松节总多糖及其制备方法和它的用途的制作方法

专利名称：松节总多糖及其制备方法和它的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种松节总多糖及其制备方法和它的医药用途。
背景技术：
松节为松科植物油松Pinus tabulaeformis Carr.、马尾松P.massonianaLamb.等的枝干结节。全国大部分地区均产，全年可采。晒干，切片，生用。松节作为药物使用，始见于《名医别录》，其主治病症为“百节久风，风虚，脚痹疼痛。”《滇南本草》谓其“味酸，性平。行经络，治痰火、筋骨疼痛、湿痹痿软，强筋舒骨。”《本草征要》曰“松节，味苦，性温，无毒。入肝、肾二经。舒筋止肢节之痛，去湿搜骨肉之风。苦燥温通、能燥血中之湿，阴亏血虚者不宜多用。”《本草易读》言其“治历节风痛，疗脚弱痛痹。燥血中之湿寒，漱风蛀之牙痛。”《本草通玄》云“松节，搜风舒筋，燥血中之湿。”《本草备要》则认为“松节，燥湿，去风；松之骨也，坚劲不凋，故取其苦温之性，以治骨节间之风湿。”《本草崇原》说到“松节气味苦温，无毒。主治百邪，久风，风虚脚痹，疼痛，酿酒，主脚软骨节风。”《本草便读》中说松节治肢节有功。燥湿宣风痹可去。味苦温无毒。骨强筋利病能除。”《本草纲目》指出其“筋骨间风湿诸病宜之。”《中华临床中药学》将其功效总结为“祛风燥湿、通络止痛。”松节历来被当作祛风湿药使用，临床长期被用来治疗寒湿痹痛、关节屈伸不利等症。
松节主要含纤维素、木质素、少量挥发油(松节油)和树脂，及熊果酸、异海松酸等；其挥发油中含α-蒎烯及β-蒎烯约90％以上，另含少量1-莰烯等。
目前对松节的利用主要是用其原药材及松节油，在医药、香料、杀虫剂、精细化学等方面有着广泛的用途。尚未见有关于松节增强免疫及抗肿瘤作用、和关于松节总多糖及其用途的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种新的多糖类物质松节总多糖，以扩展松节资源的用途。
本发明的另一个目的是提供一种上述松节总多糖的制备方法。
本发明的又一个目的是提供一种上述松节总多糖的医药用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是松节总多糖，其单糖组成主要是D-半乳糖和L-阿拉伯糖。
上述松节总多糖的单糖组成中，D-半乳糖和L-阿拉伯糖的质量比优选为10-25∶1。此质量比为采用高效凝胶色谱法测定计算而得的结果。
上述松节总多糖的单糖组成还有L-鼠李糖和/或D-木糖等。
上述松节总多糖的重均分子量为10000～100000。此重均分子量为采用高效凝胶色谱法测得的结果。
上述松节总多糖可通过包括下述步骤的方法从中药材松节中提取制得(1)、水提将松节原料(鲜品或干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径以＜5mm为佳，加3～15倍量的水煎煮提取1～6小时，提取2～5次，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重为1.01～1.25的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90～100％的乙醇，调至醇浓度为50～85％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀低温(＜60℃)减压干燥或用五氧化二磷减压干燥，即得主要含上述松节总多糖的物质。
为了得到多糖含量更高的松节总多糖，在上述松节总多糖的制备方法中，可进行进一步的纯化处理，优选的纯化处理方法有下述两种A将所述的(2)步醇沉后得到的沉淀再继续进行1～4次醇沉处理(用质量比为2～20倍的热水溶解，趁热离心或滤过，取上层液，加入90～100％的乙醇，调至醇浓度为50～85％，优选为70～85％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀(并可在任意一次醇沉处理后进一步用活性炭或过氧化氢等进行脱色处理)；然后再进行(3)步所述的干燥步骤。
B将所述的(2)步醇沉后得到的沉淀进行过柱处理，然后再进行(3)步所述的干燥步骤，即将(2)醇沉后得到的沉淀加水溶解成1～10％的水溶液，上DEAE(二乙氨乙基)-纤维素柱(OH-)或弱极性(如AB-8型、D101型、HPD450型、X-5型等)大孔树脂柱，DEAE-纤维素柱用0.1～1mol/L氯化钠水溶液洗脱，大孔树脂柱用纯水洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分的洗脱液，浓缩至较小体积后用90～100％的乙醇调至醇浓度为60-85％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀；然后再进行(3)步所述的干燥步骤。
在不进行进一步纯化处理、或者采用A法进行纯化处理时，可先将(2)步醇沉或进一步多次醇沉处理后最终得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，再用95％乙醇、无水乙醇、丙酮等中的任意一种有机溶剂除去可溶性小分子，然后再取沉淀进行(3)步所述的干燥步骤。
上述方法提取制得的主要含松节总多糖的物质，以D-葡萄糖为标准品，照分光光度计法实验(2005年版中国药典一部附录VA)，用苯酚-硫酸法测含量，证明其多糖含量(以D-葡萄糖计，下同)均在30％以上；进行进一步纯化处理后，其多糖含量可达70％以上。
如继续采用纯化分离方法处理上述主要含松节总多糖的物质，可得到纯度更高的松节总多糖。
上述松节总多糖的用途，可用于制备提高机体免疫功能或抗肿瘤的药物。即将含有临床有效量的松节总多糖制成药剂学上可以接受的任意一种剂型的药物，如片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂、注射剂等，根据各剂型需要可加入适当的药用辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明松节总多糖主要是从松节中提取分离而得的多糖类物质；该松节总多糖具有良好的增强机体免疫功能、和抗肿瘤作用，并对环磷酰胺等抗肿瘤药物具有增效作用。本发明不仅为免疫功能低下者及肿瘤患者提供了一种新的治疗途径，而且也对丰富的松节资源提供了一种新的应用途径。


图1是实施例10松节总多糖的高效凝胶色谱图。横坐标为保留时间(min)，纵坐标为摩尔分子量大小的响应值(Mv)。
图2是根据图1所得的实施例10松节总多糖的分子量分布图。横坐标为重均分子量的对数值(Slice Log MW)，纵坐标分别为微分值(dwt/d(logM))和累积值(Cumulative％)；1为分子量微分分布曲线，2为分子量累积重量分布曲线；Mw为重均分子量，Mn这数均分子量，Mp为峰位分子量，Mz为z均分子量，Mz+1为z+1均分子量。
图3是实施例10所得松节总多糖水解液的高效液相色谱图。横坐标为保留时间(min)，纵坐标为色谱峰高(Mv)；A为D-半乳糖，B为L-阿拉伯糖，C为L-鼠李糖，D为D-木糖；图中A、B、C、D分别对应处的数值为其保留时间值(min)。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。
实施例1本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(鲜品)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取2次，第1次加15倍量的水煎煮提取3小时，第2次加10倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.01的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入100％的乙醇，调至醇浓度为60％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例2
本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取5次，第1次加10倍量的水煎煮提取6小时，第2～4次每次加8倍量的水煎煮提取2小时，第5次加3倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.25的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为75％，静置过夜后，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步醇沉后得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，再用丙酮作为溶剂除去杂质；再将丙酮不溶物进行低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例3本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取4次，第1次加12倍量的水煎煮提取3小时，第2～4次每次加8倍量的水煎煮提取1.5小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.10的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为50％，冷藏过夜后，滤过，取沉淀；用质量比为20倍的热水溶解，趁热滤过，取上层液，用0.5％活性炭脱色，用100％的乙醇调至醇浓度为75％，静置过夜后，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀用五氧化二磷减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例4本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取3次，第1次加10倍量的水煎煮提取4小时，第2次加8倍量的水煎煮提取2小时，第3次加5倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.15的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为60％，冷藏12小时以上，离心，取沉淀；用质量比为10倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用90％的乙醇调至醇浓度为70％，冷藏过夜后，离心，取沉淀；再用质量比为2倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用0.3％活性炭脱色，再用90％的乙醇调至醇浓度为85％，冷藏过夜后，离心，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，再用无水乙醇作为溶剂除去杂质；再将无水乙醇不溶物用五氧化二磷减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例5本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取3次，第1次加10倍量的水煎煮提取4小时，第2次加8倍量的水煎煮提取1.5小时，第3次加6倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.05的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为50％，静置过夜后，离心，取沉淀；用质量比为20倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用100％的乙醇调至醇浓度为60％，静置过夜后，离心，取沉淀；用质量比为15倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用95％的乙醇调至醇浓度为70％，静置过夜后，离心，取沉淀；用质量比为8倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用95％的乙醇调至醇浓度为75％，静置过夜后，离心，取沉淀；再用质量比为2倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，加15％(体积比)的过氧化氢混匀，50℃保温2～3小时，取出放冷，脱色，再用90％的乙醇调至醇浓度为80％，静置过夜后，离心，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，再用95％乙醇作为溶剂除去杂质；再将95％乙醇不溶物进行低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例6本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(鲜品)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取3次，第1次加15倍量的水煎煮提取3小时，第2-3次每次加10倍量的水煎煮提取1.5小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.25的浸膏；(2)、醇沉及过柱在(1)步水提得到的浸膏中加入100％的乙醇，调至醇浓度为85％，冷藏8小时以上，滤过，取沉淀；加水溶解成2％的水溶液，上DEAE纤维素柱(OH-)，用0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分，浓缩至较小体积后用90％的乙醇调至醇浓度为60％，冷藏过夜后，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例7本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取4次，第1次加12倍量的水煎煮提取6小时，第2-3次每次加10倍量的水煎煮提取2小时，第4次加8倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.15的浸膏；(2)、醇沉及过柱在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为70％，静置过夜后，滤过，取沉淀；加水溶解成10％的水溶液，上DEAE纤维素柱(OH-)，用0.1mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分，浓缩至较小体积后用90％的乙醇调至醇浓度为60％，静置过夜后，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀用五氧化二磷减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例8
本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取5次，第1次加12倍量的水煎煮提取6小时，第2-4次每次加10倍量的水煎煮提取3小时，第5次加6倍量的水煎煮提取1小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.01的浸膏；(2)、醇沉及过柱在(1)步水提得到的浸膏中加入90％的乙醇，调至醇浓度为50％，静置过夜后，滤过，取沉淀；加水溶解成1％的水溶液，上DEAE纤维素柱(OH-)，用1mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分，浓缩至较小体积后用100％的乙醇调至醇浓度为85％，静置过夜后，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀用五氧化二磷减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例9本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取2次，第1次加12倍量的水煎煮提取6小时，第2次加10倍量的水煎煮提取4小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.10的浸膏；(2)、醇沉及过柱在(1)步水提得到的浸膏中加入95％的乙醇，调至醇浓度为70％，冷藏8小时以上，滤过，取沉淀；加水溶解成5％的水溶液，上AB-8型大孔树脂柱，用纯水洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分，浓缩至较小体积后用95％的乙醇调至醇浓度为70％，冷藏8小时以上，滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例10本实施例为通过包括下述步骤的方法从松节中提取制得的松节总多糖(1)、水提将松节原料(干燥后的药材)粉碎成松节粗颗粒，颗粒直径＜5mm，加水提取3次，第1次加10倍量的水煎煮提取6小时，第2次加8倍量的水煎煮提取6小时，第3次加5倍量的水煎煮提取2小时，提取温度均为90～100℃，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重约1.12的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入95％的乙醇，调至醇浓度为60％，静置过夜后，离心，取沉淀；用质量比为10倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用95％的乙醇调至醇浓度为80％，静置过夜后，离心，取沉淀；用质量比为8倍的热水溶解，趁热离心，取上层液，用95％的乙醇调至醇浓度为80％，静置过夜后，离心，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀进行低温(＜60℃)减压干燥，用丙酮索氏回流提取8小时，取提取后的药粉，低温(＜60℃)减压干燥，即得主要含本发明松节总多糖的物质。
实施例11本实施例为对上述实施例4所制得的松节总多糖中单糖组成的测定，具体方法为将上述实施例4制得的松节总多糖取20mg于西林瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸4ml，用丁基胶塞密封压盖，100℃水解8小时以上；水解液放冷，减压抽去三氟乙酸，并用少量甲醇反复三次减压带出残留的三氟乙酸，洗涤完全并蒸干甲醇后，加入2ml蒸馏水溶解残渣，即得松节总多糖的完全水解液；将此松节总多糖的完全水解液取5μl点于用0.3mol/L KH2PO4及0.5％的羧甲基纤维素钠液铺成的硅胶G薄层板上，同时取已配好的10mg/ml的D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖六种标准液分别点于同一薄层板上，用正丁醇-丙酮-水(4∶3∶1)为展开剂上行展开，展距约6cm，展开后晾干，喷苯胺-邻苯二甲酸液，于100℃烘5～10分钟后显色，观察结果。
测定结果表明，上述实施例4所制得的松节总多糖中单糖组成主要是D-半乳糖和L-阿拉伯糖，同时含有少量L-鼠李糖和D-木糖。
采用同样的方法，还可测得其它各实施例所制得的松节总多糖的单糖组成。
实施例12本实施例为松节总多糖的含量测定葡萄糖对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，加水溶解并制成0.25mg/ml的无水葡萄糖溶液，作为对照品溶液。
标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL，分别置具塞试管中，加蒸馏水至2.0ml，精密加入新制的5％的苯酚溶液1ml，摇匀，迅速精密加入硫酸5.0ml，摇匀，放置10分钟，置40℃水浴中保温15分钟，取出后迅速冷却至室温，以第1管为空白。照分光光度法试验[2005年版《中国药典(一部)》附录VA]，在490nm波长处测定吸收度，以浓度为横坐标、吸收度为纵坐标绘制标准曲线，计算得线性回归方程。
样品含量测定取本发明松节总多糖约15mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至100ml，摇匀，精密量取1ml，加蒸馏水至2.0ml，照标准曲线绘制项下方法测定其吸收度，并根据标准曲线计算出相应的总多糖含量。
测定结果表明上述各实施例所得松节总多糖中多糖含量(以D-葡萄糖计，下同)都在30％以上，具体数据见表1表1实施例1～10所得松节总多糖中多糖含量

实施例13本实施例为采用高效凝胶色谱法对上述实施例10所制得的松节总多糖重均分子量的测定，具体方法为所用的色谱柱为Utrahydrogel linear column，以0.7％硫酸钠溶液为流动相；流速0.8mL·min-1；Waters 2410 refractive index detector示差折光检测器，Waters 515 pump。
测定结果为上述实施例10所制得的松节总多糖的重均分子量Mw＝25296，分散系数1.70。见图1和图2。
采用同样的方法，还可测得其它各实施例所制得的松节总多糖的重均分子量和分散系数。
对松节总多糖完全水解液采用高效液相色谱法，还可测定计算得到本发明上述各实施例所得松节总多糖中各单糖的质量比。实施例10所制得的松节总多糖D-半乳糖和L-阿拉伯糖的质量比为18.5。见图3。
实施例14本实施例为以上述实施例10制得的松节总多糖制备的可提高机体免疫功能或抗肿瘤的药物(片剂)取松节总多糖250g，粉碎成细粉，加入淀粉100g、硬脂酸镁3g，混匀，制成颗粒，干燥，压成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。
实施例15本实施例为以上述实施例10制得的松节总多糖制备的可提高机体免疫功能或抗肿瘤的药物(胶囊剂)取松节总多糖250g，粉碎成细粉，加入淀粉40g，装入胶囊，制成1000粒，即得。
实施例16本实施例为以上述实施例10制得的松节总多糖制备的可提高机体免疫功能或抗肿瘤的药物(颗粒剂)取松节总多糖250g，粉碎成细粉，加入糊精100g混匀，制成颗粒，干燥，即得。
根据药剂学上各种制剂的常规制备方法，还可将其它各实施例制得的松节总多糖制成片剂、胶囊剂、颗粒剂，以及其它药剂学上可以接受的任意一种剂型的药物。
实施例17本实施例为考察本发明松节总多糖对小鼠体液免疫的影响实验
通过测定小鼠对免疫原鸡红细胞(CRBC)产生抗体的能力，考察松节总多糖对小鼠体液免疫的影响，评价其对体液免疫是否有促进作用。
1、方案设计原理正常小鼠受鸡红细胞免疫后，即可产生抗鸡红细胞抗体(溶血素)，这种抗体在体外与鸡红细胞、补体一起温育，即可使鸡红细胞溶解，释出血红蛋白，使溶液呈红色。颜色的深浅反映了红细胞溶出量的多少，而红细胞溶血与血清中抗体含量有关。因此，测定其上清液的吸光度，则可间接判断血清中抗体形成的数量，吸光度越大，则说明抗体产生量越多，反之亦然。
2、供试品名称松节总多糖-1(按照上述实施例9所制得的松节总多糖)拟用给药途径注射给药配制方法临用前生理盐水配制；名称松节总多糖-2(按照上述实施例10所制得的松节总多糖)拟用给药途径口服配制方法临用前纯水配制。
3、对照品甘露聚糖肽片(多抗甲素)批号040902；性状类白色片剂；规格5mg；包装白色塑料瓶；贮存密封，阴凉干燥处；生产企业广东宏远集团药业有限公司。
4、实验仪器和试剂紫外可见分光光度计，型号TU-1901，厂家北京普析通用仪器有限责任公司。
台式低速离心机，型号80-2，厂家上海手术器械厂。
恒温水浴锅，型号KXS-4，厂家成都科析仪器成套公司。
5％CRBC鸡翼下静脉取血，用枸橼酸钠抗凝，用生理盐水反复洗涤离心(1500r/min，5min)，弃上清液和界面的白细胞层，至上清液无色透明。以2000r/min，离心15min，直至红细胞压积恒定，按此值用生理盐水配成5％的红细胞悬液(U/V)。
10％补体(10％豚鼠血清)豚鼠股动脉取血，分离血清，将血清加入压积鸡红细胞中。血清∶CRBC＝1∶0.2(V/V)，于4℃冰箱放置30min，以除去非特异性补体参与的溶血，2000r/min离心10min，吸取上清液，用生理盐水稀释成1∶10血清备用。
5、实验动物昆明小鼠，雄性，二级，体重18-22g，96只。
公鸡1只3.0kg左右。
豚鼠，性别不限，3只，体重300g±20g。
6、实验环境动物房(等级)SPF级动物房。
温度20-26℃ 相对湿度40-70％ 换气次数10-15次/hr。
光照条件12小时光照/12小时黑暗循环。
饲料鼠颗粒饲料 饮水自由饮用纯水。
7、实验方法7.1动物分组将96只小鼠随机分为8组，每组12只(见表2)。
表2松节总多糖溶血素测定实验剂量设置

7.2剂量设置剂量设置按上述表2中剂量设置，根据供试品拟用剂量，按照小鼠与人面积转化公式，得换算后松节总多糖-1小鼠剂量为38.9mg/kg，松节总多糖-2小鼠剂量为0.29g/kg；取松节总多糖-1剂量为40mg/kg，取松节总多糖-2剂量为0.30g/kg(即300mg/kg)。试验设免疫正常与免疫低下两个大组，免疫低下组每鼠以20mg/kg隔日腹腔注射CY(环磷酰胺)造模。两大组分别再设空白/模型对照组，阳性对照组，松节总多糖-1和松节总多糖-2给药组(见表2)。
7.3给药7.3.1试验周期12天，分组后开始给药，给药第7天，每鼠腹腔注射5％生理盐水鸡红细胞0.5ml进行免疫，第12天给药后30min摘取眼球取血，离心取血清，用生理盐水将血清稀释100倍。稀释血清1ml、与0.5ml 5％CRBC、0.5ml 10％补体混合，在37℃恒温箱中保温30分钟，于0℃冰水混合物中停止反应。同时用双蒸水1ml与0.5ml 5％CRBC、0.5ml 10％补体混合作为阳性对照，用生理盐水1ml与0.5ml 5％CRBC、0.5ml 10％补体混合作为空白对照，调零用。
7.3.2测量指标离心取上清液，用分光光度计540nm下比色，测定吸光度值。
7.3.3各组吸光度值进行单因素方差分析，与对照组进行比较，检测其显著性。
8、实验结果分光光度计测得吸光度值，SPSS12.0整理，将免疫正常组与免疫低下组数据分开统计。免疫正常组中，采用单因素方差分析，各组分别与空白对照组比较；免疫低下组中，采用单因素方差分析各组与免疫低下模型对照组比较。(实验结果见表3)。
表3松节总多糖溶血素测定实验结果(x±SD)

9、实验结论及讨论小鼠经12天松节总多糖-1与松节总多糖-2给药，免疫正常组中，阳性对照组、松节总多糖-1、松节总多糖-2组与空白对照组相比，吸光度值的差异有统计学意义，结合数据情况，可认为阳性对照组、松节总多糖-2组的体液免疫功能比空白对照组高，说明松节总多糖有较好的提高小鼠体液免疫功能作用。免疫低下组模型成功，阳性药效果不理想，而松节总多糖-1组与松节总多糖-2组均显著提高了免疫底下小鼠的体液免疫功能。
以上数据表明松节总多糖具有提高机体免疫功能的作用。
实施例18本实施例为流式细胞仪检测松节总多糖对免疫低下小鼠外周血NK、B细胞的影响实验1材料1.1药物 松节总多糖(按照上述实施例10所制得的松节总多糖)。
环磷酰胺(CY)0.2g/支，江苏恒瑞医药股份有限公司生产甘露聚糖肽片(多抗甲素)批号040902；性状类白色片剂；规格5mg；包装白色塑料瓶；贮存密封，阴凉干燥处；生产企业广东宏远集团药业有限公司。
1.2动物 昆明种小鼠，体重16-18g，雌性。
1.3主要试剂 双色荧光抗体PE标记的NKR-P1B AND NKR-P1C，美国BD公司，批号36407FITC标记的CD19，美国BD公司，批号57934。
1.4主要仪器 电子学细胞计数仪、生物显微镜、离心沉淀器、流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)。
2方法2.1分组与给药 设生理盐水组、模型对照组、阳性药物对照组(多抗甲素)、药物组(含松节多糖，按等倍关系设2个浓度组松节多糖高剂量组600mg/kg、松节多糖低剂量组300mg/kg)，给药容积均为0.2ml/只。生理盐水组和模型对照组给予等体积的生理盐水，每天一次，连续给药12天。于给药的第7、8、9、11日各组小鼠按20mg/kg腹腔注射环磷酰胺药液(正常组除外)，期间继续灌胃给药。
2.2实验方法 取肝素抗凝的小鼠全血于小离心管中，分别加入PE标记的NKR-P1B AND NKR-P1C，FITC标记的CD19抗体10μL，振荡混匀，室温、避光放置30min，用PBS洗涤2遍，再加入500μL的PBS混匀，10min后用流式细胞仪FACSCalibur检测NK细胞和B细胞的阳性表达率。
2.3统计学方法 用SPSS12.0软件包进行统计。
3结果 实验结果见表4。
表4松节总多糖对免疫低下小鼠外周血NK、B细胞的影响实验结果(x±SD)

注与模型对照组比较，*P＜0.05如表4所示，模型组的NK、B细胞标志物的表达低于空白组P＜0.05；给阳性药物和松节总多糖的小鼠NK细胞的表达提高，与模型组比较P＜0.05；B细胞的表达有所回升。说明松节总多糖能增强NK细胞活性。NK细胞是一种不需要特异性抗体参与或无需靶细胞上MHC I类或II类分子的表达即可杀伤靶细胞的淋巴细胞。近年来对其复杂而重要的生物学特性进行广泛深入的研究发现，NK细胞是机体免疫监视的主要细胞，它并非单纯的外向性自然防御细胞，而是体内多种细胞，特别是T、B淋巴细胞的调节细胞，不仅具有自发溶解某些肿瘤细胞和病毒感染的能力，而且还兼有重要的生理性免疫调节的作用。它也参与移植排斥反应和某些自身免疫疾病的发生，尤其是在抗肿瘤的免疫监视作用中处于第一道防线，受到人们的高度重视。目前国内外多采用检测NK细胞活性来研究不同疾病状态下NK细胞的杀伤功能，目前的检测方法主要有形态学方法、核素释放法、酶释放法、特异性荧光染料释放法和流式细胞术等。其中流式细胞术检测法最为精确。发明人使用流式细胞术检测了松节总多糖对免疫低下小鼠NK细胞活性的影响，实验研究表明松节总多糖可以有效拮抗环磷酰胺引起的小鼠NK细胞活性的下降，也说明松节总多糖调节免疫的作用可以通过提高NK细胞的活性来实现。
以上数据表明在淋巴细胞水平上松节总多糖同样具有较强的提高免疫功能的作用。
实施例19本实施例为松节总多糖对环磷酰胺治疗小鼠S180腹水型肿瘤的增效作用实验1材料动物昆明种小鼠，雄性。
瘤株小鼠肉瘤S180。
药品及试剂松节总多糖(按照上述实施例10所制得的松节总多糖)实验前配制成一定浓度的溶液备用。环磷酰胺(CY，批号06062721)实验前按比例配制成所需浓度大小的溶液备用。
2实验方法2.1用小鼠移植性肿瘤S180生长较好的瘤源，按每1ml瘤源加2ml生理盐水的比例将瘤源配制成细胞悬浮液备用。
2.2将瘤源配制成的细胞悬浮液按0.2ml/只的剂量接种至小鼠的腋窝皮下，接种后适应喂养一天。
2.3按每组12只动物分为7个组(1)阴性对照组(模型对照组)；(2)环磷酰胺组(CY对照组)药物按15mg/kg；(3)松节总多糖高剂量+环磷酰胺(CY)组药物按600mg/kg；(4)松节总多糖中剂量+环磷酰胺(CY)组药物按300mg/kg；(5)松节总多糖低剂量+环磷酰胺(CY)组药物按150mg/kg；(6)松节总多糖中剂量药物按300mg/kg；(7)松节总多糖注射给药组药物按40mg/kg。
2.4环磷酰胺隔日给药1次后每只按0.1ml注射给药；除注射给药组外，其余药物每天按0.2ml灌胃给药；连续给药10天后处死，称重，取瘤称重，观测小鼠的脏器管的变化。用统计学的方法处理数据。
3结果 实验结果见表5。
表5松节总多糖对小鼠S180的抑制作用(x±SD)

注与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01实验结果表明，松节总多糖对小鼠S180腹水型肿瘤表现出明显的抑制作用(P＜0.05)，并对环磷酰胺抗肿瘤作用有较大程度的增效作用。说明松节总多糖具有抗肿瘤及其辅助治疗的功能。
同时，发明人还以上述各实施例所得松节总多糖为试验药品进行了对小鼠体液免疫、外周血NK、B细胞的影响、以及对环磷酰胺治疗小鼠S180腹水型肿瘤的增效作用等试验考察，试验结果表明，在所给试验药品中多糖的量达到有效剂量的基础上，各实施例所得松节总多糖均可不同程度的提高免疫底下小鼠的体液免疫功能、增强小鼠NK细胞活性、并对环磷酰胺抗肿瘤具有增效作用。说明松节总多糖可以作为提高免疫或抗肿瘤或肿瘤辅助治疗药物使用。
权利要求
1.松节总多糖，其单糖组成主要是D-半乳糖和L-阿拉伯糖。
2.根据权利要求1所述的松节总多糖，其特征于所述的单糖组成中，D-半乳糖和L-阿拉伯糖的质量比为10～25∶1。
3.根据权利要求2所述的松节总多糖，其特征于所述的单糖组成还有L-鼠李糖和/或D-木糖。
4.根据权利要求1所述的松节总多糖，其特征于所述的松节总多糖的重均分子量为10000～100000。
5.一种权利要求1所述的松节总多糖的制备方法，包括下述步骤(1)、水提将松节原料粉碎成松节粗颗粒，加3～15倍量的水煎煮提取1～6小时，提取2～5次，提取液经粗滤后合并滤液，浓缩至比重为1.01～1.25的浸膏；(2)、醇沉在(1)步水提得到的浸膏中加入90～100％的乙醇，调至醇浓度为50～85％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀；(3)、干燥将(2)步最后得到的沉淀低温减压干燥或用五氧化二磷减压干燥，即得主要含上述松节总多糖的物质。
6.根据权利要求5所述的松节总多糖的制备方法，其特征在于将所述的(2)步醇沉后得到的沉淀再继续进行1～4次醇沉处理；然后再进行(3)步所述的干燥步骤。
7.根据权利要求6所述的松节总多糖的制备方法，其特征在于在所述的任意一次醇沉处理后进行脱色处理。
8.根据权利要求5所述的松节总多糖的制备方法，其特征在于将所述的(2)步醇沉后得到的沉淀进行过柱处理，再进行(3)步所述的干燥步骤，即将(2)醇沉后得到的沉淀加水溶解成1～10％的水溶液，上DEAE-纤维素柱或弱极性大孔树脂柱，DEAE-纤维素柱用0.1～1mol/L氯化钠水溶液洗脱，大孔树脂柱用纯水洗脱，收集苯酚-硫酸法显色阳性部分的洗脱液，浓缩后用90～100％的乙醇调至醇浓度为60～85％，静置或冷藏8小时以上，离心或滤过，取沉淀；然后再进行(3)步所述的干燥步骤。
9.根据权利要求5或6所述的松节总多糖的制备方法，其特征在于在进行(3)步干燥处理前，先将(2)步醇沉、或多次醇沉处理后最终得到的沉淀进行低温减压干燥，再用95％乙醇、无水乙醇、丙酮中的任意一种溶剂除去可溶性杂质；然后再取沉淀进行(3)步所述的干燥处理。
10.一种权利要求1所述的松节总多糖的用途，用于制备提高机体免疫功能或抗肿瘤及其辅助治疗的药物，其特征在于将含有临床有效量的所述的松节总多糖制成药剂学上可以接受的任意一种剂型的药物。
全文摘要
本发明公开了一种松节总多糖，其单糖组成主要是D－半乳糖和L－阿拉伯糖。该松节总多糖具有良好的增强机体免疫功能和抗肿瘤作用，并对环磷酰胺等抗肿瘤药物具有增效作用。不仅为免疫功能低下者及肿瘤患者提供了一种新的治疗途径，而且也对丰富的松节资源提供了一种新的应用途径。本发明还公开了上述松节总多糖的制备方法和用途。
文档编号A61P37/00GK101037481SQ20071004894
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者米军, 夏隆江, 闫光华 申请人:成都南山药业有限公司