专利名称：制备假叶树甾类糖苷衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及制备假叶树甾类糖苷衍生物(假叶树皂苷(ruscosaponins))的方法。
更具体来说，本发明涉及通过经由发酵途径水解假叶树糖苷(ruscoside)和/或去葡萄糖假叶树糖苷(desglucoruscoside)来制备去葡萄糖去鼠李糖假叶树素(desglucodesrhamnoruscin)。
去葡萄糖鼠李糖假叶树素(Desglucorhamnoruscin)和易于通过酸水解由去葡萄糖去鼠李糖假叶树素制得的相应游离糖苷配基、鲁斯可皂苷元(ruscogenin)和新鲁斯皂苷元(neoruscogenin)是具有抗炎和结缔保护活性的有价值药物活性成分。
然而，由假叶树糖苷或去葡萄糖假叶树糖苷化学制备所述活性成分是有难度的，这是因为其需要剧烈的条件，例如用强酸水解，和复杂的操作步骤，从而导致获得非常不均匀的中间体和产物混合物。
因此，非常需要提供能克服与已知化学方法有关的上述缺陷的制备去葡萄糖去鼠李糖假叶树素的方法。
本发明通过提供了制备去葡萄糖去鼠李糖假叶树素的方法而满足了这样的需求，所述方法包括通过使用黑曲霉(Aspergillusniger)真菌将含有假叶树甾类糖苷(假叶树皂苷)的底物发酵来水解所述糖苷。
一般使用肉汤培养物来作为营养复合底物。
发酵一般是在25-30℃、优选27℃，在搅拌以及换气以使pO2大于或等于50％的条件下进行的。
原料甾类糖苷的浓度一般为5-15％w/v、优选为8-10％w/v，和肉汤培养物的pH为4-6、优选为4.5-5.5。
本发明方法使得能在一个发酵步骤中进行整个反应顺序，因为用合适的微生物学技术选择的微生物能够表现出进行所有转化顺序反应(从起始的复合杂糖苷到单糖苷或最终的糖苷配基)所需的酶活性。所述水解酶转化实际上包括在处理期间依次释放的中间体上进行的β-葡糖苷酶、α-鼠李糖苷酶反应顺序。另外的α-阿拉伯糖苷酶反应使得能够获得游离糖苷配基(鲁斯可皂苷元)。
所述方法是全新的，因为在文献中没有发现任何制备所述产物的所述方法的应用实例。
适于进行所涉及转化的微生物是通过在合成或半合成培养基上选择而获得的，其中所述培养基中加入了欲转化的相同底物以补充或代替常规碳源(葡萄糖、蔗糖等)。对于这种情况，所述底物(假叶树糖苷、去葡萄糖假叶树糖苷)可以以较高浓度例如90-100g/L加入。琼脂化分离培养基包含微生物学常用制剂，例如麦芽琼脂(MaltAgar)和Czapek琼脂，或类似制剂，其中氮源代表物是胨、脲、硝酸铵等，而常规碳源(葡萄糖、蔗糖)已用假叶树糖苷或去葡萄糖假叶树糖苷替代或补充。所述培养基中还可加入钾、镁、锰、锌等的无机盐例如磷酸盐、硫酸盐和/或盐酸盐。分离培养基的pH可以为4-6、优选为4.5-5.5。
适于所需生物转化的微生物可通过标量稀释和平皿接种土壤、腐殖质、植物提取物或其它类似有机源样本的水悬浮液来收集。
在含有相同培养基的微生物试管中分离如上所述选择的微生物培养物，并用于假叶树糖苷和去葡萄糖假叶树糖苷的生物转化，其中假叶树糖苷和去葡萄糖假叶树糖苷以高浓度(高达100g/L)加到液体培养基中，所述液体培养基含有与在分离培养基中使用的氮源相同的氮源例如脲或胨，并加入了如上所述的磷酸盐和其它无机盐，其pH为4-6、优选4.5-5.5。
所述操作之后，已经发现所选的黑曲霉培养物能够依次通过β-葡糖苷酶和α-鼠李糖的酶促反应将假叶树糖苷和去葡萄糖假叶树糖苷转化成去葡萄糖去鼠李糖假叶树素—鲁斯可皂苷元的直接前体。
随后的α-阿拉伯糖苷酶反应能提供糖苷配基形式的皂甙(鲁斯可皂苷元-新鲁斯皂苷元)。
当在控制的(恒温)条件下，于25-30℃最佳温度下，在旋转震动器(200-300rpm)上搅拌下生长时，所选的培养物能进行所述转化。所述发酵还可以在合适的生物反应器中以不同规模水平进行，以工业生产所需的皂甙衍生物。
用于所述生物转化的微生物能稳定地维持催化活性，甚至对于重复发酵循环，在分批或连续加工中也是如此。
本发明提供了重要优点，例如较不复杂的分离和收集产物的步骤，和易于实施以及节约成本。
可将所选的微生物在富含低温保存剂例如甘油、胨等的悬浮液中于-80℃至-196℃(在液氮中)冷冻或进行冷冻干燥以长期贮存。
可使用下述分析方法，通过在肉汤培养物上进行TLC和HPLC分析来监测生物转化的进程TLC分析-硅胶板60 F250 Merck-展开剂A)乙酸乙酯-甲醇9∶1B)乙酸乙酯-甲醇-水100∶15∶10-检测与10％硫酸反应，并加热至120℃反应5分钟，然后进行可见和UV检测。HPLC分析-柱Supelcosil LC18，250×4.6mm，5μm-洗脱剂乙腈-水60∶40-波长200nm-进样体积10μl-流速1mL/分钟。
最终的生物转化产物例如去葡萄糖去鼠李糖假叶树素可这样回收用正丁醇提取肉汤培养物，然后用氯代溶剂(例如三氯乙烷)和硅胶色谱纯化。最后，可从不同溶剂例如异丙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇中结晶。除了主产物以外，可获得在C-2’被例如2-羟基-3-甲基戊酸酯化的去葡萄糖去鼠李糖假叶树素。
糖苷配基形式的皂甙(鲁斯可皂苷元)是通过将上述发酵产物酸水解而获得的。
下述实施例更详细地公开了本发明。
发酵是在溶解的氧百分比(pO2)基础上进行的，逐渐增加搅拌速度和空气流量以获得高于50％的pO2值。通过HPLC和TLC分析监测生物转化的进程。在+27℃培养5天后发酵完成。肉汤的TLC和HPLC分析表明，假叶树糖苷已经消失，而去葡萄糖去鼠李糖假叶树素作为主产物存在，并有微量鲁斯可皂苷元。
用正丁醇充分提取肉汤培养物。将丁醇提取物在+60℃真空浓缩至干，再溶于70％甲醇中，并用三氯乙烷反提取。将该氯化溶剂的溶液真空浓缩至固体。再溶于氯仿-甲醇混合物中后，通过柱色谱(Kieselgel，Merck)纯化产物，用乙酸乙酯-氯仿9∶1洗脱。通过TLC或HPLC检查洗脱级分。将纯化产物级分真空浓缩，然后再溶于丙酮中并结晶。从甲醇中进一步结晶，获得了约7g产物，经光谱分析鉴定为去葡萄糖去鼠李糖假叶树素。除了该主产物以外，还获得了少量的在C-2’被2-羟基-3-甲基戊酸酯化的去葡萄糖去鼠李糖假叶树素(约800mg)。
将上述发酵产物酸水解，获得了糖苷配基形式的皂甙(鲁斯可皂苷元)。
如实施例1所述处理这两个发酵循环的肉汤培养物，以提取和回收产物。在最后一个步骤结束时，获得了约14g去葡萄糖去鼠李糖假叶树素。
权利要求
1.制备去葡萄糖去鼠李糖假叶树素的方法，包括通过使用黑曲霉真菌将含有假叶树甾类糖苷(假叶树皂甙)的底物发酵来水解所述糖苷。
2.权利要求1的方法，其中所述底物是肉汤培养物。
3.权利要求2的方法，其中所述发酵是在25-30℃，在搅拌以及通入空气以使pO2大于或等于50％的条件下进行的。
4.权利要求3的方法，其中所述温度是27℃。
5.权利要求3的方法，其中所述甾类糖苷的起始浓度为5-15％w/v。
6.权利要求5的方法，其中所述浓度为8-10％w/v。
7.权利要求2-6任一项的方法，其中所述肉汤培养物的pH为4-6。
8.权利要求7的方法，其中所述肉汤培养物的pH为4.5-5.5。
全文摘要
制备去葡萄糖去鼠李糖假叶树素的方法,包括通过使用黑曲霉真菌将含有假叶树甾类糖苷(假叶树皂甙)的底物发酵来水解所述糖苷。
文档编号C12P33/20GK1353767SQ00808243
公开日2002年6月12日 申请日期2000年5月26日 优先权日1999年6月1日
发明者W·阿克阿迪, C·庞佐恩 申请人:因迪纳有限公司