降低蛋白质聚集的方法

专利名称：：降低蛋白质聚集的方法
技术领域：
：本领域涉及降低蛋白质聚集的方法，以及聚集水平降低的蛋白质制剂。
背景技术：
：人类基因组计划的完成，伴随着蛋白质分离和纯化方法改进的发展，使蛋白质制剂的大量生产得以实现。事实上，有百种以上的重组蛋白质处在I期或其后的临床试验阶段，有几十种得到了美国食品药品管理局的许可。确保蛋白质或肽以生物活性形式有效、安全递送的制剂，是当前和未来生物技术产品取得商业成功的关键。不幸的是，蛋白质具有独特的物理和化学性质，对配制和开发造成了挑战。最常见的蛋白质物理不稳定性是蛋白质聚集，和宏观上与其相当的沉淀。对于想要合成、加工、并以可能的最高浓度长时间储存蛋白质的生物技术和制药行业来说，蛋白质聚集的倾向是尤为棘手的问题。尽管促使蛋白质聚集的机制尚未完全了解，这样的最终结果是人们所不愿看到的。药物组合物中多肽聚集体的形成可对该多肽的生物活性造成不利影响，使得药物组合物的治疗效果降低。此外，聚集状态的蛋白质可致免疫，甚至可在体内造成急性中毒效应。另外，聚集体形成可在蛋白质制剂的给药过程中造成其他问题，比如堵塞注射器、管、膜或泵。因此，本领域中需要降低蛋白质聚集的方法，并需要开发呈现降低的聚集水平的蛋白质制剂。发明概述本申请涉及呈现聚集降低特性的蛋白质制剂，以及制备此类制剂的方法。一方面，本申请涉及通过在制剂中加入浓度约0.5mM到约145mM的曱硫氨酸，降低制剂中蛋白质聚集的方法。与除了没有甲硫氨酸外完全相同的制剂中相同蛋白质的聚集水平相比，所述方法降低制剂中蛋白质的聚集。在具体实施方案中，与除了没有甲硫氨酸外处于同样促进蛋白质聚集的条件下、完全相同制剂中的相同蛋白质的聚集水平相比，当制剂处于促进或有助于蛋白质聚集的条件下，在制剂中加入浓度约0.5mM到约145mM的甲硫氨酸的方法，降低制剂中蛋白质的聚集。在某些实施方案中，在制剂中加入曱硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约50mM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入曱硫氨酸的终浓度为0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在某些实施方案中，当蛋白质制剂处于导致蛋白质聚集的条件下时，在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM的方法，使得制剂中有最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%、或最多约0.5%高分子量(HMW)物质，高分子量(HMW)物质通过尺寸排阻色语-高效液相色语(SEC-HPLC),在制剂处于促进蛋白质聚集的条件下之后测量。在一些实施方案中，相对于没有甲硫氨酸的制剂，在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM的方法，延长了蛋白质制剂的保存期限。在其他实施方案中，相对于没有曱硫氨酸的制剂，在蛋白质制剂中加入曱硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM的方法保持了蛋白质制剂的效力。在某些实施方案中，相对于没有甲硫氨酸的制剂，在蛋白质制剂中加入曱石克氨酸至浓度约0.5mM到约145mM的方法(例如，约1mM到约145mM)降低蛋白质制剂的免疫原性。此方法对已知会聚集、或认为可能会聚集的蛋白质最有用，该可能性基于与会聚集的蛋白质之间的同源性，或基于表明聚集可能性的实验数据。在一个实施方案中，制剂中的蛋白质在储存过程中聚集。在一些实施方案中，制剂中的蛋白质由于剪切应力聚集。在其他实施方案中，制剂中的蛋白质由于温度升高聚集。在其他实施方案中，制剂中的蛋白质由于暴露于光下聚集。在另一些实施方案中，制剂中的蛋白质由于制剂中存在某些糖或表面活性剂而聚集。在处于、或可能处于这样的条件下的制剂中加入甲硫氨酸，有效降低聚集体形成，从而保持制剂中蛋白质的生物活性和效力。在一些实施方案中，制剂中蛋白质的聚集在向制剂中加入曱碌u氨酸之前测定。在其他实施方案中，制剂中蛋白质的聚集在向制剂中加入甲硫氨酸之后测定。在另一些实施方案中，制剂中蛋白质的聚集在向制剂中加入甲硫氨酸之前和之后测定。制剂中蛋白质的聚集可用本领域普通技术人员已知的任何方法测定，方法包括但不限于尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相-高效液相色谱(RP-HPLC)、紫外吸光率、沉降速度测量及这些方法的组合。在具体实施方案中，包含约1mM到约145mM甲硫氨酸的制剂中，高分子量物质的百分比(。/。HMW)与除了没有甲硫氨酸外完全相同制剂中的。/。HMW相比，降低了至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在其他具体实施方案中，包含约1mM到约145mM甲硫氨酸的制剂中，高分子量(HMW)物质最多约5。/。、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。无论有没有甲硫氨酸，制剂中蛋白质的聚集可在制剂制备后的任何时间测量。在某些实施方案中，在配制蛋白质一天之后、在1周到12周之间、或在配制目的蛋白质之后的1个月到36个月之间测量聚集。在一些实施方案中，制剂中的蛋白质为抗体、免疫球蛋白(Ig)融合蛋白、凝结因子、受体、配体、酶、转录因子，或任何这些蛋白质的生物活性片段。在具体实施方案中，蛋白质为抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、抗CD22抗体、PSGL-Ig融合蛋白、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII，或任何这些蛋白质的生物活性片段。在一些实施方案中，蛋白质在制剂中配制的浓度为约0.1mg/ml到约250mg/ml。在一些实施方案中，蛋白质在制剂中配制的浓度为约0.1mg/ml到约200mg/ml。在其他实施方案中，蛋白质在制剂中配制的浓度为约0.1mg/ml到约100mg/ml。在一些实施方案中，蛋白质在制剂中配制的浓度为约O.lmg/ml到约10mg/ml。在某些实施方案中，蛋白质配制为液体或冻干粉。在某些实施方案中，蛋白质制剂包含表面活性剂。在具体实施方案中，该表面活性剂为聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80。在某些其他实施方案中，蛋白质制剂不含表面活性剂。在某些实施方案中，蛋白质制剂包含张度调节剂。在具体实施方案中，张度调节剂为氯化钠、甘露醇或山梨醇。在某些其他实施方案中，蛋白质制剂包含糖。在具体实施方案中，糖为蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇。在某些其他实施方案中，蛋白质制剂不含糖。在一些实施方案中，制剂的pH在约5.0和约8.0之间。在一些其他实施方案中，制剂的pH在约5.8和约6.6之间。在其他实施方案中，蛋白质制剂进一步包含一种或多种降低制剂中的蛋白质聚集的试剂。在一些实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为氨基酸。在具体实施方案中，氨基酸为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在一些实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约1mM到约300mM。在一些其他实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约5mM到约150mM。在其他实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为金属螯合剂的组合。在具体实施方案中，金属螯合剂为DTPA、EGTA和DEF。在一些实施方案中，蛋白质制剂中DTPA或EGTA的浓度为约lpM到约5mM。在一些实施方案中，蛋白质制剂中DEF的浓度为约1HM到约10mM。在其他实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为自由基清除剂，特别是氧自由基的清除剂。在具体实施方案中，自由基清除剂为甘露醇或组氨酸。在一些实施方案中，蛋白质制剂中甘露醇的浓度为约0.01%到约25%。在一些实施方案中，蛋白质制剂中组氨酸的浓度为约100nM到约200mM。在其他实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为金属螯合剂和自由基清除剂的组合。在某些其他实施方案中，降低聚集的试剂为柠檬酸盐。在某些实施方案中，蛋白质制剂中柠檬酸盐的浓度为约0.5mM到约25mM。另一方面，本申请提供了通过向制剂中加入甲石充氨酸至浓度约0.5mM到约145mM,降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法，其中蛋白质不包含甲硫氨酸残基，或包含少于IO、9、8、7、6、5、4、3或2个甲硫氨酸残基。与除了没有甲硫氨酸外完全相同制剂中的同样蛋白质相比，该方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约50mM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度为0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在其他实施方案中，向蛋白质制剂中加入约0.5mM到约mM甲硫氨酸，其中蛋白质不包含甲硫氨酸残基，或包含少于IO、9、8、7、6、5、4、3或2个曱硫氨酸残基，此方法使得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0，5%。另一方面，本申请提供了降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法，其中聚集不由甲硫氨酸氧化引起。该方法包括向制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM。与除了没有甲硫氨酸外完全相同制剂中的同样蛋白质相比，该方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约50mM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入曱硫氨酸的终浓度为0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、lOmM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在其他实施方案中，在制剂中加入约0.5mM到约145mM甲硫氨酸的方法，使得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。又在另一方面，提供了降低包含表面活性剂的制剂中的蛋白质聚集的方法。在某些实施方案中，表面活性剂导致蛋白质聚集，该方法包括向制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM。与除了没有甲硫氨酸外完全相同制剂中的同样蛋白质相比，该方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约50mM之间。在其他实施方案中，在制剂中加入曱硫氨酸的终浓度为0.5mM、lmM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在具体实施方案中，向包含表面活性剂的制剂中加入约0.5mM到约145mM曱硫氨酸的方法，使得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。再一方面，在制剂中加入浓度约0.5mM到约145mM的曱硫氨酸的方法，降低受到剪切应力的蛋白质的聚集。该方法包括在制剂受到剪切应力之前、同时或之后加入甲疏氨酸。与除了没有甲硫氨酸外完全相同制剂中的同样蛋白质相比，该方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约SOmM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度为0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在一些实施方案中，剪切应力由搅拌、震动、冷冻-解冻、运输、吸入注射器或纯化过程导致。在具体实施方案中，向受到剪切应力的制剂中加入约0.5mM到约l45mM甲硫氨酸的方法，4吏得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。在另一方面，在制剂中加入浓度约0.5mM到约l45mM的曱硫氨酸的方法，降低暴露于光下的蛋白质的聚集。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约S0mM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度为0.5mM、lmM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在一些实施方案中，光为荧光。在其他实施方案中，光为日光。在另外的实施方案中，光为紫外光。该方法包括在制剂暴露于光下之前、同时或之后加入甲硫氨酸。在某些实施方案中，甲硫氨酸在制剂暴露于光下之前和同时，或之后加入。与除了没有曱硫氨酸外完全相同制剂中的同样蛋白质相比，在制剂中加入浓度约0.5mM到约145mM的曱硫氨酸的方法，使得制剂中的蛋白质聚集降低。在具体实施方案中，向暴露于光下的制剂中加入约0.5mM到约145mM曱硫氨酸的方法，使得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。另一方面，在制剂中加入浓度约0.5mM到约145mM的甲硫氨酸的方法，降低蛋白质制剂中蛋白质的效力或生物活性的丧失。此方法使得制剂中的蛋白质聚集降低，从而保持蛋白质的效力或功能性活动。在某些实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM和约50mM之间。在具体实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度为0.5mM、lmM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在具体实施方案中，向制剂中加入约0.5mM到约145mM曱硫氨酸的方法，使得制剂中的高分子量(HMW)物质为最多约5。/。、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%。又一方面，本申请提供了包含单个肽/多个肽、单个蛋白质/多个蛋白质，或单个肽/多个肽和单个蛋白质/多个蛋白质，以及约0.5mM到约50mM甲硫氨酸的蛋白质制剂。在具体实施方案中，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度为0.5mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM和45mM。在此方面的一些实施方案中，制剂中的蛋白质为抗体、Ig融合蛋白、凝血因子、受体、配体、酶、转录因子，或这些蛋白质的生物活性片段。在具体实施方案中，蛋白质为抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、抗CD22抗体、PSGL-Ig融合蛋白、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII，或这些蛋白质的生物活性片段。在其他实施方案中，蛋白质与抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、抗CD22抗体、PSGL-Ig融合蛋白、因子VHa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII或因子XIII之间具有至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，制剂中包含緩冲剂。在具体实施方案中，緩沖剂为组氨酸緩沖剂、柠檬酸盐緩沖剂、琥珀酸盐緩沖剂或Tris緩冲剂。在某些实施方案中，制剂的pH为约5.0到约8.0。在其他实施方案中，制剂的pH为约6.0到约7.5。在一些实施方案中，制剂包含能够降低蛋白质聚集的其他试剂。制剂可另外包含糖、表面活性剂、膨胀剂、抗冻剂、稳定剂、抗氧化剂，或这些的组合。在一些实施方案中，制剂中的肽(单个或多个)/蛋白质(单个或多个)在制剂中的浓度约为O.lmg/ml和约300mg/ml。在其他实施方案中，制剂中的肽(单个或多个)/蛋白质(单个或多个)在制剂中的浓度约为0.1mg/ml和约10mg/ml。在某些实施方案中，蛋白质配制为液体或冻干粉。在某些实施方案中，蛋白质制剂作为试剂盒提供。这样的试剂盒可包括緩沖剂、赋形剂和蛋白质制剂的使用说明。另一方面，本申请提供了使用本文所述的蛋白质制剂的治疗、预防和/或i貪断方法。附图的简短说明图la为在所示的pH水平、存在或不存在10mM甲硫氨酸(Met)和0.01%聚山梨醇酯-80(PS)的情况下配制的抗B7.2制剂中初始高分子量物质的百分比(。/oHMW)的柱形图。图lb为在所示的pH水平、存在或不存在10mM甲硫氨酸(Met)和0.01%聚山梨醇酯-80(PS)的情况下配制，在40。C储存6周之后，抗B7.2制剂中％HMW物质的柱形图。图lc为在所示的pH水平、存在或不存在10mM曱硫氨酸(Met)和0.01。/。聚山梨醇酯-80(PS)的情况下配制，在利。C储存i:2周之后，抗B7.2制剂中％HMW物质的柱形图。图2a为存在或不存在10mM曱硫氨酸(Met)和0.01%聚山梨醇酯-80(PS)的情况下，在柠檬酸盐、琥珀酸盐和组氨酸緩沖剂(在不同的pH范围)中配制的抗B7.1抗体制剂中初始。/。HMW物质的柱形图。图2b为在存在或不存在10mM甲疏氨酸(Met)和0.01%聚山梨醇酯-80(PS)的柠檬酸盐、琥珀酸盐和组氨酸緩冲剂(在不同的pH范围)中配制，在40'C储存12周之后，抗B7.1抗体制剂中。/。HMW物质的柱形图。图3a为在-80'C储存一个月到36个月之后，抗CD22抗体制剂中%HMW物质的柱形图。图3b为在25'C储存一个月到36个月之后，抗CD22抗体制剂中%HMW物质的柱形图。图4显示具有或没有曱硫氨酸的情况下配制，在-80。C、25'C和40°C储存达4周之后，PSGL-Ig蛋白质制剂中的。/。HMW物质。图5为在存在(S-1和S-2)或不存在(C)甲硫氨酸的情况下，受到剪切应力的PSGL-Ig蛋白质制剂中的％HMW物质的柱形图。图6为在具有或没有甲硫氨酸的组氨酸或琥珀酸盐緩冲剂中配制的REFACTO⑧在暴露于光照和黑暗条件下一个月之后的效力的柱形图。图7为rhIL-ll氧化和多聚化之间相关性的示意图。图8提供抗B7.1抗体轻链和重链的氨基酸序列。预测的分子内二石克键通过连接相关的半胱氨酸残基显示。预期形成分子间二硫键的半胱氨酸下加了下划线，并显示其连接。降低效应功能的Fc部分的两个改变的残基被框起。N连接糖基化的共有序列位点以粗斜体表示。图9提供抗B7.2抗体轻链和重链的氨基酸序列。预测的分子内二硫键以连接相关的半胱氨酸残基显示。预期形成分子间二硫键的半胱氨酸加下划线，并显示其连接。降低效应功能的Fc部分的两个改变的残基被框起。N连接糖基化的共有序列位点以粗斜体表示。图10提供抗CD22抗体重链和轻链的氨基酸序列。下划线标出的序列为信号序列，互补决定区以加粗体字母表示。N连接糖基化的潜在位点以下划线示出。图11提供REFACTC^的氨基紗列(参见SandbergH.等，StructuralandFunctionalCharacterizationofB画DomainDeletedRecombinantFactorVIII，SewiViflM,Vi好e附flto/^y，第38期，第2巻，增刊4，第4-12页，2001年4月)。发明详述生物技术近来的进展提供了大量生物活性蛋白质制剂用于诊断和治疗。然而，这样的蛋白质制剂的开发、生产、递送、安全性和稳定性构成极大的挑战。蛋白质制剂的一个主要问题在于，由于可溶或不可溶的聚集体的形成，蛋白质制剂会失去其生物活性。聚集是蛋白质的降解状态，因此，将聚集最小化使得蛋白质制剂的保存期限延长，效力或活性提高。本申请基本涉及这样的发现，即相对于制备中不加入曱硫氨酸的蛋白质制剂，在蛋白质制剂中加入氨基酸甲硫氨酸至终浓度在约0.5mM和约145mM之间，能降低制剂中的蛋白质聚集，从而延长保存期限并保持制剂的生物活性。影响蛋白质聚集的因素蛋白质具有广泛的制药、生物技术和研究用途。在任何这些用途的不同阶段，蛋白质均可能聚集。"聚集，，指蛋白质分子之间的物理作用，致使形成共价或非共价二聚物或低聚物，其可能仍旧为可溶的，或形成从溶液中沉淀出去的不可溶聚集体。此处使用的术语"蛋白质"，包含肽、多肽、蛋白质和融合蛋白。蛋白质可通过重组或合成方法制备。许多不同因素可导致蛋白质制剂中的蛋白质的聚集。典型的纯化和储存过程可使蛋白质制剂暴露于可导致蛋白质聚集的条件和成分。例如，蛋白质制剂中的蛋白质可由于以下原因的任意一种或多种而聚集储存、暴露于升高的温度、制剂的pH、制剂的离子强度、存在某些表面活性剂(例如，聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80)和乳化剂。此处使用的术语"在储存过程中"，指制剂制备后不马上使用；而是在制备后以液体形式、冷冻状态、或之后用于重构成为液体形式或其他形式的干燥形式进行包装储存。"升高的温度"指高于蛋白质通常储存的温度的任何温度。同样，蛋白质可在受到剪切应力时聚集，比如，在溶液中重构冻干的蛋白质粕、过滤纯化蛋白质样品、冷冻-解冻、震动或通过注射器转移蛋白质溶液。聚集还可由于溶液中多肽分子的相互作用，发生在储存瓶中的液体-气体界面处。由于运输中的搅拌，在界面压缩或扩张过程中，吸附到气体-液体和固体-液体界面的多肽可发生构象变化。这样的搅拌可导致制剂中的蛋白质聚集，并最终与其他吸附的蛋白质一同沉淀。此外，蛋白质制剂暴露于光可导致蛋白质聚集。暴露于光可产生促进聚集的活性物质。在一些实施方案中，光为荧光。在其他实施方案中，光为日光。在其他实施方案中，光为紫外光。而且，蛋白质制剂的包装可影响蛋白质聚集。痕量级的金属(ppm水平的铜、铁、钴、锰)可浸出容器包装，促进酰胺键的水解，最终导致蛋白质聚集。本申请提供通过控制一种或多种上述聚集机制，降低蛋白质聚集的方法和组合物。这可以，例如，改善产物稳定性，提高制备过程和储存条件的灵活性。降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法本申请基本涉及在制剂中加入氨基酸甲疏氨酸可降低制剂中的蛋白质聚集的发现。相对于除了没有甲硫氨酸外的完全相同制剂而言，聚集降低。为降低聚集，在制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约0.5mM到约l45mM之间。本申请中使用时，"约，，指所述值±25%范围的数值。在一些实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约0.5mM到约10mM之间。在其他实施方案中，加入甲疏氨酸至终浓度为约0.5mM到约15mM之间。在一些实施方案中，加入甲石充氨酸至终浓度为约2.5mM到约10mM之间。在一些实施方案中，加入甲石危氨酸至终浓度为约2.5mM到约15mM之间。在其他实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约5mM到约15mM之间。在一些实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约5mM到约25mM之间。在一些其他实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约0.5mM到约25mM之间。在某些实施方案中，加入曱硫氨酸至终浓度为约0.5mM到约50mM之间。在其他实施方案中，加入曱硫氨酸至终浓度为约50mM到约100mM之间。在某些其他实施方案中，加入曱硫氨酸至终浓度为约100mM到约145mM之间。在另一些实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约100mM到约140mM之间。再另一些实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约100mM到约135mM之间。在另一些实施方案中，加入甲硫氨酸至终浓度为约lOOmM到约125mM之间。在其他实施方案中，加入甲石危氨酸至终浓度为约5mM到约50mM之间。在一些实施方案中，加入曱硫氨酸至终浓度为约5mM到约25mM之间。在具体实施方案中，在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸至终浓度约为0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM或约50mM。无论是什么原因导致制剂中的蛋白质聚集，加入甲硫氨酸均可降低制剂中的蛋白质的聚集。在某些实施方案中，制剂中加入甲硫氨酸降低由于储存、暴露于升高的温度、暴露于光、受到剪切应力、表面活性剂的存在、pH和离子条件、及这些的任意组合引起的聚集。上述说明的方法可用于降低以液体或干燥形式配制的蛋白质的聚集。在液体制剂中观察到了聚集的降低，无论其是直接以该种形式储存以备之后使用，以冷冻形态储存并在使用前解冻，还是以干燥形式比如冻干、风干、或喷雾千燥形式制备，用于以后在使用之前重构为液体形式或其他形式。制剂中蛋白质聚集的水平可在向制剂中加入甲硫氨酸之前、大体上同时、或之后测定。在某些实施方案中，在向制剂中加入甲硫氨酸后的约1天到约12周之间至少测定一次聚集水平。在其他实施方案中，在向制剂中加入甲硫氨酸之后的约1个月和约36个月之间至少测定一次聚集水平。在某些实施方案中，与没有甲硫氨酸的制剂相比，此处说明的方法使得%HMW物质降低约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%或约卯％。在具体实施方案中，在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸至约1mM到约145mM之间的方法，使得制剂中含有最多约5%、最多约4%、最多约3%、最多约2%、最多约1%或最多约0.5%HMW物质。在其他具体实施方案中，在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸至约lmM到约145mM之间的方法，使得制剂中含有约5%、约4%、约3%、约2%、约1。/。或约0.5。/。HMW物质。在其他实施方案中，在蛋白质制剂中加入曱硫氨酸至约1mM到约145mM之间的方法，使得制剂中含有的HMW物质在约0.5%和约5%之间。蛋白质制剂可进一步含有一种或多种降低制剂中的蛋白质聚集的试剂。在一些实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为氨基酸。在具体实施方案中，氨基酸为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在一些实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约0.5mM到约200mM。在一些实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约5mM到约IOOmM。在一些其他实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约5mM到约125mM。在某些其他实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约0.5mM到约50mM。在另一些实施方案中，蛋白质制剂中加入氨基酸的浓度为约0.5mM到约25mM。降低制剂中的蛋白质聚集的试剂还可为金属螯合剂的组合。在具体实施方案中，金属螯合剂为DTPA、EGTA和DEF。在一些实施方案中，蛋白质制剂中DTPA或EGTA的浓度为约1HM到约10mM、约ljiM到约5mM、约10fiM到约10mM、约50nM到约5mM或约75jiM到约2.5mM。在一些实施方案中，蛋白质制剂中DEF的浓度为约1jiM到约10mM、约1pM到约5mM、约10pM到约1mM或约20^M到约250jiM。降低制剂中的蛋白质聚集的试剂还可为自由基清除剂，特别是氧自由基清除剂。在具体实施方案中，自由基清除剂为甘露醇或組氨酸。在一些实施方案中，蛋白质制剂中甘露醇的浓度为约0.01%到约25%、约0.1%到约25%、约0.5%到约15%或约1%到约5%。在一些实施方案中，蛋白质制剂中组氨酸的浓度为约10nM到约200mM、约100nM到约200mM、约500jiM到约100mM或约15mM到约35mM。在其他实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为金属螯合剂和自由基清除剂的組合。在一些实施方案中，降低制剂中的蛋白质聚集的试剂为柠檬酸盐。在某些实施方案中，蛋白质制剂中柠檬酸盐的浓度为约0.5mM到约50mM、约0.5mM到约25mM、约1mM到约35mM、约5mM到约25mM或约5mM到约10mM。评估蛋白质聚集水平的方法可用许多不同的分析方法检测蛋白质制剂中聚集体的存在和水平。这些包括但不限于，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、尺寸排阻色谱(SEC)、分析超速离心(AUC)、场流分级法(FFF)、光散射检测、沉降速度、紫外光语法、差示扫描热量分析法、透射比浊法、散射比浊法、显微镜检、尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相-高效液相色谱(RP-HPLC)、电喷雾电离串联质谱(ESI-MS)和串联RP-HPLC/ESI-MS。这些方法可单独或组合使用。蛋白质制剂的一个普遍问题是聚集体随时间、热或剪切应力不可逆的积聚。通常，聚集体沉淀时形成容易检测的大颗粒。然而，较小的、非共价可溶聚集体，常常是沉淀大颗粒的前体，则较难检测和定量。因此，检测和定量蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法，需基于^皮评估的聚集体的种类。在上述方法之中，建议用于测定蛋白质制剂中可溶的、共价聚集体的存在和/或数量的方法为SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF和AUC。建议用于测定蛋白质制剂中可溶的、非共价聚集体的存在和/或数量的方法为SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC和动态光散射。建议用于测定蛋白质制剂中不可溶的、非共价聚集体的存在和/或数量的方法为紫外光语法、透射比浊法、散射比浊法、显微镜检、AUC和动态光散射。蛋白质任何易聚集的蛋白质，包括抗体、免疫球蛋白融合蛋白、凝结因子、受体、配体、酶、转录因子，或其生物活性片段，均可为本申请的方法和组合物所保护。得到或制备蛋白质的来源或方法(例如，无论是用适当的純化方法从细胞或组织来源分离、用重组DNA技术制备或用标准肽合成技术化学合成)对本申请所教导的方法而言无关紧要。因此，本申请的方法和组合物可防止大量各种天然、合成和/或重组蛋白质，包括嵌合和/或融合蛋白的聚集。欲配制的目的蛋白质包括但不限于，例如，PSGL-Ig;GPIb-Ig;GPIIbIIIa-Ig;IL-13R-Ig;IL-21R-Ig;因子VIIa;因子VIII;因子VIIIC;因子IX;因子X;因子XI;因子XII;因子XIII;组织因子；冯维勒布兰德氏因子；抗凝因子如蛋白质C;心房钠尿因子；肌肉生长抑制素/GDF-8;白细胞介素(IL),例如，IL-1到IL-15;人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；尿酸酶；尿胰蛋白质酶抑制剂(bikunin);胆红素氧化酶；枯草杆菌蛋白酶；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；前胰岛素；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子，如尿激酶或组织型纤溶酶原活化因子(t-PA);bombazine;凝血酶；纤溶酶，小纤溶酶；微纤溶酶；肿瘤坏死因子-a和-p;脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T细胞表达分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-l-a);血清白蛋白，如人血清白蛋白；副中肾管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin);鼠促性腺激素相关肽；DNA酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF);胎盘生长因子(P1GF);激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D;类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-p;血小板衍生生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)，如TGF腸a和TGF-P,包括TGF誦pi、TGF-|32、TGF-卩3、TGF隱p4或TGF-卩5;胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);截短型IGF-I(des(l-3)-IGF-I)(脑IGF-I);胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD2、CD3、CD4、CD8、CD9、CD19、CD20、CD22、CD28、CD34和CD45;促红细胞生成素(EPO);血小板生成素(TPO);骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素，如千扰素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF;超氧化物歧化酶；T细胞受体；HER受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1、VLA-4、ICAM-1和VCAM;IgE;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；衰变加速因子(DAF);病毒抗原，如，HIVgag、env、pol、tat或rev蛋白；归巢受体；地址素；免疫粘合素；以及任意上列多肽的生物活性片段或变体。术语"生物活性片段，，指蛋白质的片段，该片段保留了从其衍生的蛋白质的至少一项功能。抗体的生物活性片段包括抗体的抗原结合片段；受体的生物活性片段包括仍可结合其配体的受体片段；配体的生物活性片段包括仍可结合其受体的配体部分；酶的生物活性片段包括酶这样的部分，该部分仍可催化由全长的,化的反应。在某些实施方案中，生物活性片段保留了至少约25%、50%、70%、75%、80%、85%、90%或95%从其4汙生的蛋白质的功能。蛋白质功能可由众所周知的方法测定(例如，测试抗体-抗原相互作用、测试配体-受体相互作用、测试酶活性、测试转录活性或测试DNA-蛋白质相互作用)。在某些实施方案中，要配制的蛋白质为抗体。可以针对任意的上述蛋白质产生抗体并与之结合。在某些具体实施方案中，抗体包括抗B7.1抗体、抗Bi:2抗体、抗CD22抗体、抗肌肉生长抑制素抗体(例如，美国申请号60/752,660)、抗IL-ll抗体、抗IL-12抗体(例如，美国申请号60/752,660)和抗IL-13抗体(例如，美国申请号60/752,660)。在其他具体实施方案中，抗体包括这样的抗体，其与抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、抗CD22抗体、抗肌肉生长抑制素抗体(例如，美国申请号60/752,660)、抗IL-11抗体、抗IL-12抗体(例如，美国申请号60/752，660)或抗IL-13抗体(例如，美国申请号60/752，660)之间的氨基酸序列同一性至少为约85%、至少约卯％、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%,并保留了与其相应抗原结合的能力。两个蛋白质之间的氨基酸序列同一性可根据标准方法测定(参见，例如，Pearson和Lipman，A^/.Jc^/.Sc/.亜2444画2448，19985George，D.G.等，MacromolecularSequencingandSynthesis,SelectedMethodsandApplications,第127-149页，AlanR.Liss，Inc.1988;Feng和Doolittle，/orwa/o/^:351-360,1987;Higgins和Sharp,C4丑JOS15:151-153，1989;以及美国马里兰州百萨达国家医学图书馆国家卫生研究院(NCBI，NLM，Bethesda，MD)的多种BLAST程序)。此处使用的术语"抗体"，包括多克隆抗体、单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双体或其他抗体和重组抗体的纯化制剂。抗体可为例如，能够与目的抗原结合的，任何同种型(IgG、IgA、IgE、IgM等)的整个抗体，或其片段。在某些实施方案中，配制的抗体为具有IgG同种型的抗体。重组抗体包括，但不限于，同时包含人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体为其中不同部分由不同动物物种衍生而来的分子，如可变区衍生自鼠单克隆抗体，并具有人免疫球蛋白恒定区。单链抗体具有抗原结合位点，由单个多肽组成。多特异性抗体为具有至少两个抗原结合位点、其与不同抗原特异性结合的抗体分子。抗体可用传统技术片段化，并篩选与目的抗原结合的片段。优选地，抗体片段包含完整抗体的抗原结合区和/或可变区。因此，术语抗体片段包括能够选择性结合某些蛋白质的、经蛋白水解切割或重组制备的抗体分子部分的区段。这样的蛋白水解和/或重组片段的非限制性例子包括Fab、F(ab，)2、Fab，、Fd、Fv、dAb、分离的CDR、以及含有通过肽接头相连的VL和/或VH结构域的单链抗体(scFv)。单链抗体(scFv)可为共价或非共价连接而形成具有两个或多个结合位点的抗体。在一些实施方案中，抗体为人源化单克隆抗体。此处使用的术语"人源化单克隆抗体"，为来自非人来源(受体)的单克隆抗体，其经改变而含有与其对等的人单克隆抗体(供体)中具有的至少一个或多个氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个非人物种的互补决定区(CDR),和人免疫球蛋白分子的框架区。"完全人源化单克隆抗体，，为来自非人来源的单克隆抗体，经改变而含有与其对等的人单克隆抗体的抗原结合区中所有的氨基酸残基。人源化抗体还可包含在受体抗体或供体抗体中均不具有的残基。可进行这些修饰来进一步改善和优化抗体的功能性。人源化抗体还可任选地包含至少一部分人免疫球蛋白恒定区(Fc)。在一些实施方案中，要配制的蛋白质为融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白为免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。Ig融合蛋白为包含非Ig部分的蛋白质，所述非Ig部分与由免疫球蛋白的恒定区衍生而来的Ig部分相连。在具体实施方案中，融合蛋白包含IgG重链恒定区。在另一实施方案中，融合蛋白包含相应于人免疫球蛋白C/1的绞链区、CH2和CH3区的氨基酸序列。Ig融合蛋白的非限制性例子包括PSGL-Ig(见美国专利号5，827，8n)、GPIb-Ig(见WO02/063003)、GPIIbIIIa-Ig、IL-13R-Ig(见美国专利号6,268,480)、TNFR-Ig(见WO04/008100)、IL-21R-Ig、CTLA4-Ig和VCAM2D-IgG。制备融合蛋白的方法在本领域中众所周知(例如，美国专利号5,516,964;5,225,538;5,428,130;5,514,582;5,714,147;6，136，310;6,887,471;和6,482,409)。在一些实施方案中，制剂中的蛋白质包括与PSGL-Ig(见美国专利号5,827,817)、GPIb画Ig(见WO02/063003)、GPIIbIIIa國Ig、IL-13R-Ig(见美国专利号6,268,480)、TNFR-Ig(见WO04/008100)、IL-21R關Ig、CTLA4-Ig和VCAM2D画IgG的氨基酸序列同一性为至少约85%、至少约卯％、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的融合蛋白，以及保留了与它们相应的配体结合的能力的融合蛋白。根据对具体疾病或病症治疗和诊断的需要，制剂可包含不止一种蛋白质。选择额外的蛋白质是由于它们对制剂中的其他蛋白质有补充活性，不会对制剂中其他蛋白质有负面影响。此外，蛋白质制剂还可包含对于蛋白质制剂的最终用途有益的非蛋白质物质。例如，可加入蔗糖以提高溶液中蛋白质的稳定性和溶解度；可加入组氨酸以提供适当的緩沖容量。在某些实施方案中，要配制的蛋白质为基本纯的和/或基本均质的(也就是，基本没有污染蛋白质等)。术语"基本纯的"蛋白质指组合物中包含蛋白质级分按重量计至少约90%，优选蛋白质级分按重量计至少约95%。术语"基本均质的"蛋白质指除去溶液中各种稳定剂和水的质量，組合物中包含蛋白质级分按重量计至少约99%。要配制的蛋白质还可与细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子缀合。在一个实施方案中，缀合的蛋白质为抗体或其片段。细胞毒素或细胞毒剂包括任何对细胞有害的物质。非限制性例子包括，卡奇霉素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐才Mo丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括，但不限于，抗代谢物(例如，曱氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、和5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如，双氯乙基曱胺、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二氨合柏(II)(DDP)即顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D、博莱霉素、光辉霉素和安曲霉素)，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。将这样的部分与蛋白质缀合的技术在本领域中众所周知。制剂决定制剂的组成是基于对包括、但不限于以下几个因素的考虑蛋白质的性质(例如，受体、抗体、Ig融合蛋白、酶等)；蛋白质的浓度；期望的pH范围；蛋白质制剂的储存方式；蛋白质制剂储存的时间；以及是否和如何向患者给药蛋白质制剂。辦W尹的蛋冷灰求產制剂中的蛋白质的浓度取决于蛋白质制剂的最终用途。此处说明的制剂中的蛋白质浓度通常在约0.5mg/ml和约300mg/ml之间，例如，在约0.5mg/ml和约25mg/ml之间、在约5mg/ml和约25mg/ml之间、在约10mg/ml和约100mg/ml之间、在约25mg/ml和约100mg/ml之间、在约50mg/ml和约100mg/ml之间、在约75mg/ml和约100mg/ml之间、在约100mg/ml和约200mg/ml之间、在约125mg/ml和约200mg/ml之间、在约150mg/ml和约200mg/ml之间、在约200mg/ml和约300mg/ml之间、以及在约250mg/ml和约300mg/ml之间。蛋白质制剂可用于治疗目的。因此，制剂中的蛋白质的浓度的确定，是基于被患者所耐受、并具有治疗价值的剂量和体积提供蛋白质。如果蛋白质制剂通过小体积的注射给药，则蛋白质浓度将取决于注射体积(通常1.0-1.2mL)。基于蛋白质的治疗通常需要每周、每个月或每几个月数mg/kg的剂量。因此，如果务农患者体重以2-3mg/kg提供蛋白质，一名普通患者体重75kg,则需要以1.0-1.2mL的注射体积递送150-225mg蛋白质，或需要加大体积以适应较低的蛋白质浓度。凝，此处使用的术语"緩冲剂"，包括那些将溶液pH保持在所需范围的试剂。此处说明的制剂的pH通常在在约pH5.0到约9.0之间，例如，约pH5.5到约6.5、约pH5.5到约6.0、约pH6.0到约6,5、pH5.5、pH6.0或pH6.5。通常，使用可将溶液保持在pH5.5到6.5的緩冲剂。可用于此处说明的制剂的緩冲剂的非限制性例子包括组氨酸、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、tris(氨丁三醇)、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、马来酸、磷酸盐、柠檬酸盐、2-吗啉乙磺酸(MES)、磷酸钠、醋酸钠和二甲胂酸盐。组氨酸是通过皮下、肌肉内或腹膜注射给药的制剂所优选的緩冲剂。緩冲剂的浓度在约5mM和约30mM之间。在一个实施方案中，制剂的緩沖剂是浓度约5mM到约20mM的组氨酸。除了蛋白质、甲硫氨酸和緩沖剂之外，此处说明的制剂还可包含其他物质。这些物质包括，但不限于，抗冻剂、冻干保护剂、表面活性剂、膨胀剂、抗氧化剂和稳定剂。在一个实施方案中，此处说明的蛋白质制剂包括赋形剂，其选自由抗冻剂、冻干保护剂、表面活性剂、膨胀剂、抗氧化剂、稳定剂、及这些的组合所组成的组。此处使用的术语"抗冻剂"，包括通过优选将应力排除在蛋白质表面之外、对抗冷冻引起的应力而提供蛋白质稳定性的试剂。抗冻剂还可在初次和二次干燥及产品长期储存的过程中提供保护。抗冻剂的非限制性例子包括糖，如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖和乳糖；聚合物，如右旋糖肝、羟乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80);以及氨基酸，如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和丝氨酸。通常使用在生物系统中毒性低的抗冻剂。制剂中如果包含抗冻剂，加入的终浓度在约1%和约10%(重量/体积)之间。在一个实施方案中，抗冻剂为蔗糖，浓度在约0.5%和约10%(重量/体积)之间。在一个实施方案中，此处说明的制剂中加入了冻干保护剂。此处使用的术语"冻干保护剂"，包括在冷冻-干燥或脱水过程(初次和二次冷冻-干燥循环)中提供蛋白质稳定性的试剂，此功能通过提供无定形的玻璃状基质，和通过以氢键与蛋白质结合、取代在干燥过程中除去的水分子实现。这样可帮助保持蛋白质构象，在冻干循环中最小化蛋白质降解，并改善产物的长期稳定性。冻干保护剂的非限制性例子包括糖，如蔗糖或海藻糖；氨基酸，如谷氨酸单钠、非晶性甘氨酸或组氨酸；曱胺，如甜菜碱；感胶离子盐，如^^酸镁；多元醇，如三元醇或高糖醇，例如，甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；普流罗尼类；及这些的组合。当蛋白质制剂被冻干时，加入制剂的冻干保护剂的量通常为，不会导致不能接受的蛋白质降解/聚集的量。在冻干保护剂为糖(如蔗糖或海藻糖)，蛋白质为抗体的情况下，蛋白质制剂中冻千保护剂浓度的非限制性例子为约10mM到约400mM，优选约30mM到约300mM，最优选约50mM到约100mM。在某些实施方案中，制剂中可包含表面活性剂。此处使用的术语"表面活性剂，，，包括通过吸附在气体-液体界面降低液体的表面张力的试剂。表面活性剂的例子包括，但不限于，非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20);泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188);三硝基甲苯(TritonT^);十二烷基硫酸钠(SDS);月桂基硫酸钠；辛基葡糖苷钠；月桂基磺基甜菜碱、十四烷基磺基甜菜碱、亚油烯基磺基甜菜碱、硬脂酰基磺基甜菜碱、月桂基肌氨酸、十四烷基肌氨酸、亚油烯基肌氨酸、硬脂酰基肌氨酸、亚油烯基甜茱碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜茱碱、亚油酰胺丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、棕榈酰胺丙基甜菜碱(palmid叩ropyl-betaine)、异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺丙基)、十四烷基酰胺丙基(myristaniidopropyl)-、棕榈酰胺丙基(palmidopropyl)-、或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠、或油酰基甲基牛磺酸二钠；以及MonaquatTM系歹'j(Mona产业公司，帕特森，N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普流罗尼类，PF68)。加入的表面活性剂的量为，该量保持重构蛋白质的聚集在可接受的水平，并在此处说明的蛋白质制剂的冻干产物重构后最小化;微粒的形成，其中聚集的测定方法为，例如，用SEC-HPLC测定HMW物质或LMW物质的百分比。例如，制剂(液体，或重构冻干品之前)中可具有表面活性剂，其量为从约0.001到约0.5%，例如，从约0.05到约0.3%。在一些实施方案中，制剂中包括膨胀剂。此处使用的术语"膨胀剂"，包括为冷冻千燥产品提供结构，而不与药物产品直接相互作用的试剂。除了提供美观的药物粕，膨胀剂还可在调整崩解温度方面带来有益性质，提供冷冻-解冻保护，并增强蛋白质长期储存的稳定性。膨胀剂的非限制性例子包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。膨胀剂可为晶体(如甘氨酸、甘露醇或氯化钠)或无定形的(如右旋糖酐、幾乙基淀粉)，通常在蛋白质制剂中以0.5%到10%的量4吏用。其他可药用的载体、赋形剂或稳定剂，如《雷氏药学大全》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版Osol，A.编辑(1980)中所说明的，只要对制剂的期望特性没有有害影响，均可包含在此处说明的蛋白质制剂中。此处使用的，"可药用的栽体"指与药物施用相容的、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。将这样的介质和试剂用于药物活性物质在领域中是众所周知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在其使用剂量和浓度下对受体是无毒的，包括额外的緩沖剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，如EDTA;金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；生物可降解的聚合物，如聚酯；成盐抗衡离子，如钠、多元糖醇；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖(myoinisitose)、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、丙三醇、环醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单巯基甘油(a-monothioglycerol)和硫代疏酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮。储存方法此处说明的蛋白质制剂可用任何本领域技术人员已知的方法储存。非限制性例子包括将蛋白质制剂冷冻、冻干和喷雾干燥。在一些情况下，蛋白质制剂冷冻储存。因此，期望制剂在这样的条件下相对稳定，包括在冷冻-解冻循环条件下。测定制剂适宜性的一种方法是，将样品制剂经至少两个，例如，三到十个冷冻(例如，在-20。C或-80。C)和解冻(例如在室温快速解冻或在水上緩慢解冻)的循环，测定冷冻-解冻循环之后累积的低分子量(LMW)物质和/或HMW物质的量，并与冷冻-解冻处理之前样品中的LMW物质或HMW物质的量相比较。若LMW或HMW物质增加说明，作为制剂的一部分储存的蛋白质的稳定性降低。尺寸排阻高效液相色语(SEC-HPLC)可用于检测LMW和HMW物质的存在。在一些情况下，蛋白质制剂可作为液体储存。因此，期望液体制剂在这样的条件下相对稳定，包括在不同的温度下。测定制剂适宜性的一种方法是，将样品制剂储存在几个温度(如2-8、15、20、25、30、35、40和50。C)，监测HMW和/或LMW物质随时间累积的量。HMW和/或LMW物质随时间累积的量越小，制剂的储存条件越好。此外，蛋白质的带电情况可通过阳离子交换-高效液相色谱(CEX-HPLC)监测。或者，制剂可在冻千后储存。此处使用的术语"冻干"，指将要干燥的物质，首先冷冻而后通过在真空环境中升华，以除去冰或冷冻溶剂的过程。欲冻千的制剂中可包含赋形剂(例如，冻干保护剂)，以提高冻干产品在储存中的稳定性。此处使用的术语"重构的制剂"，指通过将冻干的蛋白质制剂溶于稀释剂中、从而蛋白质分散在稀释剂中而制备的制剂。此处使用的术语"稀释剂"，为可药用(对于给人用药安全无毒)的物质，可用于制备液体制剂，如在冻干后重构的制剂。稀释剂的非限制性例子包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩冲溶液(例如，磷酸盐緩沖盐溶液)、无菌盐溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、或盐和/或緩沖剂的水性溶液。测试制剂的蛋白质成分在冻干后的稳定性，有益于确定制剂的适宜性。除了样品制剂是冻干而不是冷冻的，方法与上述关于冷冻说明的相似，制剂用稀释剂重构，并检验重构的制剂中的LMW物质和/或HMW物质。若与相应的非冻干的样品制剂相比，冻干的样品中LMW或HMW物质增加，说明冻干的样品的稳定性降低。在一些情况下，制剂经喷雾干燥后储存。对于喷雾干燥，液体制剂在干气流存在下雾化。水从制剂小滴中去除而进入气流，得到药物制剂的干燥颗粒。在制剂中可包含赋形剂，以(i)在喷雾干燥脱水过程中保护蛋白质，(ii)喷雾干燥后在储存过程中保护蛋白质，和/或(iii)赋予溶液适宜雾化的性质。除了样品制剂是喷雾干燥而不是冷冻，方法与上述关于冷冻说明的相似，制剂在稀释剂中重构，并检验重构的制剂中的LMW物质和/或HMW物质。若与相应的非冻干样品制剂相比，喷雾干燥的样品中LMW或HMW物质的增加，说明喷雾干燥的样品的稳定性降低。治疗方法此处说明的制剂作为药物组合物，对于需要治疗的患者的疾病或病症的治疗和/或预防有效。术语"治疗"指治疗性治疗和防范或预防性措施。治疗包括向身体、分离的组织、或来自患者的细胞施用或给药蛋白质制剂，所述患者有疾病/病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的i秀因，目的在于治疗、治愈、减轻、緩解、改变、矫正、改进、改善或影响疾病、疾病的症状或疾病的诱因。"需要治疗"的人包括已患有病症和需预防病症的人。术语"病症，，指用此处说明的蛋白质制剂进行治疗，而会从中受益的任何情况。这包括慢性和急性病症或疾病，其中包括诱发哺乳动物罹患所讨论病症的病理条件。此处要治疗的病症的非限制性例子包括出血性病症、血栓症、白血病、淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、自身免疫性疾病、凝血性病症、血友病、移植排斥、炎症、心脏病、肌肉萎缩症、过敏、癌、肌营养不良、少肌症、恶病质、II型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、牛皮裤、牛皮癣性关节炎、译喘、皮炎、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病、嗜曙红细胞增多、纤维化和过量粘液产生。给秀此处说明的蛋白质制剂可用本领域中已知的方法给需要治疗的受试者用药，如用单次或多次团注，或用适宜的方式长时间输液，例如注射或输液，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病损内或关节内途径、局部用药、经粘膜、经皮肤、直肠、吸入、或通过緩释或延长释放方法。如果蛋白质制剂是经冻干的，则在给药之前冻干的物质首先在适当液体中重构。冻干的物质可在例如，抑菌性注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸緩沖盐溶液(PBS)、或蛋白质在冻干前的相同制剂中重构。为给药方便和剂量的一致，肠胃外投药可以用剂量单位形式制备。此处使用的"剂量单位形式"，指物理上分离的单位，适合待治疗受试者的单位剂量；每单位包含经计算能提供所需疗效的、预定量的活性化合物，以及经挑选的药物载体。在使用吸入方法的情况下，如定量吸入器，该装置设计为以适宜量递送制剂。对于吸入用药，化合物从压力容器、或包含适宜推进物如气体如二氧化碳的分配器或喷雾器中以气雾剂的形式递送。或者，吸入的剂量形式可为干燥粉末，使用干粉吸入器。蛋白质制剂还可包封在通过例如，凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶嚢中，例如，分别包封在羟曱基纤维素或明胶-孩l胶嚢和聚甲基丙烯酸甲酯(poly-(methylmethacylate))微胶嚢中，包埋在胶体给药系统(例如，月旨质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)中或包埋在巨乳液中。《雷氏药学大全》第18版中公开了这些技术。还可制备此处说明的蛋白质制剂的緩释制品。緩释制品的适当例子包括，包含蛋白质制剂的固体疏水聚合物半透性基质。緩释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸个乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。由于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)聚合物的生物相容性和大范围的生物可降解的性质，此处说明的蛋白质的緩释制剂可用其研发。PLGA的降解产物，乳酸和乙醇酸，在人体内可快速清除。此外，此聚合物的降解性依据其分子量和組成可由数月调整至数年。脂质体组合物也可用于配制此处说明的蛋白质或抗体。^量制剂的毒性和治疗效果可由本领域中已知的药学方法测定，使用，例如，细胞培养物或实验动物，例如，测定LDso(使50。/。的群体致死的剂量)和EDs。(在50%的群体中具有疗效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可表达为LD5Q/ED5。比。围。这样的制剂的剂量通常在包含EDs。，且很少或没有毒性的循环浓度范围内。依据使用的剂量形式和给药途径，剂量在此范围内可有所变化。对于本发明的方法中使用的任何制剂，其治疗有效剂量可由细胞培养实验初步估计。剂量可在动物^^型中配制达到包含ICs。(也就是，症状得到半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度的范围，IC5Q由细胞培养物中测定得到。这样的信息可用于更准确地确定人用剂量。血浆中的水平可利用，例如，高效液体色谱测定。制剂中的蛋白质的适当剂量取决于所治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、给药目的是预防还是治疗、之前的治疗、患者的临床史和对试剂的反应、以及主治医师的判断。制剂通常递送的剂量为在约0.1mg蛋白质/kg体重和约100mg蛋白质/kg体重之间。制剂要用于体内用药，必须为无菌的。在液体、或冻干和重构的制剂配制之前或之后，制剂可经由无菌过滤膜过滤达到无菌。此处的治疗组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如，静脉输液袋、或具有皮下注射针可穿透的塞子的瓶。产品在另一实施方案中，提供了产品，之中包含此处说明的制剂、并优选提供其使用说明。产品包括适宜盛装制剂的容器。适宜的容器包括，但不限于，瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单或双室注射器)、试管、喷雾器、吸入器(例如，定量吸入器或干粉吸入器)或药库。容器可由多种物质形成，如玻璃、金属或塑料(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯)。容器盛装制剂，且容器上的、或附随的标签可显示重构和/或使用的说明。标签还可表明制剂可用于或应该用于皮下给药。盛装制剂的容器可为多次使用的瓶，其可进行重复制剂给药(例如，2-6次给药)。产品还可包含另一容器，其包含适宜的稀释剂(例如，WFI、0.9%NaCl、BWFI、磷酸緩冲盐溶液)。当产品包含冻干形式的蛋白质制剂时，将稀释剂与冻干的制剂混合，在重构的制剂中将得到的最终蛋白质浓度通常为至少20mg/ml。产品还可包含基于商业和用户立场所需的其他物品，包括其他緩冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、和带有使用说明的包装说明书。本申请所引用的全部期刊文章、专利、专利申请和其他出版物，其全部内容在此通过引用并入到本文中。如果本申请自身的内容与任何通过引用并入至本文中的材料之间存在任何冲突，应以本申请为准。通过参照下列实施例，本发明将得到更充分的理解。但不应视为对本发明范围的限制。实施例实施例1甲硫氨酸对在升高温度下储存的抗B7,2抗体制剂中的蛋白质聚集的影响此实施例举例说明了甲硫氨酸降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的能力。具体地，下文说明的实验意在测试甲硫氨酸对40'C储存的抗B7.2抗体制剂中抗B7.2抗体(IgG2，K轻链，见图9)聚集的影响。B7.2为B细胞上表达的共刺激配体，其可与T细胞表面分子CD28和CTLA-4相互作用。加入曱石克氨酸对在不同pH水平、以液体配制的抗B7.2抗体聚集的影响，经过12周的时间进行测试，在此期间制剂在40'C储存。在不同pH水平，有和没有10mM甲硫氨酸和0,01%聚山梨醇酯-80的存在下，以1mg/ml配制抗B7.2抗体。在一开始、第6周和第12周测定聚集水平，用SEC-HPLC测定这些时间点上制剂中高分子量物质的百分比(。/。HMW)。若。AHMW升高表示发生聚集。各制剂的初始。/。HMW水平大致相同(l-2。/0，见图la)。然而，在40。C储存6周和12周后，没有曱硫氨酸的制剂中。/。HMW增加，特别是在含有聚山梨醇酯-80而不含曱硫氨酸，pH水平范围在6.0到6.6(见图lb和lc)制剂的样品中。制剂中曱硫氨酸的存在使得没有聚山梨醇酯-80的样品中，％HMW接近初始水平。尽管与含有曱硫氨酸但没有聚山梨醇酯-80的样品相比，同时包含聚山梨醇酯-80和曱硫氨酸的样品中蛋白质聚集有所增加，但蛋白质聚集的水平明显低于含有聚山梨醇酯-80但没有甲硫氨酸(见图lb和lc)的样品。总之，这些实验表明，含有和不含聚山梨醇酯-80,甲硫氨酸均降低升高温度下的制剂中抗B7.2抗体的聚集。实施例2曱硫氨酸对升高温度下的制剂中抗B7.1抗体的蛋白质聚集的影响此实施例进一步举例说明甲硫氨酸降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的能力。下文说明的实验意在测试曱硫氨酸对40'C储存的抗B7.1抗体制剂中抗B7.1抗体(IgG2，K轻链，见图8)聚集的影响。B7.1为B细胞上表达的共刺激配体，其可与T细胞表面分子CD28和CTLA-4相互作用。加入甲硫氨酸对在不同pH水平、以液体配制的抗B7.1抗体聚集的影响，经过12周的时间进行测试，在此期间制剂在40。C储存。在不同pH水平，有和没有10mM甲硫氨酸和0.01%聚山梨醇酯-80的存在下，以1mg/ml配制抗B7.1抗体。在一开始和第12周测定聚集水平，用SEC-HPLC测定这些时间点上制剂中高分子量物质的百分比(。/。HMW)。各制剂的初始。/。HMW水平大致相同(~1%,见图2a)。含有聚山梨醇酯-80且不含甲硫氨酸的情况下，抗B7.1抗体制剂在40。C储存12周，使得pH范围4.7-6.3、柠檬酸盐和琥珀酸盐緩冲剂中的。/。HMW略微增加(见图2b)。pH范围6-6.6、组氨酸緩冲剂中的o/。HMW增加更为显著(见图2b)。蛋白质制剂中加入曱硫氨酸降低了％HMW水平。这在抗B7.1抗体在组氨酸緩冲剂和聚山梨醇@旨-80中配制的情况下最为明显在40。C储存12周后，甲硫氨酸使。/。HMW保持在最小的1.2%的水平。总之，这些实验表明，含有和不含聚山梨醇酯-80，甲硫氨酸均降低在40°C储存的制剂中抗B7.1抗体的聚集。实施例3甲硫氨酸对经长期储存的抗CD22抗体制剂中蛋白质聚集的影响此实验意在测试加入甲硫氨酸对抗CD22抗体制剂中蛋白质聚集的影响(见图10)。CD22为135kD的B细胞限制性的唾液酸糖蛋白，其与含有2-6个连接的唾液酸残基的寡糖结合，并在分化晚期于B细胞表面表达。认为其参与B细胞活化，且为粘附分子。认为CD22和抗CD22对于白血病、淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤和某些自身免疫病的治疗有益。25-26mg/ml抗CD22(IgG4，k轻链)在10mM琥珀酸盐緩沖剂、pH6中配制为液体。这些制剂还同时包含10mM曱硫氨酸和0.01%聚山梨醇酯-80或其中之一。所得的抗CD22制剂在25'C或-80'C储存1个月到36个月，制剂中的％HMW水平由SEC-HPLC评估。所有在-80。C储存的制剂的。/。HMW水平大致相同(0.5%)(见图3a)。相反，在25。C长期储存导致。/。HMW水平升高(见图3b)。如果制剂中有甲硫氨酸，则。/。HMW增长大幅减少。需要注意的是，具有聚山梨醇酯-80和曱硫氨酸的抗CD22制剂产生的％HMW物质，与含有曱硫氨酸但没有聚山梨醇酯-80制剂的样品大致相同。这些数据表明，含有或不含聚山梨醇酯-80，甲硫氨酸均降低长期储存的抗CD22抗体制剂中的蛋白质聚集。实施例4曱硫氨酸对高温储存的PSGL-Ig制剂中蛋白质聚集的影响实施例提供另一示例说明甲硫氨酸防止蛋白质，特别是融合蛋白的聚集的能力。此实验意在测试加入曱硫氨酸对P-选择素糖蛋白配体-l-免疫球蛋白(PSGL-Ig)融合蛋白制剂中蛋白质聚集的影响。PSGL-1为240kDa的同型二聚体，由两条120kDa的、在所有白细胞上组成型表达的多肽链组成。PSGL-1主要处于微绒毛的顶端。由适当的糖修饰后，PSGL-1可与内皮上的P-选择素结合。在不同温度测定甲硫氨酸对融合蛋白P-选择素糖蛋白质配体-Ig(PSGL-Ig)聚集的影响。PSGL-Ig在10mMTris、150mMNaCl、0.005%聚山梨醇酯-80、pH7.5中配制为液体制剂，含有或不含10mM甲硫氨酸。样品在-80。C、25。C和40。C储存，经过4周后用SEC-HPLC评价。/。HMW。所有样品的初始。/。HMW水平相似，并在-80'C储存的样品中保持不变，无论有或没有甲硫氨酸(见图4)。储存在25'C和40'C—段时间使得聚集增加；但是，制剂中有甲硫氛酸的样品中聚集降低。实施例5甲硫氨酸对受到剪切应力的PSGL-Ig制剂中的蛋白质聚集的影响此实施例举例说明甲硫氨酸降低受到剪切应力的蛋白质的聚集。PSGL-Ig融合蛋白在10mMTris、150mMNaCl、0.005%聚山梨醇酯-80、pH7.5中配制为液体制剂，含有或不含IOmM甲硫氨酸。所得制剂不经摇动或在250rpm摇动96小时。未摇过的样品，含有或没有甲硫氨酸，其。/。HMW水平(0.6和0.7%)非常相似(见图5)。相反，没有甲硫氨酸、摇过的样品的。/。HMW增加(4.2。/。和4.4%)。在经受摇动的制剂中加入甲硫氨酸使得。/。HMW水平降低至1,0和2.2%。这些数据说明甲硫氨酸降低受到剪切应力的蛋白质的聚集。实施例6甲硫氨酸对在黑暗中储存的REFACTO⑧蛋白质制剂中蛋白质聚集的影响本实验提供又一示例，说明甲硫氨酸防止蛋白质，特别是重组蛋白质的聚集的能力。为进一步说明，本实验中使用REFACTO⑧(见图11)，其为用于修正因子VIII缺陷的重组因子VIII蛋白。用为时1个月的稳定性研究检验甲硫氨酸对REFACTO⑧稳定性的影响。REFACTCf以约250IU/ml于20mM组氨酸緩沖剂中配制为液体。一些这样的制剂中还包含10mM曱硫氨酸和10mM柠檬酸盐。所有制剂均包含4mM氯化钩和310mM氯化钠，以及0.02%吐温-80。制剂的pH为6.5。样品在黑暗中室温储存约1个月。对照样品按上述制剂配制，在-80'C储存。用SEC-HPLC评估聚集体的形成。在对照样品中，无论有没有甲硫氨酸和柠檬酸盐，。/。HMW水平均保持不变(见表l)。在没有曱硫氨酸和柠檬酸盐的组氨酸緩冲制剂中，在黑暗中储存1个月后，％HMW为26-27%，说明聚集水平高。然而，在包含甲硫氨酸和柠檬酸盐的组氨酸緩沖制剂中，在经过同样时间后聚集降低，。/oHMW仅为7-8%。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例7曱硫氨酸对在荧光下储存的REFACTO^蛋白质制剂中蛋白质聚集的影响在这组实验中，曱硫氨酸对暴露于荧光的REFACTO⑧的聚集的影响经1个月时间进行检测。REFACTO"约250IU/mI于20mM组氨酸或20mM琥珀酸盐緩冲剂中配制为液体。一些这样的制剂中还包含10mM甲硫氨酸和10mM柠檬酸盐。所有制剂均包含4mM氯化钩和310mM氯化钠，以及0.02%吐温-80。制剂的pH为6.5。样品在荧光下室温储存约1个月，以SEC-HPLC评估聚集体的形成。对照样品按上述制剂配制，在-sox:储存。在对照样品中，无论有没有曱硫氨酸和柠檬酸盐，％HMW水平在0%HMW保持不变(见表2)。在医药级组氨酸緩冲剂制剂中，没有甲硫氨酸和柠檬酸盐，在荧光下储存一个月后。/。HMW为21%,说明聚集水平高。然而，在包含曱硫氨酸和柠檬酸盐的医药级组氨酸緩沖剂制剂中，在经过同样时间后聚集降低，。/。HMW仅为2。/。。相似的，在没有甲疏氨酸和柠檬酸盐的琥珀酸盐緩冲剂制剂中，。/。HMW为25%，而在包含甲硫氨酸和柠檬酸盐的琥珀酸盐緩冲剂制剂中，仅有9%HMW(见表3)。因此，在荧光下储存后，与制剂中没有甲硫氨酸和柠檬酸盐的REFACTO②相比，甲硫氨酸和柠檬酸盐降低组氨酸或琥珀酸盐緩冲剂制剂中的REFACTO⑧的聚集。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实施例8甲硫氨酸对REFACTO⑨效力的影响甲硫氨酸对保存在黑暗中或暴露于荧光的REFACTO⑧效力的影响，经1个月时间进行检测。REFACTO②以约250IU/ml于20mM组氨酸或20mM琥珀酸盐緩冲剂中配制为液体。一些这样的制剂中还包含10mM甲硫氨酸和10mM柠檬酸盐。样品暴露于荧光或黑暗条件下室温储存1个月。暴露于荧光的样品中，緩冲溶液中没有甲硫氨酸和柠檬酸盐的任一REFACTO⑧样品室温储存1个月后效力大量丧失(见图6)。黑暗储存的有曱硫氨酸的REFACTO,其效力没有受到有害影响，而荧光下储存的有甲硫氨酸的REFACT(^虽丧失了一些效力，但与没有甲硫氨酸而致丧失了全部效力的储存样品相比，仍保留了较高效力。实施例9氧化降低rhIL-ll的多聚化此实验意在测试加入甲硫氨酸对IL-ll多聚化的影响。在四百个小瓶中手工填装O.lmg/ml重组人IL-ll(rhlL-ll)药品(在5ml管形瓶中装入1.0ml)，用标准冻干循环将rhIL-ll冻干。二百个小瓶包含的rhIL-ll以10mMNaPO4、300mM甘氨酸、pH7.0配制，其余以10mMNaP04、300mM甘氨酸、10mM甲硫氨酸、pH7.0配制。用四种不同的13mM塞子封闭容器。每种塞子用于IOO个小瓶。塞子经冲洗、煮沸而后高压灭菌。一半的塞子随后在100'C干燥16小时。将小瓶置于4'C、40。C和50。C进行两周和四周的短期加速稳定性实验。在T-O、第2周和第4周测试Met58氧化和多聚体形成。用RP-HPLC(低负载)测定rhIL-ll中Met58的氧化程度，而用SEC-HPLC监测rhIL-ll多聚体的产生。为测试氧化和多聚化之间的任何直接相关性，建立了初始图(见图7)。这些数据显示当氧化水平高时，多聚体水平低，而当氧化水平低时，多聚体水平高。这些数据显示rhIL-ll的氧化和多聚化表现为在相反的情况下发生。当优化参数以最小化rhIL-ll的氧化时，多聚化增加。权利要求1、一种降低蛋白质制剂中蛋白质的聚集的方法，包括向制剂中加入甲硫氨酸至浓度为约0.5mM到约145mM，其中，与没有甲硫氨酸的制剂中的蛋白质聚集相比，所述方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。2、权利要求1所述的方法，其中蛋白质制剂为液体制剂或冷冻干燥粉剂。3、权利要求l所述的方法，其中蛋白质浓度在约O.lmg/ml和约300mg/ml之间。4、权利要求l所述的方法，其中蛋白质制剂包含表面活性剂。5、权利要求l所述的方法，其中蛋白质制剂包含氨基酸，其选自由精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸所组成的组。6、权利要求l所述的方法，其中蛋白质制剂包含张度调节剂。7、权利要求l所述的方法，其中蛋白质制剂包含糖。8、权利要求1所述的方法，其中蛋白质制剂还包含降低制剂中的蛋白质聚集的试剂。9、权利要求1所述的方法，其中蛋白质聚集不是甲硫氨酸氧化的结果。10、权利要求1所述的方法，其中在向制剂中加入甲硫氨酸之前和/或之后评估制剂中的蛋白质的聚集。11、权利要求10所述的方法，其中用SEC-HPLC、AUC、光散射和紫外吸光率评估聚集。12、权利要求l所述的方法，其中用。/。HMW物质评估聚集，且与没有甲硫氨酸的制剂中的％HMW物质相比，％HMW物质降低了约30%。13、权利要求1所述的方法，其中在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸后1周到12周之间，或在蛋白质制剂中加入甲硫氨酸后l个月到36个月之间，评估制剂中的蛋白质聚集。14、权利要求1所述的方法，其中具有甲硫氨酸的蛋白质制剂配制后，在4。C到50。C之间的温度储存约1周到约12周后，评估制剂中的蛋白质聚集。15、权利要求1所述的方法，其中具有甲硫氨酸的蛋白质制剂配制后，在4。C到30'C之间的温度储存约1个月到约36个月后，评估制剂中的蛋白质聚集。16、权利要求l所述的方法，其中制剂中的蛋白质的聚集由剪切应力、储存、升高温度储存、暴露于光、pH、表面活性剂的存在、及这些的组合所导致。17、权利要求l所述的方法，其中制剂中加入甲硫氨酸的终浓度在约lmM和约25mM之间。18、权利要求l所述的方法，其中制剂的pH在约5.0和约7.0之间。19、权利要求l所述的方法，其中蛋白质制剂包含緩沖剂，其选自由柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、Tris、及这些的组合所组成的组。20、权利要求l所述的方法，其中该方法延长制剂的保存期限，或保持制剂的效力。21、权利要求l所述的方法，其中蛋白质不含甲硫氨酸残基或包含少于5个甲硫氨酸残基。22、一种降低受到剪切应力的蛋白质制剂中蛋白质的聚集的方法，包括向制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM，其中，与没有曱硫氨酸的制剂中的蛋白质聚集相比，所述方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。23、权利要求22所述的方法，其中剪切应力由震动、吸入注射器和纯化过程、及这些的组合所导致。24、一种降低蛋白质制剂中蛋白质效力或生物活性丧失的方法，其中制剂在室温储存多于一天，所述方法包括向制剂中加入曱硫氨酸至浓度约0.5mM到约145mM，与没有曱硫氨酸的制剂中的蛋白质相比，使得制剂中的蛋白质的效力或生物活性的丧失降低。25、权利要求24所述的方法，其中蛋白质制剂在荧光下储存。26、权利要求24所述的方法，其中蛋白质制剂在黑暗中储存约1个月。27、一种降低蛋白质制剂中蛋白质聚集的方法，包括(i)向制剂中加入甲硫氨酸至浓度约0.5mM到约l45mM;和(ii)用SEC-HPLC测定制剂中的蛋白质的％HMW水平；其中，与没有甲硫氨酸的制剂中的蛋白质聚集相比，所述方法使得制剂中的蛋白质聚集降低。28、权利要求27所述的方法，其中所述方法使得蛋白质制剂中的%HMW物质少于约5%,%HMW物质由SEC-HPLC测定。29、一种蛋白质制剂，其包含如下之一抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、抗CD22抗体、PSGL-Ig和因子VIII、或它们的生物活性片段；并包含约0.5mM到50mM甲石危氨酸。30、权利要求29所述的制剂，还包含1-150mM氨基酸，所述氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸所组成的组。全文摘要本申请提供了降低制剂中的蛋白质的聚集的方法，以及具有聚集降低的性质的蛋白质制剂。此处说明的方法和制剂保持了蛋白质的生物活性，延长了蛋白质制剂的保存期限。文档编号A61K38/37GK101420972SQ200780013243公开日2009年4月29日申请日期2007年3月19日优先权日2006年3月20日发明者A·坎托尔,E·A·奈德哈德,E·C·索利,N·G·卢克沙,N·W·沃恩,T·J·克劳利,黎李申请人:惠氏公司