专利名称：：常春藤皂苷元及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从维药瘤果黑种草籽中提取常春藤皂苷元及其制备方法和作为治疗糖尿病的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物用途。通过体外实验证实的提取的常春藤皂苷元所具有的蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)抑制剂的效果以及形成的抗糖尿病药物及保健品的用途。
背景技术：
：瘤果黑种草籽是毛莨科植物瘤果黑种草的干燥成熟种子，呈三棱状卵形，长2.5-3mm,宽约1.5mm。表面黑色，粗糙，顶端较狭而尖，下端稍钝，有不规则的突起。质坚硬，断面灰魄，有油性。气微香，味辛。可以刺激消化驱风止痛、补肾健脑、利尿、发汗、健胃、抗蠕虫、治疗哮喘等，是维吾尔医学中一种习惯用药。近年来，通过大量的试验研究出它的同属植物过黑种草籽在降脂、降糖方面具有一定功效。多年以来治疗糖尿病主要以控制空腹血糖作为治疗目标，治疗药物很长时间只有磺酰脲类和双胍类则通过增加外周组织对葡萄糖的利用而降血糖，两者对降低n型糖尿病人的空腹血糖均有较好的疗效。由于2型糖尿病的发生发展可由遗传和环境因素的相互作用等引起，其中，胰岛素信号转导障碍在发病机制中所起的重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶lB(ProteintyrosinephosphatasePTP1B)是胰岛素信号转导关键的负调控子。PTP1B是胞内PTP的代表，是第一个被鉴定并纯化出的哺乳动物蛋白酪氨酸磷酸酶，由435个氨基酸残基组成，分子量约50KD，蛋白酪氨酸磷酸酶1B在人体各组织细胞中普遍存在并表达，并通过使激活的胰岛素受体及胰岛素，底物(IRs-1)等去磷酸化失活而发挥生理功能。它可协调酪氨酸残基磷酸化和去磷酸化之间的平衡，阻止胰岛素信号转导。2型糖尿病和胰岛素抵抗患者体内特异的蛋白酪氨酸磷酸酶含量及活性均有所增加，当蛋白酪氨酸磷酸酶被剔除后，不仅胰岛素敏感性增高，而且糖尿病症状也有所改善。蛋白酪氨酸磷酸酶1B缺乏的小鼠与其野生型对照小鼠相比对胰岛素更敏感，血糖控制更好，缺乏的小鼠与其野生型对照小鼠相比对胰岛素更敏感，血糖控制更好，而且对饮食诱导的肥胖有更好的抵抗作用。因此，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的作用已成为一种新的治疗胰岛素抵抗(IR)、II型糖尿病和肥胖的方法。同时，蛋白酪氨酸磷酸酶1B的高表达可引起胰岛素抵抗和瘦素抵抗，它的过度表达可促使载脂蛋白B100(ApoB100)分泌增加，使血浆极低密度脂蛋白(VLDL)生成增多，从而导致脂代谢紊乱、2型糖尿病及肥胖。研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因敲除鼠不仅胰岛素敏感性增强，而且由于去除了蛋白酪氮酸磷酸酶1B对胰岛素和瘦素信号转导的抑制，使小鼠在高脂饮食条件下也不发生肥胖。为明确蛋白酪氨酸磷酸酶1B与脂代谢紊乱之间的关系，Klaman等对蛋白酪氨酸磷酸酶Nl基因敲除小鼠进行了研究，结果显示长期果糖喂养普通小鼠会导致了血浆极低密度脂蛋白升高，而果糖喂养PTPN1基因敲除小鼠中未见极低密度脂蛋白升高，提示蛋白酪氨酸磷酸酶1B有促进极低密度脂蛋白分泌的作用。Taghibiglou等在对携带人载脂蛋白B(ApoB100)但缺乏褐色脂肪组织的载脂蛋白B(ApoB)/褐色脂肪组织(BAT)缺陷小鼠和经果糖词养的仓鼠模型的研究中发现，肝极低密度脂蛋白一载脂蛋白B增多将导致胰岛素抵抗。有报道表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B可调控果糖诱导的糖尿病模型动物的脂蛋白谱，下调蛋白酪氨酸磷酸酶1B表达可抑制高碳水化合物诱导的胰岛素抵抗及与之相关的脂代谢紊乱。因此蛋白酪氨酸磷酸酶1B不仅胰岛素增敏剂的靶点之一，同时也可能是脂代谢紊乱的治疗靶点之一。鉴于瘤果黑种草籽具有降脂、降糖作用，本发明利用大孔树脂，从瘤果黑种草籽中提取了异常春藤皂苷元，利用理化常数、波谱数据及单晶x-衍射确定了它的结构，并在体外证实了其蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的作用。到目前为止，关于瘤果黑种草的研究仅限于郝海峰、刘玉明等先后从瘤果黑种草籽中分离得到了14个化合物，以及田泽等考察常春藤皂苷的抗肿瘤活性，但对其降脂降糖活性的研究尚未见报道。
发明内容本发明目的在于提供一种化合物常春藤皂苷元及其制备方法和用途，该化合物是从维药瘤果黑种草籽中采用脱脂、萃取及大孔树脂吸附的方法提取的常春藤皂苷元，利用理化常数、波谱数据及单晶X-衍射确定了它的结构，并在体外证实了其蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制剂的作用，以及它形成的抗糖尿病药物及保健品的用途，同时可作为该化合物或其衍生物的药物组合物的应用。本发明所述的一种从维药瘤果黑种草籽中采用脱脂、萃取及大孔树脂吸附的方法制备常春藤皂苷元，按下列步骤进行a、取干燥瘤果黑种草籽，用石油醚脱脂后，用95%、50%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓縮至浸膏状；b、按常规方法处理大孔树脂，将浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:3—1:30，用水，10—95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓縮，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用硅胶拌样，用旋转蒸发仪蒸除溶剂，干燥或直接液体上样，硅胶柱层析或凝胶色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱或甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得化合物常春藤皂苷元粗品；C、采用氯仿-甲醇重结晶，得化合物常春藤皂苷元，结构式为:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>含有常春藤皂苷元化合物或其衍生物的药物组合物。一种从维药瘤果黑种草籽中制备常春藤皂苷元的方法，按下列步骤进行a、取千燥瘤果黑种草籽，用石油醚脱脂后，用95%、50%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓縮至浸膏状；b、按常规方法处理大孔树脂，将浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:3—1:30，用水，10—95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓縮，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用硅胶拌样，用旋转蒸发仪蒸除溶剂，干燥或直接液体上样，硅胶柱层析或凝胶色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱或甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得化合物常春藤皂苷元粗品；c、采用氯仿-甲醇重结晶，得化合物常春藤皂苷元。一种从维药瘤果黑种草籽中制备常春藤皂苷元作为治疗糖尿病的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途。本发明所述的常春藤皂苷元及其制备方法和用途，经过对大鼠口服黑种草籽固态油12周，未发现对肝脏中主要的酶产生影响，同时，血液中的胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、淋巴细胞和血小板数目分别比对照降低了15.5，22，16.5，35和32%血细胞比容和血红蛋白水平上升了6.4和17.4%。用胃内管饲法给正常大鼠词喂黑种草籽石油醚提取物4周，石油醚提取物由于减少了25%的食物，因而体重短期减轻。在体内和体外试验中均未观察到植物的毒性且空腹血糖保持稳定。治疗4周后与对照组相比治疗组的大鼠空腹胰岛素和甘油三酯水平较低而HDL-胆固醇水平较高。通过Western杂交分析表明发现从各组动物中分离出来的肝细胞对胰岛素水平反应上升了。在体内石油醚部分通过增加激素受体的两种细胞内信号传导途径起到了胰岛素增敏剂的作用。按400mg/kg给链尿菌素(STZ)诱导的糖尿病仓鼠胃内管词法饲喂黑种草籽油6周，在诱导糖尿病之后，用胶原酶消化并收集分离的肝细胞已确定肝糖的产生。通过在一段时间内注射荧光素乳液，24小时后收集腹膜巨噬细胞以评价吞噬能力。治疗组血糖从治疗前的391+/-3.0mg/dl在第一、二、三、四周后减少到325+/-4.7，246+/_5.9:208+/-2.5和179+/-3.1mg/dl。在治疗组仓鼠中从糖异生作用前体来的肝糖产物明显减少提示着它的降糖效果部分源于减少了肝糖元的合成。另外，经黑种草籽油治疗后腹膜巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数明显上升，外周血中淋巴细胞数量增加。这表明其免疫保护作用是通过直接刺激巨噬细胞的吞噬活力或通过刺激淋巴细胞的活力来完成的。给雄性易于中风的自发性高血脂大鼠和Wistar大鼠按800mg/kg剂量口服黑种草籽油4周，可明显降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯的含量，同时，升高高密度脂蛋白含量。用STZ和烟酰胺诱导形成了糖尿病的大鼠为模型。给大鼠口服黑种草籽油4周，血糖明显减少，经酶连免疫和抗胰岛素单抗证明，胰岛素水平明显上升。经免疫组化染色可在胰岛中观察到大量的胰岛素阳性反应区，结果显示在2型糖尿病模型中，黑中草籽油有类似胰岛素的功能。图1为本发明免疫印迹方法分析过度表达蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B的CHO细胞中磷酸化AKT电i永图；其中++++为蛋白酪氨酸磷酸酶IB;-+++为胰岛素(16.7纳摩尔)；--+-为阳性对照(IO微摩尔)；——+中为常春藤皂苷(50微克/毫升)；p-AKT为磷酸化AKT;GADPH为3-磷酸甘油醛脱氢酶。具体实施方式实施例1取干燥瘤果黑种草籽10KG,用石油醚脱脂后，用95%、50%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓縮至浸膏状；按常规方法处理大孔树脂AB-8，浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:3，用水，10—95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓縮，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用硅胶拌样，用旋转蒸发仪蒸去溶剂，干燥，硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，合并流出液，硅胶薄层板层析检测，相同流份合并，得该化合物粗品；采用氯仿-甲醇重结晶，得该化合物常春藤皂苷元。实施例2取干燥瘤果黑种草籽IOKG，用石油醚脱脂后，用95%、50%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓縮至浸膏状；按常规方法处理大孔树脂AB-8，浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:30，用水、10—95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓縮，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用甲醇、水溶解，液体上样，甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得该化合物粗品；采用氯仿-甲醇重结晶，得该化合物常春藤皂苷元。实施例3取干燥瘤果黑种草籽IOKG，用石油醚脱脂后，用95%、50%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓縮至浸膏状；按常规方法处理大孔树脂AB-8，浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:15，用水，10—95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓缩，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用甲醇、水溶解，液体上样，甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得该化合物粗品；采用氯仿-甲醇重结晶，得该化合物常春藤皂苷元。实施例4常春藤皂苷元作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途的生物活性筛选筛选方法用对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)作为底物，以在阳性药物钒酸钠为对照，利用酶标仪进行蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂的高通量筛选，根据蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂水解对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)的磷酸基团而产生颜色反应来测定蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂的活性。酶反应体系组成如下缓冲液(50mMHEPES，pH7.3，100mM氯化钠，0.1%牛血清白蛋白和1mM二硫代苏糖醇)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)抑制剂融合蛋白，对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)特异抑制剂钒酸钠(100ug/mL)。反应体系混匀后在37'C放置30rnin，加入1M氢氧化钠终止反应，置比色仪上测定405波长条件下的吸收值(A)，测定结果减去本底值后计算酶活性。筛选结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结论:从实验结果表明，常春藤皂苷元具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的功效，其ICso为70uM。免疫印迹实验1)脂质体转染仓鼠卵巢癌细胞(CHO)在传代后在F12+10。/。胎牛血清(FBS)培养基中培养30h后，按照Lipofectamine2000TM使用说明书上的方法将携带全长-PTPlB基因的pJ3H质粒DNA与脂质体混合后转染进CHO细胞中，6小时后，除去含有脂质体的培养基换上F12+10%FBS培养基继续培养过夜；2)给第一步中处理好的细胞更换含有测试样品的F12+10%FBS培养基，3小时后加入适量的胰岛素刺激5min，收获细胞。在冰浴中，用细胞刮刮下细胞，收集细胞裂解液；3)电泳结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓縮胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从玻璃板上滑落下来。打开电转印夹，每侧垫上一^^用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与PVDF膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的膜应对电泳槽的正极。利用电转仪将SDS-PAGE上的蛋白质转移到膜上。条件400mAlh或280rnA，1.5-2h;4)封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。①洗转印膜室温漂洗3次xl0min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。取漂洗的转印膜，放入含5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4'C过夜。③用缓冲液，PH7.6室温漂洗3次xl0min;5)抗体杂交抗体表面主要采用间接法。①封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液，封口，4。C孵育过夜或室温(22-25°C)摇动孵育2h.②液洗膜3次xlOmin③加入二抗稀释液，室温lh，洗膜3xl0min);6)检测采用增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来:ECM显色剂配制按lmlH20加显色剂A、B各1滴，混匀。在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，约卜5分钟用，纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚平，并确定干的表面与胶片接触.将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟，冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时.冲洗胶片步骤先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。结果表明可以增加中细胞磷酸化AKT&^S，这使得常春藤皂苷元有可能通过PI3K/AKT途径刺激GLUT4转运，从而达到降低血糖的目的。结构鉴定常春藤皂苷元化合物为无色结晶，经LiebermannBurchard反应呈阳性，磷鉬酸显色为蓝色，，提示为一个三萜类皂苷化合物。从其氢谱看，可明显观察到在S0,92,0.97,1.03，1.08,1.09，1.24ppm处存在6个角甲基信号。在S5.50ppm处有一个烯氢信号应为齐墩果酸或乌索酸类三萜皂苷中C12双键质子的信号。从其"C谱上看S122.70，144.93、烯碳特征信号，以及S180.69羧基信号提示该化合物具有12-烯-28-齐墩果酸骨架。因^醒R中只有六个角甲基单峰信号，说明另一个角甲基被CH20H取代，因此，判定该化合物为一个齐墩果烯型三蔽并有一个羧基。与文献[KamiyaK，YoshiokaK，SaikiY，etal.TriterpenoidsanflavonoidsfromPaeonialactiflora[J].Phytochemistry，1997，44(1):141-144.和而Shao-hua，WUDa-gang，CHENYou-weiet.alChemicalconstituentsofPaeoniadelavayiChineseTraditionalandHerbalDrugs2005，36(5):648-65l]报道的hedaragenin的数据一致，故确定该化合物为常春藤皂苷元。'H(二甲基亚砜DMS0600HzSppm):0.92(3H,s)，0.97(3H,s)，1.03，(3H,s)，1.08(3H,s)1.09(3H,s),1.24(3H,S)5.50(lH,brs)，^C丽R(二甲基亚砜DMS0150HzSppm)数据归属如下:180.69(C-28)，144.93(C-13)，122.70(C—12)，73.52(C—3)，66.18(024)，48.73(C-5)，48.26(C-9)，46.75(C—19)，46.55(C-17)，42.99(C—4)，42.29(C-14)，42.11(C-18)，39.89(C-8)，38.89(C-l),37.33(C—10),33.32(C-21):31.44(C—7)，30.04(C-20)，28.44(C—15)，27.8(C-2)，26.26(027)，23.95(C-16)，23.85(C-30),23.79(C-11)，18.69(C-6),17.59(C-26):16.06(C-25)，13.22(C-23)。X-单晶衍射的结果也显示该化合物的结构为:权利要求1、一种从维药瘤果黑种草籽中采用脱脂、萃取及大孔树脂吸附的方法制备常春藤皂苷元，其特征在于按下列步骤进行a、取干燥瘤果黑种草籽，用石油醚脱脂后，用95％、50％乙醇依次提取，减压浓缩至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓缩至浸膏状；b、按常规方法处理大孔树脂，将浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1∶3-1∶30，用水，10-95％的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓缩，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95％的组分用硅胶拌样，用旋转蒸发仪蒸除溶剂，干燥或直接液体上样，硅胶柱层析或凝胶色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱或甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得化合物常春藤皂苷元粗品；c、采用氯仿-甲醇重结晶，得化合物常春藤皂苷元，结构式为2、根据权利要求1所述的化合物常春藤皂苷元，其特征在于该化合物或其衍生物的药物组合物。3、一种从维药瘤果黑种草籽中制备常春藤皂苷元的方法，其特征在于按下列步骤进行a、取干燥瘤果黑种草籽，用石油醚脱脂后，用30_90%乙醇依次提取，减压浓縮至无醇味的浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收正丁醇萃取液，减压浓缩至浸膏状；b、按常规方法处理大孔树脂，将浸膏用水溶解后，液体上样，上样量与树脂用量比例为1:3—1:30，用水，1(1一95%的乙醇依次洗脱大孔树脂柱，减压浓縮，利用薄层色谱合并成分近似的组分，70-95%的组分用硅胶拌样，用旋转蒸发仪蒸除溶剂，干燥或直接液体上样，硅胶柱层析或凝胶色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱或甲醇水洗脱，硅胶薄层板层析检测，合并相同流份，得化合物常春藤皂苷元粗品；c、采用氯仿-甲醇重结晶，得化合物常春藤皂苷元。4、一种从维药瘤果黑种草籽中提取的化合物常春藤皂苷元作为治疗糖尿病的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途。全文摘要本发明涉及一种常春藤皂苷元及其制备方法和用途，该化合物是从维药瘤果黑种草籽中采用脱脂、萃取及大孔树脂吸附的方法提取的常春藤皂苷元，利用理化常数、波谱数据及单晶X-衍射确定了它的结构，并在体外证实了提取的常春藤皂苷元具有蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制剂的作用，以及形成的抗糖尿病药物及保健品的用途，同时可作为该化合物或其衍生物的药物组合物的应用。文档编号A61P3/10GK101125880SQ20071014672公开日2008年2月20日申请日期2007年8月13日优先权日2007年8月13日发明者信学雷,阿吉艾克拜尔·艾萨申请人:中国科学院新疆理化技术研究所