专利名称：重楼醇提物作为抑制血管生成的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重楼醇提物，特别涉及重楼醇提物作为抑制血管生成的应用。
背景技术：
肿瘤的生长、转移依靠新生血管提供营养和转移通道。抑制肿瘤血管生成，与阻断肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关。
在本发明之前，恶性肿瘤的抗血管生成疗法，随着VEGF单克隆抗体获准FDA应用以来，给难治性、耐药性肿瘤患者带来了新的希望。但现有的血管生成抑制剂，例如Avastin，Endostatin，因其成本极高，价格昂贵，对于我国绝大多数肿瘤患者无法承受，使恶性肿瘤的抗血管生成疗法无法得到广泛和实际临床应用。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制、开发重楼醇提物在抑制血管生成的中的应用。
本发明的技术方案是重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其主要技术步骤为(1)将重楼根茎烘干、粉碎；(2)放入80％酒精中浸泡，加热至沸腾；(3)过滤得重楼醇提物；(4)将原代分离的人脐静脉内皮细胞在10％胎牛血清的EGM培养液中培养；(5)胰酶消化；(6)放入37℃、5％湿化CO2的培养箱中；(7)加入重楼醇提物；本发明的优点和效果在于巧妙地以血管生成作为靶点，应用对肿瘤细胞亚细胞毒浓度的重楼醇提物作用于内皮细胞，可明显抑制内皮细胞的增殖、迁移及小管形成，促进内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞DNA的合成。重楼醇提物满足抑制血管生成的条件，即差异细胞毒性，抗血管生成药物应该是其杀伤或抑制内皮细胞的药物剂量低于对肿瘤细胞的毒性剂量；干扰内皮细胞功能，抗血管生成药物应该是在尚未引起内皮细胞死亡的情况下能够干扰内皮细胞的功能；明确的作用机理，迄今血管生成的基本过程已较明确，采用本发明的产物制备出的制剂药物具有抗血管生成效应，在体内抑制血管生成，适合于抗肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病的治疗，包括可应用于肿瘤化疗和/或辅助化疗。而且价格低廉、适合于临床应用。本发明指出了重楼醇提物的新用途。
本发明的其他优点和效果将在下面继续描述。
图1——为不同浓度重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞和人肠癌LOVO细胞增殖的剂量依赖性抑制作用曲线。
图2——为不同浓度重楼醇提物处理后人脐静脉内皮细胞小管形成的光学显微镜照片(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)。
图3——为不同浓度重楼醇提物处理后人脐静脉内皮细胞迁移结果的光学显微镜照片(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)。
图4——为不同浓度重楼醇提物处理后人脐静脉内皮细胞凋亡的流式检测图(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)。
图5——为不同浓度重楼醇提物处理后人脐静脉内皮细胞周期的流式检测图(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)。
图6——为不同浓度重楼醇提物对鸡胚绒毛尿囊膜体内血管生长的光学显微镜照片(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)。
图7——为不同浓度重楼醇提物对荷瘤小鼠肿瘤抑瘤率的影响的光学显微镜照片。
图8——为不同浓度重楼醇提物对荷瘤小鼠肿瘤微血管密度的影响的免疫组化照片(A-对照组(200×)，B-重楼2g/kg(200×))。
图9——重楼醇提物对荷瘤小鼠肿瘤重量的抑制作用图。
图10——重楼醇提物与抑瘤率曲线图。
具体实施例方式
重楼是天然的延龄草科(Trilliaceae)植物，又名七枝莲、独角莲，分布于云南、广西等地。
1.1重楼醇提物的提取将重楼根茎在60℃烘箱烘6小时后，粉粹，称取100g。将药粉置烧瓶内后加入80％酒精800ml浸泡30分钟，加热至沸腾，维持2小时。药液过滤后4℃保存。取80％酒精800ml，加入药渣中重复以上提取操作2次。将三次滤出的药液混匀，药液倒入蒸发皿内挥发，令其挥干，计算得率，根据得率配制药物浓度。
1.2重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞和人肠癌LOVO细胞的体外增殖实验将原代分离的人脐静脉内皮细胞以10％胎牛血清的EGM培养液中培养。人肠癌LOVO细胞以10％新生牛血清的1640培养液中培养。取对数生长期细胞，用0.05％的胰酶消化后，以2×104cell/mL接种于96孔板，200μl/孔，每组设3个平行孔，放置于37℃、5％湿化CO2的培养箱中24小时后，加不同浓度的重楼醇提物。
将上述重楼醇提物制备成制剂药物。
检测结果分析如下在进行重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞时，同时进行人肠癌LOVO细胞的体外增殖实验，以加以对照。
设空白对照孔加完全培养液，实验对照孔仅加细胞，混匀后置于放置于37℃、5％湿化CO2的培养箱中继续培养48小时，结束前4小时加入MTT 20μl/孔，置于培养箱中孵育4小时后弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μl，微型混合器振荡5-10分钟，用酶联免疫检测仪于490/630nm波长处测定每孔吸光度OD值，按公式计算抑制率抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。结果如图1所示，表明重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制，和人肠癌LOVO细胞相比有差异的细胞毒性。
2.1重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞小管形成的抑制作用24孔培养板每孔加入BD MatrigelTMMatrix原胶300μl，置37℃一小时后聚合成胶，将HUVEC悬液以2×105cell/mL接种于铺有Mztrigel胶的24孔板中，500μl/孔，设定对照组、各浓度梯度的用药组，药物组加入500μl的含药培养液，对照组仅加入500μl的培养液。放置于37℃、5％湿化CO2的培养箱中24小时后，光学显微镜下观察内皮细胞小管的形成，每孔取5个随机视野，数码相机拍照，结果如图2所示(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)，表明重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞小管形成能力呈剂量依赖性抑制。
2.2重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用将8.0μm孔径的Transwell板内套管倒置，在其表面加10μg/ml的纤维粘连蛋白溶液(FN)100μl通风橱中风干，PBS漂洗表面，去除多余的结合蛋白。将已经血清饥饿过夜(0.5％胎牛血清)的人脐静脉内皮细胞消化后调整细胞密度为4×106/ml，向每个内室里面加50μl细胞悬浮液，设定对照组、各浓度梯度的用药组，药物组加入50μl的含药培养液，对照组仅加入50μl的培养液。下室中加入10％EGM0.6ml。放置于37℃、5％湿化CO2的培养箱中孵育12小时后，用棉签将微孔膜上表面的细胞除去，下表面用10％的甲醛溶液固定30分钟，PBS漂洗净后，结晶紫染色液(1％结晶紫2％乙醇100mM硼酸，Ph 9.0)中染色20min，PBS漂洗净后，将微孔膜剪下，底面朝上贴于载玻片上，光学显微镜下观察内皮细胞的迁移能力，每孔取5个随机视野，数码相机拍照，结果如图3所示(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)，表明重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞的迁移能力呈剂量依赖性抑制。
2.3双标记流式细胞仪检测重楼醇提物对人脐静脉内皮细胞凋亡率的影响将药物作用48小时后的人脐静脉内皮细胞用0.05％胰酶消化后，PBS洗涤1000r/min离心5min，去上清，Buffer缓冲液500μl重悬细胞，加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI(凋亡检测试剂盒)，振动后上机检测。结果如图4所示(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)，人脐静脉内皮细胞经重楼醇提物作用后细胞凋亡率呈剂量依赖性上升。
2.4流式细胞仪分析中药对人脐静脉内皮细胞周期的影响常规消化不同浓度作用的人脐静脉内皮细胞1×106个，用PBS洗涤2次，缓冲液洗涤细胞3次，1000r/min离心5min，弃上清，依次加入试剂盒中的溶液A，B，C，各孵育10分钟，其中溶液C需在冰上避光孵育。孵育结束后立即上流式细胞仪检测，应用CellQuest软件分析结果，记录细胞不同周期的比例。结果如图5所示(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)，重楼醇提物抑制人脐静脉内皮细胞DNA的合成，表现为G0-G1期细胞比率增多，而S期、G2-M期细胞比率减少。
2.5重楼醇提物对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长的抑制作用将鸡受精卵在正常孵育条件下孵化，第7天在聚光灯下找出气室和毛细血管稀疏区域(此处新生血管形成旺盛)并做出记号。75％乙醇消毒鸡卵，在超净台内于气室顶端钻出小孔，在标记区蛋壳上开窗(直径约1cm)，显露内膜，此时在气室端小孔负压吸引，使内膜与尿囊膜剥离，撕去内膜既可见上有血管生长的尿囊膜。在甲基纤维素薄片上滴加10μl含不同浓度受试药物的生理盐水溶液并以不含药物的生理盐水为对照，覆于暴露的尿囊膜上。用无菌透明胶布封闭窗孔以免污染。继续孵育72小时，每天追加相同剂量的药品。72小时后解剖鸡胚，将薄片周围3cm直径区域内的尿囊膜剪下，显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况。结果如图6所示(A-对照，B-重楼60μg/ml，C-重楼30μg/ml，D-重楼15μg/ml)，重楼醇提物对鸡胚尿囊膜血管形成具有显著的抑制作用。
2.6荷瘤鼠体内实验在严格无菌条件下，抽取接种6d的H22瘤种小鼠的腹水，以生理盐水稀释，计数并调细胞密度至2.5×1010/L。实验d1每鼠右侧腋下接种0.2mLH22细胞悬液，建立H22肝癌的荷瘤小鼠模型。接种第2天，将小鼠随机分为重楼4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg治疗组和对照组，每组5只，每天灌胃给药，连续10天后，脱椎处死小鼠，剥离皮下肿瘤，称重，取部分肿瘤组织做病理切片。肿瘤组织固定于10％多聚甲醛中，石蜡包埋，连续切片(2μm)，切片行免疫组织化学染色，检测肿瘤微血管密度(MVD)、增殖细胞核抗原(PCNA)水平。抑瘤率测定给药前及给药过程中每两天，游标卡尺测量瘤结节长径(a)、短径(b)，按公式V＝1/2ab2计算体积，绘制肿瘤体积生长曲线。剥离的皮下肿瘤称重，按下面公式计算瘤重抑制率，瘤重抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。结果如图7、9、10所示对照组小鼠瘤结节增长较快，而重楼组小鼠瘤结节增长缓慢且肿瘤重量明显低于对照组(P值为0.007)。微血管密度(MVD)的测定结果如图8所示(A-对照组(200×)，B-重楼2g/kg(200×))，重楼醇提物组的微血管计数与对照组比较，具有显著性差异(P值均＜0.01＝)。
权利要求
1.重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其步骤为(1)将重楼根茎烘干、粉碎；(2)放入80％酒精中浸泡，加热至沸腾；(3)过滤得重楼醇提物；(4)将原代分离的人脐静脉内皮细胞在10％胎牛血清的EGM培养液中培养；(5)胰酶消化；(6)放入37℃、5％湿化CO2的培养箱中；(7)加入重楼醇提物
2.根据权利要求1所述的重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其特征在于重楼醇提物的浓度为60μg/ml。
3.根据权利要求1所述的重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其特征在于可应用于抗肿瘤血管生成。
4.根据权利要求1所述的重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其特征在于可应用于肿瘤化疗和/或辅助化疗。
5.根据权利要求3所述的重楼醇提物作为抑制血管生成的应用，其特征在于可应用于由血管生成引发的疾病。
全文摘要
本发明涉及重楼醇提物作为抑制血管生成的应用。本发明将重楼根茎烘干、粉碎，放入80％酒精中浸泡、加热至沸腾，过滤得重楼醇提物，将原代分离的人脐静脉内皮细胞在10％胎牛血清的EGM培养液中培养，胰酶消化，放入37℃、5％湿化CO
文档编号A61P35/00GK101024031SQ20071002060
公开日2007年8月29日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者钱晓萍, 刘宝瑞, 胡静 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院