.4(B.Braun，Oss,TheNetherlands)透析过夜。透析后，将样品通过0.20}iM盲端过滤器过滤除菌。将抗体用1单位PNgaseF(Roche)/吗抗体37。C温育过夜去糖基化，随后在蛋白A柱上纯化。通过比浊法和280nm吸光度分析样品的IgG浓度。实施例41遞过金4^和^浙趟化重iffF"6我谬使用Talon珠子(Clontech)纯化A77-Fab，2F8-Fab和cMet-Fab抗体。使用前，将珠子用lx平衡/洗脱緩冲液pH7.0(50mM磷酸钠和300mMNaCl)平衡，随后用含有Fab抗体的培养上清液温育。用lx平衡/洗脱緩沖液清洗珠子，除去非特异结合蛋白，并用lx洗脱緩冲液(50mM磷酸钠，300mMNaCl和150mM咪唑)pH5.0洗脱His-标记蛋白。温育分批进行，而清洗和洗脱利用离心(700g2分钟)在填充柱中进行。将洗脱的蛋白质在PD-IO柱上对PBS交换脱盐。通过测量280nm吸光度，并使用从氨基酸序列计算出的理论吸光度系数，确定纯化蛋白质的产量。用SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，蛋白质迁移成一条具有预期大小的条带。实施例427DS-/gG^和戎沐的#还#5AS-iMG五为Vf纯化之后，在非还原SDS-PAGE上分析CD20特异抗体7D8-IgGl(IgGl抗-CD20)、7D8-IgG4(IgG4抗-CD20)和7D8-HG(无铰链IgG4抗-CD20)。所用的Bis-Tris电泳法是Laemmli法(LaemmliUK，Nature222,6801(1970))的修正，其中样品在中性pH下泳动。SDS-PAGE凝胶用考马斯染色，并用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)数字成像。从图1可以看出，7D8-IgGl显示1个代表全长四聚体(2条重链和2条轻链)7D8IgGl分子的主条带。7D8-IgG4显示除了代表四聚体IgG4分子的主条带之外，还有相当量的半分子(即，一条重链带和一条轻链)，如文献中所述的那样(Schuu廳nJet.al"MolImmunol1(2001);AngalSetal"MolImmunol巡105(1993);ColcherDetal.,CancerRes42,1738(1989);KingDJetal.，BiochemJ巡(Pt2),317(1992);PetersenJGetal.,JBiolChem，，5633(1974))。无铰链IgG4分子7D8-HG显示只是半分子。实施例437D諸G^,为、浙为了通过纳米喷雾技术进行质镨分析，用MilliporeMicroconYM-30浓缩器对样品进行浓缩并将緩沖液交换为20mM磷酸钠pH7.2。随后，将大约100jagIgG用1UN-糖苷酶(Roche,cat.no.1365177)在37。C消化16小时，以释放N-连接的聚糖。用C4微捕集盒(micro-trapcartridge)离线将样品脱盐，并洗脱在30%丙醇/5%乙酸中。使用Q-TOF(Waters,Almere，theNetherlands),利用纳米喷雾电喷雾-MS进行分子量分析。仪器用glu-血纤维蛋白肽校准。使用Masslynx4.0软件对所得的多电荷数据进行解巻(deconvolute)。用二硫苏糖醇还原另一等份样品。将还原产物用C4微捕集盒离线脱盐并如上所述进行分析。7D8-HG在还原条件下的MS分析显示一个23440道尔顿的轻链质量，其与预测的23440道尔顿的轻链质量一致。没有检测到重链的质量，可能是由于重链沉淀所致。非还原条件下的MS分析显示一个71520道尔顿的主质量，与缺失铰链的半分子(由一条重链和一条轻链构成)的预测质量(71522道尔顿)相关良好。观察到极少量的质量为143041道尔顿的产物，可能代表了具有无铰链重链的四聚体分子。实施例44的^"谬妖恩分浙(Mwss戸cto膨^y/eW<ie脂pp/"g)在室温下用CNBr消化等份(25pg)的7D8-HG5小时。将CNBr消化样品冻干，然后重新溶解在50mM碳酸氢铵緩冲液中，用10。/。氨水调节到pH8.4，用TPCK-处理的胰蛋白酶在37。C消化5小时。将消化产物冻干，在pH8.5的Tris-乙酸緩沖液中用过量20倍摩尔量的二硫苏糖醇(DTT)还原该消化冻干样品。反应产物用C18柱通过在线LC/ES-MS进行分析。用水成曱酸和乙腈梯度进行洗脱。用LCTPremier电喷雾质语仪检测质量，在m/z250-3000的范围内进行校准。检测到了质量为2026.2Da的胰蛋白酶肽，其与无铰链特殊肽220VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238的理论质量一致(图2)。该肽的同一性用纳米喷雾MS和MS/MS加以确认(图3和4)。这一结果显示，7D8-HG抗体不含有铰链区。实施例45通过7D8-HG在分析型超速离心(AUC)实验中的沉降速度获得的分子量分亚将溶于PBS中的1mg/ml7D8誦HG样品送到Nanolytics(Dalgow，Germany)进行AUC分析。鉴定了速度为6.7S的7D8-HG沉降物的主要部分(95%)。在11.5S处发现了一个独特的聚集体(2。/。)。余部在更高的聚集体中发现。主要成分的沉降系数表明，7D8-HG在PBS中主要以二聚体存在，摩擦比为1.4。看起来，7D8-HG通过低亲和力非共价相互作用(该作用可能在CH3区中)形成二聚体(Saphire,Stanfieldetal.2002)。该二聚体化过程可以在过量无关抗体的存在下用HG分子加以抑制(见实施例54)。Saphire，E.O.,R.L.Stanfield，etal.(2002)."ContrastingIgGstructuresrevealextremeasymmetryandflexibility."JMolBiol319(1):9-18.实施例467￡>S-/gG7、7DS-/g(^/*戎沐的^然为、^f通过流式细胞术检查这些CD20特异抗体与CD20抗原的结合。将转染NSO/CD20的细胞(50，000个细胞/50iil)在FACS緩沖液(FB:PBS,0.05%BSA:0.02。/。NaN3)中清洗，并与测试抗体在V形底96孔板中温育(50pl，4°C，30min)。清洗后，向细胞添加用PE标记的山羊F(ab)2抗人IgG-K(SouthernBiotechnology,目录号2062-09，www.southernbiotech.com)。在FB中清洗纟田胞，将总体积为150pl的细胞收集在FACS管中。用FACScalibur(BectonDickinson,SanDiego，CA,USA)对样品进4亍测量和分析。从图5可以看出，全部3种抗体都是抗原特异的，并且与CD20有良好结合。为了确定Clq(经典补体级联的第一组分)与7Dl-IgGl、7D8-IgG4和7D8-HG的结合，进行了ELISA。简言之，室温下用在PBS溶液中从10pg/ml到0.06|ng/ml系列稀释的测试抗体过夜包被微滴定ELISA板(Greiner,Germany)。倒出板中内容物，并用200plELISA-稀释剂/孔(0.1MNaP04,0.1MNaCl，0.1。/。明胶和0.05。/c)Tween-20)在室温下封闭孔30分钟。随后，倒出板中内容物，并用2^g/ml溶于Clq緩冲液中的人Clq(Quidel，批号卯0848)温育孔(PBS补充有0.1%w/v明胶和0.05%v/vTween-20，100fil/孔，37。C，1小时)。用PBST清洗孔3次，用兔抗人Clq[(DAKO，A0136)，稀释于Clq緩冲液中]温育孔(100iLil/孔，室温，lh)。用PBST清洗板(3x)后，用HRP偶联的猪抗兔IgG-Fc[(DAKO,P0300，批号069),稀释于ELISA稀释剂中]温育孔(1:2500,lOO^il/孔，室温，l小时)。之后，清洗板3次，用新鲜配制的1mg/mlABTS溶液(ABTS:2,2'-连氮基-双[3-苯并噻唑啉-6-磺酸];5mg2片，溶于10mlABTS緩冲液,BoehringerMannheim,Ingdheim,Germany)在黑暗室温下对测定体系显色30分钟。用ELISA板分析仪(BiotekInstrumentsInc.,Winooski，USA)测量405nm的吸光度。从图6可以看出，Clq与7D8-IgG4和7D8-HG均不结合(didnotbindtoboth7D8-IgG4and7D8-HG)。作为对照，评价Clq与7D8-IgGl结合，显示浓度依赖性的Clq结合。为了进一步研究CD20特异抗体的补体性质，考察补体依赖的细胞毒性。收集Daudi(ATCC,www.ATCC.org)细胞后，将它们在PBS中清洗3次(trice),并在补充了1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA;Roche，Basel,Switzerland)的RPMI1640中重新悬浮成2x1(^个细胞/ml。然后，将细胞以每孔l.Ox105个细胞、50pl体积置于96孔圆底板中。向孔中添加相同体积的抗体(最高浓度10|ng/ml,稀释于RPMI1640和1%BSA中)，并室温(RT)温育15分钟。然后，添加25pi正常人血清(NHS),将细胞在37。C温育45分钟。热失活血清(血清AT)是在56。C温育了10分钟的NHS。温育45分钟后，将细胞重悬，转移到FACS管(Greiner)中。然后，向该悬液添加10pi碘化丙锭(PI;Sigma-AldrichChemieB.V.)(10|ag/ml溶液)。用流式细胞仪(FACScaliburTM，BectonDickinson,SanDiego,CA，USA)测量死细胞(PI阳性细胞)的数目，来检测裂解。从图7A可以看出，7D8-IgGl显示daudi细胞良好裂解，而7D8-IgG4和7D8-HG显示daudi细胞的裂解减少。为了评价血清的作用，向与10pgantistof温育的细胞添加热失活血清(血清AT)。图7B显示，裂解的诱发依赖于补体活性血清，而添加热失活血清不会造成裂解。实施例47Betvl-HG抗体的非还原SDS-PAGE分析纯化后，在非还原SDS-PAGE上分析Betvl-HG(无铰链IgG4抗-Betvl)。所用的Bis-Tris电泳法是Laemmli法的修改版，样品在中性pH下运行。用考马斯染色SDS-PAGE凝胶，并用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)进行数字成像。从图8可以看出，Betvl-HG显示1条主带，代表半分子(即，一条重链和一条轻链)。实施例485erW-//G我沐凝履过滤对Betvl-HG进行凝胶过滤，以考查该突变体会以半分子还是以完整二聚体的形式洗脱。将样品(IOOnl)添加到Superdex200HR10/30柱(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden),该柱与HPLC系统(AKTAexplorer)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)连接。柱子首先在PBS中平衡。收集250pi大小的级分，其中用抗体结合测定来测量Betv1特异性的IgG。同时通过测量在214nm的吸光度来监测样品。为了检验Betv1特异抗体的抗原结合，在750piPBS/AT(补充有0.3%BSA、0.1%Tween-20、0.05%NaN3的PBS)中将稀释的抗体样品与0.75mgProtein誦GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)及50|il经稀释的1251-标记Betv1或1251-标记Feld1在室温下温育过夜。Betv1通过氯胺画T法用无载体(carrierfree)125I(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)械化,如Aalberse等所述(SerologicalaspectsofIgG4antibodies.1983.130:722-726)。用PBS-T(补充了0.1%Tween-20的PBS)清洗Sepharose悬液之后，测量结合的放射性。结果表示为相对于添加量的放射性的量。无铰链Betvl-HG的Betv1结合活性在一个峰中洗脱，其比含有完整铰链的纯化Betvl-IgG4(IgG4抗Betvl)的洗脱峰保留更长(图9)。用球蛋白校准该柱子，显示Betvl-HG在相应于分子大小为70kD的蛋白级分中洗脱(数据未示出)。这些数据支持我们的意见，即无铰链IgG4以半分子形式存在，而且与已报道的无铰链IgGl和IgG4分子(SilvertonEWetal.,ProcNatlAcadSciUSA24，5140(1977);RajanSSetal.,MolImmunol2^，787(1983);HorganCetal.，JImmunol里，5400(1993))相反，它们不会通过非共价相互作用结合成四聚体分子。实施例495erW-/gGW^举^錄4在先前已经证明，与源自血清的抗原特异性IgG4相反，体外产生的单克隆IgG4抗体能够交联抗原，例如IgGl抗体，因此是二价抗体(SchuurmanJetal.,Immunology22，693(1999》AalberseRCetal"Immunology巡，9(2002))。使用结合于Sepharose的、Betv1和1251标记的抗原，通过放射免疫测定来确定Betvl-IgGl、Betvl-IgG4和Betvl-HG交联抗原的能力。因此，制备桦树花粉Sepharose(BirchpollenSepharose)。简言之，根据制造商的说明书，使桦树花粉提取物(Allergon,Angelholm,Sweden)与CNBr活化的Sepharose4B(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)4禺联。随后，将Sepharose重悬在补充了0.3%BSA，0.1%Tween-20，0.05%NaN3的PBS中。为了检查抗体使结合于Sepharose的抗原与125I标记的抗原交联的能力，将50|il稀释抗体与750piSepharose在PBS/AT中室温温育过夜。接着，用PBS-T洗涤Sepharose悬液，之后将悬液与50pi稀释的125I标记Betvl在总体积为750pi的PBS/AT溶液中室温温育过夜。最后，用PBS-T洗涤Sepharose,并测量结合的放射性。结果表示为相对于所添加的放射标记量的结合放射性的量。从图10可以看出，全部3种抗体均是抗原特异性的，并且与放射性标记的Betvl有良好结合。图11中显示，Betvl-IgGl和Betvl-IgG4能够使Sepharose结合的Betv1与放射性标记的Betv1交联。IgGl和IgG4抗体具有二价抗体的行为。Betvl-HG抗体不能交联Betvl抗原，因此证明是单价结合。实施例50IgG4无铰链突变抗体的药物动力学评估，与正常IgGl、IgG4和IgGl片段比较将25只体重24-27g的SCID小鼠(C.B-17/IcrCrl-scid-BR,Charles-River)用于实验。小鼠饲养在中心实验室动物设备(CentralLaboratoryAnimalFacility)(Utrecht，TheNetherlands)的间隔单元(barrierunit)中，置于滤盖(filter-top)饲养笼中，自由提供饮水和食物。全部实验均获得了Utrecht大学动物伦理委员会批准。通过尾静脉注射施用单价抗体。给药后1小时、4小时、24小时、3天、7天、14天、21天和28天时，从隐静脉(saphenalvein)采集50|iil血液样品。将血液采集到含有肝素的小瓶中，lO，OOOg离心5分钟。将血清保存于-20cC，用于确定mAb浓度。在该实验中，比较无铰链IgG4变体(7D8-HG,批号570-003-EP)的清除和正常IgG4(7D8-IgG4，批号570-002-EP)、IgGl变体(7D8-IgGl，批号793-001-EP)、F(ab，)2(7D8-Gl-F(ab，)2，批号815-004-XX)及后一种mAb的Fab片段(7D8-Gl-Fab,815-003-X)的清除。将每种抗体施用于5只小鼠，剂量为每只小鼠200pl，其中含0.1mg。用夹心ELISA确定人IgG浓度。用小鼠mAb抗人IgG-K克隆MH19-1(#M1272,CLBSanquin，TheNetherlands)以100ng/孔的浓度包被在96孑LMicrolonELISA板(Greiner，Germany)上，作为捕集抗体。用补充了2%鸡血清的PBS封闭板之后，添加样品，在ELISA緩冲液(补充了0.05%Tween20和2。/。鸡血清的PBS)中系列稀释，并在多孔板摇床上室温(RT)温育lh。随后，将样品与过氧化物酶标记的山羊抗人IgG免疫球蛋白F(ab，)2片段(#109-035-097,Jackson,WestGrace,PA)温育，并用2,2，-连氮基-双-(3-乙基苯并p塞唑啉-6-磺酸显色。用酶标仪(Biotek,Winooski，VT)测量405nm的吸光度。选择SCID小鼠是因为它们的血浆IgG浓度低，从而IgG的清除相对緩慢。这就为检测由于Fcy-部分与新生儿Fc受体(FcRn)的结合降低而导致的清除加速提供了一种非常灵敏的PK模型。药物动力学分析是通过用双尾修正(tailcorrection)确定浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)发生的。以剂量/AUC(ml/天)计算血浆清除率。用GraphPadPRISMvs.4(GraphpadSoftware)进行统计分析。图12显示了浓度随时间的半对数曲线图。对于所有完整mAbs，包括无铰链变体，初始血浆浓度大致都(inthesameorder)在85-105ug/ml左右。这些初始浓度相应于大约1ml的中心分布体积，这与进入小鼠血浆区室的分布一致。对于F(ab，)2和Fab片段，观察到的初始浓度较低，分别为75和4ug/ml。对于Fab片段而言，这很可能是由于在给药后的第1个小时内在血管外快速分布而造成的。图13显示了为小鼠个体计算的清除率。无铰链变体的清除率比正常IgGl和IgG4高3-4倍。然而，比F(ab，)2片段慢超过10倍，比Fab片段的清除慢超过200倍。实施例51/gG4无凝链^f戎谬4义瘦活遂V、處沐力的秀浙动力夢一估，与j!,7gC^实验使用12只8周龄Balb/c小鼠(Balb/CAnNCrl，Charles-River)。将小鼠饲养在中心实验室动物设备(CentralLaboratoryAnimalFacility)(Utrecht,TheNetherlands)的间隔单元(barrierunit)中，置于滤盖饲养笼中无菌的条件下，自由提供饮水和食物。全部实验获得Utrecht大学动物伦理委员会批准。通过尾静脉注射施用单价抗体。在给药后l小时、4小时、24小时、3天、7天和10天时，从隐静脉(saphenalvein)采集50|^1血液样品。将血液采集到含有肝素的小瓶中，10，000g离心5分钟。血清保存于-20。C，用于确定mAb浓度。在本实验中，将无铰链IgG4变体(7D8-HG,批号570-003-EP)的清除率与正常人IgG4(7D8-IgG4，批号570-002-EP)、IgGl变体(7D8-IgGl,批号793-001-EP)、7D8IgGl的F(ab')2片段(7D8-Gl画F(ab，)2,批号815-004國XX)的清除率进行比较。每种抗体施用于4只小鼠，剂量为每只小鼠200(Tl0.1mg，相当于每kg体重4mg的剂量。用夹心ELISA确定人IgG血浆浓度。将小鼠mAb抗人IgG-K克隆MH19-1(#M1272，CLBSanquin，TheNetherlands)以100ng/孔的浓度包被在96孔MicrolonELISA板(Greiner,Germany)上，用作捕集抗体。用补充了2%鸡血清的PBS封闭板之后，添加样品，在ELISA緩沖液(补充了0.05%Tween20和2%鸡血清的PBS)中系列稀释，并在多孔板摇床上室温(RT)温育lh。洗涤后，接着将板用过氧化物酶标记的山羊抗人IgG免疫球蛋白F(ab，)2片段(#109-035-097,Jackson,WestGrace,PA)温育，用2，2，-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS;Roche,Mannheim,Germany)显色。用酶标仪(Biotek,Winooski,VT)测量405nm的吸光度。选择Balb/c小鼠是因为，它们具有正常的IgG产生，因此IgG的清除比SCID小鼠快。这就提供了一种小鼠模型，其中被施用的抗体可以和内源小鼠IgG竟争结合新生儿Fc受体(FcRn)。图15显示了浓度随时间的半对数曲线图。初始血浆浓度均为100|ag/ml左右，与进入小鼠血浆区室的初始分布一致。无铰链IgG4变体的清除仅比正常IgG4快一点。重要的是，无铰链变体的清除比具有相当分子大小的F(ab')2片段慢得多。本实验表明，在具有正常免疫系统的小鼠体内，Fc-部分对血浆保留时间具有有利的效果，同时表明，在内源IgG的存在下，也存在与新生儿Fc受体(FcRn)的功能相互作用。实施例52/gG4无^链^f谬戎谬^冉^;:r入/gG的sc/dv、處伴力的秀參动力夢一估将16只体重18-22g的SCID小鼠(C.B-17/IcrCrl-scid-BR，Charles-River)用于实验。小鼠在中心实验室动物设备(Utrecht,TheNetherlands)的间隔单元中饲养，置于无菌的滤盖饲养笼中，自由提供饮水和食物。全部实验均获得了Utrecht大学动物伦理委员会的批准。选择免疫缺陷的SCID小鼠用于研究无铰链IgG4变体的药物动力学，是因为这些小鼠对人蛋白质不会产生抗体应答，这种应答可能会影响持续时间超过1周的清除率研究。给这些IgG缺陷小鼠静脉补充高剂量的免疫球蛋白(人类多供体多克隆IgG)，用于研究无铰链IgG4突变体在生理相关浓度的人IgG的存在下的清除。这就提供了一种可以更好地反映人类体内状况的小鼠模型，因为1)IVIG的存在防止了无铰链IgG4締合成二价形式，和2)无铰链IgG4必须与其他IgG竟争结合新生儿Fc受体(FcRn)1。与FcRn结合可保护IgG避免在胞吞后在细胞内降解，而且是其血浆半衰期长的原因。在本模型中，研究了来自人CD20特异性人类mAb克隆7D8的变体的血浆清除。将无铰链IgG4变体(7D8-HQ，批号570-003-EP)的清除与正常IgG4(7D8-IgG4，批号570-002-EP)、7D8IgGl的F(ab，)2片段(7D8-F(ab，)2，批号892-020-XX)的清除进行比较。此外，检验了酶促去糖基化的无铰链变体制备物(TH3001-7D8-HG去糖基，批号991-004-EP)。每种抗体通过尾静脉施用于4只小鼠，剂量为每只小鼠0.1mg于200pi中，相当于每kg体重BazinR,etal.Useofhu-lgG-SCIDmicetoevaluatetheinvivostabilityofhumanmonoclonalIgGantibodies.JImmunolMethods.1994;172:209-17.5mg的剂量。单克隆抗体以和静脉内免疫球蛋白(60mg/ml，Sanquin，TheNetherlands,JFK108ST,charge#04H04H443A)1:1混合物的形式给药。总注射体积为400pl/小鼠，相当于12.5mg/小鼠IVIG的剂量。于给药后15分钟、5小时、24小时、2天、3天、7天和10天，从隐静脉采集50pl血液样品。将血液采集到含有肝素的小瓶中，14,000g离心10分钟。将血浆保存于-20。C,用于确定mAb浓度。用夹心ELISA确定7D8变体的血浆浓度。使用小鼠mAb抗7D8独特型抗体(克隆2F2SAB1.1(LD2)批号0347-028-EP)作为捕集抗体。用补充了0.05%Tween和2%鸡血清的PBS封闭板之后，添加样品，在ELISA緩冲液(补充了0.05%Tween20和2°/0鸡血清的PBS)中系列稀释，并在多孔板摇床上室温(RT)温育2h。输注的抗体用作参照。洗涤后，接着将板与过氧化物酶标记的山羊抗人F(ab，)2特异抗体(109-035-097,JacksonImmunoresearch，WestGrace,PA)温育，并用2，2，-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS;Roche,Mannheim,Germany)显色。用酶标仪(Biotek，Winooski,VT)测量405nm的吸光度。用类似的ELISA确定总人IgG血浆浓度。小鼠mAb抗人IgG-K克隆MH16(#M1268，CLBSanquin,TheNetherlands)用作捕集抗体。过氧化物酶标记的山羊抗人IgG免疫球蛋白(#109-035-098，Jackson,WestGrace,PA)用于检测。药物动力学分析通过确定浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)进行，并作尾修正(tailcorrect)。血浆清除率以剂量/AUC(ml/天)计算。用GraphPadPRISMvs.4(GraphpadSoftware)进行统计分析。图20上图显示了mAb7D8变体浓度随时间的半对数曲线图，下图显示了总人IgG浓度。最初的总人IgG浓度平均为2.3mg/ml，IO天后下降到0.47mg/ml。7D8IgG4和IgG4HG变体的初始血浆浓度处于94-180pg/ml的范围，与进入小鼠血浆区室的分布一致。对于F(ab，)2片段而言，初始浓度低一些，平均62|ig/ml。上图清楚地显示，无铰链变体(包括去糖基化制备物)的清除比完整的IgG4稍快，但是大大慢于F(ab，)2片段。下表显示了从浓度-时间曲线计算出的清除率。无铰链变体的清除率比正常IgG4高2-3倍。然而，其比F(ab，)2片段慢超过10倍。重要的是，去糖基化对无铰链IgG4变体的清除率无显著影响。IgG4血浆清除率(D/AUC)igGlIgG4HG去以ml/天每kg计F(ab')2IgG4HG糖基平均值平均值95°/。置信下限平均值95%置信上限值数3803464154141217439255342919384因此，同样在存在生理相关浓度的人IgG的情况下，无铰链变体的清除比具有相当分子大小的F(ab，)2片段慢得多。该实验证明，同样在存在生理浓度的竟争性人IgG的情况下，无铰链IgG4变体能够与新生儿Fc受体(FcRn)发生功能相互作用。而且，本实验表明，无铰链IgG4变体的糖基化不影响血浆清除，非糖基化的无铰链IgG4变体具有与完全糖基化形式相似的体内半衰期。实施例53/gG4尤^链炎^T伴戎沐^FcW"-/"/、虡谬冲的秀浙动力夢伊估，进行本实验是为了考察IgG4无铰链突变体是否能够与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用，其通过保护IgG在胞吞后免于细胞内降解而延长IgG的血浆半衰期。本实验中使用B2M敲除小鼠，因为它们不表达FcRn。12只雌性C57B1/6B2M敲除小鼠(Taconic模型B2MN12-M,称作FcRrW-小鼠)和12只雌性C57B1/6野生型对照小鼠(Taconic,modelnr.B6，称作WT小鼠)用于实验。小鼠在中心实验室动物设备(Utrecht,TheNetherlands)的隔离单元中祠养，置于滤盖伺养笼中，自由提供饮水和食物。全部实验均获得了Utrecht大学动物伦理委员会的批准。研究来自人CD20特异性人类mAb克隆7D8的变体的血浆清除。将无铰链IgG4变体(7D8-HG,批号992-001-EP)的清除率与正常人IgG4(7D8-IgG4，批号992-002-EP)、7D8IgGl的F(ab，)2片段(7D8-F(ab,)2,批号892-020-XX)进行比较。通过尾静脉静脉内施用单克隆抗体。每种抗体以200pl/鼠，~0.1mg的剂量施用于4只小鼠，相当于5mg/kg体重的剂量。于给药后10分钟、5小时、24小时、2天、3天、7天和10天，从隐静脉(saphenalvein)采集50pl血液样品。将血液采集到含有肝素的小瓶中，14,000g离心10分钟。将血清保存于-20。C,用于确定mAb浓度。用夹心ELISA确定人IgG血浆浓度，其中将小鼠mAb抗人IgG-K克隆抗体MH19-1(#M1272，CLBSanquin,TheNetherlands)以100ng/孔包3皮在96孑LMicrolonELISA4反(Greiner,Germany)上，用作捕集抗体。用补充了0.05%Tween和2%鸡血清的PBS封闭板之后，添加样品，在ELISA緩冲液中系列稀释。相应输注抗体制备物的系列稀释物用作参照。温育和洗涤之后，将板与过氧化物酶标记的F(ab，)2特异性AffiniPure山羊4元人IgG(109-035-097，JacksonImmunoresearch，WestGrace,PA)温育，并用2，2，-连氮基-双-(3-乙基苯并漆唑啉-6-磺酸(ABTS;Roche,Mannheim,Germany)显色。用酶标4义(Biotek，Winooski,VT)测量405nm的吸光度。药物动力学分析通过确定浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)来进行，并进行尾修正。血浆清除率以剂量/AUC(ml/天)计算。用GraphPadPRISMvs.4(GraphpadSoftware)进行统计分析。图21显示了浓度随时间的半对数曲线图。初始血浆浓度均为lOOpg/ml左右，与小鼠血浆区室内的初始分布一致。下表显示了从小鼠个体的浓度-时间曲线计算得到的血浆清除率。<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table>对于F(ab，)2片段，野生型(WT)和缺失(FcRiW-)小鼠之间没有观察到显著差异。相反，对于IgG4和无铰链IgG4变体，WT小鼠中的清除率比FcRn-/-小鼠中慢3-5倍。本实验显示，FcRn的存在对无铰链IgG4的血浆保留时间具有有利的效果。因此，这提供了证据证明无铰链IgG4能够在体内与FcRn发生功能相互作用，这可以解释其良好的血浆半衰期。实施例54MAb2F8是针对人表皮生长因子受体(EGFr)的人IgGl单克隆抗体(mAb)，其能够通过阻断配体的结合抑制EGFr信号传导。由该mAb制备了IgG4变体2F8-IgG4以及无铰链变体2F8-HG。在本实施例中，我们比较了体外2F8-HG与2F8-IgGl和2F8-Fab片段抑制细胞中配体诱导的EGFr磷酸化的效力。该实验在添加和不添加静脉内免疫球蛋白(IVIG)——种包含全部IgG亚类的多克隆人IgG制备物一的条件下进行。用两步测定法测量EGFr磷酸化的抑制，使用表皮细胞系A431(ATCC,AmericanTypeCultureCollection,Manassas,USA)。细月包在含有0.5%人白蛋白(人白蛋白20%，Sanquin，theNetherlands)的无血清培养基的96孔板上培养过夜。接着，加入系列稀释的mAb，同时加或不加固定终浓度(100或1000pg/ml)的IVIG(免疫球蛋白I.V.,Sanquin)。37。C温育60分钟后，添加50ng/ml的重组人EGF(Biosource)，诱导未封闭的EGFr活化。再温育30分钟后，用裂解緩沖液(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)溶解细胞，将裂解物转移到包被有1|ig/ml小鼠抗EGF-R抗体(mAbEGFR1，BDPharmingen，SanDiego，CA)的ELISA板上。室温下温育2小时后，洗涤板，并使用铕标记的磷酸化酪氨酸特异性小鼠mAb(mAbEu-NlP-Tyr-100,PerkinElmer)检测磷酸化EGF-R的结合。最后，添力。DELFIA增强液(enhancementsolution)，在EnVision酶才示4义(PerkinElmer)上测量时间-分!岸荧光，315nm激发，测量615nm发射光。用非线性回归(GmphPadPrism4)计算S型剂量响应曲线。从图14的上图可以看出，当使用没有添加IVIG的培养基时，2F8-HG和2F8-IgGl在抑制磷酸化方面效果相当。两种mAb均比单价结合EGFr的2F8-Fab片^:更有效力。^v图l4的中图和下图显示，添加IVIG对2F8-IgG4和2F8-Fab的影响可以忽略。然而，它使2F8-HG的剂量-响应曲线显著右移，提示结合特性改变，这与如下的观点相符，即在某些条件下2F8-HG可以如二价抗体行为，但是在多克隆人IgG存在下分离成单价形式。实施例55^理证效(Vo0/0/>〃'"">/^,4'/、/^模型诈##CD卵的尤#义链7gG4(0)卯-州》^浙/^￡介,的学裙Pasquier等(Pasquier,Betal.，Immunity22，31(2005))显示，FcaRI(CD89(MonteiroRCetal.，AnnuRevImmunol21，177(2003))同时具有抗炎和促炎作用。FcaRI的聚集通过募集Syk和中止SHP-1结合导致细胞激活。与FcaRI单价相互作用可抑制该激活响应SHP-1被招募，Syk、LAT和ERK的碌酸化被削弱。抗CD-89抗体的Fab片段(克隆A77)能够抑制IgG介导的利用人类单核细胞的吞噬作用。而且，这种抗CD89抗体的Fab片段能够抑制体外(使用FcaRI转染RBL-2H3细胞)和体内(在一种IgE介导的哮喘才莫型中)的IgE介导的响应。在上述动物模型中，用TNP-OVA致敏FcaRI-转基因小鼠(LaunayPetal.，JExpMed巡，1999(2000))。在A77Fab-片段的存在下用IgE-TNP-OVA免疫复合物鼻内刺激的小鼠显示对醋曱胆碱的支气管反应性降低，而无关的Fab片段能够降低支气管超反应性。在如下的实验中获得了抗原特异性非交联单价非活化抗体的原理证明。将贴壁PBMC与10吗/mlA77-HG(IgG4无铰链)(已在有或者没有无关IgG4(GenmabBV)的条件下预温育了24h)或者与无关IgG4(GenmabBV)温育30分钟，洗涤，然后与经过或者未经过多克隆兔抗大肠杆菌IgG抗体调理的德克萨斯红偶联大肠杆菌(50个菌体/细胞)(MolecularProbes,Eugene,OR)根据制造商的说明书在37。C温育30分钟。制作载玻片，并用激光共聚焦显微镜进行检查。接受经调理的大肠杆菌和A77-HG(与无关IgG4预温育过)的PBMC与接受被调理大肠杆菌和对照HG抗体的PMBC相比，大肠杆菌的吞噬作用降低。按照(PasquierBetal.,Immunity22,31(2005))所述用TNP-OVA致敏FcaRI-转基因小鼠，或者，根据Deurloo等的描述(DeurlooDTetal.,ClinExpAllergyH，1297(2003))用OVA致敏FcaRI-转基因小鼠。对人FcaRI转基因小鼠和同窝出生的对照在第0天和第7天用含TNP-OVA或OVA(Sigma)的氢氧化铝腹膜内免疫两次。用和20|ig抗DNP-IgE复合的TNP-OVA(Zuberi，RIetal.,JImmunol巡，2667(2000))或OVA气雾剂(DeurlooDTetal.,ClinExpAllergy11，1297(2003))在A77-HG(IgG4无铰链)或无关无铰链抗体(对照HG)的存在下，连续数天鼻内刺激小鼠。小鼠腹膜内接受50吗A77-HG或对照HG两次，一次在刺激期间，另一次在最后一次鼻内刺激时。最后一次鼻内刺激之后12小时，将小鼠置于全身体禾只4苗i己室(whole國bodyplethysmographchamber)(BUXCOElectronics,SharonCT,USA)内，输送300mM醋曱胆碱。暴露于醋甲胆碱之后，测量气道阻力(Airwayresistance)。对小鼠实施安乐死之后，对肺切片进行免疫组织化学评估。接受A77-HG的小鼠与接受对照HG抗体的小鼠相比，超反应性降低。这表明，无铰链IgG4分子是非交联、单价、非活化的，因此，如果这种惰性抗体对于例如抑制FcaRI介导的炎性反应有利，它可用于治疗目的。实施例56无凝^7gC^cMd「cMW-Z/C^的V々芯证效(prao/o/co"ceW,^f《受体酪氨酸激酶c-Met显著地表达于多种上皮细胞上。在胚胎发生期间，c-Met和肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF)参与组织特异性分化，导致上皮细胞、肌肉内皮和神经及造血系统的正确组织(organization)。在肺瘤发生中，特别是侵袭性和转移性肿瘤的发病中涉及不正常的c-Met信号传导。作为c-Met活性提高的后果，肿瘤细胞可提高其生长速度，对细胞凋亡产生抗性，从而获得生长和/或存活优势。而且，cMet激活可能导致细胞骨架重组(reorganization)和整联蛋白激活，以及参与细胞外基质降解的蛋白水解系统活化，导致侵袭性和迁移能力提高。因此，抑制HGF/SF-cMet信号传导是治疗恶性肿瘤的一个重要治疗途径。Kong-Beltran等在CancerCell(2004,第6巻，第75-84页)中产生了一种抗体(5D5)，其针对cMet的胞外域并抑制HGF结合。抗Met5D5的Fab片段显示可抑制HGF驱动的cMet磷酸化、细胞运动、迁移和肿瘤生长。他们推测，抗cMet-5D5-Fab通过立体位阻(sterichindering)阻断受体二聚体化。MAbC6是针对人cMet的人IgGl单克隆抗体(mAb)，其能够以高亲和力结合H441细胞，激活cMet磷酸化，诱导DU-145分散，并阻断ELISA中HGF与cMet的结合。从该mAb制备了一种IgG4变体(cMet-IgG4)以及一种无铰链变体(cMet-HG)。在针对cMet的无铰链IgG4的构思证明研究中，该单价抗体抑制HGF结合，受体二聚体化/激活，细胞分散和下游信号传导。在添加和未添加静脉内免疫球蛋白(IVIG)的条件下进行该实验，其中IVIG是包含全部的IgG亚类的多克隆人IgG制备物，具有和不具有rHGF。在DMEM+(含有500mlMEMDulbecco(DMEM-培养基，葡萄糖4.5g/ml,含NaHC03,无谷氨酰胺，Sigma,D-6546),50ml加强型小牛血清(HycloneSH30087.03),5ml的200mM/LL-谷氨酰胺(BioWhittatker，BE17-605F)，5ml丙酮酸钠(BioWhittakerBE13-115E)，5ml青霉素/链霉素(BioWhittaker,DE17-603E))中培养DU-145(人前列腺癌细胞系，ATCCHTB-81)细胞，生长成贴壁丛集(adherentclustered)细胞。添加rhHGF(Sigma,H-1404),诱导细胞迁移，产生单体化(singularized)细胞。这个过程称作分散。通过显微镜观察分散的诱导或抑制。第一天在添加或无添加6mg/mlIVIG的条件下，过夜温育cMet、cMet-HG、cMet-Fab、cMet-IgG4(30/3.0/0.3/0.03pg/ml)。接种DU145细胞(从T75培养瓶取出的贴壁细胞)。除去细胞培养上清，用10mlPBS洗涤细胞1次，添加2ml胰蛋白酶/EDTA(37。C),将细胞在37°C温育1-2分钟。通过轻敲使细胞从培养瓶的表面脱离，用储藏的培养上清(storedculturesupernatant)终止胰蛋白酶/EDTA反应。对细胞计数，在新鲜培养基中制备"10"田胞/ml悬液，以50(xl/孔铺板到96孔板(无菌平底Costar，3596)中(最终密度1000细胞/孔)。细胞在37°C和5%C02的培养箱中培养15-24h。第2天将培养基更换为新鲜的培养基，40pl/孔。向细胞添加40pl预温育的抗体，将细胞在37°C培养箱中温育60分钟，之后添加40(il/孔的培养基或60ng/ml的rh-HGF(终浓度为10/1.0/0.1/0.01pg/mlAb,2mg/mlIVIQ20ng/mlHGF)。将细胞温育至少24h。第3和4天24h后或者48h后通过显微镜双盲观察分散情况。分散的形态学特征细胞从表面脱离，呈纺锤形(迁移)，大多数为单个细胞，不聚集成群。抗体对rh-HGF诱导分散的抑制的分级3细胞最大分散2微小的分散抑制1分散抑制0无分散在本实验中，与IVIG预温育的C6-HG显著阻断了HGF诱导的分散。c総f雄的碌凝化在Ham，sF12培养基中培养A549细胞，cMet在正常培养条件下不磷酸化。一旦被HGF激活，cMet受体磷酸化。利用与IVIG预温育的cMet-Fab或cMet-HG阻断cMet，HGF介导的受体磷酸被抑制。第1天在添加和不添加IVIG2.5mg/ml的条件下过夜温育cMet-IgGl,cMet-HG(12.5(ig/ml)。在6孔板中培养A549细胞(1*106/孔)。第2天除去培养基(含有500mlHam，sF12(BioWhittakerBE12-615F50ml加强型小牛血清(HycloneSH30087.03),5ml200mM/LL-谷氨酰胺(BioWhittatker,BE17-605F),5ml青霉素/链霉素(BioWhittaker,DE17-603E))，并向细胞添加800pl经预温育的抗体，在37。C培养箱中温育细胞15min，之后，添加200fil/孔的培养基或80ng/ml的rh-HGF(终浓度为10pg/mlAb,2mg/mlIVIQ16ng/mlHGF)。再温育15min后,除去温育培养基,用冰冷PBS洗涤细胞2次，添加250|ilRIPA裂解緩沖液(含有50mMTris，pH7.5,0.5%脱氧胆酸钠和0.1%NonidetP40，150mMNaCl，0.1°/。SDS，2mM钒酸盐和Complete(蛋白酶抑制剂，Roche1836170)，在4°C轻柔旋转板10min。将裂解物转移到预冷的小管(Eppendorf)中，以最高速度4°C离心30min。除去DNA，取一部分用于BCA蛋白质含量分析(Pierce)，然后将裂解物在N2中速冻(flashfrozen)。裂解物保存在-80。C,直到用于Western印迹。取10|xg还原的样品在4-20%Tris-HClCriterion预制凝胶(Biorad345-0033)上电泳，并根据标准程序在硝酸纤维素膜(Biorad162-0114)上进行Western印迹。在摇床(rollerbank)上用封闭溶液(含有5%BSA(Roche,10735086)的TBST溶液(Tris-HCL20mMpH7.5,NaCl150mM，0.1%Tween20))室温封闭膜1.5小时。将膜与1:1000稀释的抗磷酸Met(pYpYpY123012341235)-兔IgG(Abcam，ab5662)在4。C过夜温育。用TBST洗涤6次后，在摇床上室温温育溶于封闭试剂中的第二抗体山羊抗兔-HRP，CellSignalling,7074(1:2000)60分钟。用TBST洗涤膜6次。最后用鲁米诺增强终止液(LuminolEchancerstopsolution)(Pierce1856145)显色条带，并在Lumiimager上进行分析。与IVIG预温育的cMet-HG可抑制HGF介导的受体磷酸化。图22培养DU-145细胞，并与系列稀释的(A)cMet-Fab;cMet-Fab和IVIG;cMet-Fab和HGF;cMet-Fab和IVIG和HGF(B)cMet-HG;cMet-HG和IVIG;cMet-HG和HGF;cMet-HG和IVIG和HGF进行温育。48h后，通过显微镜双盲观察(由14人打分)分散情况，并将平均值士SEM绘成曲线图。有或没有IVIG的cMet-Fab(A)和与IVIG预温育的cMet-HG(B)以剂量依赖的方式显著阻断了HGF诱导的分散。图23培养DU-145细胞，并与10pg/ml的(A)cMet-Fab;cMet-Fab和IVIG;cMet-Fab和HGF;cMet-Fab和IVIG和HGF(B)cMet-HG;cMet-HG和IVIG;cMet-HG和HGF;cMet-HG和IVIG和HGF进行温育。48h后，通过显微镜双盲观察(由14人打分)分散情况。有或没有IVIG预温育的cMet-Fab和与IVIG预温育的cMet-HG显著阻断了HGF诱导的分散。对于统计学分析，用假定中位数值3(最大分散)进行双尾Wilcoxon符号秩次检验(two-tailedWilcoxonsignedrankedtest)。图24从与cMet-HG(泳道l)、cMet-HG和IVIG(泳道2)、cMet-HG和HGF(泳道3)、cMet-HQIVIG和HGF(泳道4)、cMet-IgGl(泳道5)、cMet國IgGl和IVIG(泳道6)温育的A549细胞制备提取物，将提取物在4-20%Tris-HClCriterion预制凝胶上进行SDS-PAGE分析，并在硝酸纤维素膜上进行Western印迹。将膜与抗磷酸Met(pYpYpY123012341235)-兔IgG(Abcam，ab5662)在4°C过夜温育。用TBST洗涤后，在摇床上室温温育溶于封闭试剂中的第二抗体，山羊抗兔-HRP，CellSignalling,7074(1:2000)60分钟。用TBST洗涤膜6次。最后用鲁米诺增强终止液显色条带，并在Lumiimager上进行分析。Western印迹显示一条169Kd条带，指示磷酸-Met(pYpYpY123012341235)。实施例57乾/^4^^长西f^沐(EG尸^的/gGW无凝链炎f体拔体的体^^估；潜合亲和力和戎沐该務'/i紐應介,细應毒斧^^ix:q)的谬,在本实验中，将一种靶向表皮生长因子受体(EGFr)的IgG4无铰链突变体抗体，mAb2F8-HG，与分别称作2F8-IgG4、2F8-IgGl和2F8-Fab的IgG4型、IgGl型和Fab片段进行比较。体外评估包括在ELISA中结合EGFr的亲和力和ADCC的诱导。ELISA.结合亲和力用ELISA确定，其中用纯化的EGF-R(Sigma，StLouis,MO)以50ng/孑L包净皮96孑LMicrolonELISA板(Greiner，Germany)。用补充了0.05。/。Tween20和2。/。鸡血清的PBS封闭板。随后，添加在含有100pg/ml多克隆人IgG(静脉内免疫球蛋白，IVIGSanquinNetherlands)的緩沖液中系列稀释的样品，室温(RT)温育lh。随后，用过氧化物酶偶联的兔抗人K轻链(DAKO,Glostrup,Denmark)作为检测抗体温育板，并用2,2，-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS;Roche,Mannheim,Germany)显色。用酶标仪(Biotek，Winooski,VT)测量405腦的吸光度。图16显示，2F8-HG和2F8-Fab的结合曲线能够重叠，并且与IgGl和IgG4的结合曲线相比明显右移。对EGFr包被层的亲和力的差异符合如下的看法，即在IVIG存在下，2F8-HG单价结合，正如Fab片段一样。抗体依赖的细胞介导细胞毒作用(ADCO.用铬-51("Cr)释放测定来评估诱导肿瘤细胞发生效应细胞依赖型裂解的能力。在37。C的振荡条件下用100^CiNa251Cr04(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)标记耙A431细胞(2-5xl06细胞)1h。用PBS洗涤细胞3次，并重新悬浮在培养基中，lx105细胞/ml。将经标记的细胞分配在96孔板内(5xl03，50pl/孔)，并与50|xlmAb[在培养基中10-倍系列稀释，范围从20吗/ml到0.02ng/ml(终浓度)]预温育(RT,30分钟)。添加培养基而不是抗体，用于确定自发"Cr释放，添加tritonX100(l。/。终浓度)，用于确定最大51Cr释放。之后，向孔添加PBMC(5xl0V孔)，将细胞在37。C温育过夜。第二天，采集上清液，通过在伽马计数器中确定每分钟的计数(cpm)测量51Cr释放。用如下的公式计算细胞毒性百分比%特异性裂解=(实验释放(cpm)-自发释放(cpm))/(最大释放(cpm)-自发释放(cpm))x100其中最大51Cr释放通过向耙细胞添加tritonX-100确定，自发释放在不存在致每丈抗体和效应细胞的情况下测量。图17显示，2F8-HG不会诱导ADCC，正如2F8-IgG4—样，而2F8-IgGl在这方面非常强。实施例58对lgG4恒定无铰链单价抗体应用AlgoNomics，Epibase⑧平台。简而言之，平台分析源于靶序列的所有可能的10聚体肽的HLA结合特异性(Desmet^a/.1992，1997,2002,2005)。在同种异型水平上对总共20种DRB1，7种DRB3/4/5，14种DQ和7种DP，即48种HLAII型受体，进行剖析(profiling)。Epibase⑧计算肽对48种II型受体中每一种的结合自由能的定量估计值AGbind。然后进一步对这些数据进行如下的处理将肽归类为强(S)结合子、中(M)结合子、弱和无(N)结合子(binder)。在lgG4无铰链单价抗体恒定区内没有遇到强结合表位，仅遇到l个中等结合表位。这个单独的新表位产生一个中等DRB1*0407结合子(DRB1*0407)。DRBP0407是一种少见的同种异型，存在于不到2%的白种人中。此外，中等强度的单个表位即使在免疫原性最小的抗体的总表位计数中也是不显著的。总之，预期无铰链单价IgG4抗体具有免疫原性的可能性极低。实施例59对于单抗体CD4(Unibody-CD4)的实施例59和60的研究背景和所用材料进行体外和体内实验研究针对CD4的人单克隆抗体(HuMax-CD4)抑制HIV-1感染的能力。抗体针对于CD4的结构域l，并与CD4上的HIV1gpl20结合位点重叠。本实施例(59)显示，抗CD4抗体的Fab片段可抑制不同原代分离林和T细胞系适应的HIV病毒对CD4-CCR5细胞或CD4-CXCR4细胞的感染。抑制的IC50值处于HuMax-CD4与sCD4结合和与细胞结合型CD4结合的EC50值的范围内(数据未显示)，提示抑制HIV-1被膜与CD4的结合是其抑制机制。一般地，HuMax-CD4的Fab片段的抑制效力比完整抗体低10倍，这一点/人Fab与完整抗体之间的亲和力差异可以预见到。实施例60显示，在用HuMax-CD4处理的小鼠体内，CD4/CD8比值的下降比IgG对照处理组低，表明HuMax-CD4可保护CD4阳性细胞免于被HIV-1耗损。而且，HuMax-CD4处理导致血液中HIV-1RNA拷贝数随时间降低，而IgG对照处理不会诱导这种降低。体外数据提示，抗CD4抗体能够抵御HIV-1诱导的CD4耗损，降低HIV感染的程度和病毒负荷。Norris等公开了用IgG4亚类的完整抗CD4(结构域2)抗体治疗HIV-1感染的个体。功效结果证明，在主要终点(primaryendpoint)(24周)具有显著的抗病毒活性。持续的应答，如接受TNX-355的患者中第48周的结果所提示的。TNX-35510mg/kg+OBR显示，在48周时，HIV-RNA较之基线降低0.96loglO,而安慰剂+OBR降低0.14loglO(pO.OOl)。TNX-35515mg/kg+OBR显示，在48周时，HIV-RNA较之基线降低0.71loglO,而安慰剂+OBR降^f氐0.14loglO(p=0.009)。在48周，用TNX-355+0811处理，无论是在10mg/kg组(+48细胞，p=0.031)还是在15mg/kg组(+51细胞，p二0.016)中，与安慰剂增加(+l细胞)相比，都伴随着统计学显著的并且具有临床意义的CD4+细胞增加。文献ZwickM.B.,WangM.,PoignardP.,StieglerG"KatingerH.,BurtonD.R.,andParrenP.W.H.I.2001.Neutralizationsynergyofhumanimmunodeficiencyvirustype1primaryisolatesbycocktailsofbroadlyneutralizingantibodies.75:"皿PoignardP"SabbeR.,PicchioG.R.,WangM.,GuliziaR.J.,KatingerH.，ParrenR"W.H.I.,MosierD.E.,andBurtonD.R.1999.NeutralizingantibodieshavelimitedeffectsonthecontrolofestablishedHIV-linfectioninvivo.NorrisD.，MoralisJ.,GatheJ.,GodafskyE.,GarciasF.，HardwickR.,andLewisS.2006.Phase2efficacyandsafetyofthenovelviral-entryinhibitor,TNX-355,incombinationwithoptimizedbackgroundregimen(OBR).J;T/HuMax-CD4完整抗体和HuMax-CD4抗体的Fab片段对HIV-1的体外中和该方法在Zwick等(2001)中有详细描述。总而言之，通过萤光素酶活性测量病毒被抗体中和的程度。通过共转染位于修饰pSVIIIenv载体内的合适病毒构建体(例如原代分离抹JR-CSF,JR-FL,SF162,ADA,YU2,89.6,US143和T细胞适应病毒1118)和？见4-3.160.11~6-，产生能够进行单轮复制(singleroundofreplication)的病毒。将病毒与不同量的针对U87.CD4.CCR5细胞(原代分离株)或CD4-CXCR4细胞(用于IIIB)的抗体预温育(在添加之前确定计数为大约100,000),培养3天。洗涤孔，并与萤光素酶细胞培养物裂解试剂温育，将裂解物转移到不透明测定板上，用萦光素酶测定试剂在发光计上测量萤光素酶活性。对于中和，测试HuMax-CD4和HuMax-CD4的Fab片段。根据所描述的方法，在使用萤光素酶测定表达系统的体外中和测定中使用病毒构建体YU2，IIIB,ADA，89.6，US143，JR-FL,JR-CSF和SF162。HIV-1IIIB是T细胞适应病毒，所有其他病毒是HIV-1的原代分离抹。HuMax-CD4和HuMax-CD4的Fab片段以1:2稀释响应(dilutionresponse)添加，起始于图25所示的浓度。图27给出了HuMax-CD4和HuMax-CD4的Fab片段通过4参数逻辑斯谛分析拟合的曲线，图25中标明了从这些拟合计算出的IC50。数据显示，HuMax-CD4抗体抑制了全部受测病毒的感染，而且一般地，其效力比Fab片段(除YU2和JR-CSF之外)高10倍。HuMax-CD4与sCD4结合的EC50确定为大约0.3-1nM。抑制的IC50值处于这些EC50值的范围内，表明HuMax-CD4所致的受体占据与感染抑制的程度相关。我们的实验为抗CD4抗体(即Fab片段)的单价结合可有效抑制HIV-1对表达CXCR4和CCR5HIV-1共受体的细胞的感染提供了原理证明。这为证明HG抗CD4抗体也可实现类似的抑制提供了证据。实施例60在脊力/w-i^MC-SC7D'/、it///K4染^^型诈膠乂CD4+r细/《凝為实验程序在Poignard等1999中有详细描述。简言之，用大约25x106个正常人PBMC(外周血单个核细胞)重建(reconstitute)CB-17SCID小鼠。大约2周后，用HIV-1(HIV-ljR-csF)感染动物。3天后，对动物腹膜内施用1mg/mlHuMax-CD4或人IgG同种型对照抗体，或者不处理。注射后1小时、6小时、1、2、3、6、9、13和15天时采血，3周后对动物实施安乐死，进行比(用CD4-PE和CD8-APC双染色)。而且，通过定量RocheRTPCR测定法测量HIV-1RNA水平，从而测定血浆病毒负荷。此外，用直接sCD4结合ELISA(sCD4包被在平板上，并用抗Fc多克隆抗体检测)，确定血浆中HuMax-CD4的浓度。图28中，给出了动物的血浆浓度。可以得出结论，HuMax-CD4注射产生高HuMax-CD4血浆浓度，其在第15天仍然保持在100(ig/ml以上。未处理的小鼠没有显示高于背景的可测量值。图26中，给出了在实验结束时从小鼠采集的细胞数目。数据表明，HIV-1感染导致CD4阳性T细胞大量降低，这可从CD4/CD8比值的下降看出。这表明，与未感染小鼠的恒定水平相比，血液中的CD4阳性T细胞被HIV-1快速损耗。腹膜内HuMax-CD4处理的小鼠CD4/CD8比的下降小得多，这表明HuMax-CD4具有保护CD4阳性细胞免遭HIV-1损耗的作用。图29中，给出了每ml血液的HIV-1RNA拷贝数随时间的数据，这些数据表明，HuMax-CD4处理可随时间降低血液中HIV-1RNA的拷贝数，而同种型对照抗体没有造成降低。我们的实验为体内保护CD4细胞在HIV-1感染中的损耗提供了原理证明。甚至在完整抗CD4抗体本身具有CD4损耗性的情况下，也观察到了抗损耗的保护作用。这表明，使用单价非损耗性抗CD4抗体，例如抗CD4HG抗体进行处理，可以获得针对HIV-1诱导的T细胞损耗的强保护。在相似的实验设置中，可以获得用抗CD4HG中和HIV-1和保护CD4抗损耗的原理证明。这证明，显示长体内半衰期的HuMax-CD4HG可以抑制HIV-1感染和HIV-1病毒负荷，保护CD4阳性细胞防止损耗。结果总结实验中提供的数据显示，通过破坏铰链外显子的剪接供体位点表达无铰链IgG4抗体可产生无铰链IgG4半分子(一条重链和一条轻链的组合)。非还原条件下的SDS-PAGE、质语、大小排阻层析和》文射免疫测定证明了无交联能力的IgG4无铰链半分子的存在。无铰链抗体保留了与天然形式的IgGl和lgG4抗体分子相同的抗原结合特异性。这一点在两种具有不同特异性的无铰链抗体7D8-HG(B细胞抗原CD20特异性)和Betvl-HG(桦树花粉抗原Betv1特异性)中得到了证明。7D8-HG的Clq结合不存在，而且仅观察到微弱的补体依赖性细胞毒作用(ADCC)(与天然形式的7D8-IgG4抗体相比)。使用Betvl-HG的交联实验显示了无铰链半分子的单价性。IgGl和lgG4显示可将结合于Sepharose的Betv1与放射性标记的Betv1交联，而无铰链分子Betvl-HG则不能交联。在小鼠药物动力学(PK)实验中，对7D8-HG的半衰期进行了体内评估，并与7D8-IgG4进行了比较。尽管在此模型中7D8-HG的清除比正常IgG4快2-3倍，但是其6天的半衰期与报道的IgGF(ab，)2片段不足1天的半衰期相比更加有利。我们得出结论，有利的PK曲线使得IgG4无铰链抗体在需要非交联性、单价和非补体激活性抗体时具有治疗应用价值。序列列表SEQIDNo:l:人IgG之CLk的核酸序列101CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGT151AACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG201CCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAG301AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTSEQIDNo:2:人IgG之CLk的氨基酸序列1RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV()WKVDNALQSG51NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK101SFNRGECSEQIDNo:3:人IgG之的核酸序列151CCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAA251CCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAG301AAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCASEQIDNo:4:人IgG之CLX的氨基酸序列1TVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSS51PVKAGVETTTPSKQS丽KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVE101KTVAPTECSSEQIDNo:5:HuMab-7D8之VH的核酸序列351GGTCACCGTCTCCTCASEQIDNo:6:HuMab-7D8之VH的氨基酸序列1EVQLVESGGGLVQPDRSLRLSCAASGFTFHDYAMHWVRC^APGKGLEWVST51ISWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQ顧SLRAEDTALYYCAKDI101QYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSSEQIDNo:7:鼠抗Betv-1之VH的核酸序列101TCCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGGTTGGAAGG351CTCASEQIDNo:8:鼠抗Betv-1之VH的氨基酸序列1EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWVGR51IDPATGNTRYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCASFR101PGYALDYWGQGTSVTVSSSEQIDNo:9:HuMab-7D8之VL的核酸序列301GGGACACGACTGGAGATTAAASEQIDNo:10:HuMab-7D8之VL的氨基酸序列1EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD51ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQ101GTRLEIKSEQIDNo:ll:鼠抗Betv-1之VL的核酸序列301GGCACCAAGCTGGAAATCAAASEQIDNo:12:鼠抗Betv-1之VL的氨基酸序列1DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSFTCKASQDVFTAVAWYQQKPGQSPKLLIYW51ASTRRTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHFSTPPTFGG101GTKLEIKSEQIDNo:13:人lgG4野生型CH区的核酸序列251ACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAG301AGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTC751GCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCC1001TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC1151AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCACGGGGTGCGAGGGCCACAT1551ACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAASEQIDNo:14:人IgG4野生型CH区的氨基酸序列1ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV51HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES101KYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED201CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK251GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG301NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKSEQIDNo:15:编码在714位和722位突变的人IgG4之CH区(SEQIDNo:13)的核酸序列251ACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAG301AGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCCCTC751GCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCC1001TGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC1151AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCACGGGGTGCGAGGGCCACAT1551ACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAASEQIDNo:16:人IgG4无铰链CH区的氨基酸序列1ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV51HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVAP101EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV151EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI201EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE251SNGQPE丽YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL301HNHYTQKSLSLSLGKSEQIDNO:17丄链恒定区的氨基酸序列(登录号S25751)1qpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvka51gvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektva101pteCsSEQIDN0:18:K链恒定区的氨基酸序歹'J(登录号P01834)1tvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgn51sqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtks101fnrgeCSEQIDNO:19:IgGl恒定区的氨基酸序歹寸(登录号P01857)1astkgpsv^)lapSskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgv51htf^avlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvep101kscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvs151hedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngk201eykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsRDemtknqvsltc251lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysKltvdksrw301qQgnvfscsvmhealhnhytqkslslsPgkSEQIDNO:20:IgG2恒定区的氨基酸序列(登录号P01859)1astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgv51htfpavlqssglyslsswtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktver101kccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedp151evqfiiwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrwsvltvvhqdwlngkeykc201kvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsReemtknqvsltclvkg251fypsdiavewesngqpennykttppMldsdgsfflysKltvdksrwqQgn301vfscsvmheahnhytqkslslsPgkSEQIDNO:21:IgG3恒定区的氨基酸序列(登录号A23511)1astkgpsvfplapcsrstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgv51h饰avlqssglyslssvvtvpssslgtqtytcnvnhkpsntkvdkrvel101ktplgdtthtcprcpepkscdtpppcprcpepkscdtpppcprcpepksc151dtpppcprcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshed201pevqfkwyvdgvevhnaktkpreeqynstfrwsvltvlhqdwlngkeyk251ckvsnkalpapiektisktkgqprepqvytlppsReemtknqvsltclvk301gfypsdiavewesSgqpennyNttppMIdsdgsfflysKltvdksrwqQg351nlfscsvmhealhnRFtqksslsPgk权利要求1.制备单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码Ig之恒定CL区的核苷酸序列，其中所述编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和所述编码Ig之CL区的核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列经过修饰，使得CL区不含有任何如下所述的氨基酸在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸能够与其它包含与该CL区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价键；ii)提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人Ig之恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，使得下列区域相应于铰链区的区域，以及如Ig亚型所要求的，CH区的其它区域，如CH3区不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与人IgCH区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或者共价或稳定非共价的重链间键，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和该编码所述Ig之CH区的核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。2.根据权利要求1的方法，其中人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。3.根据权利要求l的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸Ch区的IgGl,其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)被Gln(Q)替换；239位的Asp(D)被Glu(E)替换；292位的Lys(K)被Arg(R)替换；302位的Gin(Q)被Glu(E)替换；和328位的Pro(P)被Leu(L)替换。4.根据权利要求3的方法，其中238位的Arg(R)被Gin(Q)替换。5.根据权利要求3的方法，其中238位的Arg(R)被Gln(Q)替换，328位的Pro(P)被Leu(L)替换。6.根据权利要求3的方法，其中发生了全部5种替换。7.根据权利要求1或3的方法，其中人Ig是IgGl,并且CL区是具有如SEQIDNO:18所示之氨基酸序列的k轻链CL,其中CL区经过修饰而使得106位的末端半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。8.根据权利要求1或3的方法，其中人Ig是IgGl，并且CL区是具有如SEQIDNO:17所示之氨基酸序列的入轻链CL,其中CL区经过修饰而使得104位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基替换或者被删除。9.根据权利要求l、3、7或8的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl，其中CH1区经过修饰而使得14位的Ser(S)被半胱氨酸残基替换。10.根据权利要求1的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:20所示之氨基酸Ch区的IgG2，其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)被Gin(Q)替换；276位的Met(M)被Val(V)替换；288位的Lys(K)被Arg(R)替换；298位的Gin(Q)被Glu(E)替换；和324位的Pro(P)被Leu(L)替换。11.根据权利要求10的方法，其中234位的Arg(R)被Gln(Q)替换。12.根据权利要求10的方法，其中234位的Arg(R)被Gin(Q)替换；324位的Pro(P)被Leu(L)替换。13.根据权利要求10的方法，其中发生了全部5种替换。14.根据权利要求1的方法，其中人Ig是具有如SEQIDNO:21所示之氨基酸Ch区的IgG3,其中CH3区经过修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)被Gin(Q)替换；314位的Ser(S)被Asn(N)替换；322位的Asn(N)被Lys(K)替换；327位的Met(M)被Val(V)替换；339位的Lys(K)被Arg(R)替换；349位的Gin(Q)被Glu(E)替换;352位的lie(I)被Val(V)替换；365位的Arg(R)被His(H)替换；366位的Phe(F)被Tyr(Y)替换；和375位的Pro(P)被Leu(L)替换。15.根据权利要求14的方法，其中285位的Arg(R)被Gin(Q)替换。16.根据权利要求14的方法，其中285位的Arg(R)被Gin(Q)替换；375位的Pro(P)被Leu(L)替换。17.根据权利要求14的方法，其中发生了全部IO种替换。18.用于产生单价抗体的方法，所述方法包括i)提供编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码Ig之恒定(CO区的核酸序列，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和该编码Ig之CL区的核酸序列可操作地连接在一起；ii)提供编码所述单价抗体之重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人IgG4之CH区的核酸序列，其中编码重链的核酸序列经过修饰，使得相应于重链铰链区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物人类时，所述氨基酸残基能够参与同其它包含与人IgG4恒定(Ch)区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核酸和该编码IgG4之CH区的核酸可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。19.根据权利要求l-18任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于重链铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。20.根据权利要求l-19任一项的方法，其中所产生的单价抗体是人抗体。21.根据权利要求l-20任一项的方法，其中所产生的单价抗体不与合成抗原(Tyr,Glu)-Ala-Lys结合。22.根据权利要求1-21任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域中的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被替换为其他氨基酸残基。23.根据权利要求22的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰，从而使铰链区的半胱氨酸残基被替换为具有不带电荷极性侧链或非极性侧链的氨基酸残基。24.根据权利要求22或23的方法，其中具有不带电荷极性侧链的氨基酸独立地从下组选择甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，具有非极性侧链的氨基酸独立地从下组选择丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和曱疏氨酸。25.根据权利要求22的方法，其中所述核酸序列编码人IgG4的重链，并且其中该核酸序列经过修饰从而使重链包含这样的Ch区，其中删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸的氨基酸。26.根据权利要求22或25的方法，其中所述核酸序列编码人IgG4的重链，并且其中该核酸序列经过修饰从而使重链包含这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106-109位氨基酸残基的氨基酸残基。27.根据权利要求22-26任一项的方法，其中所述核酸序列编码人IgG4的重链，并且其中该核酸序列经过修饰从而使重链包含这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第99-110位氨基酸残基的氨基酸残基。28.根据权利要求22-27任一项的方法，其中编码重链的核酸序列经过修饰从而使整个铰链区被删除。29.根据权利要求l-28任一项的方法，其中编码所述单价抗体之重链的核酸构建体包括编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点的至少一个核苷酸被替换为另一种核苷酸。30.根据权利要求29的方法，其中编码所述单价抗体之重链的核酸构建体包括编码人IgG4之CH区的核苷酸序列，其中相应于SEQIDNo:13所示序列之第714和722位核苦酸的核香酸各自被替换为与SEQIDNo:13中该位置上存在的核苷酸不同的核苷酸。31.根据权利要求30的方法，其中该编码所述单价抗体重链的核酸构建体包括编码人IgG4CH区的核苦酸序列，该序列包含SEQIDNo:13所示的序列，其中SEQIDNo:13所示序列第714和722位的核苷酸各自被替换为与SEQIDNo:13中该位置上存在的核苷酸不同的核苷酸。32.根据权利要求31的方法，其中该编码所述单价抗体重链的核酸构建体包含SEQIDNo:15所示核苷酸序列。33.根据权利要求22的方法，其中所述核酸序列编码人IgG4的重链，并且其中该核酸序列经过修饰从而使该重链含有这样的Ch区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列之第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。34.根据权利要求29-33任一项的方法，其中编码CH区铰链区的核酸序列中被替换的核苷酸是通过定点诱变替换的。35.根据权利要求l-34任一项的方法，其中编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体包括编码人IgGk链之CL区的序列。36.根据权利要求35的方法，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:l所示的核香酸序列。37.根据权利要求l-34任一项的方法，其中编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体包括编码人IgGi链CL区的序列。38.根据权利要求37的方法，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:3所示的核苷酸序列。39.根据权利要求l-38任一项的方法，其中所述核酸构建体是DNA构建体。40.根据权利要求l-39任一项的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的核酸构建体是原核表达载体。41.根据权利要求l-40任一项的方法，其中所述细胞表达系统是原核细胞表达系统。42.根据权利要求41的方法，其中所述原核细胞表达系统包含大肠杆菌细胞。43.根据权利要求42的方法，其中大肠杆菌细胞是内源蛋白酶活性缺陷菌抹的细胞。44.根据权利要求l-39任一项的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的核酸构建体是真核表达载体。45.根据权利要求44的方法，其中细胞表达系统是真核细胞表达系统。46.根据权利要求45的方法，其中细胞表达系统是哺乳动物细胞表达系统。47.根据权利要求46的方法，其中哺乳动物细胞表达系统包含CHO细胞。48.根据权利要求46的方法，其中哺乳动物细胞表达系统包含HEK-293F细胞。49.根据权利要求l-39任一项的方法，其中表达系统的i)和ii)包含适合于基因治疗的DNA构建体。50.根据权利要求l-39任一项的方法，其中表达系统的i)和ii)是适合于基因治疗的病毒构建体。51.根据权利要求l-39任一项的方法，其中哺乳动物细胞表达系统的iii)是包含i)和ii)的人类细胞，它们适合于植入到需要用所产生的单价抗体治疗的患者体内。52.根据权利要求l-51任一项的方法，其中人类细胞源于患者。53.根据权利要求l-52任一项的方法，其中所产生的单价抗体是供治疗用的。54.—种单价抗体，它是通过使用根据权利要求l-50和53任一项的方法获得的。55.—种单价抗体，它可通过使用根据权利要求l-50和53任一项的方法获《曰付。56.—种单价抗体，包含轻链和重链，其中a)所述轻链包含选定的抗原特异性抗体之可变(VO区的氨基酸序列和Ig之恒定(CO区的氨基酸序列，并且其中，在IgGl亚型的情况下，恒定(CO区的氨基酸序列经过修饰，使得它不含有任何如下所述的氨基酸在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸能够参与同其它包含与所述Ig之恒定(QJ区相同的氨基酸序列的肽形成二疏键或共价键；和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体之可变(VH)区的氨基酸序列和人Ig之恒定(Ch)区的氨基酸序列，其中恒定(Ch)区的氨基酸序列经过修饰，使得下述区域铰链区，以及如Ig亚型所要求的，Ch区的其它区域，如Ch3区不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与所述人Ig之恒定(QO区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或者共价或稳定非共价重链间键。57.根据权利要求56的单价抗体，其中人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。58.—种单价抗体，包含轻链和重链，其中a)所述轻链包含选定的抗原特异性抗体之可变(VO区的氨基酸序列和Ig之恒定(CO区的氨基酸序列，和b)所述重链包含选定的抗原特异性抗体可交(Vh)区的氨基酸序列和人IgG4恒定(QO区的氨基酸序列，其中重链的氨基酸序列经过修饰，使得在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，在相应于铰链区的区域内存在的任何氨基酸残基均不能参与同其它包含与所述人IgG4恒定(ch)区相同的氨基酸序列的肽形成稳定的二硫键。59.根据权利要求56-58任一项的单价抗体，其中CL区是人IgGk轻链的恒定区。60.根据权利要求59的单价抗体，其中CL区包含SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。61.根据权利要求56-58任一项的单价抗体，其中C^区是人IgGX轻链的恒定区。62.根据权利要求61的单价抗体，其中C^区包含SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。63.根据权利要求56-62任一项的单价抗体，其中轻链和重链通过一个或多个二辟^定相互连接。64.根据权利要求56-63任一项的单价抗体，其中该轻链和重链通过酰胺键相互连4妾。65.根据权利要求56-64任一项的单价抗体，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。66.根据权利要求56-65任一项的单价抗体，其中重链的氨基酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域中至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被替换为其他氨基酸残基。67.根据权利要求56-66任一项的单价抗体，其中铰链区的半胱氨酸残基被替换为具有不带电荷极性侧链或非极性侧链的氨基酸残基。68.根据权利要求67的单价抗体，其中具有不带电荷极性侧链的氨基酸独立地从下组选择甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸，具有非极性侧链的氨基酸独立地从下組选择丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和曱硫氨酸。69.根据权利要求66的单价抗体，其中重链是人IgG4的重链，其中该重链的氨基酸序列经过修饰从而使该重链包括这样的Ch区，其中删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸的氨基酸。70.根据权利要求66或69的单价抗体，其中重链是人IgG4的重链，其中该重链的氨基酸序列经过修饰从而使该重链包括这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106-109位氨基酸残基的氨基酸残基。71.根据权利要求66-70任一项的单价抗体，其中该重链是人IgG4的重链，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使该重链包含这样的Ch区，其中至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第99-110位氨基酸残基的氨基酸残基。72.根据权利要求66-71任一项的单价抗体，其中整个铰链区被删除。73.根据权利要求69的单价抗体，其中重链包含SEQIDNo:16所示的氨基酸序列。74.根据权利要求66的单价抗体，其中该重链是人IgG4的重链，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使重链包含这样的CH区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。75.根据权利要求66的单价抗体，其中重链是人IgG4的重链，其中该重链的氨基酸序列经过修饰，从而使该重链包括这样的CH区，其中相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基中的一个被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，而相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基中的另一个被删除。76.根据权利要求75的单价抗体，其中相应于第106位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基，而相应于第109位氨基酸残基的氨基酸残基被删除。77.根据权利要求75的单价抗体，其中相应于第106位氨基酸残基的氨基酸残基被删除，而相应于第109位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。78.根据权利要求56-77任一项的单价抗体，其中所述抗体可以通过包括在体外细胞表达系统中重组表达该抗体的方法获得。79.根据权利要求78的单价抗体，其中该方法包括i)提供编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体，所述构建体包括编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码Ig之恒定CL区的核芬酸序列，其中该编码选定的抗原特异性抗体之Vt区的核苷酸序列与编码Ig之CL区的所述核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgGl亚型的情况下，编码CL区的核香酸序列经过修饰，从而使Cl区不含有任何如下所述的氨基酸在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸能够和其它包含与Ct区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价键；ii)提供编码所述单价抗体之重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人Ig之恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，使得下列区域相应于4交链区的区域，和如Ig亚型所要求的，Ch区的其它区域，如Ch3区不包含任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与所述人Ig之CH区相同的氨基酸序列的肽形成二疏4定或者共价或稳定非共价重链间键；其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和该编码Ig之CH区的核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。80.根据权利要求79的单价抗体，其中人Ig是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4抗体。81.根据权利要求78的单价抗体，其中该方法包括i)提供编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码IgG之(\区的核苷酸序列；ii)提供编码所述单价抗体之重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核普酸序列和编码人IgG4之Cw区的核苷酸序列，其中编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使得相应于铰链区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基能够参与形成稳定的二硫键；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达所述核酸构建体产生所述单价抗体，该抗体包括由(i)的核酸构建体编码的轻链和由(ii)的核酸构建体编码的重链。82.根据权利要求56-81任一项的单价抗体，该单价抗体在以4mg/kg的剂量体内施用时，具有10pg/ml以上的血浆浓度超过7天。83.根据权利要求82的单价抗体，其中该单价抗体在以4mg/kg的剂量体内施用于SCID小鼠时，具有10pg/ml以上的血浆浓度超过7天。84.根据权利要求56-83任一项的单价抗体，该单价抗体的血浆清除比F(ab，)2片段的血浆清除慢超过10倍。85.根据权利要求84的单价抗体，其中F(ab，)2片段的序列与单价抗体相应区域的序列相同。86.根据权利要求84的单价抗体，其中血浆清除是用SCID小鼠测量的。87.根据权利要求84的单价抗体，其中F(ab，)2片段的VH区和Vl区与单价抗体的Vh区和V^区相同。88.根据权利要求56-87任一项的单价抗体时，其半衰期至少为5天。89.根据权利要求56-87任一项的单价抗体时，其半衰期至少为5天，最长达21天。90.根据权利要求56-87任一项的单价抗体时，其半衰期至少为5天，最长达14天。91.根据权利要求56-87任一项的单价抗体时，其半衰期至少为14天。92.根据权利要求56-87任一项的单价抗体时，其半衰期至少为21天。93.根据权利要求88的单价抗体，其中所述单价抗体在体内施用于SCID小鼠时，其半衰期至少为5天。94.根据权利要求56-93任一项的单价抗体，其中所述抗体能够与FcRn结合。95.根据权利要求56-94任一项的单价抗体，其特异性结合肺瘤抗原。96.根据权利要求56-95任一项的单价抗体，其特异性结合细胞表面受体，该受体在受体二聚体化时被激活。97.根据权利要求56-96任一项的单价抗体，其中该单价抗体在与靶分子结合时，抑制靶分子多聚体化和/或聚集。98.根据权利要求56-97任一项的单价抗体，其中该单价抗体与从下组选择的耙标结合VEGF、cMet、CD20、CD38、IL-8、CD25、CD74、FcalphaRI、FcepsilonRI、乙酰胆碱受体、fas、fasL、TRAIL、肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的包膜E2、组织因子、组织因子与因子VII的复合物、EGFr、CD4和CD28。99.根据权利要求56-97任一项的单价抗体，其中该单价抗体与从下组选择的靶标特异性结合VEGF、cMet、CD20、CD38、IL-8、CD25、CD74、FcalphaRI、FcepsilonRI、乙酰胆碱受体、fas、fasL、TRAIL、肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的包膜E2、组织因子、组织因子与因子vn的复合物、EGFr、CD4和CD28。100.根据权利要求56-97任一项的单价IgG4抗-cMet抗体。101.根据权利要求54-100任一项的单价抗体，其在存在多克隆人IgG时处于单价形式。102.根据权利要求54-100任一项的单价抗体，其在施用给人类时处于单价形式。103.根据权利要求54-100任一项的单价抗体，其在存在多克隆人IgG时解离成单价形式。104.根据权利要求54-100任一项的单价抗体，其在施用给人类时解离成单价形式。105.根据权利要求56-104任一项的单价抗体，其中所述抗体不能结合效应物。106.根据权利要求54-104任一项的单价抗体，其中该抗体生产以供药用。107.制备权利要求56-106任一项的单价抗体的方法，该方法包括如下步骤a)培养包含编码所述单价抗体的核酸的宿主细胞；和b)从宿主细胞培养物中回收单价抗体。108.根据权利要求107的方法，其中所述宿主细胞是原核的。109.根据权利要求108的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。110.根据权利要求109的方法，其中大肠杆菌细胞是内源蛋白酶活性缺陷菌才朱的细胞。111.根据权利要求107的方法，其中所述宿主细胞是真核的。112.根据权利要求111的方法，其中所述宿主细胞是HEK-293F细胞。113.根据权利要求lll的方法，其中所述宿主细胞是CHO细胞。114.根据权利要求111的方法，其中所述宿主细胞是人类细胞。115.根据权利要求107-114任一项的方法，其中从培养基回收单价抗体。116.根据权利要求107-114任一项的方法，其中从细胞裂解物回收单价抗体。117.用于表达供药用的单价抗体的核酸构建体，其包含i)编码IgG4之CH区的核酸序列，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使得相应于所述CH区中铰链区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基能够参与同包含与所述CH区氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽形成稳定的二硫键；或ii)编码人Ig恒定CH区的核苷酸序列，其中该编码CH区的核苷酸序列经过修饰，从而使得相应于下列区域4交链区，以及如Ig亚型所要求的，Ch区的其他区域，如Ch3区的区域不含有任何如下所述的氨基酸残基当存在多克隆人IgG或施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与所述人IgCH区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或者共价或稳定非共价重链间键；或(iii)与它们互补的序列。118.根据权利要求117的核酸构建体，其中该编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域不含有任何半胱氨酸残基。119.根据权利要求117或权利要求118的核酸构建体，其中编码CH区的核酸序列经过修饰，从而使相应于铰链区的区域中的至少一个氨基酸残基，包括任何半胱氨酸残基，被删除和/或被替换为其它氨基酸残基。120.根据权利要求119的核酸构建体，其中该编码IgG4CH区的核酸序列经过修饰，从而删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸的氨基酸残基。121.根据权利要求119或权利要求120的核酸构建体，其中编码IgG4之ch区的核酸序列经过修饰，从而至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第106-109位氨基酸残基的氨基酸残基。122.根据权利要求119-121任一项的核酸构建体，其中编码IgG4之ch区的核酸序列经过^^饰，/人而至少删除了相应于SEQIDNo:14所示序列中第99-110位氨基酸残基的氨基酸残基。123.根据权利要求119-122任一项的核酸构建体，其中编码IgG4之ch区的核酸序列经过修饰，从而使整个铰链区被删除。124.根据权利要求117-123任一项的核酸构建体，其中该编码ch区的核酸序列经过修饰，从而使编码铰链区的核酸序列的剪接供体位点的至少一个核苷酸被另一种核苦酸替换。125.根据权利要求124的核酸构建体，其中相应于SEQIDNo:13所示序列中第714和722位核苷酸的核苷酸被替换为与SEQIDNo:13所示序列中该位置上存在的核苷酸不同的核苷酸。126.根据权利要求125的核酸构建体，其中编码IgG4CH区的核酸序列包含SEQIDNo:13所示的序列，其中SEQIDNo:13所示序列中第714和722位核苷酸被替换为与SEQIDNo:13所示序列中该位置上存在的核苷酸不同的核香酸。127.根据权利要求126的核酸构建体，其中编码CH区的核酸序列包含SEQIDNo:15所示的核苷酸序列。128.根据权利要求119的核酸构建体，其中编码ch区的核酸序列经过修饰，从而使相应于SEQIDNo:14所示序列中第106和109位氨基酸残基的氨基酸残基被替换为不同于半胱氨酸的氨基酸残基。129.根据权利要求124-128任一项的核酸构建体，其中该编码ch区的核酸序列中被替换的核苦酸是通过定点诱变替换的。130.根据权利要求117-129任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含编码抗原特异性抗体之VH区的核酸序列或其互补序列。131.根据权利要求130的核酸构建体，其中编码Vh区的核酸序列可操作地连接于编码CH区的核酸序列或其互补序列。132.根据权利要求117-131任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含编码根据权利要求54-106任一项的单价抗体的重链的核苷酸序列。133.根据权利要求132的核酸构建体，其中所述构建体包含编码根据权利要求54-106任一项的单价抗体之VL区的核酸序列。134.根据权利要求133的核酸构建体，其中编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体包含编码人IgGk链CL区的序列。135.根据权利要求134的核酸构建体，其中该核酸构建体包含SEQIDNo:l所示的核芬酸序列。136.根据权利要求133的核酸构建体，其中编码所述单价抗体之轻链的核酸构建体包含编码人IgGX链CL区的序列。137.根据权利要求136的核酸构建体，其中核酸构建体包含SEQIDNo:3所示的核苷酸序列。138.根据权利要求117-137任一项的核酸构建体，其中该核酸构建体是DNA构建体。139.根据权利要求117-138任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体是表达载体。140.根据权利要求139的核酸构建体，其中所述表达载体是原核表达载体。141.根据权利要求139的核酸构建体，其中所述表达载体是真核表达载体。142.根据权利要求141的核酸构建体，其中所述表达载体是哺乳动物表达载体。143.根据权利要求142的核酸构建体，其中所述表达载体适合于人类中的基因治疗。144.根据权利要求139的核酸构建体，其中所述表达载体是适合于人类中的基因治疗的病毒载体。145.制备根据权利要求54-106任一项的单价抗体的方法，包括培养宿主细胞从而使多肽表达，并从细胞培养物回收抗体，所述宿主细胞包含根据权利要求117-144任一项的核酸构建体，并且如果所述核酸构建体不编码所述抗体的轻链，还包含含有编码所述抗体的轻链的核酸序列的核酸构建体。146.根据权利要求145的方法，其中从细胞裂解物中回收单价抗体。147.根据权利要求145的方法，其中从细胞培养基中回收单价抗体。148.根据权利要求117-144任一项的核酸构建体用于制备根据权利要求54-106任一项的单价抗体的用途。149.根据权利要求148或170的用途，其中单价抗体的制备包括使用根据权利要求1-53任一项的方法。150.宿主细胞，其包含根据权利要求117-144任一项的核酸。151.根据权利要求150的宿主细胞，该宿主细胞是原核细胞。152.根据权利要求151的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。153.根据权利要求150的宿主细胞，该宿主细胞是真核细胞。154.根据权利要求153的宿主细胞，该宿主细胞是哺乳动物细胞。155.根据权利要求154的宿主细胞，该宿主细胞是CHO细胞。156.根据权利要求154的宿主细胞，该宿主细胞是HEK-293F细胞。157.根据权利要求154的宿主细胞，该宿主细胞是人类细胞。158.根据权利要求154的宿主细胞，该宿主细胞是源于患者的人类细胞。159.根据权利要求154的宿主细胞，该宿主细胞是患者中的人类细胞。160.宿主细胞，其包含根据权利要求132-144任一项的核酸。161.纟艮据权利要求160的宿主细胞，该宿主细胞是原核细胞。162.根据权利要求161的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌细胞。163.根据权利要求162的宿主细胞，该宿主细胞是真核细胞。164.根据权利要求163的宿主细胞，该宿主细胞是哺乳动物细胞。165.根据权利要求164的宿主细胞，该宿主细胞是CHO细胞。166.根据权利要求164的宿主细胞，该宿主细胞是HEK-293F细胞。167.制备根据权利要求54-106任一项的单价抗体的方法，包括培养根据权利要求160-166任一项的宿主细胞，该宿主细胞包含编码所述抗体之轻链的核酸序列，从而表达多肽，并/人细胞培养物中回收抗体。168.根据权利要求167的方法，其中从细胞裂解物中回收抗体。169.根据权利要求167的方法，其中从细胞培养基中回收抗体。170.根据权利要求150-159任一项的宿主细胞用于制备根据权利要求54-106任一项的单价抗体的用途。171.根据权利要求170的用途，其中该单价抗体的制备包括使用根据权利要求l-53任一项的方法。172.—种免疫偶联物，包括与治疗性模块偶联的根据权利要求54-106任一项的单价抗体。173.根据权利要求172的免疫偶联物，其中该治疗性模块是细胞毒素、化学治疗剂、免疫抑制剂或》文射性同位素。174.用作药物的根据权利要求56-106任一项的单价抗体。175.用作治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症病症和/或血管新生病症的药物的根据权利要求174的单价抗体，其中该抗体特异性结合给定的靶标或靶表位，其中抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。176.用作治疗疾病或病症的药物的根据权利要求174或权利要求175的单价抗体，该疾病或病症能够通过施用针对特定靶标的抗体而加以治疗，其中对于实现施用该抗体的效果而言，免疫系统介导的活性的参与不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。177.用作治疗疾病或病症的药物的根据权利要求174-176任一项的单价抗体，该疾病或病症能够通过阻断或抑制可溶抗原而加以治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不利的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。178.用作治疗疾病或病症的药物的根据权利要求174-176任一项的单价抗体，该疾病或病症能够通过阻断或抑制细胞膜结合受体而加以治疗，其中所述受体能够通过该受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异性结合。179.根据权利要求54-106任一项的单价抗体作为药物的用途。180.#4居权利要求179的用途，其中该药物有用于治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症病症和/或血管新生病症，其中该抗体特异性结合给定的靶标或靶表位，其中抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。181.根据权利要求179或权利要求180的用途，其中该药物有用于治疗疾病或病症，该疾病或病症能够通过施用针对特定把标的抗体加以治疗，其中对实现施用该抗体的效果而言，免疫系统介导的活性的参与不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。182.根据权利要求179-181任一项的用途，其中该药物有用于治疗疾病或病症，该疾病或病症能够通过阻断或抑制可溶抗原加以治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不利的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。183.根据权利要求179-181任一项的用途，其中该药物有用于治疗疾病或病症，该疾病或病症能够通过阻断或抑制细胞膜结合受体加以治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异性结合。184.根据权利要求54-106任一项的抗体在制备用于治疗癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症病症和/或血管新生病症的药物组合物中的用途，其中该抗体特异性结合给定的靶标或耙表位，其中抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。185.根据权利要求54-106任一项或权利要求184的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症能够通过施用针对特定輩巴标的抗体加以治疗，其中对实现施用该抗体的效果而言，免疫系统介导的活性的参与不是必需的或者是不利的，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。186.根据权利要求54-106任一项或权利要求184或权利要求185的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症能够通过阻断或抑制可溶抗原加以治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不利的免疫复合物，并且其中所述抗体与所述抗原特异性结合。187.4艮据权利要求54-106任一项或权利要求184或权利要求185的抗体在制备用于治疗疾病或病症的药物组合物中的用途，该疾病或病症能够通过阻断或抑制细胞膜结合受体加以治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述抗体与所述受体特异性结合。188.用于抑制罹患疾病或病症的受试者体内抗原的方法，在所述疾病或病症中所述抗原的活性是不利的，该方法包括向受试者施用根据权利要求54-106任一项的单价抗体，该抗体与所述抗原特异性结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体，从而使受试者体内该抗原的活性受到抑制。189.用于抑制疾病或病症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求54-106任一项的单价抗体、包含所述抗体的药物组合物、包含所述抗体的免疫偶联物、或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体，藉此治疗所述疾病或病症。190.根据权利要求189的方法，其中所述疾病或病症是癌症、细胞增殖病症、(自身)免疫病症、炎症和/或血管新生病症，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求54-106任一项的单价抗体，该抗体与所述抗原特异性结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体，且其中该抗体与给定的靶标或靶表位特异性结合，其中抗体与所述靶标或靶表位的结合对治疗所述疾病有效。191.根据权利要求189或权利要求190的方法，其中所述疾病或病症能够通过施用针对特定靶标的抗体加以治疗，其中免疫系统介导的活性的参与对于实现所述抗体施用的效果而言不是必需的或者是不利的，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求54-106任一项的单价抗体，其中所述抗体与所述受体特异性结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体。192.才艮据权利要求189-191任一项的方法，其中所述疾病或病症能够通过阻断或抑制可溶抗原加以治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不利的免疫复合物，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求54-106任一项的单价抗体，其中该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体。193.根据权利要求189-191任一项的方法，其中所述疾病或病症能够通过阻断或抑制细胞膜结合受体加以治疗，其中所述受体可通过所述受体的二聚体化而激活，并且其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求54-106任一项的单价抗体，该抗体与所述抗原特异结合；包含所述抗体的药物组合物；包含所述抗体的免疫偶联物；或者根据权利要求117-144任一项的核酸构建体。194.根据权利要求189-193任一项的方法，包括向受试者施用一种或多种其它治疗剂。195.药物组合物，其包括根据权利要求54-106任一项的单价抗体，以及一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。196.—种转基因动物，其含有根据权利要求117-144任一项的核酸构建体。197.根据权利要求54-106任一项的单价抗体作为诊断剂的用途。198.—种鉴定具有长半衰期的单价抗体或单价抗体片段的方法，其中测试该单价抗体或抗体片段受FcRn保护抗清除的作用。199.一种单价抗体或抗体片段，其受FcRn保护而抗清除。200.根据权利要求56-106任一项的单价抗体或其单价抗体片段，其受FcRn保护而抗清除。201.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天。202.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天，多达21天。203.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内施用时，其半衰期为至少5天，多达14天。204.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内具有至少14天的半衰期。205.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在体内具有至少21天的半衰期。206.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段在SCID小鼠中体内施用时，其半衰期为至少5天。207.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其中所述单价抗体或单价抗体片段能够结合FcRn。207.根据权利要求199或200的单价抗体或单价抗体片段，其血浆清除比F(ab，)2片段的血浆清除慢超过10倍。208.可通过权利要求1的方法获得的单价抗体，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl，其中CH3区经过修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位Arg(R)被Gln(Q)替换；239位Asp(D)被Glu(E)替换；292位Lys(K)被Arg(R)替换；302位Gln(Q)被Glu(E)替换；和328位Pro(P)被Leu(L)替换。209.根据权利要求208的单价抗体，其中238位Arg(R)被Gln(Q)替换。210.根据权利要求208的单价抗体，其中238位Arg(R)被Gln(Q)替换，且328位Pro(P)被Leu(L)替换。211.根据权利要求208的单价抗体，其中发生了全部5种替换。212.根据权利要求208的单价抗体，其中人Ig是IgGl，CL区是具有如SEQIDNO:18所示之氨基酸序列的k轻链CL，其中CL区经过修饰，使得106位的末端半胱氨酸残基被替换为另一种氨基酸残基或被删除。213.根据权利要求208的单价抗体，其中人Ig是IgGl,CL区是具有如SEQIDNO:17所示之氨基酸序列的X轻链CL，其中CL区经过修饰，使得104位的半胱氨酸残基被替换为另一种氨基酸残基或被删除。214.根据权利要求208的单价抗体，其中人Ig是具有如SEQIDNO:19所示之氨基酸CH区的IgGl，其中CH1区经过修饰，使得14位的Ser(S)被替换为半胱氨酸残基。215.根据权利要求208的单价抗体，其中人Ig是具有如SEQIDNO:20所示之氨基酸Qi区的IgG2，其中CH3区经过修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)被Gln(Q)替换；276位的Met(M)被Val(V)替换；288位的Lys(K)被Arg(R)替换；298位的Gln(Q)被Glu(E)替换；和324位的Pro(P)被Leu(L)替换。216.根据权利要求208的单价抗体，其中234位的Arg(R)被替换为Gln(Q)。217.根据权利要求208的单价抗体，其中234位的Arg(R)被替换为Gln(Q);且324位的Pro(P)被替换为Leu(L)。218.根据权利要求1-217任一项的单价抗体，其中该抗体不与肽合成抗原(Tyr，Glu)-Ala-Lys特异性结合。219.根据权利要求1-218任一项的单价抗体，其中所产生的单价抗体是人抗体。220.才艮据权利要求54-106和208-219任一项的单价抗体作为药物的用途。221.根据权利要求54-106和208-219任一项的单价抗体用于制备药物组合物的用途。222.根据权利要求221的用途，其中该药物组合物是制备用于治疗癌症的。223.根据权利要求221的用途，其中该药物组合物是制备用于治疗炎性症候的。224.—种药物组合物，其包含根据权利要求54-106和208-219任一项的单价抗体。225.根据权利要求224的药物组合物，其中该组合物包含一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。226.根据权利要求224和225的药物组合物，其中该组合物进一步包括一种或多种其它治疗剂。227.根据权利要求224-226任一项的药物组合物，其中该组合物是制备用于治疗疾病或病症的，所述疾病或病症能够通过阻断或抑制细胞膜结合受体加以治疗，其中所述抗体特异性结合所述受体。228.根据权利要求224-226任一项的药物组合物，其中该组合物是制备用于治疗疾病或病症的，该疾病或病症能够通过阻断或抑制可溶抗原加以治疗，其中所述抗原的多聚体化可形成不利的免疫复合物，并且其中所述抗体特异性结合所述抗原。全文摘要本发明提供了在体内施用时具有长半衰期的单价抗体，并提供了制造这些单价抗体的方法、包含这些抗体的药物组合物以及这些单价抗体的使用。文档编号A61K51/10GK101370526SQ200680051928公开日2009年2月18日申请日期2006年11月28日优先权日2005年11月28日发明者保罗·帕伦,威廉·K·布利克,帕特里克·范伯克尔,弗兰克·比尔斯肯斯,汤姆·文克,简·G·J·范德温克尔,贾尼尼·舒尔曼申请人:根马布股份公司