专利名称：带有血管生长因子基因药物pUDKH的血管支架的制作方法
技术领域：
本申请属于生物工程技术领域。本发明涉及一种用介入法治 疗血管狭窄和血管栓塞所用的携带pUDKH基因药物的血管内支架。本
法明还涉及pUDKH在制备治疗或预防血管再狭窄或再栓塞的药物或
血管支架中的用途
背景技术：
血管狭窄和血管栓塞是临床常见的闭塞性血管病。由于人们饮食 结构的不合理，以及工作节奏的加快、世界老龄化程度的加剧，冠心 病、动脉硬化、糖尿病的发病率逐年提高，这些疾病都会导致高发病 率的血管狭窄和血管栓塞，而血管狭窄和血管栓塞会导致局部组织的 供血障碍。当发生在肢体部位时，因为局部缺乏营养物质的供^f吏组 织变色、溃疡、甚至坏死；当发生在心脏部位时，因为心肌缺血导致 心绞痛、甚至心脏摔死。
为治疗血管狭窄和血管栓塞，1977年人们进行了首例人体冠脉球 嚢扩张术(PTCA),其后的临床实践发现，PTCA术后6个月内易发生再 狭窄(restenosis, RS )，且RS发生率高达3(T/。 60。/。，因为球嚢扩张虽 然可以很好地扩充血管，但是球嚢扩张后血管会自动回缩，再加上组 织的不断修复，原来扩开的血管又会变得狭窄。金属棵支架 (bare-metal stents BMS)植入术作为PTCA的补充于1987年开始应用 于临床，用支架扩张狭窄或栓塞的血管，支架留在血管里面可以很好 地防止回缩。但术后113发生率仍高达20%~30%[1]，究其原因，人们认 为主要是由于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ， VSMC)和细胞外基质的增殖导致血管内膜增厚、管腔狭窄[2'3]。于是临 床应用了以抑制VSMC的迁移和增殖为目的的药物洗脱支架 (drug-eluting stents, DES )， 所用药物主要有以紫杉醇 (paclitaxel)为^表的抗肿瘤药物和以雷帕霉素(rapampyin)为 代表的免疫抑制剂。但随着DES的广泛应用，其缺陷也逐渐为人们所 认识。①与使用BMS相比，使用该类DES可以延迟血管的愈合，从而形 成更多的后期血栓"'51,而后期血栓比血管再狭窄具有更严重的预后
效果。该类DES在抑制平滑肌细胞迁移、增生的同时，对内皮细胞 (endothelial cells, EC)的增殖也有抑制作用。经过大量的试一验 和临床实践，人们认识到，EC功能及完整性的恢复是避免支架植入后 血管再狭窄与再栓塞的有效途径[6]。②为减少血栓的形成，植入该类 DES后， 一般^f吏用抗血小板凝集药物氯吡格雷或阿司匹林3到6个月， 甚至更长时间"1，在这期间，如果患者因其他疾病需要手术治疗时， 会有出血危险；③该类DES可能导致侧枝血管形成功能的降低，晚期 栓塞发生时，正常侧枝血管的保护功能被损伤，使局部缺血程度加剧 和死亡率增高[7，8，91。
Michael, joner等人的报导中(参见Journal of the American College of Cardiology,第48巻，第1期，2006，第193-202页)， 披露了来自一位38岁的女性患者的带支架的动脉组织学切片照片。 死亡前6个月，她的左侧前降支近端放置了一个3. 0x12mm的紫杉醇 支架。患者术后口服波力维和阿司匹林，但因严重胸痛于当地医院急 诊科就诊，然后很快因室颤而死亡。根据上述文献报导披露的带支架 的动脉切片图片及其文字说明，可以看出，植入支架的动脉管腔被大 量的血小板血栓(Th)完全阻塞。支架区域没有愈合，被纤维蛋白包 围。支架安置在血管分枝口。高倍镜下支架的D切片(Movat)和E 切片(HE)显示，纤维蛋白包围支架，无平滑肌细胞、内皮细胞和炎 症细胞。
为克服以上DES及BMS的诸多缺陷，人们对支架疗法进行了多方面 改进。如Neil Swanson将涂有聚合物的支架浸渍于VEGF溶液中制备 VEGF药物支架，并用该支架培养人脐静脉EC，发现支架培养的EC数量 比对照组增加11%[1°；Eric Van Belle将新西兰大白兔的髂外动脉内 皮损伤后植入BMS,然后局部给予VEGF溶液，发现与对照组相比，VEGF 组可加速血管内皮化、显著降低植入支架部位的内膜增生[11]; Eric VanBelle还将新西兰大白兔的髂外动脉内皮层损伤后才JL^BMS，立即 通过球嚢导入phVEGFw (编码有人血管内皮生长因子的质粒DNA)凝 胶，与对照组相比，phVEGF"5组可加速支架的内皮化，减少血管内膜 的增生，没有形成血栓[12]; Dirk H. Walter制得质粒phVEGF -2基因 药物支架，发现它可加速损伤血管的内皮化、预防血管的再狭窄[13]。 此外，人们将人自体的EC或体外培养的EC种植在支架上，治疗冠状动 脉和周围血管的狭窄和栓塞，支架因接近正常生理血管而避免了内膜 增生和形成血栓t14'15'16] ; Vishwanath Bhattacharya将CD34+骨髓细
胞种植在支架上，CD34+细胞可分化为EC，从而促进血管的愈合，该 试验还观察到种植细胞的支架组与对照组相比，新内膜上形成的微血 管显箸增加[17] 。 JiroAoki将CD34抗体包被支架，利用抗原抗体结合 的原理，支架在体内能捕捉血液中的内皮祖细胞(EPCs),并使其附 着在支架上，EPCs快速分化为血管内皮细胞，在临床应用时，支架内 无血栓形成，局部炎症反应明显P争低，抗凝血药氯吡格雷的应用时间 缩短为1个月[18'19]。
虽然与单独使用棵支架相比，以上方案均可加速血管的内皮化、 降低血栓的发生率，但还存在一些问题，如VEGF有导致水肿的副作用； 将EC种植在支架上，EC的来源问题不易解决、EC容易脱落、且制备工 艺复杂、不易大规模生产；CD34抗体包被支架，其预防支架内再狭 窄的效果并非理想，可能是因为支架包被的是抗体，病人外周血中 EPCs的数量少和活性低，不能很快形成内皮层；抗体的性质不稳定， 在用Y射线灭菌时活性损失等。
为治疗血管狭窄和血管栓塞，目前临床常用的药物洗脱支架所携 带的药物主要是抑制平滑肌细胞增生的药物，如雷帕霉素、紫杉醇等， 该类药物在抑制平滑肌细胞迁移、增生的同时，对内皮细胞 (endothelial cells, EC)的增殖也会有4中制4卡用
内皮细胞与内膜增殖支架植入血管后不可避免地会造成血管内 皮的损伤，导致血管内皮细胞功能紊乱，使得N0、肝素和前列环素等 抑制平滑肌增殖因子分泌减少，而促SMC增殖的血管活性物质增多， 并且内皮对SMC的接触抑制丧失，进一步促进SMC增殖、迁移并分泌 大量细胞外基质，形成过度增生的新生内膜。
内皮细胞与栓塞内皮细胞在血管腔的表面形成一个抗凝血和抗 血栓系统，维持血液在血管中的正常流动。尤其是内皮细胞可以分泌 N0、前列环素(PGI)等活性物质，可有效防止血栓形成。因此，内 皮细胞的剥脱、损伤和功能紊乱势必在支架植入术后再栓塞的形成过 程中起重要作用。
人们进行了多方面的尝试和努力，发现EC完整性的破坏及功能紊 乱与支架植入后血管再狭窄与再栓塞有着密切的关系，提出将促使EC 功能及完整性的恢复作为预防再狭窄的新策略。
在以往促进支架部位血管内皮化的研究中，人们或将EC种植在支 架上、或将CD34抗体包被支架以捕捉血液中的内皮祖细胞(EPCs ), 或制备血管内皮生长因子(VEGF)支架，或在植入支架后，局部给予重
组人血管内皮生长因子(rhVEGF)溶液。与单独使用棵支架相比，以 上方案均可加速血管的内皮化、降低血栓的发生率、降低血管的狭窄 程度，但还存在一些问题，如将EC种植在支架上，EC容易脱落、且支 架不易大规模生产；CD34抗体包被支架，其预防支架内再狭窄的效果 并非理想，作者i^为可能与支架制备过程特别是灭菌过^i中药物的活 性降低有关，本发明人认为还可能与在抗体的有效期内流经支架部位 并被捕捉的EPC s数量有限有关。
血管狭窄和血管栓塞出现临床症状时，常常已经造成了与之有关 的局部组织的供血障碍，所以在解决血管狭窄和血管栓塞的同时，应 考虑侧枝循环的重建。
pUDKH是由本发明人研制完成的 一种携带人肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor, HGF)的表达质粒，是一种血管生长因 子基因药物，有关该质粒的发明公开于2004年5月19日授权公告的中 国专利中，专利号为ZL00132196.X。在上述专利中，所述质粒用于治 疗缺血性疾病，包括月支体梗塞性血管病、冠状动力永梗塞性血管病和脑 动脉梗塞性血管病。尽管在上述专利中提及了所述质粒在治疗缺血性 梗塞疾病中的用途，但是其中没有任何有关该质粒用于治疗或预防血 管再狭窄和再栓塞方面的用途。
发明内容
本发明的目的在于利用pUDKH基因，制备药物洗脱支架，通过其 对血管狭窄和血管再栓塞的治疗或预防作用，制备临床上可应用的 pUDKH基因药物血管支架。
本发明中的血管支架的用途为治疗和/或预防血管狭窄或血管栓 塞，目的是预防球嚢扩张后特别是放置支架后血管的再狭窄和再栓 塞。
本发明的血管支架的作用机理具体如下球嚢扩张瓦故置支架导 致内膜撕裂，内皮细胞剥脱，内皮下胶原及纤维暴露，激活血小板， 产生黏附、聚集反应，释放多种生长因子(单核细胞趋化因子、凝附 分子、血管内皮生长因子等)和血管活性物质，导致血管腔内附壁血 栓形成；球嚢扩张及放置支架损伤动脉壁，促进内皮剥脱、斑块破裂 及活化血小板内皮释放丝裂原。单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、多 形核白细胞聚集在动脉损失部位；来自血小板、炎性细胞、内皮细胞、 平滑肌细胞的血小板衍生生长因子(PDGF) ， a成纤维细胞生长因子(aFGF) ， b成纤维细胞生长因子(bFGF)等化学因子和生长因子诱导平 滑肌细胞增殖，从中膜迁移人内膜，使大量基质成分沉积，平滑肌表 现型从收缩型转向合成型，形成新生内膜，导致血管再狭窄。pUDKH 是由本发明人研制完成的一种携带人肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)的表达质粒，是一种血管生长因子基因药物。 本发明中的用药机理主要是促进损伤血管内皮的结构和功能恢复，从 而预防球嚢扩张后特别是放置支架后血管的再狭窄和再栓塞。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案
一方面，本发明提供一种带有药物膜的血管内支架，它是在介入 疗法治疗血管狭窄和血管栓塞所用的血管内支架的外表面粘固有含 pUDKH基因的药物层。
在本发明优选的方案中，药物层包裹在血管内支架的外表面。
根据需要，本发明所述的带有药物膜的血管内支架的药物层中可 以含有辅料透明质酸钠、右旋糖酐、海藻酸盐、甘露醇、EDTA、磷酸 緩沖盐、壳聚糖等其中一种或多种成分。
更优选的是，为了在输送入目的血管的过程中防止药物被血液冲 洗流失，本发明所述的带有药物膜的血管内支架在药物层的外层涂有 隔离层。所述隔离层的组成可以是聚乳酸、乳酸一乙醇酸共聚物、PHA、 交联海藻酸盐、PEG等其中一种或多种成分。
另一方面，本发明还提供一种pUDKH基因在制备治疗或预防血管 再狭窄或再栓塞药物中的用途。
另一方面，本发明还提供一种pUDKH基因在制备治疗或预防血管 再狭窄或再栓塞的生物支架中的用途。
本发明中的给药形式是应用介入技术，结合球嚢扩张或支架用 药，药物可以以液体形式、胶体形式、涂布在支架表面的固体形式等。
肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)通过与特异 性膜受体c-met结合而发挥多种生物学作用，它是一生理性生长因子， 相对安全；HGF是强有力的血管内皮细胞的致有丝分裂原，而且对内 皮细胞有抗凋亡和营养作用，但对血管平滑肌细胞无作用，不会加重 血管狭窄；与血管内皮生长因子(VEGF)相比较，有其自身的特点 (1) HGF对内皮细胞的分裂活性较VEGF强，故HGF促进血管内皮化的 作用较强，促进血管生成的活性较强；(2) HGF不会有VEGF的副作用， 其I/IIa期临床试验中没观察到水肿的发生，但VEGFI/11a期临床试验 中有6 0%的患者发生中度或严重的水肿。
质粒DNA是一种比较安全的非病毒载体，无病人特异性、不引起 炎症反应；棵露质粒表达时间相对短暂，对全身的毒副作用小，更为 安全。
使用本发明的血管支架，不仅保持了 HGF的上述诸多优势，而且 克服了 HGF分子量较大(8(K90KDa)，在溶液状态的稳定性低，容易 形成聚集体，其纯化工艺复杂，且半衰期较短的缺陷，这些都给临床 治疗带来很大不便。故本发明人选择pUDKH作为涂布支架的药物，将 支架植入后，pUDKH逐渐释放，促进损伤的血管内皮化，降低血管的 再狭窄与再栓塞的发病率，同时可形成新生血管，促进侧枝循环的建 立，两个方面共同发挥作用，改善缺血区的血液供应。
图1为犬的左侧锁骨下动&財莫型处理 图2为正常犬的下肢动脉
图3显示栓塞处理后的骶正中动脉，仅保留供应尾部的血管 图4为犬的双侧股动脉形成狭窄，箭头所示为狭窄处 图5显示植入pUDKH支架的组织切片，箭头所示为新生血管 图6为才直入金属棵支架(bare-metal stents BMS)的组织切片
具体实施例方式
实施例l: pUDKH支架的制备
1)磷酸盐緩冲液(PBS)的配制
取磷酸二氩钠、磷酸氢二钠、EDTA、蒸馏水适量，配制成浓度为 2 0 mM、含EDTA 0.1 mM、 pH值7. 5的PBS。
2 ) pUDKH药物薄膜的制备
将pUDKH溶解于上述PBS中，使其浓度为2 mg/ml;取1 mlpUDKH 溶液于合适大小的表面皿中，加入1.5mg甘露醇、1.2mg透明质酸钠，
混合均匀，冷冻干燥成膜。
3 ) PLGA溶液的配制
以二氯曱烷为溶剂，将分子量为l万的PLGA ( 50:50 )配制成6 %的溶液。
4 ) pUDKH支架的制备
将pUDKH药物薄膜包裹于金属棵支架外侧，浸于PLGA溶液中，取 出，自然干燥。
实施例2:植入pUDKH基因药物支架的体内效果试验
1 、 试验动物
采用家犬(雄性，体重2 2 . 0 - 2 4 . 0 kg )进行本试^r。手术操作 在常规全身麻醉和灭菌条件下进行，动物造模术后至处死期间，给予 阿司匹林肠溶片(50mg /日)。造模手术后及腔内造影术后给予抗感 染药物(阿莫西林胶嚢，0.5g/次，2次/日，连续5天)，腔内造影 前静脉注射肝素2G mg。
2 、造模的过程
选择犬的股动脉作为支架的放置部位，因为犬的股动脉部位表浅，易 于制作血管狭窄或闭塞模型；其内径约为6mm,易于进行介入操作； 其分支血管少，便于观察侧枝循环形成以及再狭窄情况。采取锁骨下 动脉或颈总动脉作为介入的通路。见图1。
利用犬后肢的大隐静脉血管环包于犬股动脉，形成血管狭窄^t型。 之所以利用大隐静脉血管环包股动脉，是由于静脉血管壁有弹性，术 后仍可用介入技术重新开通血管，与临床植入支架的情况接近。犬下 肢的血供主要来源于髂股动脉，同时骶正中动脉不仅供应犬尾部而且 其侧枝血管供应犬下肢内侧的部分肌肉。为减少侧枝血管的影响，釆 用腔内栓塞技术或者外科结扎技术进行处理。腔内造影证实造模成 功。正常犬的下肢动脉、栓塞处理后的骶正中动脉和血管狭窄模型分 别见图2、图3和图4。
3、 支架植入
在造模后一周，在血管狭窄处植入BMS或pUDKH基因药物支架。
4、 结果分析
支架植入后一个月，常规全身麻醉动物，取出植入BMS和pUDKH基因 药物支架的血管，发现植入BMS的血管容易与周围组织分离，而植入 pUDKH基因药物支架的血管不容易与周围组织分离。取下支架，将血 管行HE染色，显微镜下观察病理切片，pUDKH洗脱支架可见到典型 的细小血管形成并呈扩张状态，同时未观察到任何水肿现象(见图5 )， 棵支架未见到新生血管(见图6)。
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权利要求
1.一种带有药物膜的血管内支架，其特征在于它是在介入疗法治疗血管狭窄和血管栓塞所用的血管内支架的外表面粘固有含pUDKH的药物层。
2、 根据权利要求1所述的带有药物膜的血管内支架，其特征在 于药物层包裹在血管内支架的外表面。
3、 根据权利要求1所述的带有药物膜的血管内支架，其特征在 于药物层中含有辅料透明质酸钠、右旋糖酐、海藻酸盐、甘露醇、EDTA 、 磷酸緩冲盐、壳聚糖中的一种或多种成分。
4、 根据权利要求1所述的带有药物膜的血管内支架，其特征在 于为防止支架在输送入目的血管的过程中药物#1血液冲洗流失，在药 物层的外层涂有隔离层。
5、 根据权利要求4所述的带有药物膜的血管内支架，其隔离层 的组成是聚乳酸、乳酸一乙醇酸共聚物、PHA、交联海藻酸盐、PEG 等其中一种或多种成分。
6、 pUDKH在制备治疗或预防血管再狭窄或再栓塞的药物中的用途。
7、 pUDKH在制备治疗或预防血管再狭窄或再栓塞的生物支架中 的用途。
全文摘要
本发明公开了一种带有血管生长因子基因药物pUDKH的血管支架，它涉及用介入法治疗血管狭窄和血管栓塞所用的血管内支架。它是在介入疗法治疗血管狭窄和血管栓塞所用的血管支架(1)的外表面粘固有含pUDKH基因的药物层(2)。该支架在置入目的血管后，药物层(2)中的药物pUDKH基因释放于血管内壁，其表达产物刺激血管内皮细胞的迁移与增殖，促进损伤血管的内皮化；同时促进周围新生血管的形成，以治疗血管狭窄和血管栓塞病症，降低介入治疗后的血管再狭窄和血管再栓塞的发病率，改善支架周围组织的血液供应。
文档编号A61L31/08GK101366983SQ20071012030
公开日2009年2月18日 申请日期2007年8月15日 优先权日2007年8月15日
发明者吴祖泽, 张宏鹏, 毕建进, 王秀冬, 王立生 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所