专利名称：作为抗增殖剂和血管生成抑制剂的疏螺旋体素衍生物的制作方法
专利说明作为抗增殖剂和血管生成抑制剂的疏螺旋体素衍生物
背景技术：
疏螺旋体素1(
图1)是由数种菌株产生的18元大环内酯，这些菌株包括但不限于娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)ATCC23956、小小链霉菌(Streptomyces parvulus)Tü113和小小链霉菌Tü4055。疏螺旋体素的整体结构在1967年被首次阐明(Keller-Scheirlein，1967)，随后通过详细的NMR分析进行了精制(Kuo等人，1989)。通过X-射线晶体学确认了疏螺旋体素的绝对构型(Anderson等人，1989)。已经验证了其作为抗生素密螺霉素(treponemycin)的共同特性(Maehr和Evans，1987)。
多个小组已经报道了疏螺旋体素结构的片段的合成，已经报道了疏螺旋体素的4种独立的全合成(Hanessian等人，2003；Duffey等人，2003；Nagamitsu等人，2004；Vong等人，2004)。此外，还已经对负责通过小小链霉菌Tü4055生物合成疏螺旋体素的基因簇进行了鉴别、克隆和测序(WO2004/058976；Olano等人，2004a)。据此，生物合成工程技术的应用已经使产生疏螺旋体素和产生新类似物的生物合成途径得到了阐明(WO2004/058976；Olano等人，2003；Olano等人，2004b；Moss等人，2006)。
疏螺旋体素由于其抗菌活性而被首先发现(Berger等人，1949)，虽然该抗菌活性仅延伸到有限数目的微球菌，并且没有发现对抗所有常见受试细菌的活性。在敏感微生物中的作用方式包括选择性抑制苏氨酰tRNA合成酶(Paetz和Nass，1973；Ruan等人，2005)。已经报道了对抗密螺旋体属(Treponema)的螺旋体(Singh等人，1985；US 4,759,928)、对抗病毒(Dickinson等人，1965)、用于控制动物害虫和杂草(DE 3607287)和用作农业杀真菌剂(DE 19835669；US 6,193,964)的其它活性。此外，近来还已经报道了疏螺旋体素对耐药的镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)株具有抗疟疾活性(Otoguro等人，2003)。在所有这些报道中，仅有两篇已经报道了任意在合成上被修饰的衍生物。这些报道的第一篇描述了苄酯及其双-O-(4-硝基苯甲酰基)衍生物(Berger等人，1949)。这些报道的第二篇描述了疏螺旋体素甲酯、甲酯双O-乙酰基衍生物以及甲酯Δ14-15-二氢-、Δ14-15，12-13-四氢-和Δ14-15，12-13-四氢-C12-氨基衍生物(Anderton和Rickards，1965)。没有报道任意这些化合物的生物活性。
近来特别关注的公开内容是发现疏螺旋体素显示出抗血管生成活性(Wakabayashi等人，1997)。血管生成是新血管形成的过程。血管生成在成人中仅局部和短暂地发生，它参与例如局部创伤后的修复和女性生殖周期。已经确定血管生成是一些病理过程、包括癌症、类风湿性关节炎和糖尿病性视网膜病的关键组分(Perrin等人，2005)。Folkman(Folkman，1986)确定了血管生成在使肿瘤能够生长超过1-2cm直径中的重要性，它由肿瘤响应于缺氧所引起。在其下游结果中，血管生成主要是宿主衍生的过程，因此，血管生成的抑制在治疗癌症中提供了重要的潜能，避免了其它抗癌治疗模式的障碍、例如癌症类型的多样性和耐药性(Matter，2001)。另外的关注是近来的出版物已经描述了酪氨酰-和色氨酰-tRNA合成酶在调节血管生成中的功能相关性(Wakasugi等人，2002；Otani等人，2002)。
在血管生成的大鼠主动脉基质培养模型中，疏螺旋体素显示出有效的血管生成抑制作用，并且还以剂量依赖的方式通过诱导毛细血管形成细胞的细胞凋亡而使所形成的毛细血管破坏(Wakabayashi等人，1997)。疏螺旋体素抑制毛细血管形成，其IC50值为0.4ng/mL(0.8nM)。在同一研究中，疏螺旋体素在细胞生长试验中显示出对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)具有抗增殖活性；测得IC50值为6ng/mL，该值比在相同培养基中测得的抗血管生成活性弱15倍。疏螺旋体素的该抗增殖活性显示对多种细胞系而言是普遍的，如在癌细胞生长抑制试验中所观察到的那样。除了这些数据外，作者还报道疏螺旋体素可抑制培养的大鼠细胞中的蛋白质合成，这是最可能与其抑制苏氨酰tRNA合成酶的能力有关的因素；但是，抗血管生成活性的IC50值(0.4ng/mL)比对抑制蛋白质合成所报道的IC50值(20ng/mL)低50倍，表明该化合物的不同活性。因此认为，抗增殖活性可能与苏氨酰tRNA-合成酶抑制有关，特异性改变两种不同活性的分子结构修饰提供了提高治疗指数的手段。苏氨酰tRNA合成酶的抑制可以通过多种公开的方法来测定，例如按照由Ruan等人(Ruan等人，2005)公开的方法来测定。
使用小鼠背部气囊模型，疏螺旋体素还显示出在体内可有效地抑制血管生成(Funahashi等人，1999)，该模型检查了VEGF诱导的血管生成，它是研究肿瘤血管生成的优良的模型。疏螺旋体素通过腹膜内注射以1.8mg/kg的剂量施用，它显示出可显著地减少由WiDr细胞引起的血管体积的增加，并且减小的程度较TNP-470高，TNP-470是临床试验中合成的血管生成抑制剂。详细对照证实这些数据是血管生成抑制并且不是肿瘤细胞生长抑制的数据。作者还表明，疏螺旋体素在相同剂量下通过抑制与B16-BL6黑素瘤细胞的自发性肺转移形成有关的血管生成过程而有效抑制B16-BL6黑素瘤细胞的自发性肺转移的形成。
JP 9-227,549和JP 8-173,167证实疏螺旋体素可有效地对抗人结肠癌的WiDr细胞系并且还可对抗人前列腺癌的PC-3细胞系。JP 9-227,549描述了通过娄彻氏链霉菌Mer-N7167合成疏螺旋体素(Ferm P-14670)和从所得的发酵培养物中分离疏螺旋体素。除了疏螺旋体素1外，还描述了12-脱腈-12-羧基疏螺旋体素2(可能是生物合成的中间体或旁路代谢物)、10-脱甲基疏螺旋体素3(可能是疏螺旋体素PKS的模块4中备选丙二酰-CoA延伸单元的错误掺入导致的生物合成类似物)、11-表疏螺旋体素4和C14，C15-顺式疏螺旋体素类似物5(参见图1)。因此，JP 9-227,549详细说明了疏螺旋体素和疏螺旋体素类似物，其中腈或羧基在C12处与碳骨架连接，氢原子或低级烷基在C10处与碳骨架连接。
在20世纪60年代研究了疏螺旋体素的药学(抗病毒)潜能，但是，这些努力由于毒性而中断了，特别是其作为化学增敏剂的作用(Lumb等人，1965，Dickinson等人，1965)。
WO 01/09113公开了疏螺旋体素类似物的制备，该类似物在环戊烷环的羧酸部分经历合成修饰。使用内皮细胞增殖和内皮毛细血管形成试验以类似于上述的方法研究了这些化合物的活性。通常，羧基部分的修饰提高了对抑制毛细血管形成的选择性该选择性提高的主要原因是通过细胞增殖抑制活性的降低，而毛细血管形成抑制活性被改变的程度低得多。具体来说，对于疏螺旋体素的毛细血管形成抑制活性相对于细胞增殖而言，疏螺旋体素-吗啉代基乙基酯显示出60倍选择性指数，疏螺旋体素-酰胺显示出37倍选择性指数，疏螺旋体素-(2-吡啶基)-乙基酯显示出7.5倍选择性指数，疏螺旋体素-吗啉代基乙基酰胺显示出6倍选择性指数。采用微血管形成试验证实了这些和其它疏螺旋体素衍生物的毛细血管形成抑制活性。此外，作者还表明，当使用路易斯(Lewis)肺腺癌模型时，在除去原发性肿瘤后疏螺旋体素可微弱地抑制转移性小结的传播。但是，疏螺旋体素-(3-吡啶甲基酰胺)衍生物被报道以亚毒性剂量进行腹膜内以及经口施用后非常显著地抑制大鼠中的微小转移的增加。类似地，使用结肠38脾肝模型，在用该疏螺旋体素衍生物的亚毒性剂量进行治疗后，移植到小鼠脾中的小鼠结肠腺癌细胞的转移形成能力被显著降低。这些数据证实了早期报道的疏螺旋体素及其衍生物抑制转移形成的能力。
疏螺旋体素还已经被鉴别为酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)的细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc28/Cln2的抑制剂，其IC50值为12μg/mL(24μM)(Tsuchiya等人，2001)。表明在不影响总蛋白质生物合成的浓度下，疏螺旋体素抑制晚G1期(与α-交配信息素不能区别的时间点)的单倍体和二倍体细胞。这些数据表明疏螺旋体素具有作为前导化合物来开发抗肿瘤剂的潜能。
已经出版了两篇关于疏螺旋体素的生物活性的另外的报道。这些报道中的第一篇表明疏螺旋体素的抗血管生成作用通过不同途径介导(Kawamura等人，2003)。高浓度的苏氨酸被发现可减弱疏螺旋体素抑制大鼠主动脉培养模型中毛细血管形成和HUVEC细胞增殖的能力；但是，它不影响疏螺旋体素破坏所形成的毛细血管或诱导HUVEC中细胞凋亡的能力。疏螺旋体素还被发现可激活胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8，它们两者的抑制剂抑制了疏螺旋体素诱导的HUVEC中的细胞凋亡。这些文章中的第二篇使用了总细胞mRNA图谱的方法研究了疏螺旋体素对酿酒酵母的作用(Eastwood和Schaus，2003)。该分析表明当用疏螺旋体素处理时以时间依赖性的方式诱导氨基酸生物合成酶，并证明该途径的诱导涉及GCN4转录因子。
疏螺旋体素的某些类似物已经在WO2004/058976(百药科(Biotica)技术有限公司等)中有描述。
总之，疏螺旋体素的血管生成抑制作用针对增殖和毛细血管形成的双重生物效应。此外，疏螺旋体素及其衍生物已经显示出抑制转移的传播。疏螺旋体素还被指示用于细胞周期调节。因此，对于研究作为治疗肿瘤组织的治疗剂(作为单独的物质或用作其它治疗的辅助剂)而言，疏螺旋体素和相关化合物是特别吸引人的靶标。此外，它们可用于治疗其中血管生成在病理过程中有牵连的其它疾病，这些疾病包括但不限于以下名单类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化和多种眼紊乱如糖尿病性视网膜病以及年龄相关性黄斑变性(AMD)、角膜新生血管形成和早产儿视网膜病。
本发明提供了可用作抗癌剂和抗B细胞恶性病剂以及可用作治疗其中血管生成在病理过程中有牵连的其它疾病的物质的疏螺旋体素衍生物。
因此，仍然需要识别治疗指数提高的新的疏螺旋体素衍生物，这些新的疏螺旋体素衍生物可在治疗癌症和/或B细胞恶性病中具有功效或者具有作为治疗其中血管生成在病理过程中有牵连的其它疾病的物质的功效。优选这类疏螺旋体素衍生物具有一种或多种以下性质抗血管生成活性与抑制一般细胞增殖和/或tRNA合成酶活性的比值提高、水溶性提高、细胞渗透性提高、药理学性质改善和施用的副作用减少。本发明公开了具有开链起始物单位或4元环起始物单位的疏螺旋体素类似物的衍生物，其与疏螺旋体素和相关类似物相比通常具有改善的生物学性质；特别是它们对于抗血管生成活性与抑制一般细胞增殖的比值提高而言显示出了改善。
发明概述 本发明提供了疏螺旋体素的衍生物、制备这些化合物的方法、其中间体和在医药中使用这些化合物的方法。
在更具体的方面，本发明提供了下式(I)的疏螺旋体素衍生物或其可药用盐
式(I) 其中 R1和R2各自独立地代表H、SR3或C1-C4烷基，其可以任选被一个或多个选自OH、F、Cl或SR3的基团所取代，其中R3代表H、CH3或COCH3；或者，R1和R2与它们所连接的碳一起代表任选被一个或多个卤素原子或者一个或多个C1至C3烷基所取代的4元环烷基环； R4代表
或-NHNHC(O)R8，其中R8代表生物素、H或任选被一个或多个选自OH、F、Cl的基团所取代的C1-C4烷基； X代表-NH-或-O-； Y代表-NH-、-O-或-CH2-； R5代表H或-(CH2)nR6，其中 n代表1至3的整数； R6代表H、-OH、-OCH3、-CO2R7或任选被一个或多个选自OH、F、Cl、-CO2R7、-COR7的基团所取代的C1至C4烷基，其中R7代表C1-C4烷基； 或者R6代表 i)6元芳香族环， ii)含有1至3个N、S或O原子的5至7元杂芳香族环， iii)5-7元环烷基，或 iv)含有1至3个N、S或O原子的5-7元杂烷基环， 以上i)至iv)各自可以任选被一个或多个选自CH3、OCH3、F、Cl或Br的基团所取代； R9代表CN、CO2H、CH3或CONH2； 但是，条件是当X代表-O-时，则R5不代表H。
以上结构显示了代表性互变异构体，本发明包括式(I)化合物的所有互变异构体，例如其中烯醇化合物被说明的酮化合物，反之亦然。
在另一方面，本发明提供了用作药物的疏螺旋体素衍生物，例如式(I)化合物或其可药用盐。
定义 本文中使用的实体名词表示一个/一种或一个/一种以上(即至少一个/一种)该实体。作为举例，“类似物”表示一种类似物或一种以上类似物。
如本文所用的术语“类似物”指在结构上与另一种化合物类似但是在组成上略有不同的化合物(如一个原子被另一个原子代替或者有或无特定官能团的存在)。
具体而言，术语“疏螺旋体素类似物”指通过WO 2004/058976的方法制备的和如式(II)所示的疏螺旋体素化合物。这些化合物还称为“母体化合物”，在本申请中这些术语可互换使用。在本申请中，术语“疏螺旋体素类似物”包括对疏螺旋体素本身的称谓。
如本文所用的术语“疏螺旋体素衍生物”指在其最广泛的方面代表本发明的上文所称的疏螺旋体素衍生物，即上述式(I)化合物或其可药用盐。这些化合物还称为“本发明的化合物”或“疏螺旋体素的衍生物”，在本申请中这些术语可互换使用。
如本文所用的术语“癌症”指产生于上皮、见于皮肤或更通常地见于身体器官如乳房、前列腺、肺、肾、胰、胃或肠的衬里(lining)的恶性新生物。癌症倾向于潜入邻近组织并扩散(转移)到远端器官如骨、肝、肺或脑。如本文所用的术语癌症包括转移的肿瘤细胞类型，例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤，还包括组织癌类型，例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、gliobastoma(成胶质细胞瘤)、原发性肝癌和卵巢癌。
如本文所用的术语“B细胞恶性病”包括一组紊乱，所述的紊乱包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。它们是血液和血液形成器官的肿瘤性疾病。它们引起骨髓和免疫系统机能障碍，后者使宿主对感染和出血高度敏感。
本发明的化合物如式(I)化合物的可药用盐包括由可药用的无机或有机酸或碱所形成的常规的盐以及季铵酸加成盐。适宜酸盐的更具体的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、枸橼酸、palmoic acid(扑酸)、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic acid(类固醇酸、硬脂酸)、鞣酸的盐等。其它酸如草酸虽然本身不是可药用的，但是可用于制备在获得本发明的化合物及其可药用盐中用作中间体的盐。适宜碱盐的更具体的实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因的盐。下文对本发明的化合物的称谓包括式(I)化合物及其可药用盐。
烷基、链烯基和炔基可以是直链或支链的。
C1-C4烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。
5至7元环烷基指可以任选是支链的包括5-7个碳原子的环烷基环。其实例包括环戊基和环己基。
含有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至7元杂烷基环包括含有一个或两个杂原子、尤其是一个杂原子的环。其实例包括呋喃、吡喃、氧杂环丁烷、环氧乙烷、哌啶、吡咯烷、氮杂环丁烷、氮杂环丙烷、硫杂环丙环、硫杂环丁烷、噻吩、噻喃和吗啉。
6元芳香族环包括苯基。
含有1至3个选自O、N和S的杂原子的5至7元杂芳香族环包括6元环如吡啶基和嘧啶基以及5元环如呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻吩基、噁唑基、噁二唑基、噻唑基和噻二唑基。
发明详述 本发明提供了如上文提出的疏螺旋体素的衍生物、制备这些化合物的方法、其中间体和在医药中使用这些化合物的方法。
R9适宜地代表CN。
R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表4元环烷基环。
R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环。
X适宜地代表-O-。或者，X适宜地代表-NH-。
Y适宜地代表-NH-或-O-。在一项实施方案中，Y代表-NH-。在另一项实施方案中，Y代表-O-。
R4适宜地代表
n适宜地代表1。或者，n适宜地代表2。
R6适宜地代表含有1至3个N、S或O原子的6元杂芳香族环。
R6更适宜地代表含有一个N原子的6元杂芳香族环。
R6最适宜地代表
或
或者，R6适宜地代表含有1至3个N、S或O原子的6元杂烷基环。
R6更适宜地代表
R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-O-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-O-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
或者，R1和R2与它们所连接的碳一起适宜地代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表H。
通常，本发明的化合物通过将疏螺旋体素类似物进行半合成衍生化来制备。疏螺旋体素类似物可以使用如在WO 2004/058976中描述的方法来制备，该文件整体引入本文作为参考。
通常，制备式(I)化合物或其可药用盐的方法包括 (a)采用下文(i)至(viii)中描述的任一种方法使式(II)化合物或其被保护的衍生物进行反应
或者 (b)将式(I)化合物或其盐转化为其它式(I)化合物或它的其它可药用盐；或者 (c)将被保护的式(I)化合物脱保护。
式(II)化合物可以适宜地通过本领域技术人员已知的任意方法来制备。特别地，可以按照在WO 2004/058976中描述的方法来制备。
本发明提供了制备式(I)化合物的方法，特别是采用本领域技术人员已知的酯化、酰胺化和还原方法来制备式(I)化合物的方法。除了本文提供的具体的方法和参考文献外，本领域技术人员还可以查阅有关合成方法的标准教科书参考书目，包括但不限于《沃格尔氏实用有机化学教科书》(Vogel’sTextbook of Practical Organic Chemistry)(Furniss等人，1989)和《马希氏高等有机化学》(March’s Advanced Organic Chemistry)(Smith和March，2001)。
通式(I)的化合物可以通过修改本文描述的通用方法、例如通过使用但不限于以下方法来制备 (i)使由式(II)化合物形成的酰基氯与适宜的醇或胺反应； (ii)在碳二亚胺如N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDCI)和碱的存在下将式(II)化合物直接酯化或酰胺化； (iii)将由式(II)化合物形成的酯与适宜的醇进行酯交换； (iv)使式(II)化合物的甲基酯与适宜的胺反应； (v)由式(II)化合物例如与1-羟基苯并三唑形成活性酯，然后与适宜的醇或胺反应； (vi)由式(II)化合物例如与氯甲酸酯形成混合酸酐，然后与适宜的胺反应； (vii)将来自式(II)化合物的混合酸酐用金属氢化物还原为醇； (viii)使由式(II)化合物制备的伯醇进行烷基化和酰化。
特别地，式(II)化合物的酯衍生物可以最优选通过使由式(II)化合物与1-羟基苯并三唑在碳二亚胺(例如N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDCI))的存在下所形成的活化衍生物与适宜的醇反应来制备。
该反应通常在惰性溶剂、例如但不限于四氢呋喃(THF)中进行。在该反应中，N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDCI)用作碳二亚胺，二甲基氨基吡啶(DMAP)用作碱。可适宜地使用过量10倍摩尔浓度的醇组分。该反应在0℃至100℃之间的温度下、优选于环境温度(例如25℃)进行，同时搅拌1至10小时、但是通常为3小时。
式(II)化合物的酰胺衍生物可以例如用氯甲酸酯形成的混合酸酐衍生物来容易地制备。该反应可以在不含水的惰性有机溶剂、例如但不限于THF或二氯甲烷(DCM)中进行。三乙胺、吡啶和4-(二甲基氨基)吡啶可以用作碱。通常，所偶联的胺可以以最多过量10倍摩尔浓度存在。该反应通过在-20℃至50℃之间的温度下搅拌来进行。通常将反应物搅拌1至10小时。在方法的优选实施方案中，混合酸酐在三乙胺的存在下于-20℃在无水THF中用氯甲酸异丁酯形成，偶联在加入过量5至10倍的胺后历经3小时进行。
式(II)化合物的伯醇衍生物可以由混合酸酐并且用复合金属氢化物在THF中于-20℃进行还原来制备。这类化合物的烷基化和酰化可以通过任意通用方法、例如在《沃格尔氏实用有机化学教科书》(Furniss等人，1989)和《马希氏高等有机化学》(Smith和March，2001)中描述的那些来进行。
除了本文提供的具体方法和参考文献外，本领域技术人员还可以查阅有关合成方法的标准教科书参考书目，包括但不限于《沃格尔氏实用有机化学教科书》(Furniss等人，1989)和《马希氏高等有机化学》(Smith和March，2001)。
在步骤(a)和(c)中，保护基团的实例及其除去的方法可以在TW Greene的“有机合成中的保护基团”(Protective Groups in Organic Synthesis)(约翰·威利公司(J Wiley and Sons，1991))中找到。适宜的羟基保护基团包括可以通过水解被除去的烷基(例如甲基)、缩醛(例如丙酮化合物)和酰基(例如乙酰基或苯甲酰基)，以及可以通过催化氢解被除去的芳基烷基(例如苄基)，或者可以通过酸性水解或氟离子辅助裂解(fluoride ion assistedcleavage)被除去的甲硅烷基醚。适宜的胺保护基团包括可以在适宜时通过水解或氢解被除去的磺酰基(例如甲苯磺酰基)、酰基(例如苄氧羰基或叔丁氧羰基)和芳基烷基(例如苄基)。
本发明的其它化合物可以通过本身已知的方法或者通过类似于上述那些的方法来制备。
本发明的化合物可直接以及作为进一步进行半合成或生物转化的模板用于制备可用作抗癌剂的化合物。疏螺旋体素的半合成衍生化的方法已经在WO 01/09113中有描述。
中间体(例如式(II)化合物)的以上结构可以经过互变异构化，当述及代表性互变异构体时，应当理解意欲指所有互变异构体，例如当述及烯醇化合物时意欲指所有酮化合物，反之亦然。
另外，本发明还提供了本发明的化合物在治疗癌症或B细胞恶性病中的用途。它还提供了用于治疗癌症或B细胞恶性病的本发明的化合物。它还提供了治疗癌症或B细胞恶性病的方法，该方法包括给患者施用有效量的本发明的化合物。它还提供了本发明的化合物在制备用于治疗癌症或B细胞恶性病的药物中的用途。
还已知疏螺旋体素在治疗其它病症、包括但不限于细菌感染、病毒感染和疟疾中具有功效，以及在其中血管生成在病理过程中有牵连的其它疾病中具有功效，所述的其它疾病包括但不限于以下疾病类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病和多种眼紊乱。涉及本发明的化合物的用途和方法也扩大到这些其它适应症。
在优选的实施方案中，本发明提供了在治疗癌症或B细胞恶性病中具有功效的化合物。本领域技术人员将能够通过常规实验来确定这些化合物抑制肿瘤细胞生长的能力(例如参见Roth等人，1999和Dengler等人，1995中描述的方法以及在本文实施例中描述的方法)。
本发明还提供了包含安莎霉素衍生物或其可药用盐以及可药用载体的药物组合物。
本发明的上述化合物或其制剂可以通过任意常规方法来施用，例如但不限于它们可以经胃肠道外(包括静脉内施用)、经口服、经局部(包括口腔、舌下或透皮)、通过医用装置(例如支架)、通过吸入或通过注射(皮下或肌内注射)来施用。治疗可以包括单剂量或历经一段时间的多剂量。
当本发明的化合物可能单独施用时，优选连同一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂呈现。因此，提供了包含本发明的化合物以及一种或多种可药用稀释剂或载体的药物组合物。在可与本发明的化合物配伍并且对其接受者无害的意义上来说，稀释剂或载体必须是“可接受的”。适宜载体的实例在下文有更详细的描述。
本发明的化合物可以单独或者与其它治疗剂组合施用。共同施用两种(或更多种)物质可以考虑显著降低各自所用的剂量，由此减少所观察到的副作用。还提供了包含本发明的化合物和另外的治疗剂以及一种或多种可药用稀释剂或载体的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了本发明的化合物在与用于治疗癌症或B细胞恶性病的第二种物质的组合治疗中的用途。
在一项实施方案中，本发明的化合物与用于治疗癌症或B细胞恶性病的其它治疗剂共同施用，优选的治疗剂包括但不限于甲氨蝶呤、leukovorin(亚叶酸)、亚德利亚霉素、prenisone(泼尼松)、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西他赛、长春花新碱、长春花碱、长春瑞滨、多柔比星、他莫昔芬、托瑞米芬、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(例如HerceptinTM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(例如
TarcevaTM、ErbituxTM)、HSP90抑制剂(例如17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)或17-(二甲基氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG))、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素、CCI-779、RAD001)或VEGF抑制剂(例如AvastinTM)、蛋白酶体抑制剂(例如VelcadeTM)或
此外，本发明的化合物还可以与其它治疗、包括但不限于放射治疗或手术组合施用。
制剂可以方便地以单位剂型来提供并且可以通过药学领域中众所周知的任意方法来制备。这类方法包括使活性成分(本发明的化合物)与组成一种或多种助剂的载体联合的步骤。通常，制剂通过如下方法来制备使活性成分与液体载体或细分的固体载体或这两种载体均匀而紧密地联合，然后如果需要的话，使产物成形。
本发明的化合物通常将经口服或者通过任意胃肠道外途径以包含活性成分(任选以无毒的有机或无机酸或碱加成盐的形式)的药物制剂形式、以可药用的剂量形式来施用。根据所治疗的紊乱和患者以及施用途径，组合物可以以变动的剂量来施用。
例如，本发明的化合物可以经口服、口腔或舌下以用于立即释放、延迟释放或控制释放应用的、可以含有矫味剂或着色剂的片剂、胶囊剂、卵形剂(ovules)、酏剂、溶液剂或混悬剂的形式来施用。
这类片剂可以含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、枸橼酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；以及制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，还可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。
相似类型的固体组合物还可以在明胶胶囊剂中用作填充剂。在这方面，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬剂和/或酏剂，本发明的化合物可以与多种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂和与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油及它们的联合进行组合。
片剂可以任选与一种或多种助剂通过压制或模制来制备。压制片剂可以通过在适宜的机器中将任选与如下物质混合的自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分压制来制备粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。模制片剂可以通过在适宜的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物模制来制备。片剂可以任选被包衣或刻划痕并且可以被配制以提供缓慢或控制释放的活性成分，其中使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放性质。
适于口服施用的本发明的制剂可以作为如下制剂来提供作为分离的单位，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，它们各自含有预定量的活性成分；作为散剂或颗粒剂；作为在水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂来提供。
适于在口中局部施用的制剂包括包含在矫味基质、通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的活性成分的锭剂；包含在惰性基质、例如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分的软锭剂；以及包含在适宜液体载体中的活性成分的漱口剂。
应当理解，除了以上具体提到的成分外，本发明的制剂还可以包括关于所讨论制剂类型的领域中常规的其它物质，例如适于口服施用的那些可以包括矫味剂。
适于局部施用的药物组合物可以被配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉末、溶液剂、糊剂、凝胶剂、浸渍敷料(impregnated dressings)、喷雾剂、气雾剂或油剂、透皮装置、扑粉等。这些组合物可以通过含有活性剂的常规方法来制备。因此，它们还可以包含可配伍的常规载体和添加剂，例如防腐剂、帮助药物穿透的溶剂、乳膏剂或软膏剂中的柔润剂以及用于洗剂的乙醇或油醇。这类载体可以以组合物的约1％至约98％而存在。更通常而言，它们将最多占组合物的约80％。仅作为说明，乳膏剂或软膏剂通过如下方法来制备将足够量的亲水材料和足够量的含有约5-10％重量的化合物的水进行混合，以产生具有所需稠度的乳膏剂或软膏剂。
适于透皮施用的药物组合物可以作为用于与接受者的表皮保持长时间紧密接触的分离贴剂来提供。例如，活性剂可以通过离子导入法从贴剂中传递。
对于外部组织如口和皮肤的应用，组合物优选作为局部用软膏剂或乳膏剂来应用。当配制成软膏剂时，活性剂可以与石蜡或水混溶性软膏剂基质一起使用。
或者，活性剂可以与水包油型乳膏剂基质或油包水型基质一起被配制成乳膏剂。
对于胃肠道外施用，液体单位剂型可采用活性成分和无菌溶媒、例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油、优选水来制备。根据所用的溶媒和浓度，可以将活性成分混悬或溶解在溶媒中。对于制备溶液，可以将活性成分溶解在注射用水中，过滤灭菌，然后装入适宜的小瓶或安瓿中并密封。
可以有利地将物质如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解在溶媒中。为了提高稳定性，可以在装入小瓶中后将组合物冷冻，在真空下除去水。然后，将干燥的冻干粉末在小瓶中密封，可以提供附带的含有注射用水的小瓶以在临用前重构液体。
胃肠道外混悬剂基本上按照与溶液剂相同的方法来制备，不同的是将活性成分混悬于而非溶解于溶媒中以及灭菌不能通过过滤来完成。可以在混悬于无菌溶媒中之前通过暴露在环氧乙烷中而将活性成分灭菌。表面活性剂或润湿剂有利地被包括在组合物中以帮助活性成分均匀分布。
本发明的化合物还可以使用本领域已知的医用装置来施用。例如，在一项实施方案中，本发明的药物组合物可以用无针头皮下注射装置、例如在U.S.5,399,163、U.S.5,383,851、U.S.5,312,335、U.S.5,064,413、U.S.4,941,880、U.S.4,790,824或U.S.4,596,556中公开的装置来施用。可用于本发明的众所周知的植入剂和组件(modules)的实例包括US 4,487,603，它公开了以受控速率分配给药的可植入微量输液泵；US 4,486,194，它公开了穿过皮肤施用药物的治疗装置；US 4,447,233，它公开了以精确的输注速率传递药物的给药输注泵；US 4,447,224，它公开了用于连续传递药物的流量可变的可植入输液器；US 4,439,196，它公开了具有多室隔室的渗透药物传递系统；和US 4,475,196，它公开了渗透药物传递系统。许多其它这类植入剂、传递系统和组件是本领域技术人员已知的。
本发明的化合物的所施用的剂量将根据具体化合物、所涉及疾病、受治疗者和疾病的性质及严重性以及受治疗者的身体状况和所选的施用途径而改变。适宜的剂量可以由本领域技术人员容易地确定。
组合物可以含有0.1％重量、优选5-60％、更优选10-30％重量的本发明的化合物，这取决于施用的方法。
本领域技术人员将知道，本发明化合物的单独剂量的最佳量和间隔将由所治疗的病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位以及所治疗具体受治疗者的年龄和状况来确定，并且医师将最终确定所用的适宜剂量。每当适宜时，该剂量可以被重复。如果出现副作用，则可以根据通常的临床实践来改变或减少剂量的量和/或频率。
附图简述 图1说明了从产生疏螺旋体素的生物体中分离的疏螺旋体素和一些相关代谢物的结构。
图2显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-羟基乙基))吗啉酯(7)的1H NMR光谱。
图3显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-(2-羟基乙基)吡啶酯(8)的1H NMR光谱。
图4显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-氨基乙基))吗啉酰胺(9)的1H NMR光谱。
图5显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-氨基甲基)吡啶酰胺(10)的1H NMR光谱。
图6显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-氨基甲基)吡啶酰胺(11)的1H NMR光谱。
图7显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-氨基甲基)吡啶酰胺(12)的1H NMR光谱。
图8显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-(2-氨基乙基))吡啶酰胺(13)的1H NMR光谱。
图9显示了17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素酰胺(14)的1H NMR光谱。
图10在实施例中制备的化合物(6-14)的结构。
实施例 通用方法 培养物的发酵 按照先前在WO 2004/058976中描述的方法进行了疏螺旋体素类似物的制备，以下提供了典型的实施例(实施例1)。
发酵肉汤分析和体内转化研究的LCMS分析方法 将培养肉汤(1mL)和乙酸乙酯(1mL)混合15分钟，然后离心10分钟。收集0.5mL有机层，蒸发至干，然后重新溶解在0.25mL甲醇中。在与以阳离子模式运行的Bruker Daltonics Esquire 3000+电雾化质谱仪联用的集成安捷伦(Agilent)HP1100 HPLC系统上进行了LCMS。经PhenomenexHyperclone柱(C18 BDS，3u，150×4.6mm)、以1mL/min的流速、用从“水+0.1％甲酸”至“乙腈+0.1％甲酸”的线性梯度历经25分钟进行洗脱而完成了色谱法。
合成 所有反应均在无水条件下(另有说明除外)、在于真空下冷却的烘干玻璃器皿中并且使用无水溶剂进行。通过LC-UV-MS在Micromass平台单四极仪上监测反应。经反相二氧化硅、使用亚特兰蒂斯(Atlantis)dC18柱(50×2.1mm，5微米)、以1ml/min用以下梯度进行洗脱而完成了色谱法T＝0，100％ A；T＝2.5，100％ B；流动相A，水+0.1％甲酸；流动相B，乙腈+0.1％甲酸。于215nm进行了UV检测。
水溶性评价 水溶性可以如下测定于室温用100％ DMSO制备10mM疏螺旋体素类似物的储备液。在琥珀色小瓶中将一式三份的0.01mL等分试样用0.1M PBS(pH7.3)溶液或100％ DMSO制备成0.5mL。于室温在
vibrax VXR振荡器上将所得的0.2mM溶液在暗处振摇6小时，然后将所得的溶液或混悬液转移到2mL Eppendorf管中，于13200rpm离心30分钟。然后将上清液的等分试样通过如上所述的LCMS方法进行分析。
细胞渗透性评价 细胞渗透性可以如下测定用DMSO将受试化合物溶解至10mM，然后用缓冲液进一步稀释以产生最终的10μM给药浓度。荧光标记荧光黄也被包括在内以监测膜完整性。然后，将受试化合物应用于Caco-2细胞单层的顶端表面，测定化合物向底外侧室中的渗透。这在相反的方向(底外侧至顶端)下进行以研究主动转运。使用LC-MS/MS来定量受试化合物和标准对照化合物(例如心得安和醋丁洛尔)的水平。
合成化合物的NMR结构测定 在Bruker 400机器上于400MHz记录了1H NMR光谱。将化合物溶解在CDCl3中，并与在δ＝7.26ppm处共振的残余质子进行了参照。
抗癌活性的体外生物测定 在昂克测试试验装置(Oncotest Testing Facility)(试验肿瘤学研究所(Institute for Experimental Oncology)，昂克测试有限公司(Oncotest GmbH)，弗莱堡)上进行了化合物在一组12种人肿瘤细胞系中在单层增殖试验中的抗癌活性的体外评价。12种所选的细胞系的特性概括于表I中。
表I-受试细胞系
如Roth等人(1999)所述由人肿瘤异种移植物建立了昂克测试(Oncotest)细胞系。Fiebig等人(1999)描述了供体异种移植物的来源。其它细胞系由NCI获得(H460、SF-268、OVCAR-3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-468)或者购自DSMZ(不伦瑞克，德国)(LNCAP)。
除非另有说明，所有细胞系于37℃在湿润氛围(95％空气，5％CO2)中、在含有RPMI 1640培养基、10％胎牛血清和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，
德国)的‘即可混合’培养基中培养。
单层试验-方案简述 使用修改的碘化丙啶试验评价了受试化合物对人肿瘤细胞系生长的作用(Dengler等人，(1995))。
简言之，从指数生长期培养物中通过胰蛋白酶消化收集细胞，对其计数，以取决于细胞系的细胞密度(5-10.000个活细胞/孔)铺在96孔平底微量滴定板中。恢复24小时以使细胞重新开始指数生长后，将0.010mL培养基(6个对照孔/板)或含有麦克菌素(macbecin)的培养基加入到孔中。以一式三份接种各浓度。应用了2个浓度(0.001mM和0.01mM)的化合物。连续接触4天后，将含或不含受试化合物的细胞培养基用0.2mL碘化丙啶(PI)水溶液(7mg/L)替换。为了测定活细胞的比例，通过将板冷冻而将细胞进行了可渗透化处理。将板解冻后，使用Cytofluor 4000微量培养板读数器(激发波长530nm，发射波长620nm)测定了荧光，得到与活细胞总数的直接关系。
将穿过12种细胞系组的平均生长抑制表示为经处理者/对照×100(％T/C)。
疏螺旋体素类似物经该癌细胞生长抑制试验所显示出的活性被认为主要通过抑制苏氨酰tRNA合成酶而发生。
实施例117-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(6)的发酵和分离 所给的实施例是针对6的制备具体说明的，但是该方法通用于所有疏螺旋体素类似物，本领域技术人员将领会如何修改下述的具体方法来制备供选的疏螺旋体素类似物。如所述那样运行了3×7L Applikon发酵罐，合并发酵肉汤以进行提取。
将含有NYG培养基(30mL，在250mL Erlenmyer瓶中)的接种瓶用小小链霉菌Tü4055/borG::aac3(IV)(WO2004/058976)进行了接种，该小小链霉菌来自菌丝体的储用培养物(0.5mL；通过将2天接种培养物用冷冻防护剂(在去离子水中的20％w/v甘油和10％w/v乳糖)进行1∶1稀释而产生)。NYG培养基在去离子水中含有牛肉膏(0.3％w/v)、细菌用蛋白胨(0.5％w/v)、葡萄糖(1％w/v)和酵母浸液(0.5％w/v)。
次级种子也如上所述制得(但是用250mL NYG在2L Erlenmyer瓶中)。将含有0.01％ v/v普流罗尼克L0101以防止起泡的PYDG生产培养基(4L)用次级种子接种物(10％ v/v)接种。PYDG培养基在去离子水中含有胨化牛奶营养素(1.5％ w/v)、酵母自溶产物(0.15％ w/v)、糊精(4.5％ w/v)和葡萄糖(0.5％ w/v)，调至pH7.0。使其在7L Applikon发酵罐中于30℃发酵6天。24小时后，加入在甲醇中的环丁烷1，2-反式-二甲酸以产生4mM的终浓度。用倾斜档板将气流设置在0.75vvm和将叶轮速度经电子控制在250至600rpm之间以使溶解的氧张力保持在30％空气饱和度或以上。合并三个该发酵罐的发酵肉汤(12L)并进行了测定；制得总量为339mg的6(平均滴度为28mg/L)。
将发酵肉汤调至pH～5.5(浓HCl)，然后通过离心使其澄清。将上层液用乙酸乙酯(2×1体积当量)萃取，将细胞沉淀物用甲醇(2×1体积当量)萃取。将合并的有机萃取液蒸发，得到褐色水性浆液。将其用水稀释(至1L)，用乙酸乙酯(3×1L)萃取。将合并的有机萃取液蒸发，得到褐色油状物(～4.5g)。将此油状物溶解在丙酮中，加入快速硅胶60(150g)，通过蒸发除去溶剂。将其应用于在庚烷中预制的快速二氧化硅柱(5×25cm)。将柱用由100％庚烷至100％乙酸乙酯的阶段梯度进行了洗脱。通过TLC鉴别出了含有6的级分，将其合并，通过蒸发除去溶剂，得到黄色油状物(～1g)。然后，将此油状物溶解在最小体积的溶剂混合物(庚烷:CHCl3:乙醇，10:10:1)中，将其应用于在相同溶剂混合物中预制的葡聚糖凝胶LH-20柱(2.5×60cm)。在重力下用约3L相同溶剂混合物将柱进行了洗脱，收集到12mL级分。合并含有6的级分，通过蒸发除去溶剂。将所得浅黄色固体(550mg)通过溶解在最小量CHCl3中、然后加入己烷直至变浑浊而进行了结晶。将所得溶液于-20℃保存过夜，过滤收集所得固体，然后用冷己烷洗涤。将母液再次进行类似处理。将两批合并，得到6(190mg)。
在Bruker Advance 500波谱仪上于298K、对1H和13C分别在500MHz和125MHz下操作而记录了6的NMR光谱。使用标准Bruker脉冲程序获得了1H-1H COSY、APT、HMQC和HMBC光谱；偶合常数以赫兹给出。NMR实验在CDCl3中进行，并对CDCl3而言在δH 7.26处共振的残余质子和在δC77.0处的碳进行了参照。
表II ESI-MS m/z498.4[M+Na]+，476.3[M+H]+，458.4[M-18]+；474.5[M-H]-，456.4[M-18]-UVλmax(DAD)＝258nm 实施例217-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-羟基乙基))吗啉酯(7)的合成 在氮气下将搅拌的疏螺旋体素类似物6(125mg，0.263mmol)在无水四氢呋喃(THF)(7mL)中的溶液用1-羟基三唑(35mg，0.263mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(EDCI)(64mg，0.33mmol)和DMAP(73mg，0.60mmol)处理。30分钟后，加入4-(2-羟基乙基)吗啉(344mg，0.32mL，2.63mmol)。另外3小时后，将混合物蒸发至干。将残余物加入到二氯甲烷(DCM)中，用水洗涤2次，通过硫酸镁干燥。过滤并蒸发后，将残余物通过‘Combiflash’、用在DCM中的0-90％乙酸乙酯的梯度洗脱进行纯化。将产物蒸发至干，用氯仿共沸2次，得到无色玻璃状物。产量＝61mg，39％。纯度(通过LCMS)>95％。1H NMR与标题化合物一致(图2)。
实施例317-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-(2-羟基乙基)吡啶酯(8)的合成 按照实施例2中描述的方法，使用相同量的物质但是用2-(2-羟基乙基)吡啶(323mg，0.30mL，2.63mmol)代替4-(2-羟基乙基)吗啉制得该化合物。产量＝89mg，58％。纯度(通过LCMS)>95％。1H NMR与标题化合物一致(图3)。
实施例417-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-氨基乙基))吗啉酰胺(9)的合成 将搅拌的6(100mg，0.204mmol)在无水THF(7.5mL)中的溶液冷却至-20℃，在氮气下用无水三乙胺(0.03mL，0.225mmol)处理，然后用氯甲酸异丁酯(0.03mL，0.225mmol)处理。于-20℃搅拌30分钟后，将混合物过滤以除去盐酸三乙胺。将滤液再次冷却至-20℃，在氮气下用4-(2-氨基乙基)吗啉(0.17mL，1.3mmol)处理。然后历经下一个3小时使温度升至环境温度，然后将混合物蒸发至干。将残余物加入到DCM中，用水洗涤3次，通过硫酸镁干燥。过滤后，于室温蒸发除去溶剂。将产物通过‘Combiflash’、用在DCM中的0-90％乙酸乙酯的梯度、然后用在乙酸乙酯中的5％三乙胺洗脱进行纯化。蒸发后，得到淡黄色玻璃状的产物。产量＝84mg，54％。纯度(通过LCMS)>99％。1H NMR与标题化合物一致(图4)。
实施例517-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-氨基甲基)吡啶酰胺(10)的合成 按照实施例4中描述的方法、但是使用以下量的物质制得该化合物疏螺旋体素类似物6(125mg，0.263mmol)、无水THF(10mL)、无水三乙胺(29mg，0.04mL，0.289mmol)、氯甲酸异丁酯(39mg，0.04mL，0.289mmol)和4-(氨基甲基)吡啶(181mg，0.17mL，1.68mmol)。使用‘Combiflash’、使用在DCM中的0-90％乙酸乙酯、然后使用纯乙酸乙酯进行了纯化。分离白色固态的产物。产量＝32mg，21.5％。纯度(通过LCMS)>97％。1H NMR与标题化合物一致，但是需要加入一些d6-DMSO以帮助产物溶解(图5)。
实施例617-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-氨基甲基)吡啶酰胺(11)的合成 按照实施例4中描述的方法，使用相同量的物质但是用3-(氨基甲基)吡啶(181mg，0.17mL，1.68mmol)代替4-(2-氨基乙基)吗啉制得该化合物。使用‘Combiflash’、使用在DCM中的0-90％乙酸乙酯、然后90％乙酸乙酯进行了纯化(产物在副产物之后洗脱出)。将产物用氯仿共沸2次，得到无色玻璃状物。产量＝121mg，81％。纯度(通过LCMS)100％。1H NMR与标题化合物一致(图6)。
实施例717-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-氨基甲基)吡啶酰胺(12)的合成 按照实施例4中描述的方法，使用相同量的物质但是用2-(氨基甲基)吡啶(181mg，0.17mL，1.68mmol)代替4-(2-氨基乙基)吗啉制得该化合物。按照实施例4进行纯化，得到无色玻璃状的产物。产量＝137mg，92％。纯度(通过LCMS)100％。1H NMR与标题化合物一致(图7)。
实施例817-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-(2-氨基乙基))吡啶酰胺(13)的合成 按照实施例4中描述的方法，使用相同量的物质但是用3-(2-氨基乙基)吡啶(205mg，0.27mL，1.68mmol)代替4-(2-氨基乙基)吗啉制得该化合物。按照实施例4进行纯化，得到无色玻璃状的产物。产量＝98mg，64％。纯度(通过LCMS)100％。1H NMR与标题化合物一致(图8)。
实施例917-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素酰胺(14)的合成 按照实施例4中描述的方法，使用相同量的物质但是用氨水(0.1mL)代替4-(2-氨基乙基)吗啉制得该化合物。加入3滴冰醋酸，然后立即进行后处理，接着按照实施例4进行纯化，得到无色玻璃状的产物。产量＝90mg，72％。纯度(通过LCMS)>99％。1H NMR与标题化合物一致(图9)。
实施例10酯衍生物7和8以及酰胺衍生物9和13的裂解研究 将化合物7、8、9和13在大鼠血液中孵育并检查它们产生母体酸6的裂解。
将化合物7、8、9和13以0.01mg/mL的终浓度加入到大鼠血液(含有EDTA)中，于37℃孵育。在时间2、30、60、120和180分钟取样，使用SPE柱进行提取。简言之，将样品(0.1mL)转移到2mL丙烯管中，加入内标物。通过加入0.1M KH2PO4水溶液将样品稀释至1mL体积。将样品涡旋5分钟，于3000rpm离心5分钟。将Oasis MAX柱(1cc/30mg)相继用1mL MeOH和1mL水进行了调节。将上层液以1-2mL/min的流速转移到已调节的柱中。用在水中的2％ NH4OH和30％ MeOH(含有2％甲酸)以1-2mL/min洗涤柱子。最后，用80％ MeOH(含有2％甲酸)以1-2mL/min洗脱出分析物。将萃取液转移到自动采样瓶中，立即通过LC/MS进行了分析。将样品与6的标准校准曲线进行了比较。
在提取后将各化合物的2分钟时间的样品进行系列稀释，通过LC-MS进行分析以确保它们在3-100％浓度范围内的响应是线性的。在与HPLC偶联的装配有电雾化源的Bruker Daltonics Esquire 3000+质谱仪上进行了LCMS。HPLC条件为20％ B进行1分钟，然后历经7分钟进行线性梯度至100％B，在100％ B下进行2分钟的等浓度时期。进样体积0.05mL。HPLC在Waters Symmetry C83.5微米柱(50mm×2.1mm)上以如下流动相进行流动相A在水中的0.1％甲酸；流动相B在乙腈中的0.1％甲酸；流速1mL/分钟。
化合物6在m/z 474处显示出强[M-H]-离子。该分子种类的碎裂产生了于m/z 271和412处具有强离子的光谱。可以理想地选择m/z 412处的子离子进行定量。
使用这些方法，酰胺衍生物9和13不裂解产生任何母体化合物6。两种酯衍生物7和8迅速裂解产生母体化合物6。7裂解的半衰期估计为12分钟，8的裂解速率太快以致于使用该方案不能计算。
根据这些数据，认为酯衍生物7和8可用作6的潜在前药。酰胺衍生物不能作为6的前药起作用。
实施例11生物学数据-疏螺旋体素衍生物的抗癌活性的体外评价 如通用方法所述、使用修改的碘化丙啶试验进行了受试化合物在一组人肿瘤细胞系中在单层增殖试验中的抗癌活性的体外评价。该筛选可以用作化合物在抑制一般的细胞生长中毒性作用的模型。
结果显示在下表III中；除化合物1和6的结果代表一式两份实验的平均值之外，各结果代表一式三份实验的平均值。
表III-体外细胞系数据
化合物9、10、11、12、13和14在1μM很少或不抑制细胞生长，因此，可以说这些化合物具有相对良好的安全性能。化合物7和8相对于化合物6本身有了提高，而化合物6相对于化合物1有了提高。
实施例12生物学数据-使用鸡绒毛尿囊膜(CAM)试验进行的疏螺旋体素衍生物的抗血管生成活性的评价 在标准蛋孵育箱中于37℃将新鲜的受精蛋孵育3天。在第3天，在无菌条件下将蛋打开，将胚胎置于20×100mm塑料板中，于37℃在底架带有蓄水池的胚胎孵育箱中培养。使用小泵将空气连续通入蓄水池中以使孵育箱中的湿度保持恒定。在第6天，将无菌的硅“o”形环置于各CAM上，在无菌罩中将溶解在10μl 0.5％甲基纤维素中的固定量的受试化合物传递到各“o”形环中。加入受试物质后，将胚胎送回孵育箱。对照胚胎仅接受10μL载体。在第8天，将胚胎从孵育箱中取出，保持在室温下，同时使用图像捕获系统在160×的放大倍数下在各“o”形环下测定了血管密度。
使用血管生成评分系统半定量地测定了血管密度，在该评分系统中，使用了指数数字1至32来表示在CAM上在处理部位处存在的血管数目。数字32代表最高的密度，0代表没有血管生成。使用该部位所记录的得分除以由各单独实验的适宜对照样品所得到的平均得分而计算了在各给药部位处的抑制百分数。通过将对该剂量所得到的所有结果进行汇合而计算了给定化合物的各剂量的抑制百分数。
结果显示在下表IV中；各平均血管密度得分代表十份实验的平均值。通过由100减去来自表III的在1uM的平均％T/C而计算了在1uM的癌细胞系的抑制百分率。CAM脉管系统的抑制与体外癌细胞的抑制的较高比值将提示，与一般细胞生长抑制或tRNA合成酶活性相比，抗血管生成活性相对增加。
表IV-CAM试验数据以及癌细胞抑制与血管生成抑制的比值 根据该数据，显示9的抗血管生成治疗指数(抗血管生成与一般细胞抑制的比值)尤其地好，7和9与1和6相比有了提高。
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1.根据下式(I)的化合物或其可药用盐
式(I)
其中
R1和R2各自独立地代表H、SR3或C1-C4烷基，其可以任选被一个或多个选自OH、F、Cl或SR3的基团所取代，其中R3代表H、CH3或COCH3；或者，R1和R2与它们所连接的碳一起代表任选被一个或多个卤素原子或者一个或多个C1至C3烷基所取代的4元环烷基环；
R4代表
或-NHNHC(O)R8，其中R8代表生物素、H或任选被一个或多个选自OH、F、Cl的基团所取代的C1-C4烷基；
X代表-NH-或-O-；
Y代表-NH-、-O-或-CH2-；
R5代表H或-(CH2)nR6，
n代表1至3的整数；
R6代表H、-OH、-OCH3、-CO2R7或任选被一个或多个选自OH、F、Cl、-CO2R7、-COR7的基团所取代的C1至C4烷基，其中R7代表C1-C4烷基；
或者R6代表
i)6元芳香族环，
ii)含有1至3个N、S或O原子的5至7元杂芳香族环，
iii)5-7元环烷基，或
iv)含有1至3个N、S或O原子的5-7元杂烷基环，
以上i)至iv)各自可以任选被一个或多个选自CH3、OCH3、F、Cl或Br的基团所取代；且
R9代表CN、CO2H、CH3或CONH2，
但是，条件是当X代表-O-时，则R5不代表H。
2.根据权利要求1的化合物，其中R9代表CN。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表4元环烷基环。
4.根据权利要求3的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环。
5.根据权利要求1至4任一项的化合物，其中R4代表
6.根据权利要求1至5任一项的化合物，其中X代表-O-。
7.根据权利要求1至5任一项的化合物，其中X代表-NH-。
8.根据权利要求1至7任一项的化合物，其中n代表1。
9.根据权利要求1至7任一项的化合物，其中n代表2。
10.根据权利要求1至9任一项的化合物，其中R6代表含有1至3个N、S或O原子的6元杂芳香族环。
11.根据权利要求10的化合物，其中R6代表含有一个N原子的6元杂芳香族环。
12.根据权利要求11的化合物，其中R6代表
或
13.根据权利要求1至9任一项的化合物，其中R6代表含有1至3个N、S或O原子的6元杂烷基环。
14.根据权利要求13的化合物，其中R6代表
15.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-O-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
16.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-O-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
17.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
18.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
19.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
20.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表1且R6代表
21.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表-(CH2)nR6，其中n代表2且R6代表
22.根据权利要求1或权利要求2的化合物，其中R1和R2与它们所连接的碳一起代表仅被R4取代的4元环烷基环，所述的R4代表
其中X代表-NH-且R5代表H。
23.根据权利要求1的化合物，所述化合物是
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-羟基乙基))吗啉酯；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-(2-羟基乙基)吡啶酯；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-(2-氨基乙基))吗啉酰胺；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(4-氨基甲基)吡啶酰胺；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-氨基甲基)吡啶酰胺；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(2-氨基甲基)吡啶酰胺；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素(3-(2-氨基乙基))吡啶酰胺；
17-去(环戊烷-2-甲酸)-17-(环丁烷-2-甲酸)疏螺旋体素酰胺；
或其任一种的可药用盐。
24.用作药物的根据权利要求1至23任一项的化合物。
25.在治疗癌症或B细胞恶性病中用作药物的根据权利要求1至23任一项的化合物。
26.药物组合物，包含权利要求1至23任一项的化合物以及一种或多种可药用稀释剂或载体。
27.治疗癌症或B细胞恶性病的方法，该方法包括给患者施用有效量的权利要求1至23任一项的化合物。
28.权利要求1至23任一项的化合物在制备用于治疗癌症或B细胞恶性病的药物中的用途。
29.在治疗其中血管生成有牵连的眼紊乱中用作药物的权利要求1至23任一项的化合物。
30.根据权利要求29的化合物，其中眼紊乱是糖尿病性视网膜病。
31.根据权利要求29的化合物，其中眼紊乱是年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成和早产儿视网膜病。
32.制备如权利要求1至23任一项中所定义的式(I)化合物或其可药用盐的方法，该方法包括
(a)采用下文(i)至(viii)中描述的任一种方法使式(II)化合物或其被保护的衍生物进行反应
其中R1、R2和R9如权利要求1至23任一项中所定义，
(i)使由式(II)化合物形成的酰基氯与适宜的醇或胺反应；
(ii)在碳二亚胺和碱的存在下将式(II)化合物直接酯化或酰胺化；
(iii)将由式(II)化合物形成的酯与适宜的醇进行酯交换；
(iv)使式(II)化合物的甲基酯与适宜的胺反应；
(v)由式(II)化合物形成活性酯，然后与适宜的醇或胺反应；
(vi)由式(II)化合物形成混合酸酐，然后与适宜的胺反应；
(vii)将来自式(II)化合物的混合酸酐用金属氢化物还原为醇；
(viii)使由式(II)化合物制备的伯醇进行烷基化和酰化；
或者
(b)将式(I)化合物或其盐转化为其它式(I)化合物或它的其它可药用盐；或者
(c)将被保护的式(I)化合物脱保护。
全文摘要
本发明涉及疏螺旋体素的衍生物，它们可用于医药，例如可用于治疗癌症或B细胞恶性病或者其中血管生成对病理起作用的其它疾病、包括眼紊乱如糖尿病性视网膜病以及年龄相关性黄斑变性(AMD)、角膜新生血管形成和早产儿视网膜病。本发明还提供了制备这些化合物的方法以及它们在医药、特别是在治疗和/或预防癌症或B细胞恶性病和其中血管生成在病理过程中有牵连的其它疾病。
文档编号A61K31/335GK101442999SQ200780017320
公开日2009年5月27日 申请日期2007年5月17日 优先权日2006年5月19日
发明者B·威尔金森, S·莫斯, M·张 申请人:百奥帝卡技术有限公司