专利名称：一种云南重楼提取物及制备方法、药用用途和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，具体涉及云南重楼提取物的药用用途，制备方法及药物组合物
背景技术：
云南重楼Paris polyphylla var.yunnannensis(Paris yunnannensisFreanch)在植物分类学上属百合科重楼属植物。云南重楼主要有效成分是甾体皂苷类，也含有黄酮类、植物甾醇类成分。
近几年来对云南重楼的水及醇提取液进行了一些药理研究研究，发现云南重楼的提取物具有抗炎、止血、镇痛、抗癌等作用。
但到目前为止，尚未见到本发明所涉及的将云南重楼提取物制备成药物的文献报道，发明人经过大量的试验研究证实，云南重楼提取物具有止血、镇痛、抗癌等作用，并制成了药剂，完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种云南重楼提取物。
本发明的另一个目的是提供一种云南重楼提取物的提取方法。
本发明的再一个目的是提供以云南重楼提取物在制备预防和治疗止血、镇痛、抗肿瘤的应用。
本发明的又一个目的是提供以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合物。
本发明的云南重楼提取物为以下方法所获得的物质
以云南重楼为原料，用0％至100％醇提取1-10次，最好使用70％醇提取；最好提取3次，或水提取60％-95％醇沉淀的提取方法，回收醇也可以；或水提取碱沉淀的提取方法也可以，提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，最佳用70％醇洗脱，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉，用0％-95％醇溶解，最好用70％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的重楼提取物。经HPLCf法化学分析，所得重楼提取物的主要成分有
重楼提取物的皂苷含量大约为75％以上。
上述过程所获得的物质，除含75％以上重楼总皂苷外，其他成分还有蛋白质、肽、氨基酸、多糖，以及微量元素和挥发油。本领域技术人员可以理解到，这些杂质成分基本上不会给本发明药物组合物中重楼提取物的药理学活性带来不利影响。
本发明的云南重楼提取物的制备方法是1、以云南重楼为原料，用0％至100％醇提取，也可用水提取60％-95％醇沉淀的方法，再回收醇，或水提取碱沉淀的提取方法；2、提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化；3、用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉；4、用0％-95％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的重楼提取物。
本发明的云南重楼提取物的药物应用包括云南重楼提取物在制备治疗或预防各种出血症药物中的应用；云南重楼提取物在制备治疗癌症药物中的应用；云南重楼提取物在制备止痛药物中的应用本发明以云南重楼提取物为基本活性成分的药物是由云南重楼提取物与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相组成。
本发明组合药物原料用量的重量比例可以是含有1％-99％的云南重楼提取物和99％-1％的赋形剂。
本发明组合药物原料用量优选的重量比例是含有20％-80％的云南重楼提取物和80％-20％的赋形剂。
本发明的以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合。其中云南重楼提取物占所说的药物组合物的最佳重量比为50％(w/w)以上，并且所说的云南重楼提取物主要是由甾体皂苷组成的。
本发明的积极效果是提供了一种效果良好的治疗癌症、出血症及镇痛的药物活性物质以及用该活性物质为治疗成分制备的新药，为以上疾病的治疗拓宽途径。
这里应特别指出的是，可根据需要在本发明的药物组合物中加入一种或多种天然或合成的其他与云南重楼提取物具有协同或辅助作用的活性成分.这些可能被加入的天然或合成的辅助活性成分是本领域技术人员已知的和可以想到的。
本发明的以云南重楼提取物为基本活性物质的药物，可制成适用于临床上使用的不同剂型的药物组合物.例如可将所说的组合物配制成可供静脉内，肌肉内、腹腔内、皮下、脑脊髓腔内等注射给药的注射剂，或者制成适于口服给药的片剂、颗粒剂、滴丸、冲剂、液体制剂、粉末剂。丸剂、胶囊剂和悬浮剂，以及适于局部给药的喷雾剂、气雾剂、霜剂、软膏和栓剂。
为了制备适于胃肠道外途径药的溶液剂，例如可使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或赋形剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠或尼泊金甲酪作为防腐剂，使用二甲基亚砜作为吸收促进剂。
为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂，悬浮剂或胶囊剂，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素、滑石粉等作为载体或赋形剂。在这些适于口服给药的制剂中，还可含有其他适当的添加剂，例如增溶剂、崩解剂、润滑剂、吸收促进剂、分散剂、表面活性剂、矫味剂或着色剂等。
最好将本发明的药物组合物制成各种适于口服绐药的剂型，例如片剂、粉末剂、胶囊剂，或口服液或乳剂.这些口服制剂的单位剂量一般包含30-800mg云南重楼提取物。
本发明药物组合物的另一个优选给药途径是静脉内或肌肉内注射适于这些给药途径的注射液。例如对于某些子宫出血或癌症病人，可将本发明药物组合物的注射液制剂加在等渗葡萄糖溶液或等渗氯化钠溶液中，持续地滴注给药。
服用量口服300mg/日(以提取物纯量计)；注射100mg/日(以提取物纯量计)。
药理体内试验研究抗肿瘤试验例摘要重楼提取物以80、30mg/kg剂量灌胃给药，P388腹水型及S180实体肉瘤显示较明显的抗癌活性，对肝癌腹水型也有一定的抗癌作用。
药物重楼提取物，黄色粉末，经筛选用剂量80 30mg/kg，，用时以生理盐水溶解，吐温-80助溶。
动物昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄兼用，购自长春市绿园区科新实验动物养殖场。合格证号吉动质字10-1015。
瘤株P388腹水型、S180实体肉瘤、肝癌腹水型，均购自吉林省肿瘤研究所。
方法取接种7-10天的荷瘤动物，脱颈椎处死，在无菌条件下，消毒腹部皮肤，抽取乳白色瘤液，以生理盐水按1∶2比例稀释，然后给正常动物接种，每只0.2ml，腹水型接种于雌性动物腹腔，实体型接种于雄性动物腋窝皮下，接种后次日开始分组给药，观察对腹水型的生命延长率及对实体型的抑瘤率，结果用统计学t检验处理。见下表1。
表1重楼提取物对动物移植性肿瘤P388的影响
注*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001以下同略表2重楼提取物对动物移植性肿瘤S180的影响
表3重楼提取物对动物移植性肿瘤Hep-A-22的影响
由表中结果可知，重楼提取物对P388腹水型及S180肉瘤均显示出较强的抗癌作用，与对照组比较差异显著，其中80mg/kg剂量疗效较稳定，对Hep-A-22腹水型也显示有一定作用。
药理体外试验研究---MTT法测定重楼提取物对不同体外培养细胞株细胞增殖的影响实验目的MTT法通过颜色的深浅对比间接反映活的增殖细胞的数量，从而检测受试中药样品对不同细胞的增殖作用，用于细胞体外药物敏感性的检测。
1试剂和仪器Eagle’s MEM培养基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco，USA)；96孔培养板(Costar，USA)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，USA)；酶标光度计(CliniBio 128C，EC)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所，批号200004)；CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)，其余试剂均为国产AR。
2细胞株宫颈癌细胞系(HeLa)、人乳腺癌细胞系(Bcap-37)、人肺癌细胞系(A549)、人肝癌细胞系(HepG2)、人胃癌细胞系(SGC-7901)，人白血病细胞系(K562)，以上细胞系均购自武汉大学菌种保藏中心(CCTCC)。
3受试样品重楼提取物黄色粉沫，抗肿瘤1号为黄色颗粒。
4阳性对照药硫酸长春新碱(广州明兴制药厂，批号010701)；甲氨蝶呤(淅江万马药业有限公司，批号010301)；顺铂(山东省德州制药厂，批号010914)。盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司，批号0111E1)。
5细胞培养常规传代培养[1]。
6实验方法采用MTT法。取生长状态良好的上述细胞各一瓶，制成细胞悬液，以1×104/孔100μl接种在96孔培养板中，同时加入受试样品20μl，10倍稀释成不同浓度，对照组加入不含样品的培养液20μl，样品与细胞37℃，5％CO2，饱和湿度下，培养48h，加入MTT20μl(1mg/ml)，继续培养4h，弃液体，换成100％二甲基亚砜，自动酶标光度计测定λ1＝550nm，λ2＝620nm。测定结果实验结果表4.重楼提取物对HeLa细胞株增殖活性的影响
各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05.
表4结果表明，阳性对照药和抗肿瘤1号和重楼提取物对人宫颈癌细胞的增殖均有显著的抑制作用，其中阿霉素和抗肿瘤1号的作用较强。
表6、重楼提取物对SGC-7901细胞株增殖活性的影响
各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表6结果表明，除阿霉素和重楼提取物对人胃癌细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
表7、重楼提取物对K562细胞株增殖活性的影响
各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表7结果表明，长春新硷、阿霉素、抗肿瘤1号和重楼提取物对白血病细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
表8、重楼提取物对A549细胞株增殖活性的影响
各加药组分别与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05.
表8结果表明，除抗肿瘤1号和重楼提取物对肺癌细胞有显著抑制作用外，其他样品的抑制作用均不显著。
结论实验结果表明，重楼提取物剂量在50μg/ml时，对宫颈癌、胃癌细胞、白血病细胞和肺癌细胞的增殖有显著的抑制作用(P＜0.01)。
止血药效试验例1.材料和方法仪器BFS型血液纤维仪。
2.动物 昆明种小白鼠，体重1 9.0±SD0 31g；wistar大鼠，体重179.±SD3.1g；家兔255±SD0 31g。
3药品云南重楼提取物，为白色粉末，我们研究室提供。
3.方法和结果1)对正常小鼠的止血作用(1).时效关系小鼠分4组，1组为对照组，其余3组均灌服云南重楼提取物150mg/kg，分别给药后1、1.5和3小时，用断尾法测定小鼠出血量。实验结果表明云南重楼提取物150mg/kg甾给药后1小时既有显著的止血作用.作用高峰在给药后1.5小时，作用持续3小时以上。
(2).量效关系4组小鼠分别灌服云南重楼提取物50、100、150mg/kg、及等量生理食盐水，与给药后1.5小时，用断尾法测定小鼠出血量。计算止血效应.实验结果表明当剂量为100mg/kg，既有显著的止血作用，止血效应为69.35％，当剂量为150mg/kg时，止血效应为87.79％，量效关系系数为0.9642.
2).对正常大鼠的止血作用给大鼠灌服云南重楼提取物150mg/kg后1小时，按前法测定大鼠出血量，计算止血效应。结果表明对照组出血面积675±265(mm2)，给药组出血面积135±45(mm2)，止血效应为82.36％，P＜0.01，有显著差异。
结论实验结果表明，云南重楼提取物剂量在150mg/kg时，具有显著的止血作用，与对照组比较止血效应有显著差异。止血时间持续长。
镇痛效果试验例电刺激测痛试验取雌性小鼠，随机分组，每组10只，置小鼠于固定皿中，用电刺激其尾，以尾动作为指标，调节刺激电压，使小鼠痛阈在4-5秒左右。
表云南重楼提取物镇痛作用
试验结论云南重楼提取物具有良好的镇痛作用。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领城普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1(云南重楼提取物片剂)1、取重楼1kg加16kg的水，加热煮沸2次，每次1.0小时；2、收集并合并所得的水提液，浓缩至50℃相对密度为1.10波美；3、浓缩液中加入乙醇，使溶液中乙醇含量达到80％，滤过，滤液回收乙醇；4、将上述滤液调节PH值至10，放置，滤过；5、将滤液通过D101大孔吸附树脂柱，用10％乙醇洗脱树脂柱，分别洗脱至洗脱液无色后，弃去洗脱液，用80％浓度乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；6、80％乙醇洗脱液通过阳离子树脂柱及阴离子树脂柱，减压回收醇，浓缩成浸膏状或干粉；7、将干粉用70％乙醇溶液溶解，配制成5％提取物溶液，加1％的药用活性炭，加热回流1小时，趁热滤过，再精滤，滤液减压回收乙醇，浓缩并干燥至干粉，得含量达80％的高纯度云南重楼提取物。
8、将上述重楼提取物粉按重楼提取物1、药用淀粉0.5、糊精1的重量比，并加入适量50％乙醇制粒，整粒，干燥，压片。每片0.3g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下。
实施例2(云南重楼提取物颗粒剂)1、云南重楼1kg加适量18kg的水，加热煮沸3次，每次1.5小时；2、收集并合并所得的水提液，浓缩至80℃相对密度为1.15；3、浓缩液中加入乙醇，使溶液中乙醇含量达到70％，滤过，滤液回收乙醇；4、将上述滤液调节PH值至11，放置，滤过；5、将滤液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用30％乙醇洗脱树脂柱，分别洗脱至洗脱液无色后，弃去洗脱液，用65％浓度乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；
6、65％乙醇洗脱液通过阳离子树脂柱及阴离子树脂柱，减压回收醇，浓缩成浸膏状或干粉；7、将干粉用70％乙醇溶液溶解，配制成5％重楼提取物溶液，加1％的药用活性炭，加热回流1小时，趁热滤过，再精滤，滤液减压回收乙醇，浓缩并干燥至干粉，得含量达80％的高纯度重楼提取物。
8、将上述重楼提取物粉按8∶2的重量比加常用药物颗粒剂型赋行剂和适量的润滑剂，等按常规制粒工艺制成颗粒剂。
实施例3(云南重楼提取物胶囊剂)1、取重楼1kg加22kg的水，加热煮沸3次，每次1.5小时；2、收集并合并所得的水提液，浓缩至80℃相对密度为1.20；3、浓缩液中加入乙醇，使溶液中乙醇含量达到65％，滤过，滤液回收乙醇；4、将上述滤液调节PH值至12，放置，滤过；5、将滤液通过D21大孔吸附树脂柱，用20％乙醇洗脱树脂柱，分别洗脱至洗脱液无色后，弃去洗脱液，用70％浓度乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；6、70％乙醇洗脱液通过阳离子树脂柱及阴离子树脂柱，减压回收醇，浓缩成浸膏状或干粉；7、将干粉用70％乙醇溶液溶解，配制成5％重楼提取物溶液，加1％的药用活性炭，加热回流1小时，趁热滤过，再精滤，滤液减压回收乙醇，浓缩并干燥至干粉，得含量达80％的高纯度云南重楼提取物。
8、按重楼提取物1、药用淀粉0.5的重量比混合，用80％乙醇湿法制粒，整粒，装2#胶囊，每粒0.2g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下。
实施例4(云南重楼提取物液态口服剂)1、取重楼1kg加适量18kg的水，加热煮沸3次，每次1.5小时；2、收集并合并所得的水提液，浓缩至80℃相对密度为1.15；3、浓缩液中加入乙醇，使溶液中乙醇含量达到70％，滤过，滤液回收乙醇；4、将上述滤液调节PH值至11，放置，滤过；5、将滤液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用30％乙醇洗脱树脂柱，分别洗脱至洗脱液无色后，弃去洗脱液，用65％浓度乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；6、65％乙醇洗脱液通过阳离子树脂柱及阴离子树脂柱，减压回收醇，浓缩成浸膏状或干粉；7、将干粉用70％乙醇溶液溶解，配制成5％重楼提取物溶液，加1％的药用活性炭，加热回流1小时，趁热滤过，再精滤，滤液减压回收乙醇，浓缩并干燥至干粉，得含量达80％的云南重楼提取物。
8、将上提取物按1∶1的重量比加水溶解，分装，灭菌，制成口服剂。
实施例5(云南重楼提取物滴丸剂)1、取重楼1kg加22kg的水，加热煮沸3次，每次1.5小时；2、收集并合并所得的水提液，浓缩至80℃相对密度为1.20；3、浓缩液中加入乙醇，使溶液中乙醇含量达到65％，滤过，滤液回收乙醇；4、将上述滤液调节PH值至12，放置，滤过；
5、将滤液通过D21大孔吸附树脂柱，用20％乙醇洗脱树脂柱，分别洗脱至洗脱液无色后，弃去洗脱液，用70％浓度乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液；6、70％乙醇洗脱液通过阳离子树脂柱及阴离子树脂柱，减压回收醇，浓缩成浸膏状或干粉；7、将干粉用70％乙醇溶液溶解，配制成5％重楼提取物溶液，加1％的药用活性炭，加热回流1小时，趁热滤过，再精滤，滤液减压回收乙醇，浓缩并干燥至干粉。
8、将上述干粉按4∶6的重量比加聚乙二醇，按通常的药物滴丸制剂工艺制成滴丸剂。
实施例6(云南重楼提取物注射剂1)取云南重楼2kg加水煮沸三次，(每次40分钟)，首次加水20kg，以后每次加水15kg；收集并合并所得的水提液，过滤，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用70％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，将所得浓缩物用70％乙醇溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状重楼提取物100g。取重楼提取物100g，用75％乙醇溶解制成5％的重楼提取物溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水制成每ml含20mg重楼提取物的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，高压灭菌，无菌分装于西林瓶中，每瓶5ml，置冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。
权利要求
1.云南重楼提取物，为以下方法所获得的物质以云南重楼为原料，用0％至100％醇提取1-10次，最好使用70％醇提取；最好提取3次，或水提取60％-95％醇沉淀的提取方法，回收醇也可以；或水提取碱沉淀的提取方法也可以，提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化，用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，最佳用70％醇洗脱，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉，用0％-95％醇溶解，最好用70％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的重楼提取物。
2.根据权利要求1的云南重楼提取物，其特征是其中的活性成分包括，重楼皂苷A、重楼皂苷B、薯蓣皂苷、偏诺皂苷B、偏诺皂苷E、云南重楼皂苷A、云南重楼皂苷B七种单体成分。
3.云南重楼提取物的制备方法，其特征有以下步骤(1)、以云南重楼为原料，用0％至100％醇提取，也可用水提取60％-95％醇沉淀的方法，再回收醇，或水提取碱沉淀的提取方法；(2)、提取液合并，过滤，滤液经过大孔吸附树脂柱纯化；(3)、用0％-20％醇洗脱至无色后，用10％-100％醇洗脱后收集洗脱液，回收醇，至无醇味，减压下或常压下浓缩成漫膏状或干粉；(4)、用0％-95％醇溶解，滤过，除去沉淀物并回收滤液，减压回收醇后得到所需的重楼提取物。
4.云南重楼提取物在制备治疗或预防各种出血症药物中的应用。
5.云南重楼提取物在制备治疗癌症药物中的应用。
6.云南重楼提取物在制备止痛药物中的应用。
7.以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合物，由有效治疗量的云南重楼提取物与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相组成。
8.根据权利要求7的以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合物，其特征是原料用量的重量比为云南重楼提取物1％-99％；药用载体和/或赋形剂99％-1％。
9.根据权利要求7的以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合物，其特征是原料用量的重量比为云南重楼提取物20％-80％；药用载体和/或赋形剂80％-20％。
10.根据权利要求7的以云南重楼提取物为基本活性成分的药物组合物，其特征是其中云南重楼提取物占所说的药物组合物的最佳重量比为50％(w/w)以上。
全文摘要
本发明的云南重楼提取物是以云南重楼为原料，经水或醇提取，大孔吸附树脂柱纯化，醇洗，浓缩，醇溶解，滤过，所得的提取物。该提取物可与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂组合，制备成治疗或预防各种出血症，癌症及止痛的药物，得到一种效果良好的治疗以上疾病的药物。
文档编号A61P25/00GK1810284SQ20051001655
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者徐东铭, 徐雅娟 申请人:徐东铭