专利名称：糖基化葛根素衍生物及其组合物在制备防治心脑血管病应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及一种新的葛根素衍生物及其药物组合物在制备治疗用于心脑血管病；防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的应用。
背景技术：
葛根素(Puerarin)是从葛根(Radix Puerariae)中提取得到的有效成分，为常用天然药物，收载于国家药品标准中，主要用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、视网膜动静脉栓塞、突发性耳聋等。葛根素制剂有注射液、冻干粉针剂、滴眼剂。实际使用主要是以注射给药应用于临床，随着临床使用时间的延长，一些不良反应显露出来，这主要因为存在如下缺点1)体内消除速率快，临床使用剂量较大，口服生物利用度小；2)因为葛根素水溶解度低，制剂大多含助溶剂以增加制剂的稳定，同时不溶性杂质也增加，对人体产生一定的不良反应，致使用药安全性降低。因为本发明的产物与葛根素比具有溶解度好、药理活性较高、体内半衰期延长，弥补了葛根素产品缺陷，使用药的安全性提高，疗效增加，是一发展前景看好的新药产品。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的葛根素的衍生物及其药学上可接受的盐，不仅使其水溶性增加，而且克服体内消除速率快，及制剂稳定性不好的缺点。
本发明的另一目的是提供一种制备上述一类新的葛根素的衍生物及其药学上可接受的盐的方法，葛根素的衍生物及其药学上可接受的盐水溶性好，可与药学上可接受的载体形成药物组合物。
本发明的第三个目的是提供上述物质在制备治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病；用于防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的药物组合物应用，采用这种物质制备口服制剂片剂与胶囊，其体外溶出度增加，提示生物利用度提高，更值得一提的是可做成稳定的以水为载体的制剂。
为完成上述三个发明任务，本申请的技术方案分别如下 本发明的目的是提供一类新的葛根素的衍生物，其特征如结构式(I)所示
式(I) 式(I)中，R为单糖基或寡糖基，其特征是单糖基为环状6碳糖或5碳糖基，6碳糖基如葡萄糖基，甘露糖基，葡萄糖醛酸基，半乳糖基，半乳糖醛酸基，阿洛糖基，果糖基，山梨糖基，金缕梅糖基，链霉糖基，2-氨基葡萄糖基，2-氨基半乳糖基，或5碳糖基，如阿拉伯糖基，来苏糖基，木糖基，核糖基，夫糖基，鼠李糖基，鸡纳糖基，芹糖基，优选葡萄糖基；其寡糖基为2-5个6碳糖或/和5碳糖脱水缩合而成寡糖基，如海藻糖基，槐糖基，新陈皮糖基，芸香糖基，刺槐二糖基，麦芽糖基，蔗糖基，乳糖基，龙胆3糖基，果胶基，优选麦芽糖基。根据式(I)化合物当R优选葡萄糖基时，生物转化的化合物为葛根素-7-O-葡萄糖苷，即葡萄糖基上的半缩醛羟基与葛根素A环上7位碳上的羟基形成糖苷；当R优选麦芽糖基时，生物转化的化合物是葛根素-7-O-异麦芽糖苷，即基团异麦芽糖基末端的第2个葡萄糖基上的半缩醛羟基与葛根素A环上7-O-葡萄糖苷上的6位羟基之间形成糖苷键。
本发明的方案是微生物转化法制备葛根素的糖基化衍生物，即选择葛根素为被转化的母核，采用具有葛根素糖基化酶活力的菌体细胞、或该菌体细胞的酶提取液、或该酶的重组表达蛋白；糖基化的供体选择单糖基或寡糖基；转化位点为葛根素A环上C-7位羟基上，经合适的微生物转化方法，转化得目标化合物，本发明优选的目标化合物是葛根素-7-O-葡萄糖苷和葛根素-7-O-异麦芽糖苷。
本发明选用具有葛根素糖基化酶活力的微生物菌种，是任何其它可以糖基化葛根素的微生物或混合微生物，优选微生物是Microbacterium oxydans CGMCC 1788，也可以是Microbacterium saperdae CGMCC 1.1906等所有微杆菌属菌种。
本发明对转化合成液的分离纯化的制备方法是a)转化合成液中的菌体或菌体酶蛋白经加热沉淀、离心去除；b)用固相萃取、或液相萃取、或柱色谱分离；c)通过重结晶分别纯化。
本方案在转化的众多的转化产物中，优选含葛根素-7-O-葡萄糖苷和葛根素-7-O-异麦芽糖苷组分方法的转化合成液，用下列方法进行分离，纯化 1)用固相萃取转化合成液，其固相载体可以是为聚酰氨树脂或大孔树脂，用水和/或醇溶剂洗脱萃取的树脂，洗脱液浓缩干燥即得； 2)用柱色谱分离转化合成液，可采用硅胶，或烷基键合硅胶或大孔树脂或聚酰氨树脂为固定相，进行色谱分离，目标馏分浓缩干燥即得； 3)用液相萃取法，其特征是所用溶剂系统是水-有机溶剂，有机溶剂是正丁醇、或乙酸乙酯、或氯仿、或乙醚、或己烷，石油醚等，或上述两种或两种以上有机溶剂的混合物，萃取，分离萃取液，浓缩干燥即得。
4)方案中目标化合物的纯化方法是溶剂可以采用水和/或醇溶剂，或醇和/或脂溶性溶剂，其脂溶性溶剂特征是乙酸乙酯、或氯仿、或乙醚、或环氧乙烷，或己烷、或石油醚。
本方案的目标化物可进一步在式(I)的基础上，利用4’位羟基或单糖基(如葡萄糖醛酸)或寡糖基(其中含有的葡萄糖醛酸片段)上的酸性官能团制备其药学上可接受的盐为金属离子盐或含氮有机碱的盐，其中，(1)金属离子为碱金属或碱土金属，优选钠、钾、钙、镁；(2)含氮的有机碱，为碱性氨基酸，优选精氨酸、赖氨酸、肉毒碱；或C1-C40含氮有机碱，如葡甲胺、氨基葡萄糖，川芎嗪，优选葡甲胺。
方案中药学上可接受的盐的制备方法是 (1)将结构式(I)化合物与含氮有机碱以1∶0.5～2.0的摩尔比，在水和/或醇溶剂中反应，或将结构式(I)化合物与含金属离子以1∶0.5～2.0的当量比，在水和/或醇溶剂中反应。
(2)其中含氮有机碱优选碱性氨基酸或C1-C40有机碱，或金属离子优选碱土金属离子，其中与碱性氨基酸或与C1-C40有机碱反应的摩尔比为1∶0.8-1.5，或其中与碱土金属离子反应的当量比是1∶0.8-1.5。
(3)其中含氮有机碱优选碱性氨基酸或C1-C40有机碱，或金属离子优选碱金属离子K+，Na+或碱土金属离子Ca++，Mg++，其中与碱性氨基酸或与C1-C40有机碱反应的摩尔比为1∶0.8-1.5，或其中与K+，Na+，Ca++，Mg++，反应的当量比是1∶0.8-1.5。
上述葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐加入药用辅料，制备成药物制剂。
更进一步方案之一是，本发明人用含葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐实验结果表明形成的目标化合物，使原来微溶于水的含葛根素变成了可溶于水的葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，提高了口服制剂体外溶出度(提示口服制剂的体内生物利用度提高)；葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐水溶性增加，可做成以水为载体的注射剂，本发明中葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐的药物制剂稳定性优于葛根素。因此，可制备葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐在治疗心脑血管疾病的药学应用 本发明的药用组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使通式(I)为活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
糖基化葛根素衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗用于心脑血管病；防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的应用。
具体应用方式，可以将所述的葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐作为药物有效成分的原料，然后与药学上可接受的药用辅料组合，制成用于治疗心脑血管病；防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的药物组合物，该组合物含有治疗有效剂量的上述任一葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
上述任一葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，加入药用辅料，制备成药物制剂。在制备治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、视网膜动静脉栓塞、突发性耳聋；用于防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老、抑制细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的药物应用。所述的药物组合物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明的药用组合物优选含有摩尔比为0.1％～99.5％的通式(I)的葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，其中葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐含量为1.0％～95％。本发明的药用组合物除含有治疗有效量的上述通式(I)葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，还应含有一种或多种药学上可接受的载体。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；卵磷脂；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明的药用组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、口服液、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，其剂型是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、喷雾剂、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、滴丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，它是葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐与填充剂、崩解剂组配的片剂或胶囊剂；或者是葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐与填充剂、羟丙甲纤维素K4M组配的缓释片剂或胶囊剂；或者是葛根素的糖基化衍生物分散于油相中得到葛根素的糖基化衍生物物软胶囊。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，其特征在于，所述的填充剂是蔗糖，乳糖、微晶纤维素、糊精、淀粉或磷酸钙、卵磷脂；所述的崩解剂是羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或交联羧甲基纤维素钠； 本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，所述制剂中还含有粘合剂、润湿剂或润滑剂。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特征在于，它是葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐与增溶剂或溶剂形成的注射剂；或者是葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐形成的冻干注射用粉针剂；或者是葛根素的糖基化衍生物分散于油相中得到的注射用乳剂，或者是混悬型注射液，所述的混悬型注射液是将葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐微粉和聚山梨酯80混研后，溶解到含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尼泊金酯和羧甲基纤维素钠的水溶液，经研磨制得。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，所述的油相是大豆油、聚乙二醇400、棉籽油、花生油、麻油、玉米油或橄榄油；在所述的油相中还可加增溶剂或潜溶剂或抗氧剂。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的药物组合物制剂，其特点是，所述的增溶剂是聚氧乙烯蓖麻油，聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、吐温、聚乙二醇、普流罗尼F-68；所述的助溶剂是精氨酸、赖氨酸、葡甲胺或氨基葡萄糖、二乙胺、乙二胺、尿素、肉毒碱、川芎嗪、烟酰胺、脯氨酸、葡萄糖、枸橼酸及其钠盐。
本发明药用组合物制剂的各种剂型的制备方法之一是，用葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐为活性成分与以上所述的一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
本发明的药用组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐的活性成分。
本发明方案中式(I)葛根素的糖基化衍生物是一类新型的葛根素-7-O-糖苷的天然产物，优选的葛根素-7-O-葡萄糖苷及葛根素-7-O-异麦芽糖苷，与葛根素类似，具有降血压、扩张冠脉及脑血管，改善脑部微循环、保缺血心肌和心肌缺血再灌注损伤、抗血栓、分解血浆纤维蛋白原、降低血液粘度、防止动脉粥样硬化、降低血脂、维持血糖正常、抗氧化、抗衰老、防治骨吸收及促进骨骼生长、抑制细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用，用于临床治疗。但所列未能尽述。
本发明的新型葛根素衍生物-葛根素-7-O-葡萄糖苷及葛根素-7-O-异麦芽糖苷，改善了现有葛根素的理化性质、药代动力学和药理活性。葛根素-7-O葡萄糖苷(Puerarin-7-O-Glucoside)具有较高水溶性，葛根素-7-O-葡萄糖苷的水溶性较母体化合物葛根素提高了18.5倍，葛根素-7-O-异麦芽糖苷的水溶性较母体化合物葛根素提高了100倍，可以直接制备注射水针剂，大大减少了助溶剂用量，规避了用药不安全的风险；葛根素-7-O-葡萄糖苷在血液中的滞留时间与葛根素相比得到延长，T1/2是葛根素的2.85倍，减少了用药剂量；实验结果表明血管舒张活性显著增加，为安全性更高的葛根素药物的替代品。
具体实施例方式 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，为详细描述的各种过程和方法是本领域中公共的常规方法。所用试剂的来源，商品名以及有必要列出其组分者，均在首次出现时表明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次表明的内容相同。
实施例1. 将150mL LB培养基放入500mL三角瓶中，共1L培养基。121℃高压蒸汽灭菌后，接入Microbacterium oxydans CGMCC1788种子液，30℃，220rpm振荡培养12小时后，停止发酵，离心分离收集菌体细胞，放入500mL三角瓶中，加入150mL含0.02％葛根素-2％麦芽糖的1/15mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，30℃，200rpm振荡通气进行葛根素糖基化静息细胞转化反应，48h后，停止转化反应，离心去除菌体，上清液用C18制备型高效液相色谱分离，分别获得葛根素-7-O-葡萄糖苷和葛根素-7-O-异麦芽糖苷组分，减压薄膜浓缩到适当体积后，置于4℃至结晶析出，收集晶体，洗涤干燥后为产品，葛根素-7-O-葡萄糖苷晶体和葛根素-7-O-异麦芽糖苷晶体经HPLC检测其含量均大于99％，请见附图。
上述葛根素-7-O-葡萄糖苷纯品在DMSO的1H-NMR和13C-NMR的化学位移的特征如下 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6) δ3.28-4.05(m，glucosyl-H)，4.79(1H，d，J＝3.5Hz，glucosyl H-1″′)，4.80(1H，d，J＝9.9Hz，glucosyl H-1″)，6.80(2H，d，J＝8.6Hz，H-3′/H-5′)，6.97(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.39(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′/H-6′)，7.92(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，8.29(1H，s，H-2)； 13C-NMR(100MHz，DMSO-d6) δ61.1(glc-6″，glc-6′″)，70.3(glu-4″′)，70.5(glc-4″)，71.2(glc-2″)，72.6(glc-2′″)，73.0(glc-5′″)，73.8(glc-1″)，74.0(glc-3″′)，79.2(glc-3″)，80.5(glc-5″)，99.0(glc-1″′)，113.1(C-8)，115.4(C-6/C-10，C-3′/C-5′)，123.0(C-1′)，123.6(C-3)，126.6(C-5)，153.0(C-2)，157.6(C-9，C-4′)，161.4(C-7)，175.4(C-4)。
TOF-MS质谱分析结果m/z601.2[M+Na]+，元素组成为C27H31O14Na。
葛根素-7-O-葡萄糖苷在纯水中25℃溶解度0.22±0.003M；DSC热分析熔点为179.80℃左右。
上述葛根素-7-O-异麦芽糖苷纯品在DMSO的1H-NMR和13C-NMR的化学位移的特征如下 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.28-4.05(m，glucosyl-H)，4.62(1H，br.S，glucosyl H-1″″)，4.76(1H，d，J＝3.2Hz，glucosyl H-1″′)，4.79(1H，d，J＝7.3Hz，glucosyl H-1″)，6.80(2H，d，J＝8.4Hz，H-3′/H-5′)，6.98(1H，d，J＝8.8Hz，H-6)，7.39(2H，d，J＝8.6Hz，H-2′/H-6′)，7.93(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，8.31(1H，s，H-2)； 13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ61.3(glc-6″″，glc-6″)，66.5(glc-6″′)，70.4(glc-4″)，70.6(glc-4′″，glc-4″″)，71.0(glc-2″″)，71.3(glc-2″)，72.4(glc-2″′)，72.5(glc-5″′)，72.9(glc-5″″)，73.6(glc-3″″)，73.9(glc-1″)，74.1(glc-3′″)，79.2(glc-3″)，80.3(glc-5″)，98.7(glc-1′″)，98.9(glc-3″″)，113.6(C-8)，115.4(C-6/C-10，C-3′/C-5′)，123.0(C-1′)，123.6(C-3)，126.7(C-5)，153.0(C-2)，157.6(C-9，C-4′)，161.4(C-7)，175.4(C-4)。
TOF-MS质谱分析结果m/z763.2[M+Na]+，元素组成为C33H40O19Na。
葛根素-7-O-异麦芽糖苷在纯水中25℃溶解度为1.27±0.068M；DSC热分析熔点为188.93℃左右。
实施例2. 将Microbacterium oxydans CGMCC1788菌种接入含300mL灭菌的LB培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm振荡培养24小时后，接入含3LLB培养基的发酵罐中，30℃，3L/min通气量，培养18小时，离心收集菌体，用200mL水重悬菌体，采用Franch Press仪器1800psi高压破碎菌体细胞提取糖基转移酶，离心收集酶提取液160mL，取两份40ml酶提取液分别加入到2个3L含4％蔗糖-0.2％葛根素的1/15mol/L PBS缓冲液(PH8.0)中，30℃，400rpm.搅拌条件下转化72小时后停止反应。100℃加热5分钟使蛋白质沉淀，10000rpm离心15分钟去除沉淀。上清液用35cm×2.5cm大孔树脂层析拄吸附，经蒸馏水淋洗柱后，用60％乙醇洗脱，浓缩，用色谱法分离，固定相为硅胶，流动相氯仿-甲醇(逐步增加甲醇浓度)分别获得葛根素-7-O-葡萄糖苷和葛根素-7-O-异麦芽糖苷组分，减压薄膜浓缩到适当体积后，置于4℃至结晶析出，收集晶体，甲醇重结晶，得葛根素-7-O-葡萄糖苷晶体和和葛根素-7-O-异麦芽糖苷晶体经HPLC检测其含量均大于95.0％。
实施例3. 将150mL LB培养基放入500mL三角瓶中，共1L培养基。121℃高压蒸汽灭菌后，接入Microbacterium oxydans CGMCC1788种子液，30℃，220rpm振荡培养12小时后，停止发酵，离心分离收集菌体细胞，放入500mL三角瓶中，加入150mL含0.02％葛根素-4％麦芽糖的1/15mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，30℃，200rpm振荡通气进行葛根素糖基化静息细胞转化反应，72h后，停止转化反应，离心去除菌体，加热浓缩10倍，加入95％乙醇调浓度到20％，离心或过滤去除菌体，上清液通过大孔树脂柱，用水洗脱杂质后，在用60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压薄膜浓缩到适当体积后，色谱柱分离得葛根素-7-O-异麦芽糖苷粗品，用60-90％乙醇精重结晶，收集晶体，洗涤干燥后为产品，葛根素-7-O-异麦芽糖苷，经HPLC检测其含量均大于95％，请见附图。
实施例4. 将Microbacterium oxydans CGMCC1788菌种接入含300mL灭菌的LB培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm振荡培养24小时后，接入含3L LB培养基的发酵罐中，30℃，3L/min通气量，培养18小时，离心收集菌体，用200mL水重悬菌体，采用Franch Press仪器1800psi高压破碎菌体细胞提取糖基转移酶，离心收集酶提取液160mL，取两份40ml酶提取液分别加入到2个3L含2％蔗糖-0.4％葛根素的1/15mol/L PBS缓冲液(PH8.0)中，30℃，400rpm.搅拌条件下转化32小时后停止反应。100℃加热5分钟使蛋白质沉淀，10000rpm离心15分钟去除沉淀。上清液用聚酰氨树脂柱吸附，经水淋洗柱后，用20％-60％乙醇洗脱，减压薄膜浓缩到适当体积后，用色谱柱分离，得葛根素-7-O-葡萄糖苷粗品，用95％乙醇重结晶，得葛根素-7-O-葡萄糖苷，经HPLC检测其含量大于95％，请见附图。
实施例5 葛根素-7-O-葡萄糖苷钠盐的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取10％碳酸钠溶液，加入葛根素-7-O-葡萄糖苷的溶液中，调pH至9-11，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体2.8g。
实施例6 葛根素-7-O-异麦芽糖苷钙盐的制备 取葛根素-7-O-异麦芽糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取饱和石灰水，加入葛根素-7-O-异麦芽糖苷的溶液中，调pH至9-11，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体3.0g。
实施例7 葛根素-7-O-葡萄糖苷精氨酸盐的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取L-精氨酸2.5g溶于水加入葛根素-7-O-葡萄糖苷的溶液中，加热，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体3.1g。
实施例8 葛根素-7-O-异麦芽糖苷赖氨酸盐的制备 取葛根素-7-O-异麦芽糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取赖氨酸2.3g溶于水加入葛根素-7-O-异麦芽糖苷的溶液中，加热，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体2.9g。
实施例9 葛根素-7-O-异麦芽糖苷葡甲胺盐的制备 取葛根素-7-O-异麦芽糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取葡甲胺3g溶于水加入葛根素-7-O-异麦芽糖苷的溶液中，加热，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体3.1g。
实施例8 葛根素-7-O-葡萄糖苷葡甲胺盐的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取葡甲胺3g溶于水加入葛根素-7-O-葡萄糖苷的溶液中，加热，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体3.1g。
实施例9 葛根素-7-O-葡萄糖苷川芎嗪盐的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷2g置适宜容器中，加乙醇溶解，取川芎嗪2.3g溶于水加入葛根素-7-O-葡萄糖苷的溶液中，加热，搅拌使溶解，减压条件下抽去溶剂，得到固体2.6g。
实施例10 葛根素-7-O-葡萄糖苷氨基葡萄糖盐的制备 取氨基葡萄糖6.3g，溶于250ml蒸馏水，搅拌下加入葛根素-7-O-葡萄糖苷2.5g，加热回流2h。稍冷却，加入700ml无水乙醇，离心分离，弃去沉淀。上清液减压蒸去部分溶剂，至剩余体积约100ml。加入无水乙醇70ml，冷却，析出固体。过滤，滤饼以含水乙醇重结晶，40度真空干燥，得葛根素-7-O-葡萄糖苷氨基葡萄糖。
实施例1-10所制备的各物质均分别作为治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑梗塞及视网膜动、静脉栓塞等症的药物。
实施例11 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷胶囊剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷 20g 或葛根素-7-O-异麦芽糖苷 微晶纤维素 60g 乳糖100g 羧甲基淀粉钠14g 2％HPMCE5溶液 适量 6％吐温80 适量 硬脂酸镁2g 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，以含吐温80的HPMG溶液为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，湿颗粒于50-60。C烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，灌装于胶囊(普通胶囊或或肠溶胶囊)中。
实施例12 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷的盐胶囊剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖 20g 苷的盐(按葛根素-7-O-葡萄糖苷计算投料，下 同) 微晶纤维素 30g 乳糖 30g 羧甲基淀粉钠 5g 2％HPMCE5溶液适量 6％吐温80适量 硬脂酸镁 1g 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷的盐、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，以含吐温80的HPMC溶液为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，湿颗粒于50-60。C烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，灌装于胶囊(普通胶囊或或肠溶胶囊)中。
实施例13 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷片剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或 20g 葛根素-7-O-异麦芽糖苷 微晶纤维素 30g 乳糖40g 羧甲基淀粉钠7g 2％HPMCE5溶液 适量 含5％吐温80 适量 硬脂酸镁1g 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，以含吐温80的HPMC溶液为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，湿颗粒于50-60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，压片。
实施例14 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐片剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽 20g 糖苷盐(按葛根素-7-O-葡萄糖苷计算投料， 下同) 微晶纤维素 30g 乳糖40g 羧甲基淀粉钠5g 2％HPMCE5溶液 适量 6％吐温80 适量 硬脂酸镁1g 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，以含吐温80的HPMC溶液为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，湿颗粒于50-60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，(1)压普通片，(2)压肠溶片取丙烯酸2g，加蓖麻油混合，加95％乙醇至600ml，用喷雾滚转包衣法包衣。
实施例15 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷卵磷脂片的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷20g 或葛根素-7-O-异麦芽糖苷 微晶纤维素 30g 大豆卵磷脂 40g 羧甲基淀粉钠 7g 2％HPMCE5溶液 适量 含5％吐温80适量 硬脂酸镁 1g 按处方量，称取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷、大豆卵磷脂，置烧瓶中，加入无水乙醇700ml，加热回流1-2小时，回收乙醇，减压干燥，研磨成细粉(100-200目)，微晶纤维素、羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，以含吐温80的HPMC溶液为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，湿颗粒于50-60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，(1)压普通片，(2)压肠溶片取丙烯酸2g，加蓖麻油混合，加95％乙醇至600ml，用喷雾滚转包衣法包衣。
实施例16 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐肠溶胶囊的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐，邻苯二甲酸醋酸纤维素209，溶于丙酮和乙醇(1∶1)混合液500ml溶液中，搅拌，缓缓滴入正己烷，至沉淀为止，硬化，干燥，再将肠溶微囊装入普通空心硬胶囊中，制成肠溶胶囊。
实施例17 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷缓释胶囊剂的制备 将葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷和聚维酮溶于少量乙醇中，减压加热以挥去乙醇，所得固体过100目筛；将上述固体与微晶纤维素、羟丙甲纤维素K4M过60目筛混合均，加入3％羟丙甲纤维素(E5)水溶液适量制软材，过20目筛制粒。40-50℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过20目筛整粒，加入处方量的滑石粉，混合均匀。按处方量灌装于胶囊中。
实施例18 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐缓释胶囊剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖 80g 苷盐(按葛根素-7-O-葡萄糖苷计算投料，下同) 微晶纤维素 15g 羟丙甲纤维素K4M 100g 3％羟丙甲纤维素(E5)水溶液适量 滑石粉 2g 将葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐、微晶纤维素、羟丙甲纤维素K4M过60目筛混合均，加入3％羟丙甲纤维素(E5)水溶液适量制软材，过20目筛制粒。40-50℃烘箱鼓风干燥。干颗粒过20目筛整粒，加入处方量的滑石粉，混合均匀。按处方量灌装于胶囊中。
实施例19 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷缓释片剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽50g 糖苷 聚维酮50g 乳糖 15g 羟丙甲纤维素K4M 100g 3％羟丙甲纤维素(E5)水溶液 适量 滑石粉1g 将葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷和聚维酮溶于少量乙醇中，减压加热以挥去乙醇，所得固体过100目筛；将上述固体与乳糖、羟丙甲纤维素K4M过60目筛混合均，加入3％羟丙甲纤维素(E5)水溶液适量制软材，过20目筛制粒。40-50℃烘箱鼓风干燥。干颗粒过20目筛整粒，加入处方量的滑石粉，混合均匀，压片即得。
上述实例还可选用其它辅料，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微分硅胶、氢化植物油，聚乙二醇4000和6000；润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80；骨架材料如羟丙甲纤维素、乙基纤维素等。
实施例19 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷注射剂的制备 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷10g 注射用水 加至5L 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷，加入注射用水中，充分溶解，加入0.1％活性炭，加热煮沸15分钟，过滤除炭，调pH值至5.0～7.0，测中间体含量、pH值，合格后，灌封于玻璃安剖中，100℃，30分钟流通蒸气灭菌，得葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷注射剂。
实施例20 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷注射剂 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷，精氨酸或赖氨酸(或取葛根素衍生物盐)置适宜容器中，加注射用水9000ml，搅拌均匀，加入精氨酸或赖氨酸，加热至溶解，加入氯化钠搅拌使溶解，补加注射用水至加至2.5L，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装封口，于100℃流通蒸汽灭菌30分钟即得。
实施例21 注射用葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷粉针剂的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷与精氨酸或赖氨酸置适宜容器中，加注射用水400ml，搅拌均匀，超声至溶解，加入甘露醇搅拌使溶解；按0.1％加入针用活性炭，搅拌30分钟，经钛砂芯脱碳抽滤到洁净的容器中，补加注射用水至500ml，将溶液搅拌5分钟使均匀，再经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液灌装在西林瓶中，每瓶2ml或5ml，然后部分地塞上丁基橡胶赛，送至冻干箱内的板层上，插入温度探头，关闭箱门。按冻干曲线冷冻干燥，最后干燥温度为35℃以上并保持2小时。密塞，放气，出箱，轧盖。
实施例22 注射用葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐粉针剂的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷盐(可以是葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷的精氨酸、赖氨酸、氨基葡萄糖、葡甲胺等盐)置适宜容器中，加注射用水400ml，搅拌均匀，超声至溶解，加入甘露醇搅拌使溶解；按0.1％加入针用活性炭，搅拌30分钟，经钛砂芯脱碳抽滤到洁净的容器中，补加注射用水至500ml，将溶液搅拌5分钟使均匀，再经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液灌装在西林瓶中，然后部分地塞上丁基橡胶赛，送至冻干箱内的板层上，插入温度探头，关闭箱门。按冻干曲线冷冻干燥，最后干燥温度为35℃以上并保持2小时。密塞，放气，出箱，轧盖。
实施例23 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷口服液的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷溶于纯化水中，搅拌使充分溶解，加入85％的单糖浆，调节pH值3.5～7.0，再加0.3％的苯甲酸钠作防腐剂，加热煮沸30分钟，用0.8μm的微孔滤膜过滤，灌封于20ml的棕色口服玻璃瓶中，100℃，30分钟灭菌，得葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷口服液。
实施例24 葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷注射输液的制备 取葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷，加入注射用水中，配成浓度为1mg/ml，充分溶解，加入0.1％活性炭，加热煮沸15分钟，过滤除炭，调pH值至5.0～7.0，测中间体含量、pH值，合格后，灌封于100ml玻璃瓶中，100℃，30分钟流通蒸气灭菌，得葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖注射输液。
实施例25 不同葛根素-7-O-葡萄糖苷或葛根素-7-O-异麦芽糖苷注射液与葛根素注射液比较 取不同葛根素-7-O-葡萄糖苷、葛根素-7-O-异麦芽糖苷、葛根素适量，置10ml容量瓶中，加水，振摇使溶解，定容，封口即得水为载体的制剂，结果见表4，葛根素-7-O-葡萄糖苷、葛根素-7-O-异麦芽糖苷比葛根素在制剂上稳定。
表4葛根素及其衍生物注射液比较 实施例26-33说明 1、葛根素简称Pue，由青岛金峰制药有限公司提供，纯度经高效液相色谱(HPLC)分析为99％。葛根素-7-O-葡萄糖糖苷简称Pue-glu，葛根素-7-O-异麦芽糖苷，简称Pue-mal，均由本发明方法制备，经高效液相色谱(HPLC)纯度在99％。
2、试验动物 Sprague-Dawley大鼠，体重200-250g，雄性，有南京中医药大学实验动物中心提供，使用许可证SKXK(苏)2002-00123。
昆明种小白鼠，体重18～22g，雌雄各半，由南京医科大学实验动物中心提供，生产许可证SCXK(苏)2002-0031。
3、统计 数据以
±s表示，采用t检验，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。
4、仪器和试药 采用本领域技术人员熟悉的方法中涉及的仪器和试药。
图1底物葛根素HPLC谱图 图2葛根素-7-O-葡萄糖苷及葛根素-7-O-异麦芽糖苷转化液的HPLC图谱 图3葛根素-7-O-葡萄糖苷纯品HPLC图谱 图4葛根素-7-O-异麦芽糖苷纯品HPLC图谱 实施例26.葛根素衍生物在血液中的代谢动力学实验 1 仪器和色谱条件 HPLC分析采用Agilent 1100高效液相色谱仪(USA)；色谱柱为Agilent Zobox OSD柱(250×4.6μm，5μm)；进样体积为20μL；柱温为室温；检测器为AgilentG1314A紫外检测器，波长为254nm；流动相A水，加入0.1‰(v/v)色谱级乙酸，B甲醇，A∶B＝70∶30；流动速度1mL/min。
2 试验方法与结果 2.1 样品采集 SD大鼠随机分成6组，每组5只。实验前禁食12h。Pue，Pue-glu分别溶入氯化钠注射液中形成最终剂量分别为16.68mg/kg和23.12mg/kg的溶液。按4mL/kg给予大鼠尾静脉注射Pue和Pue-glu。对照给予氯化钠注射液。
服用后经t＝1，5，10，15，20，30，40，60，80，100，120，150，180min后，眼眶采集0.5毫升血液置于肝素钠处理过的离心管中，立即以3000rpm的条件下离心分离15min，分离血浆以备分析。对照组在试验结束后采集血浆作空白血浆。
2.2 样品处理 精密取血浆0.2mL置试管中，再加入6％高氯酸溶液0.2mL沉淀蛋白，于涡旋混合器上混合2min，然后离10min，10000rpm，放入冰箱中静置2h，测定前离心10min，上清液用于高效液相色谱(HPLC)分析。
2.3 数据分析 按照3.2.2所述处理和使用样品，Pue及Pue-glu的血浆浓度用单点外标法计算得到。得到的数据用药代动力学统计软件进行分析。结果显示在活体内Pue和Pue-glu的代谢符合大鼠的一房室模型，R值均大于0.99，拟合程度好。这说明Pue-glu能更快的在血液和血管外组织间达到平衡。
2.4 结果 主要代谢动力学参数列在表5中。由表5可见，Pue-glu在血液中的滞留时间与Pue相比得到延长，T1/2是Pue的2.85倍，有利于药物在体内有较长的作用时间。与此相对应，试验证明Pue-glu的AUC比Pue高，Pue-glu的Cmax是Pue的1.6倍。
表5 Pue及Pue-glu的在大鼠中的代谢动力学(Pharmacokinetic)参数(n＝5)
**p＜0.01差异及其显著，*p＜0.05差异显著 t1/2＝消除的半衰期 MRT＝平均滞留时间 AUC＝浓度-时间曲线下的面积 C(max)＝化合物能达到的最大浓度 实施例27.葛根素衍生物的血管舒张的药理药效试验 试验方法和结果 1 方法 大鼠用钝器击昏，颈椎脱位处死后，迅速打开胸腔，取其胸主动脉，放入盛有4℃，通100％O2饱和K-H液的培养皿中。仔细拔除血管周围结缔组织，冲洗血管内血液，剪成长3～4mm的血管环，用细钢丝插入管腔，滚动破坏血管内皮后，悬挂于通100％O2的7mLK-H液的浴槽中，恒温37℃，连接张力换能器。其静息张力0.5～2g，稳定平衡1～2小时，每20min用预先温至37℃的K-H液更换浴槽内溶液一次。加入NE(110-6mol/L)，待血管环收缩达到稳定后，用K-H液换洗至基线，稳定20min。重复此操作一次。加入PE 110-5M预收缩动脉环，待收缩稳定加入乙酰胆碱(Ach)10-5M检测血管内皮功能，以≤20％认为内皮去除，进行下一步实验。
用Pue，Pue-glu，pue-mal 10-4.5-10-2M温孵10min，观察对各种收缩的抑制作用A，PE(110-5M)诱导的收缩，待血管收缩达到稳定后，加入累加剂量的Pue或Pue-7-O-glc引起的收缩；B，KC(110-1M)诱导的收缩，待血管收缩达到稳定后，加入累加剂量的Pue或Pue-7-O-glc引起的收缩。记录最大收缩张力(g)，以不加药组为对照组，计算各种药物对不同处理引起的收缩的抑制收缩百分率。
2 结果 2.1 Pue或Pue-7-O-glc对KCl预收缩主动脉环张力的影响 当KCl引起大鼠胸主动脉环的收缩达到最大幅度后，累积性增加Pue或Pue-7-O-glc的浓度(10-4.5-10-2M)，发现Pue，Pue-glu，Pue-mal对去内皮的血管环均有舒张的作用，且呈浓度依赖性，当累积浓度达到10-2.0M时，Pue-glu，pue-mal的舒张作用比同浓度的Pue作用更强，t检验p＜0.01。数据统计结果见表 表 Pue和Pue-glu，Pue-mal对KCl预收缩的主动脉环张力的影响
**Pue-glu，pue-mal与对照组相比p＜0.01，##Pue-glu，pue-mal与Pue组相比p＜0.01 2.2 Pue，Pue-glc，Pue-mal对PE预收缩主动脉环张力的影响 当PE引起大鼠胸主动脉环的收缩达到最大幅度后，累积性增加Pue，Pue-glc，Pue-mal的浓度(10-4.5-10-2M)，发现Pue，Pue-glu，Pue-mal对去内皮的血管环仅在10-2M才有抑制收缩的作用，两者之间没有明显差异。数据统计结果见表。
表 Pue，Pue-glu，Pue-mal对PE预收缩的主动脉环张力的影响
Pue-glu，pue-mal与对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01；#Pue-glu，pue-mal与Pue组相比p＜0.05 3 结论 浓度为10-2.5，10-2M的Pue-glu或(Pue-mal)较Pue能更强地抑制KCl引起的去除内皮后的主动脉环收缩，但对抑制苯肾上腺素引起的去除内皮后的主动脉环的收缩作用与Pue相比没有明显差异。
由于Pue-glu，pue-mal与Pue有着相同母核，药理作用相似，提示Pue-glu，pue-mal也具有治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、视网膜动静脉栓塞、突发性耳聋；防治动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的药物组合物应用。
Pue-glu，pue-mal与Pue相比在舒张血管的药理作用上某些方面较优。
实例28冠心病、心绞痛、心肌梗死实验 1 方法 Wistar大鼠50只，体重200～250g，雌雄各半，随机分为假手术(S)组；缺血再灌注(I/R)组；缺血预处理(IPC)组；Pue-glu组；Pue-mal组。每组10只。参照文献[覃数等，大白鼠实验性心肌缺血再灌注模型制备与心电图改变德特点，重庆医科大学学报，1998，23(1)8～11]方法并进行改良，复制大鼠心肌I/R模型。10％水合氯醛0.3～0.4ml/100g腹腔注射麻醉后固定，气管插管接小动物呼吸机。将针形电极插入四肢皮下，通过BL2420E生物机能实验系统记录心电图。于胸骨左缘第4肋间隙开胸，剪开心包暴露心脏，在左心耳下缘3～4mm处进针，向肺动脉圆锥方向出针，将一小段聚乙烯管(直径115mm)置于结扎线下收紧结扎线，以阻断大鼠冠状动脉左前降枝(LAD)血流。观察心电图，以出现QRS波群高大增宽为结扎成功标志(郭鹞，人类疾病的动物模型，人民卫生出版社，1982365-367)。缺血45min后，取出聚乙烯管即再灌注，以QRS波群振幅逐渐降低为再灌注成功标志(吴其夏等，缺血-再灌注损伤和预适应，新编病理生理学，1999191-210)。
(1)S组开胸后仅在LAD下穿线而不结扎，给予等量生理盐水尾静脉注射。
(2)I/R组结扎LAD缺血45min，再灌注120min，给予等量生理盐水尾静脉注射。
(3)IPC组缺血5min，再灌注5min，反复3次，随后缺血45min，再灌注120min，给等量生理盐水尾静脉注射。
(4)Pue-glu组缺血前5min，尾静脉缓慢注射。
(5)Pue-mal组缺血前5min，尾静脉缓慢注射。PUE-GLU与PUE-MAL组(100mg/kg体重)，其余操作同I/R组。
2 观察指标 2.1 心肌梗死面积每组10只大鼠再灌注结束后迅速取出心脏，原位结扎LAD，经主动脉逆行灌注伊文氏蓝1～2ml，分离非缺血区(蓝染)和缺血区(无蓝染)。将缺血区和非缺血区心肌分别用滤纸吸干、称重，以缺血区重量与全心重量之百分比表示缺血面积。再将缺血区沿垂直于心脏纵轴方向切开，每片厚1～2mm，置于1％TTC磷酸缓冲液(pH 7.1)中37℃孵育20min，然后将梗死区(灰白色)和非梗死区(砖红色)分离，分别滤纸吸干、称重，以梗死心肌重量与缺血区心肌重量之比表示梗死面积。
2.2 血清CK活力和TnT水平各组大鼠再灌注结束后股动脉取血，4℃，3500r/min离心，分离血清，然后严格按照试剂盒说明书操作测定CK活力。再灌注结束后股动脉取血1ml，肝素抗凝，测TnT，各组TnT浓度结果制成频数表资料，I、II、III、IV级分别表示TnT浓度为0.1～0.65mg/L、0.65～1.3mg/L、1.3～2.0mg/L和＞2.0mg/L。
3 结果 3.1 心肌梗死面积 S组未见心肌梗死发生；除S组外，各组间缺血面积无明显差异(P＞0.05)；与I/R组比较，IPC组、Pue-glu组和Pue-mal组梗死面积均缩小(P＜0.05)，且Pue-glu组和Pue-mal组分别与IPC组间差异无显著性(P＞0.05)。结果表明Pue-glu和Pue-mal预处理可显著缩小缺血再灌注引起的心肌梗死范围，同IPC效应相似。见表1。
3.2 血清CK活力和TnT浓度 I/R组血清CK活力、TnT浓度较sham组、IPC组明显升高(P＜0.01或P＜0.05)；IPC组与S组相比CK活力和TnT浓度差异均无显著性；Pue-glu和Pue-mal组CK活力、TnT浓度较I/R组明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，而与IPC组无显著差异(P＞0.05)。可见，Pue-glu和Pue-mal预处理同IPC均可降低缺血再灌注损伤时血清CK活力及TnT浓度。结果见表2。
表1 心肌缺血面积和梗死面积(n＝10，
±s)
#与I/R组比较，P＜0.05 表2 血清CK活力和TnT浓度变化(n＝10，
±s)
与S组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与I/R组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 实例29缺血性脑血管病实验 1 方法 脑微循环血流量的测定 小白鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，沿头顶正中切开皮肤，轻刮颅顶骨，应用J I2200型激光微循环动态分析仪测量脑微循环血流量。稳定5～10min后开始实验。正常小鼠每组动物，均先测量和记录正常脑微循环血流量，然后尾静脉注射Pue-glu，Pue-mal，并记录注射后即刻0、1、5、10、30、60min时的微循环血流量。高分子右旋糖酐(HMWD)所致微循环障碍小鼠，分别记录尾静脉注射10％HMWD 0.2ml造成微循环障碍前后的微循环血流量，3min后尾静脉注射Pue-glu，Pue-mal，同前记录注射后各时相的脑微循环血流量。
2 结果 2.1 Pue-glu，Pue-mal对正常小鼠脑微循环的影响小白鼠每组10只，体重18～22g，随机分组，雌雄各半。对照组小鼠尾静脉注射生理盐水0.2ml/只，低剂量组和高剂量组每只动物分别尾静脉注射1％Pue-glu、1％Pue-mal各0.2ml。结果见表1。从表1可看出，静脉注射Pue-glu，Pue-mal后3～5min，脑微循环血流量即显著升高，其效应至少持续30min。
2.2 Pue-glu，Pue-mal对HMWD所致微循环障碍小鼠脑微循环血流量的影响小白鼠30只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为对照组、；Pue-glu组；Pue-mal组，每组10只。每组动物均在注射10％HMWD 0.2ml 3min后，尾静脉注射盐水或Pue-glu、Pue-mal，剂量同前。结果见表2。由表2可看出，小鼠静脉注射HMWD后，脑微循环血流量明显降低，3～5min后维持一较低水平，此时注射Pue-glu，Pue-mal，可使脑微循环血流量稍有升高，作用较明显。
表1 Pue-glu、Pue-mal对正常小鼠脑微循环血流量的影响(mV，
±s)
注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表2 Pue-glu、Pue-mal对HMWD所致微循环障碍小鼠脑微循环血流量的影响(mV，
±s)
注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01 实例30 动脉粥样硬化实验 1.方法 1.1 主动脉内皮细胞的培养无菌条件下迅速取出新生乳牛的胸主动脉，置于高抗的Hanks溶液中，洗掉残余血污，转移至培养皿中，采用胰蛋白酶消化法取得内皮细胞，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基培养，置37℃、5％CO2培养箱中，约3d更换培养液，一周左右，细胞长至完全汇合时进行传代培养，采用生长良好的2代进行实验。
1.2 对低密度脂蛋白(LDL)诱导的内皮细胞损伤的影响内皮细胞以1×105cell/ml的密度接种于24孔板中，每孔0.5ml，培养至融合后，分别加入10-7mol/mlPue-glu，Pue-mal培养12h后，换成含50μg/ml LDL的培养基继续培养24h，吸取培养液，测定培养液中NO的含量，贴壁细胞用1％Triton溶解后，试剂盒测定细胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性。实验分对照组(内皮细胞培养液中加0.5％新生牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基；模型组(内皮细胞培养液中加0.5％FBS RPMI-1640培养基和50μg/ml LDL作用24h)；Pue-glu、Pue-mal组(实验前12h在培养液中加Pue-glu、Pue-mal 10-7mol/L，然后加50μg/ml LDL作用24h)和Pue-glu，Pue-mal组(实验前12h在培养液中1mg/ml Pue-glu、Pue-mal，加50μg/ml LDL作用24h)。
1.3 动物与分组成年健康Wistar大鼠，体重220～250g，♀
兼用，由南京医科大学实验动物中心提供。饲料喂1周后，随机分为Control、Model、Pue-glu、Pue-mal组，每组6只。Control空白对照组，饲喂标准基础饲料；Model组模型组，饲喂高脂饲料由1％胆固醇、10％猪板油、0.2％丙基硫氧嘧啶和88.8％基础饲料组成[李仪奎，中药药理实验方法学，上海上海科技出版社，1993398]。Pue-glu，Pue-mal组实验组，饲喂高脂饲料并按80mg/kg添加Pue-glu，Pue-mal片剂。各组饲养环境条件一致。血脂测定在饲喂6周时，尾静脉取血，采用酶联试剂(盒)使用VitalabMicro半自动生化分析仪(荷兰)测定甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量，根据测定结果计算出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)值。
2. 结果 2.1 对内皮细胞培养液中NO含量的影响与对照组相比，50μg/mlLDL组NO含量明显降低(P＜0.05)，而Pue-glu、Pue-mal使内皮细胞合成和分泌NO升高(P＜0.01，表1)。
2.2 对内皮细胞中一氧化氮合酶(NOS)活性的影响细胞用1％Triton溶解后，测定细胞中NOS的活性。与对照组相比，50μg/ml LDL组结构型NOS(cNOS)活性明显降低(P＜0.01)，而Pue-glu、Pue-mal组(10-7mol/L)细胞内cNOS活性明显提高，与50μg/ml LDL组比较有显著差异(P＜0.01，表2)，而Pue-glu、Pue-mal对诱导型NOS(iNOS)活性无显著影响。Pue-glu、Pue-mal组cNOS活性与50μg/ml LDL组比较明显提高(P＜0.05，表2)。
2.3 实验结果表明，饲喂高脂饲料的模型组(Model)与正常对照组(Control)比较，6W后诱发大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量升高，HDL-C含量明显降低(P＜0.01)。实验组(Pue-glu、Pue-mal)与正常对照组(Control)比较，各项血脂指标也有较明显变化(P＜0.05)，鼠血清TG、TC、LDL-C的含量显著降低(P＜0.01)，而HDL-C含量明显升高(P＜0.01)。结果见表3。
表1 Pue-glu，Pue-mal对内皮细胞培养液中NO含量的影响(
±s，n＝8)
与正常对照组比较*P＜0.05，与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01 表2 Pue-glu，Pue-mal对内皮细胞中NOS活性的影响(
±s，n＝8)
与正常对照组比较*P＜0.05，与模型组比较##P＜0.01 表3 Pue-glu、Pue-mal对大鼠血脂水平的影响(
±s)
*与正常对照组比较P＜0.05，##与模型组比较P＜0.01 高血脂尤其是高TC及LDL-C为引发动脉粥样硬化(AS)的主要原因之一。而高TG是重要的引发冠心病的危险因素[韦育林等，微粒化力平脂治疗原发性高脂血症疗效的初步观察，岭南心血管病杂志，1997，2(4)36]。因此，防治高脂血症对预防AS及冠心病具有积极作用。本研究表明，Pue-glu、Pue-mal能有效降低高脂血症大鼠血清中TG，TC含量，可明显提高大鼠血浆中HDL-C含量。HDL-C/TC值越大，则抗AS作用越强[蔡秀成，王力光，刑立新，等.松籽油对大鼠血脂及脂质过氧化的影响[J].食品科学，1999，20(6)54，56.] 实例31防治糖尿病肾病实验 1 方法 1.1 动物建模40只SD雄性大鼠预养1w后，空腹12h，腹腔注射1％链脲佐菌素(STZ)柠檬酸钠缓冲液(STZ 60mg/kg体重)，对照组注射等量柠檬酸钠缓冲液。72h后静脉采血测血糖，血糖≥16.7mmol/L者，确定模型建立，纳入本实验。将30只糖尿病鼠纳入实验。
1.2 分组正常对照组(10只)；糖尿病鼠随机分为糖尿病模型组(10只)和Pue-glu、Pue-mal治疗组各10只。Pue-glu、Pue-mal各组每只腹腔注射Pue-glu、Pue-mal各80mg/kg/d，连续给药16w。各组为了避免酮症和维持糖尿病鼠的生存，模型组和Pue-glu、Pue-mal组隔日腹腔注射长效胰岛素2～4单位，并断尾取血测大鼠血糖，使血糖波动在25mmol/L左右，实验共16w。第16w实验终止时，各组大鼠在禁食的基础上，用代谢笼收集24h尿，测定尿白蛋白(UAE)含量。动物经乙醚麻醉后称体重，股动脉放血5ml测大鼠血糖、尿素氮、血肌酐，计算内生肌酐清除率、8-iso-PGF2α。
1.4 观察指标一般情况观察每日观察大鼠饮食饮水量、精神状态、活动情况、大便性状及尿量，隔日测体重并加以记录。观察每只大鼠的饮水量、尿量(用代谢笼收集尿液)，取其平均值作为最终数据。肾脏湿重去包膜后用精密天平称重。
1.5 生化指标用全自动生化仪测血糖、尿素氮、血肌酐。尿白蛋白排泄率(UAER)收集24h尿液，用二甲苯防腐，混匀后取2ml用免疫细胞计数仪测定。肾小球滤过率(GFR)以内生肌酐清除率为代表，GFR＝(尿肌酐×尿量)/血肌酐。8-iso-PGF2α参照试剂盒说明书测定。
2 结果 2.1 一般情况观察正常组大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。模型大鼠精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、早期多动，后期反应迟钝、动作迟慢、弓背蛇体、多汗出、毛竖无光泽、小便量多，每天需换垫料1～2次；有1只视力下降；有2只白内障；有1只出现反复腹泻。Pue-glu、Pue-mal组精神状况良好，无白内障及尾、足坏死，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差。
2.2 Pue-glu、Pue-mal对大鼠尿量、体重、肾重/体重、血糖的影响造模成功的大鼠较正常组体重明显下降，尿量增加，血糖升高，肾重/体重比值增加(P＜0.05)。治疗后，Pue-glu、Pue-mal组较模型组尿量减少，体重增加、肾重/体重比值下降(P＜0.05)，见表1。
2.3 Pue-glu、Pue-mal对大鼠UAER、血肌酐、肌酐清除率、尿素氮的影响造模成功的大鼠血清UAER、血肌酐、尿素氮较正常组明显升高，内生肌酐清除率下降，差异显著(P＜0.05)，模型组较Pue-glu、Pue-mal组，UAER、血肌酐、尿素氮明显升高，内生肌酐清除率下降(P＜0.05)，见表2。
2.4 Pue-glu、Pue-mal对8-iso-PGF2α及血清糖化血红蛋白(HbAlc)的影响造模成功的大鼠血清8-iso-PGF2α和血清HbAlc较正常组明显升高(P＜0.05)，模型组较Pue-glu、Pue-mal组，8-iso-PGF2α和血清HbAlc明显升高(P＜0.05)，见表3。
表1 各组大鼠尿量、体重、肾重、体重、血糖的变化比较(n＝10，
±s)
*与正常对照组比较，#与模型组比较P＜0.05，下表同 表2 各组大鼠UAER、血肌酐、肌酐清除率、尿素氮的变化比较(n＝10，
±s)
表3 各组大鼠8-iso-PGF2α及血清HbAlc的比较(n＝10，
±s)
实例32 胰岛素抵抗实验 1 方法 1.1 胰岛素抵抗-高血压(IRH)大鼠模型的建立与分组 用SPSS统计软件按大鼠体重分层随机抽出20只空白对照组，饮用蒸馏水和普通饲料喂养；其余大鼠饮用5％蔗糖22％盐水，喂饲高脂高盐高糖饲料(20％猪油、15％蛋黄粉、10％蔗糖、3％盐、52％普通饲料)造模。每2w检测血压1次；第4周和第8周，检测空腹血糖(FBG)和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后2h血糖(2hBG)；第8w，造模大鼠大部分血压较正常组大鼠血压增高3～5kPa(1kPa＝715mmHg)，并出现糖耐量减退；挑选血压和糖耐量异常的IRH造模大鼠，用SPSS统计软件均衡随机分成以下6组模型阴性对照组；模型卡托普利(Cap组)；Pue-glu、Pue-mal各高和低2个剂量组。
1.2 用药方法与指标检测 各组大鼠均照上述方法继续造模4w。同时，空白对照和模型阴性对照组均im 50％丙二醇，0.18ml/kg，qd×4w；Cap组im Cap注射液7mg/kg，qd×4w；Pue-glu、Pue-mal均按60mg/kg、30mg/kg分组，并选取大鼠双侧足三里(后三里)、脾俞、肾俞进行穴位注射，每日1组穴位，交替使用，qd×4w。以上各组在给药后第2和第4w各测血压1次，第4w做FBG和OGTT-2hBG检测。全部大鼠禁食过夜，末次给药2h后，全部大鼠眼眶放血，离心、分离血清，并按试剂盒说明书操作，用生化分析仪测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和血浆血糖含量(FPG)；用酶联免疫分析仪测定血浆空腹胰岛素(Fins)含量，并计算胰岛素敏感指数(ISI)ISI＝In[1/(Fins×FPG)]。
2 结果 2.1 Pue-glu、Pue-mal对IRH大鼠血压及糖耐量的影响 表1 结果显示，IRH大鼠血压及OGTT-2hBG明显高于空白对照组，差异有高度显著性(P＜0.01)；Cap，Pue-glu，Pue-mal 60mg和30mg/kg组，能明显降低IRH大鼠血压及OGTT-2hBG(P＜0.01)；Pue-glu Pue-mal降压作用呈量效关系。
2.2 Pue-glu Pue-mal对IRH大鼠血脂及胰岛素敏感性的改善作用表2结果显示，IRH大鼠的血浆Fins含量、TG和TC含量明显高于空白对照组，差异有显著性(P＜0.05～0.01)；ISI差异明显下降，有高度显著性(P＜0.01)；Cap组、Pue-glu，Pue-mal 60mg/kg和30mg/kg组，能降低IRH大鼠TG、TC含量(P＜0.05～0.01)；Cap和Pue-glu Pue-mal 60mg/kg组还能降低IRH大鼠的血浆血糖含量(P＜0.05)。Cap和Pue-glu 60mg/kg组，能提高低下的ISI，差异有高度显著性(P＜0.01)，增强胰岛素敏感性；而Pue-glu，Pue-mal低剂量组，对Fins含量和ISI作用，差异均未见显著性(P＞0.05)。
2.3 结论实验结果可见，Pue-glu、Pue-mal可以明显降低IRH大鼠TG、TC水平，提示Pue-glu可以有效地纠正IRH大鼠紊乱的脂质代谢，从而有效地保护β细胞并拮抗胰岛素抵抗，降低IRH大鼠血压。
表1 Pue-glu、Pue-mal对IRH大鼠血压(收缩压)及糖耐量的影响(kPa，n＝10，
±s)
注与模型阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
表2 Pue-glu对IRH大鼠血脂和胰岛素敏感性的作用(n＝10，
±s)
注与模型阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
实例33 抗骨质松实验 1 方法 1.1 分组及给药70只大鼠，其中60只腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，按常规方法切除双侧卵巢，余10只大鼠做相同的手术操作，但不切除卵巢，作为假手术组(Sham)。将切除卵巢的大鼠分为6组，在手术后1周开始灌胃给药，Sham和OVX(Ovariectomization卵巢切除模型对照组)组每天给予0.5％CMC溶液；尼尔雌醇(E3)组给予尼尔雌醇0.15mg/kg，每周2次(周一和周四)，Pue-glu、Pue-mal大、小剂量组分别每天ig Pue-glu、Pue-mal均为80和20mg/kg，给药体积均为110ml/100g体重，连续7个月。饲养室温度20℃～26℃，湿度50％～70％，喂以普通饲料，自由饮水。每周称一次体重并按新体重调整给药体积。
1.2 骨密度测定于给药4和7个月时，大鼠35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，在双能骨密度仪(DEXA)上以前臂骨密度测量软件测定大鼠全身骨矿含量(BMC)和全身骨矿密度(BMD)。仪器参数134kV，110mA，扫描长度26cm，宽度1414cm。
2.3 股骨相对体积质量测定最后一次给药1d后，处死大鼠，分离一侧股骨和胫骨，剔尽附着的肌肉和结缔组织，于电子天平上称湿重后，在自制的排水法体积测定装置上测定其体积，计算其湿相对体积质量。
1.3 骨生物力学性能测定采用电子万能试验仪做股骨和胫骨的三点弯曲试验，仪器参数加载速度6mm/min，最大负荷200N，跨距20mm，描记负荷2变形曲线，计算最大负荷及结构强度(引起1mm变形需要的负荷，相当于曲线上的斜率)。
1.4 股骨灰相对体积质量测定力学指标后，收集残断的股骨，马弗炉灰化后称灰重，灰重和体积之比即股骨灰相对体积质量。
1.5 股骨钙含量和钙盐密度测定将骨灰溶解在40mL(6mol/L)盐酸中，并以EDTA络合滴定法，钙红作指示剂，测定钙含量，并计算出单位体积Ca含量(钙盐密度)。
1.6 子宫重量系数测定解剖取出子宫，轻挤出子宫腔内的液体，于电子天平上称重，它和体重之比即为子宫重量系数。
3 结果 3.1 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠BMC和BMD的影响大鼠在切除卵巢后4和7个月全身BMC和BMD显著降低，尤以BMD为甚。Pue-glu、Pue-mal分别高低剂量80和20mg/kg连续ig 4和7个月，显著提高BMC和BMD。4和7个月时，Pue-glu、Pue-mal的80mg/kg与20mg/kg组BMC和BMD分别升高。而E3组BMD在4和7个月时均显著提高，BMC仅在4个月时显著提高，但在7个月时没有明显改善(表1)。
3.2 Pue-glu、Pue-mal对大鼠股骨相对体积质量及钙盐密度的影响和Sham组相比，去卵巢后大鼠股骨相对体积质量降低了4.49％，而钙元素含量降低更多(-11.3％)。PUE-GLU，PUE-MAL各大、小剂量组使股骨相对体积质量分别增加，骨灰相对体积质量分别增加。同时，股骨钙盐密度得到完全恢复，甚至比Sham组还高。E3组有类似作用，但增加的幅度比PUE-GLU，PUE-MAL大剂量组略小(表2)。
3.3 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠股骨和胫骨生物力学性能的影响切除卵巢7个月后，大鼠股骨的生物力学性能显著下降，股骨的最大负荷和结构强度分别下降了15.0％和17.3％，胫骨的最大负荷也下降了13.5％。Pue-glu、Pue-mal显著改善骨生物力学指标，大剂量组股骨最大负荷与强度分别提高非常显著，小剂量组分别提高显著。胫骨的力学指标也得到恢复，结构强度甚至超过Sham组。E3组在最大负荷没有得到改善，但结构强度明显提高(表3)。
3.4 Pue-glu，Pue-mal对大鼠体重和子宫重量的影响Pue-glu、Pue-mal大剂量组和雌激素一样引起大鼠体重明显下降，小剂量组不影响体重。切除卵巢后大鼠子宫明显萎缩，重量显著减轻，仅为Sham组的1/3左右。E3组则能使子宫重量完全恢复至Sham组水平。Pue-glu、Pue-mal也能显著增加子宫重量，大、小剂量组使子宫重量系数均提高1倍左右，但比E3组更低(表4)。
表1 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠BMC和BMD的影响(n＝10，
±s)
与OVX组比较*P＜0.05 **P＜0.01；与Sham组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 表2 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠股骨、骨灰和钙盐相对体积质量的影响(mg/mm3)(n＝10，
±s)
与OVX组比较*P＜0.05 **P＜0.01；与Sham组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 表3 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠股骨和胫骨生物力学性能的影响(n＝10，
±s)
与OVX组比较*P＜0.05 **P＜0.01；与Sham组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 表4 Pue-glu、Pue-mal对去卵巢大鼠体重和子宫重量的影响(n＝10，
±s)
与OVX组比较*P＜0.05 **P＜0.01；与Sham组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 实施方式涉及的生物材料 生物材料的分类命名氧化微杆菌Microbacterium oxydans。
保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100080。
保藏日期2006年08月25日。
保藏编号CGMCC No.1788。
权利要求
1、一种葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，其特征如结构式(I)所示
式(I)
式(I)中，母核为葛根素(R＝H)，R选自单糖(6碳糖或5碳糖)基或寡糖(2-5个6碳糖或/和5碳糖连接)基。
2、根据权力要求1的化合物，其特征是单糖基选择葡萄糖基，甘露糖基，葡萄糖醛酸基，半乳糖基，半乳糖醛酸基，阿洛糖基，果糖基，山梨糖基，金缕梅糖基，链霉糖基，2-氨基葡萄糖基，2-氨基半乳糖基，或阿拉伯糖基，来苏糖基，木糖基，核糖基，夫糖基，鼠李糖基，鸡纳糖基，芹糖基；其寡糖基选择异麦芽糖基、海藻糖基，槐糖基，新陈皮糖基，芸香糖基，刺槐二糖基，麦芽糖基，蔗糖基，乳糖基，龙胆糖基，果胶基。
3、根据权力要求1的化合物，R优选1个葡萄糖基的化合物称葛根素-7-O-葡萄糖苷，其特征是葡萄糖基上的半缩醛羟基与葛根素7位碳上的羟基形成糖苷；R优选异麦芽糖基的化合物是葛根素-7-O-麦芽糖糖苷，其特征是麦芽糖基末端葡萄糖基上的半缩醛羟基与葛根素7-O-葡萄糖苷的6位羟基之间形成糖苷键。
4、根据权力要求1的化合物，其药学上可接受的盐为金属离子盐或含氮有机碱的盐，其中，
(1)金属离子为碱金属或碱土金属，优选钠、钾、钙、镁；(2)含氮的有机碱，为氨基酸，优选精氨酸、赖氨酸、肉毒碱；或C1-C40含氮有机碱，优选葡甲胺、氨基葡萄糖，川芎嗪。
5、根据权力要求1的化合物的微生物转化合成方法，糖供体可以是任何一种可以作为糖基化酶作用的糖供体，糖供体为单糖或寡糖或淀粉，其单糖为6碳糖，如葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸，半乳糖，半乳糖醛酸，阿洛糖，果糖，山梨糖，金缕梅糖，链霉糖，2-氨基葡萄糖，2-氨基半乳糖，或5碳糖，如阿拉伯糖，来苏糖，木糖，核糖，夫糖，鼠李糖，鸡纳糖，芹糖，优选葡萄糖；其寡糖为2-5个6碳糖或/和5碳糖脱水缩合而成，海藻糖，槐糖，新陈皮糖，芸香糖，刺槐二糖，麦芽糖，蔗糖，乳糖，龙胆3糖，果胶，优选麦芽糖。
6、根据权力要求1的化合物的微生物转化合成方法。
1)采用具有葛根素糖基化酶活力的菌体细胞、或该菌体细胞的酶提取液、或该酶的重组表达蛋白，将糖供体上的单糖基或寡糖基转移到葛根素A环上C-7位羟基上，优选将葡萄糖基或异麦芽糖基转移到葛根素A环上C-7位羟基上；
2)优选合成葛根素-7-O-葡萄糖苷和/或葛根素-7-O-异麦芽糖苷；
3)转化合成液中的菌体或菌体酶蛋白经加热沉淀、离心去除；
4)用固相萃取、或液相萃取、或柱色谱分离
a)用固相萃取转化合成液，其固相载体可以是为聚酰氨树脂或大孔树脂，用水和/或醇溶剂洗脱萃取的树脂，洗脱液浓缩干燥即得；
b)用液相萃取法，其特征是所用溶剂系统是水-有机剂，有机溶剂是正丁醇、或乙酸乙酯、或氯仿、或乙醚、或己烷，石油醚等，或上述两种或两种以上有机溶剂的混合物，分取萃取液，浓缩干燥即得。
c)用柱色谱分离转化合成液法，可采用硅胶，或烷基键合硅胶或大孔树脂或聚酰氨树脂为固定相，进行色谱分离，目标馏分浓缩干燥即得；
5)通过重结晶纯化产物，其特征是溶剂可以采用水和/或醇溶剂，或醇和/或脂溶性溶剂，其脂溶性溶剂特征是乙酸乙酯、或氯仿、或乙醚、或环氧乙烷，或己烷、或石油醚。
7、根据权力要求5，6的方法，具有葛根素糖基化酶活力的微生物菌种，是任何其它可以糖基化葛根素的微生物或混合微生物，优选微生物是Microbacterium oxydans CGMCC 1788，也可以是Microbacterium saperdae CGMCC 1.1906等所有微杆菌属菌种。
8、按照权利要求4所述盐的制备方法将结构式(I)化合物与含氮有机碱以1∶0.5～2.0的摩尔比，在水和/或醇溶剂中反应，或将结构式(I)化合物与含金属离子以1∶0.5～2.0的当量比，在水和/或醇溶剂中反应。
9、按照权利要求4所述盐的制备方法，其中含氮有机碱优选碱性氨基酸或C1-C40有机碱，或金属离子优选碱土金属离子，其中与碱性氨基酸或与C1-C40有机碱反应的摩尔比为1∶0.8-1.5，或其中与碱土金属离子反应的当量比是1∶0.8-1.5。
10、依据权利要求4所述盐的制备方法，其中碱性氨基酸为精氨酸或赖氨酸，或其中C1-C40含氮有机碱为葡甲胺、氨基葡萄糖，川芎嗪，或其中碱金属离子为Na+或K+或碱土金属离子Mg2+或Ca2+离子。
11、含有治疗有效量的权利要求1-4化合物和药学上可接受的载体的药物组合物，用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松。
12、根据权利要求12所述的药物组合物制剂，其特征在于，其剂型是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、滴眼剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服液、混悬剂、冲剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
13、权利要求1-4化合物在制备防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、动脉粥样硬化、降低血脂、糖尿病肾病及对胰岛素抵抗、抗骨质疏松的药物组合物应用。
全文摘要
本发明涉及通式(I)所示葛根素的糖基化衍生物及其药学上可接受的盐，式中R如正文所述，其制备方法，以及含有有效剂量的通式(I)化合物的药物组合物。该组合物用于治疗和预防心脑血管疾病、糖尿病肾病、骨质疏松症。
文档编号A61P19/10GK101585858SQ200710021700
公开日2009年11月25日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者生 袁, 蒋洁蓉, 丁娟芳, 丛晓东, 朱守创, 戴亦军, 辉 叶 申请人:南京师范大学, 江苏联创医药技术有限公司