专利名称：家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、表达技术。
背景技术：
人B淋巴细胞刺激因子(hBAFF)是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。BAFF具有很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞，BAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表达，延长休眠B细胞的寿命。体内它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。BAFF-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失。BAFF刺激B细胞增殖、分化并分泌抗体，成熟的B细胞及其产生的抗体构成了机体抵御感染和抑制肿瘤滋生的关键组分。由于BAFF的免疫增强特异活性，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国FDA已正式批准重组人BAFF进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症(CVID)患者。
根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前只有人、鼠、鸡、鸭和鹅的BAFF cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别是AF116456、AF119383、AF506010、DQ445092及DQ874394。家猪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)cDNA还未被克隆出来，关于家猪BAFF基因的研究及应用在整个国内外还处于完全空白状态。家猪是国内外十分重要的肉源畜类，由于B淋巴细胞刺激因子(BAFF)具有很强的免疫增强能力，基因工程家猪BAFF蛋白有可能开发成一种能增强家猪免疫能力的生物制剂(如免疫佐剂等)，用于体质弱、免疫功能低下的病家猪，增加家猪的抗病毒能力，尤其是在由于家猪新型免疫抑制性疾病如家猪蓝耳病、伪狂犬，圆环病毒病(仔家猪断奶多系统消耗性综合症)，导致传统兽医疫苗免疫效力不足或失效，因而给畜牧业生产造成了极大损失的今天。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量家猪的细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市。细胞因子用于细菌病毒类疾病的治疗能够克服传统药物副作用大、疗效不佳的缺点，而且运用基因工程方法生产的细胞因子，可以大大降低生产成本，获得良好的市场信价比，因此，重组家猪BAFF(pBAFF)蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从家猪提取的B淋巴细胞刺激因子(BAFF)cDNA，并提供B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组表达及活性检测技术。
本发明从家猪中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
家猪B淋巴细胞刺激因子，它具有SEQ ID NO.2所示的序列。
本发明的家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根据已知物种的B淋巴细胞刺激因子cDNA保守序列设计引物正义寡核苷酸兼并引物z15’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C)反义寡核苷酸兼并引物z25’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C)(2)从家猪脾脏提取总RNA。
(3)通过RT-PCR方法，以上述引物z1及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。
(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，根据已获得的P1核苷酸序列设计正义引物GSP2(5’-GAACTGAGTCTGGTGACTTTGTTCCGA-3’)及反义引物GSP1(5’-CTCCTTCCTCCAGCTTTGCAATGCCAGC-3’)分别用以扩增出BAFF cDNA 3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。
(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL1(5’-GTAAACAAATGTATGAATCCACTGGGGA-3’)及FL2(5’-GGTATTTCCAGTTAAGTGTTTTCTCT-3’)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定及验证。
上述家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下(1)根据已知物种的B淋巴细胞刺激因子全长cDNA两段高保守区域设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物z1(5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C))与反义寡核苷酸兼并引物z2(5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C))，(2)应用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手册，提取出家猪脾脏细胞的总RNA，
(3)应用RT-PCR方法，以上述z1及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全长为408bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为48℃逆转录45min，94℃变性2min，再进行40个PCR循环(94℃变性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最后于68℃延伸7min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约408bp的DNA条带，置4℃保存。
(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit(Clontech公司)根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP2(5’-GAACTGAGTCTGGTGACTTTGTTCCGA-3’)及反义引物GSP1(5’-CTCCTTCC TCCAGCTTTGCAATGCCAGC-3’)分别用以扩增出BAFF cDNA3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(621bp)及P3(351bp)，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。
(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出全长序列，并设计首尾引物FL1(5’-GTAAACAAATGTATGAATCCACTGGGGA-3’)及FL2(5’-GGTATTTCCAGTTAAGTGTTTTCTCT-3’)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取8个阳性克隆进行碱基序列测定，以验证其真实性。
将所得序列与GenBank数据库序列进行BLAST程序相似性搜索，发现与已知的人、鼠、鸡、鸭和鹅BAFF序列相似率最高，分别是73，70，64，63和63％、，从而可以确定该序列是家猪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的全长cDNA，其开放阅读框如SEQ ID NO.1所示。
对该基因的进一步研究表明pBAFF基因是一个组成表达性基因；表达该基因功能区后的重组蛋白(soluble pBAFF)具有很强的生物学活性；该基因功能区编码的蛋白对家猪及人B淋巴细胞具有明显的促增殖效应；充分表明本发明克隆得到的基因就是家猪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的cDNA。
上述家猪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)cDNA的重组应用就是通过现有基因工程方法，生产重组pBAFF，作为家猪免疫增强剂。
所说的家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入家猪体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
图1是pig BAFF(pBAFF)全长cDNA的克隆过程示意图；其中P1代表同源克隆片段；P2代表3’-RACE产物；P3代表5’-RACE产物；全长cDNA共805bp。
图2是pig BAFF全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。
图3是pig BAFF与人、鼠、鸡及鸭BAFF全长氨基酸序列同源性比较图。其中*代表一致氨基酸；()及(.)分别代表保守和半保守的氨基酸，箭头所指代表弗林蛋白酶识别位点，切割后的C端为BAFF的胞外可溶性功能区(soluble pBAFF)。其中BAFF保守的跨膜区，胞外保守的半胱氨酸及beta-折叠区都在图中已指明。
图4是pig BAFF mRNA在各组织中的表达分析图。GAPDH mRNA的扩增作为内参。
图5是pig BAFF的可溶性功能区(soluble pBAFF)在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达，Ni+柱纯化后重组蛋白的SDS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，A图中条带1是未经IPTG诱导的全菌蛋白，2是经IPTG诱导5小时后的全菌蛋白，3是经Ni+柱纯化后目的蛋白；B图是鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，可见在目的蛋白位置出现了特异性条带。
图6是本发明克隆的pBAFF的可溶性功能区(soluble pBAFF)对家猪及人B淋巴细胞的共刺激促增殖作用(金黄色葡萄球菌Cowan 1(SAC)作为共刺激因子)结果示意图。图A是说明不同浓度的soluble pBAFF(psBAFF)相对于PBS对照组、全菌蛋白对照组及金黄色葡萄球菌Cowan 1(SAC)对照组在作用家猪B淋巴细胞72小时后，对家猪B淋巴细胞显著的促增殖作用，且呈剂量依赖效应；图B是说明不同浓度的psBAFF同样相对于各对照组在作用人B淋巴细胞72小时后的对人B淋巴细胞的共刺激促增殖作用。(说明SAC是B淋巴细胞特异丝裂原，在此作为soluble pBAFF的共刺激因子)具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1家猪(Sus scrofa)，人工饲养。
(1)引物设计应用ClustalX软件对已克隆出的人、鼠、鸡B淋巴细胞刺激因子全长cDNA序列进行同源性比对分析，精心选取出两段高保守区域用来设计同源克隆的正义寡核苷酸兼并引物z1(5’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’(N＝A、T、G、C))与反义寡核苷酸兼并引物z2(5’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’(N＝A、T、G、C))，(2)提取总RNA应用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)按照其操作手册提取出约0.5克家猪脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。
(3)应用RT-PCR方法，以上述z1及z2为特异性引物，扩增出pig BAFF(pBAFF)cDNA的一段序列，全长为408bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、Tf1 DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为48℃逆转录45min，94℃变性2min，再进行40个PCR循环(94℃变性30s，57℃退火1min，68℃延伸2min)，最后于68℃延伸7min。RT-PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约408bp的DNA条带，置4℃保存。
(4)应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit(Clontech公司)根据已获得的P1碱基序列设计正义引物GSP2及反义引物GSP1分别用以扩增出pBAFF cDNA3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2(621bp)及P3(351bp)，分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。操作完全按照试剂盒操作手册要求进行。
(5)如图1所示，根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出pig BAFF cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL1及FL2一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，得到如图2所示的pig BAFF全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。
(6)同源检索将所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列，在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析，如图3所示，发现与已知的鸡(GenBank登录号AF506010)、人(GenBank登录号AF116456)、鼠(GenBank登录号AF119383)、鸭(GenBank登录号DQ445092)及鹅(GenBank登录号DQ874394)BAFF氨基酸序列相似性最高(但不包括数据库中其他种属BAFF的预测氨基酸序列)，分别是73，70，64，63和63％，可以确定该序列是就家猪B淋巴细胞刺激因子(pBAFF)的全长cDNA。并且其开放阅读框具有SEQ ID NO.1序列，碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
Pig BAFF基因在各组织的表达分析采用实施例1中的提取RNA的方法，分别提取了家猪肝(liver)、外周血淋巴细胞(PBLs)、肾(kidney)、胸腺(thymus)、小肠(intestine)、脾(spleen)、心(heat)及脑(brain)的总RNA，运用RT-PCR法对pig BAFF基因在各组织的表达进行了研究，结果如图4所示，pig BAFF基因是一个组成表达性基因，它在各个组织中均有表达。试验中家猪GAPDH mRNA扩增作为内参，采用的引物为PG1(5’-GACTTCGAGCAGGAGATGG-3’)和PG2(5’-GCACGGTGTTGGTGTTGGCGTAGAGG-3’)。RT-PCR体系如实施例1。
pig soluble BAFF重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达以实施例1得到的pig BAFF全长cDNA为模板，设计引物ps1(5’-TCAGGACATATGGCCGCGCAGGATGCGGAGGAAAC-3’(Nde I))及ps2(5’-ACTGAGGGATCCTCACAGAAGTTTCAATGCACCA-3’(BamH I))扩增出pig BAFF cDNA胞外可溶区段(soluble pBAFF)，引物分别引入酶切位点Nde I及BamH I，亚克隆入pET28a载体，构建成重组载体pET28a-psBAFF。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经特异性条件(诱导温度24℃；IPTG诱导浓度0.1mM/L)诱导，胞浆内高可溶性表达出了目的蛋白soluble pBAFF，此融合蛋白经共刺激促增殖试验(图6)证实具有solublepBAFF的高活性生物学功能。
重组目的蛋白的的Ni+亲和纯化IPTG诱导含有重组载体pET28-psBAFF的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)5小时后，4℃收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，4℃，13,000×g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6体积Wash Buffer(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗去未结合上Ni+-NTA柱的杂蛋白，最后6体积EluteBuffer(1M 咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱目的蛋白，PBS透析除盐，以SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并以紫外分光光度计检测蛋白浓度，如图5(A，条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达93％的活性目的蛋白，其产量是103mg/L。
Western-blotting分析Western-blot中所用一抗为羊抗His6-tag，二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。其简要步骤是将诱导的产物先行SDS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与抗His6单抗孵育1h，与HRP标记的鼠抗羊IgG孵育1h，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图5(B)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。
Pig BAFF对家猪及人B淋巴细胞促增殖作用实验采用免疫磁珠法即抗CD19分子的抗体磁珠(Miltenyi Biotec公司)严格按照说明书无菌分离家猪脾及人外周血B淋巴细胞(经流式细胞术检测分离后的B淋巴细胞纯度为98％)，用RPMI1640调节细胞密度至1×105个/mL.将B细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl。向每孔内加入不同浓度的soluble pBAFF，37℃，5％CO2培养72h后每孔加入10μl5mg/mL MTT，37℃，5％CO2继续培养5h，加入100μl SDS-HCl溶解沉淀物，37℃过夜，测定各孔OD570值.实验设三复孔，取其平均值，并计算标准误差。在体外通过MTT细胞毒试验检测pig BAFF对家猪及人B淋巴细胞的促增殖作用，如图6所示，结果表明本发明克隆得到的soluble pBAFF对家猪及人B淋巴细胞均具有明显的促增殖效应，与鸡、人、鼠BAFF的体外生物学功能相同(参考已发表的文献)，且呈现剂量依赖效应，即当soluble pBAFF为2μg/ml(对家猪B细胞)/3μg/ml(对人B细胞)时soluble pBAFF的促增殖作用最强，同时也证实了BAFF在生物体内促B细胞增殖的生物学功能的保守性。
实施例3将实施例1获得的家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，生产重组soluble pig BAFF，作为家猪类免疫增强剂。
实施例4将实施例1获得的家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA通过现有基因工程方法，转入家猪体内，增加其免疫力，在饲养中应用。
按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰家猪B淋巴细胞刺激因子基因并用于所述研究和生产。
SEQUENCE LISTING<110>南京师范大学<120>家猪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用<160>2<210>1<211>702<212>cDNA<213>家猪(Sus scrofa)<400>1atgtatgaat ccactgggga gcagtcacgc ctttcttgcc ttagcacgag agaagaaatg 60aaaatgaagg agacggtccc catcctcccc cagaaggaaa gcccctctgt ccgcatctcc 120aaagatggga agctgctggt cgtgaccctg ctgctggccc tgctgtcctg tttcctcacg 180gggatctttg caccaccagc tccaagggag agcagctcca ttcaaagcaa caggagtaag 240cgcgccgcgc aggatgcgga ggaaacagtc actcaggact gcttgcaatt gattgcagac 300agtgacatgc ctactatacg aaaaggagct tatacatttg ttccatggct tctcagcttt 360aaaagaggaa gagccctagg agaaaaagaa aataaaaccg tggtcaaaga aacgggttac 420ttttttatat acggtcaggt tttatacacc gataacacct ttgccatggg gcatctcata 480cagaggaaga aagtccatgt ctttggggat gaactgagtc tggtgacttt gttccgatgt 540attcaaaata tgcctgaaac actacccaat aattcctgtt attcagctgg cattgcaaag 600ctggaggaag gagatgaact ccaactggca ataccacgtg aagacgctaa aatatcacgg 660gatggagacg gcacattttt tggtgcattg aaacttctgt ga 702<210>2<211>233<212>PRT<213>家猪(Sus scrofa)<400>2Met Tyr Glu Ser Thr Gly Glu Gln Ser Arg Leu Ser Cys Leu Ser1 5 10 15Thr Arg Glu Glu Met Lys Met Lys Glu Thr Val Pro Ile Leu Pro20 25 30Gln Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ile Ser Lys Asp Gly Lys Leu35 40 45Leu Val Val Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Phe Leu Thr50 55 60
Gly Ile Phe Ala Pro Pro Ala Pro Arg Glu Ser Ser Ser Ile Gln65 70 75Ser Asn Arg Ser Lys Arg Ala Ala Gln Asp Ala Glu Glu Thr Val80 85 90Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Asp Met Pro Thr95 100 105Ile Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe110 115 120Lys Arg Gly Arg Ala Leu Gly Glu Lys Glu Asn Lys Thr Val Val125 130 135Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr140 145 150Asp Asn Thr Phe Ala Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val155 160 165His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys170 175 180Ile Gln Ala Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser185 190 195Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala200 205 210Ile Pro Arg Glu Asp Ala Lys Ile Ser Arg Asp Gly Asp Gly Thr215 220 225Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu23023权利要求
1.猪B淋巴细胞刺激因子cDNA，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.一种权利要求1所述的猪B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根据已知物种的B淋巴细胞刺激因子cDNA保守序列设计引物正义寡核苷酸兼并引物z15’-CTGNNTGCANCTGATTGCNGACAG-3’，反义寡核苷酸兼并引物z25’-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3’；(2)从家猪脾脏提取总RNA；(3)通过RT-PCR方法，以上述引物z1及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定；(4)应用cDNA末端快速扩增方法，根据已获得的P1核苷酸序列设计正义引物GSP25’-GAACTGAGTCTGGTGACTTTGTTCCGA-3’及反义引物GSP15’-CTCCTTCCTCCAGCTTTGCAATGCCAGC-3’，分别用以扩增出BAFF cDNA 3’-及5’-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定；(5)根据P1、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序列，并设计首尾引物FL15’-GTAAACAAATGTATGAATCCACTGGGGA-3’及FL25’-GGTATTTCCAGTTAAGTGTTTTCTCT-3’，一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定及验证。
3.一种权利要求1所述的猪B淋巴细胞刺激因子cDNA的重组应用，是通过现有基因工程方法，生产重组猪B淋巴细胞刺激因子，作为猪类免疫增强剂。
4.猪B淋巴细胞刺激因子，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的序列。
全文摘要
猪B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。猪B淋巴细胞刺激因子的基因，具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。其克隆方法如下根据B淋巴细胞刺激因子的保守序列设计引物；从猪脾脏提取总RNA；通过RT－PCR方法，扩增出一段cDNA，命名为P1，克隆入pMD18－T载体，测序；应用cDNA末端快速扩增方法，根据P1的序列设计正义引物及反义引物分别用以扩增出上述cDNA 3’－及5’－全长末端区域，扩增片段分别命名为P2及P3，分别克隆入pMD18－T载体，并测序；将P1、P2、P3拼接出cDNA全长序列，并设计首尾引物一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18－T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述猪B淋巴细胞刺激因子的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组duck BAFF，作为猪类免疫增强剂。
文档编号A61K38/17GK101089179SQ20071002091
公开日2007年12月19日 申请日期2007年4月3日 优先权日2007年4月3日
发明者张双全, 管政兵 申请人:南京师范大学