专利名称：：自体大肠癌疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种肿瘤疫苗，具体为一种自体大肠癌疫苗的制备方法。
背景技术：
：树突状细胞(dendriticcell,DC)是由美国学者setinman和cohn于20世纪70年代首次报道，因其成熟细胞具有许多树突样突起而得名。DC是体内专职抗原递呈细胞(APC,antigenpresentingcell)在T细胞免疫应答中发挥重要作用。T细胞介质的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中起主导地位，而其致敏、激活、扩增需要APC呈递抗原特异性抗原并提供T细胞活化的共刺激信号。其它APC如巨嗜细胞、B细胞等仅刺激已活化或记忆T性细胞，不能诱导初始免疫应答，而DC除了摄取、加工、呈递特异性抗原激活T细胞外，是唯一能剌激初始T细胞增殖、诱导初次免疫应答的APC，是机体免疫的启动者，被称为免疫治疗的天然佐剂。对DC的研究不仅有助于阐明机体免疫应答的调控机制，也对认识肿瘤、移植排斥反应、感染、自身免疫的发生机制并制定有效的防治措施具有重要意义。人的DC广泛分布于除脑组织之外的全身各组织和器官，但数量极少，在外周血中的含量不到1%，体外存货能力仅数日，限制了对它的研究。90年代后，DC在体外培养获得成功，使其逐渐成为免疫学研究热点，免疫学者针对DC来源，形成及功能进行广泛而深入的研究，为临床多种疾病的免疫治疗提供新的思路和策略。一、DC主要由骨髓中髓样干细胞分化而来，与单核巨噬细胞有共同的前体细胞，这些髓系来源的DC称为髓样DC(myeloidDC,MDC)，这部分DC由淋巴样干细胞分化而来，与淋巴细胞有共同的前体细胞，此类淋巴来源的DC称为淋巴样DC(lymphoidDC,LDC)，目前对LDC的分化发育过程知之甚少，而对MDC的分化发育过程已逐渐清楚，大致分为四个阶段，(1)前体期，(2)未成熟期，(3)迁移期，(4)成熟期，各阶段DC其表型标志和功能都存在差别，多数骨髓来源的DC由骨髓进入外周血，再分布至全身各组织。人体周血中的含量不到1%，体外存货能力仅数日，限制其作为疫苗应用于临床，近年来，人们建立了多种体外诱导培养DC的方法。现举例如下，DC的体外诱导培养(O以外周血CD14+单核细胞诱导DC，(2)以CD34+造血祖细胞诱导DC,(3)其它来源的DC。影响DC发育的因素1、促进DC发育、成熟的因素；2、抑制DC发育、成熟的因素。二、以DC为基础的肿瘤免疫治疗，肿瘤逃避宿主免疫监视的可能原因是(1)大多数恶性肿瘤失去了活化淋巴细胞必需的共剌激分子(B7)和黏附分子(ICAM-1)，MHC-1类分子表达下调，导致T细胞不能活化，甚至发生免疫耐受和调亡；(2)荷瘤宿主APC受肿瘤组织分泌的血管内皮细胞生长因子(VEFG)和IL-10抑制，前者抑制DC成熟，后者抑制肿瘤局部浸润，下调DC多种免疫分子表达。研究晚期肿瘤患者与正常人MO-DC，发现患者DC表现IDC特征共刺激分子表达低、IL-12分泌低、刺激T细胞增殖能力弱、寿命短、摄取抗原能力较正常人DC弱。目前，调节荷瘤宿主APC功能，从而诱发或增强宿主对肿瘤的免疫反应，成为肿瘤特异性免疫治疗的重要措施。DC疫苗作为一种新的肿瘤疫苗，通过修饰改造患者APC，使其携带肿瘤特异性抗原以活化静息T细胞，产生特异性抗肿瘤效应，已经在动物和临床试验中取得较好效果。以DC为基础的免疫治疗，其机制如下1诱导产生大量效应T细胞，2趋化效应T细胞迁移至肿瘤部位，3维持效应T细胞长期存在于肿瘤部位，4抑制肿瘤血管生成。2.DC免疫治疗设计，DC免疫治疗主要有两类方案，一类是以提高免疫系统中DC对抗肿瘤抗原提呈能力为方向，另一类以增加机体组织DC数量为方向。具体方法如下，2.1肿瘤抗原致敏DC，DC的体外培养过程中，接触相应抗肿瘤抗原可被致敏，将这些功能正常且负载肿瘤抗原的DC输回体内，可诱导机体产生抗相关肿瘤抗原的免疫应答。2丄1合成抗原肽此类抗原结构与功能较为清楚，可被CTL识别。经合成肿瘤抗原肽体外致敏的DC在体内可激发针对表达相同抗原肿瘤细胞的特异性CTL。多家研究机构已开始进行合成抗原肽致敏DC并输回患者的临床试验，所用的合成抗原肽包括黑色素瘤相关抗原MARTI和MELANA，GPIOO，P53以及CEA等。2丄2细胞性肿瘤抗原以灭活肿瘤细胞体外致敏DC，或将肿瘤细胞与DC融合后回输体内，在体内可产生较强的抗肿瘤免疫效应。由于目前肿瘤特异性抗原较少，此法简便易行，无须分离鉴定肿瘤抗原，可由DC完成对抗原的识别、摄取、加工及提呈。因此，本方法对未确定特异性抗原的肿瘤进行DC主动性免疫治疗具有一定实际应用价值，此类技术文献以专利号9311260.8，97105061.9，00805910.1等为代表所报道。2丄3肿瘤抗原提取物以肿瘤抗原提取物致敏DC，可提高抗原决定族的有效浓度，增强CTL反应，实验中一次免疫即可检测到CTL。目前常用提取物包括，肿瘤细胞碎片、MRNA和洗脱肽(采用弱酸洗脱肿瘤细胞表面MHC-I类抗原肽致敏DC)。肿瘤细胞及其裂解物作为抗原致敏DC，简便易行，适于临床推广。此类技术以专利号02153446.2，00101792.9为代表。2丄4抗独特型抗体以抗独特型抗体为抗原进行免疫治疗，因免疫原性弱，疗效有效，与DC联用可提高疗效。曾有报道HSU以自身抗独特型抗体致敏DC治疗4例B淋巴瘤患者，所有患者均产生特异性抗肿瘤反应，l例肿瘤完全消失；2例肿瘤部分消失；l例临床症状缓解。2.2基因修饰的DC疫苗，将外源基因导入DC,以改变DC性能，从而提高DC的免疫活性，是以DC进行抗肿瘤的又一思路，该技术以专利申请号为200310107908.4为代表。2.2.1导入肿瘤相关抗原(TTA)基因DC经抗原致敏可有效地将抗原提呈给T细胞，将编码该蛋白的基因导入DC使其表达，也可激发特异性抗肿瘤免疫反应。转基因法致敏DC，与抗原肽或肿瘤细胞碎片致敏DC比较，有效递呈时间更长，且质粒DNA易于保存，操作。2.2.2导入细胞因子基因细胞因子使用具有安全性，广泛性，在DC呈递抗原过程中起重要作用，将编码细胞因子的基因导入DC对其进行基因修饰，可提高DC活性。由于CTL识别肿瘤蛋白具有MHC限制性，以TAA制备的DC疫苗应用受限，而细胞因子基因修饰DC，则可用于几乎所有肿瘤的治疗。2.3DC的直接应用，DC作为体内抗原提呈功能强大的细胞，体外扩增后回输到患者体内，以获得更多CTL(细胞毒T淋巴细胞)，此法可视为过继续免疫治疗。大多肿瘤组织浸润DC的数量与肿瘤患者预后直接相关，浸润DC多则预后好。DC肿瘤疫苗临床应用已取得令人鼓舞的结果，在治疗黑色素瘤、肾癌、胃肠道肿瘤方面取得显著疗效。在前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、内分泌肿瘤的治疗中也取得一定的疗效。尽管肿瘤DC疫苗在部分恶性肿瘤治疗中显示良好疗效，但也存在一些问题，比如如何获得足够数量的DC,DC诱导的最佳途径及成熟调控，使用肿瘤抗原肽、肿瘤细胞溶解物、肿瘤细胞RNA还是调亡肿瘤细胞，那种方式使DC发挥最佳抗原呈递功能，DC疫苗接种的剂量，次数及注入途径。DC疫苗接种后对机体免疫保护作用的持续时间，有效佐剂的配合应用，DC疫苗毒副作用的评价及解决方案，评价DC疫苗特异性免疫治疗效果的指标等。郑州大学学报(医学版)2007年3月20日第42巻第2期(总第161期)发表了大肠癌肿瘤抗原修饰的树突状细胞活性检测一文，文中提出了一种对大肠癌肿瘤自体疫苗的制备方法，思路是提取结肠癌症患者自身的DC，制备肿瘤抗原，然后用肿瘤抗原修饰DC，用最后用肿瘤抗原修饰DC来诱导淋巴细胞。最后经过淋巴细胞体外排斥杀伤肿瘤细胞实验得到以下效果的数据分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>该文献报道为DC在体内外的抗自体肿瘤免疫应答研究及临床应用提供了实验基础。但是还未经过临床试验证实，而且在对肿瘤杀伤效果上及制备方法中还存在一些不足的问题。
发明内容本发明为了解决现有技术中利用患者自身DC和大肠肿瘤抗原制备自体抗肿瘤疫苗存在的杀伤效果不理想的问题而提供了一种自体大肠癌疫苗的制备方法。本发明是由以下技术方案实现的，一种自体大肠癌疫苗的制备方法，包括以下步骤，1、DC体外诱导培养，取外周静脉血，经梯度密度离心获得单核细胞加GM-CSF100ng/mL，IL-410ng/mL，培养5d，再加TNF-a50ng/mL,LPS100ng/mL培养2d，获得成熟的DC，2、肿瘤抗原的制备，取自体大肠癌细胞，培养后用0.25°/。胰蛋白酶消化收集，在-80'C和37"C条件下反复冻融4次，得到肿瘤抗原备用，3、用制备好的肿瘤抗原在37'C,5%<:02饱和湿度条件下与制备好的DC混合培养24h，以获得自体大肠癌抗原修饰的DC。4、再将DC和淋巴细胞按照1:10-1000的数量比例混合在37。C，5%C02饱和湿度条件下共同培养2472h。与现有技术中最接近本发明的技术相比较，1、用来修饰树突状细胞DC的肿瘤抗原来源方面做了改进，现有技术中使用的肿瘤细胞购买于中科院上海细胞库，而本申请使用的是临床患者自体的肿瘤(大肠癌症)细胞，从而为临床实践应用治疗打下了坚实基础，2、体外诱导，扩增树突状细胞方法做了改进，原文献中采用将大肠癌患者外周单核细胞经GM-CSF100ng/mL，IL-410ng/mL诱导分化，而本申请再其基础上又增加了TNF-a50ng/mL，LPS100ng/mL继续培养2d，DC表型分析方面原文献中CDllc由2.38%上升到10.47%CD80由1.91°/。上升到3.20%HLA-DR由1.50%上升到7.41%本申请中，CD11C由2.38%上升到21.58%CD80由1.91%上升到7.56%HLA-DR由1.50%上升到18.64%另外加入了一种表型鉴定，CDla0.65。/。上升到37.18%DC数量的不同原文献中20ml外周血得到的DC2.0X1()6-2.5X106个本申请中20ml外周血得到的DC8.4X1()6个3、对大肠癌细胞杀伤率显著提高表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>总而言之，与现有技术相比，本发明变大肠癌株为自体大肠癌细胞，从而为临床应用及治疗提供了实验基础；从大肠癌症患者自体外周血单核细胞诱导分化出大量的DC，再体外经过自体大肠癌抗原修饰后回输到大肠癌症患者体内，临床观察到肿瘤縮小或消退，已经积累了部分病例。具体实施例方式实施例11、DC体外诱导培养取外周静脉血40ml，加40mlPBS稀释，吸管吸取20ml稀释后的血液，在淋巴细胞分离液上lcm处，沿离心管壁缓慢加到20ml淋巴分离液上，共四管。1500rpm离心30min毛细吸管小心吸取界面细胞，力口1/3量PBS混匀。1500rpm离心15min，弃上清，加红细胞裂解液5ml，混匀后静置10min。1000rpm离心5min，弃上清。沉淀物用2mlRPMI1640混匀，记细胞数和活细胞比例。800rpm离心5min，沉淀物与淋巴细胞培养液混合均匀，调浓度为2X106/ml。放置于培养瓶中，5%C02，37'C孵育箱中孵育2h，轻摇晃培养瓶，吸取悬浮细胞(淋巴细胞)用淋巴细胞完全培养液培养。粘附于培养瓶的贴壁细胞(主要是单核细胞)以5ml淋巴细胞完全培养液加GM-CSF100ng/ml，IL-410ng/ml，培养于5%C02，37-C孵育箱中，隔一天换一半培养液并补充细胞因子，5€1后再加，-a50ng/mL，LPS100ng/mL培养2d，获得成熟的DC，取细胞5乂106个，加入2mlPBS以1000rpm离心洗涤2次，沉淀物用PBS调节细胞浓度为lX106/ml，分别加入FITC标价的单克隆抗体(抗CD11C、抗CD80，抗HLA-DR，CDia)0.25ug/管，混合均匀，4。C冰箱中放置30min。2、肿瘤抗原的制备取自体大肠癌细胞2X1()S个，用0.25°/。的胰蛋白酶消化大肠癌细胞，HANK'S液收集细胞低速离心(800rpm，10min)，PBS悬重，调细胞浓度为6X106/ml。加入冻存管中，每管lml，-80^和371:条件下反复冻融4次，所得的细胞裂解液经5000rpm离心40min，取上清也体用PBS稀释至1ml，4(TC冻存。3、用制备好的肿瘤抗原在37"C，5。/。C02饱和湿度条件下与制备好的DC按照l:3的数量比例混合培养24h，以获得自体大肠癌抗原修饰的DC。4、再将DC和淋巴细胞按照1:101000'的数量比例混合在37。C，5%C02饱和湿度条件下共同培养2472h。在24孔板上按照DC和淋巴细胞比例分别为1:10，1:100，1:1000加入肿瘤抗原修饰后的DC和淋巴细胞，在37。C，5%C02饱和湿度条件下共同培养24h、48h、72h。实验组1以肿瘤抗原修饰的DC激发的淋巴细胞为效应细胞，实验组2以未诱导的淋巴细胞为效应细胞，其它实验方法为常规方法，具体实验结果见表l，其中在DC和淋巴细胞为1:IOO的数量比例，时间48h条件下淋巴细胞灭瘤活性最高。权利要求1、一种自体大肠癌疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤，(1)、DC体外诱导培养，取外周静脉血，经梯度密度离心获得单核细胞加GM-CSF100ng/mL，IL-410ng/mL，培养5d，再加TNF-α50ng/mL，LPS100ng/mL培养2d，获得成熟的DC，(2)、肿瘤抗原的制备，取自体大肠癌细胞，培养后用0.25％胰蛋白酶消化收集，在-80℃和37℃条件下反复冻融4次，得到肿瘤抗原备用，(3)、用制备好的肿瘤抗原在37℃，5％CO2饱和湿度条件下与制备好的DC混合培养24h，以获得自体大肠癌抗原修饰的DC，(4)、再将DC和淋巴细胞按照1∶10～1000的数量比例混合在37℃，5％CO2饱和湿度条件下共同培养24～72h。2、根据权利要求l所述的自体大肠癌疫苗的制备方法，其特征在于在步骤(4)中，DC和淋巴细胞为1:IOO的数量比例，培养时间48h。全文摘要本发明涉及一种肿瘤疫苗，具体为一种自体大肠癌疫苗的制备方法。解决了现有技术中利用患者自身DC和大肠肿瘤抗原制备自体抗肿瘤疫苗存在的杀伤效果不理想的问题。包括以下步骤，DC体外诱导培养，获得成熟的DC；取自体大肠癌细胞，得到肿瘤抗原备用；用制备好的肿瘤抗原和制备好的DC混合培养24h，以获得自体大肠癌抗原修饰的DC，再将DC和淋巴细胞按照1∶10～1000的数量比例混合培养。最后获得的自体大肠癌疫苗对大肠癌细胞杀伤率显著提高。文档编号A61K39/00GK101168053SQ20071013968公开日2008年4月30日申请日期2007年11月1日优先权日2007年11月1日发明者毅冯申请人:史增祥