通过向载体病毒蛋白中直接转座子介导插入外源免疫决定簇构建重组病毒疫苗的制作方法

专利名称：通过向载体病毒蛋白中直接转座子介导插入外源免疫决定簇构建重组病毒疫苗的制作方法
专利说明通过向载体病毒蛋白中直接转座子介导插入外源免疫决定簇构建重组病毒疫苗 发明领域 本发明涉及通过向载体病毒蛋白中直接转座子介导插入外源免疫决定簇构建重组病毒疫苗及相应的组合物和方法。

背景技术：
接种是医学领域最大的成就之一，使数百万人免受毁灭性疾病的作用。在疫苗广泛使用之前，仅在美国了每年有成千上万的儿童和成人死于感染性疾病，世界范围内更多。接种被广泛用于预防和治疗细菌、病毒和其他病原体引起的感染。在接种中使用数种不同的方法包括给与杀灭的病原体、减毒活病原体和非活性的病原体亚单位。在病毒感染中，已发现活疫苗可带来最强效和持续的保护性免疫应答。
已研发抗黄病毒的减毒活疫苗，它们是一般通过被感染的蚊子和蜱传播的体积小有包膜的正链RNA病毒。黄病毒科的黄病毒种包括约70种病毒，其中的大部分例如黄热病(YF)、登革热(DEN)、日本脑炎(JE)和蜱传脑炎(TBE)为主要的人类病原体(参考Burke和Monath，Fields Virology，第4版1043-1126，2001)。
在研发黄病毒的疫苗中使用了不同的方法。例如对于黄热病毒通过连续传代研发了两种疫苗(黄热17D和法国嗜神经性疫苗)(Monath，“Yellow Fever，”Plotkin和Orenstein，Vaccines，第3版，Saunders，Philadelphia，第815-879页，1999)。另一种用于接种的黄病毒减毒方法涉及构建嵌合黄病毒，其包括两种(或更多)不同黄病毒的组分。理解如何构建这些嵌合体需要解释黄病毒基因组的结构。
黄病毒蛋白由翻译单一的长阅读框以生成多聚蛋白然后通过宿主和病毒蛋白酶组合对该多聚蛋白一系列复杂的翻译后蛋白水解裂解生成成熟的病毒蛋白质产生(Amberg等，J.Virol.738083-8094，1999；Rice，“Flaviviridae，”In Virology，Fields(编辑)，Raven-Lippincott，NewYork，1995，第I卷，第937页)。该病毒的结构蛋白以C-prM-E的顺序排列在多聚蛋白中，其中“C”为衣壳，“prM”为病毒包膜结合膜(M)蛋白的前体，“E”为包膜蛋白。这些蛋白质存在于多聚蛋白的N端区域而非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)位于该多聚蛋白的C端区域。
已制备了包括来自不同黄病毒的结构和非结构蛋白的嵌合黄病毒。例如所谓的ChimeriVaxTM技术应用了黄热病毒17D的衣壳和非结构蛋白传递其他黄病毒的包膜蛋白(prM和E)(参见，例如，Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999)。这一技术已用于研发抗登革热、日本脑炎(JE)、西尼罗(WN)和圣路易脑炎(SLE)病毒的候选疫苗(参见，例如，Pugachev等，New Generation Vaccines，第三版，Levine等编辑，Marcel Dekker，New York，Basel，第559-571页，2004；Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999；Guirakhoo等，Virology 257363-372，1999；Monath等，Vaccine 171869-1882，1999；Guirakhoo等，J.Virol.745477-5485，2000；Arroyo等，Trends Mol.Med.7350-354，2001；Guirakhoo等，J.Virol.784761-4775，2004；Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004；Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003；Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004；和Pugachev等，Am.J.Trop.Med.Hyg.71639-645，2004)。
基于ChimeriVaxTM的疫苗已显示出更有利的性质，例如就以下性质而言在底物细胞中复制、在小鼠模型中低神经毒性、在猴子模型中高减毒性、体外和体内高遗传和表型稳定性、在蚊子中的无效复制(对于预防自然界中的不可控传播非常重要)以及单次剂量给予后可在小鼠、猴子和人中诱导强效的保护性免疫而不会引起免疫后副作用。确实，ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒，包含来自SA14-14-2 JE病毒(在中国使用的减毒活JE)的prM-E基因，已成功进行了临床前和I期和II期临床试验(Monath等，Vaccine 201004-1018，2002；Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003)。相似地，已对ChimeriVaxTM-WN候选疫苗进行了成功的I期临床试验，其包含来自西尼罗病毒的prM-E序列，在E蛋白中掺入了3个特异氨基酸改变以增强减毒(Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004)。
已进行了其他减毒方法，例如黄病毒诱变，包括嵌合黄病毒。这些方法包括例如在包膜蛋白中引入替换、在3’未翻译区内的缺失和衣壳蛋白中的缺失(这些突变的实例参见以下参考文献Men等，J.Virol.703930-3937，1996；Mandl等，J.Virol.722132-2140，1998；Durbin等，AJTMH 65405-413，2001；Pletnev，Virology 282288-300，2001；Markoff等，J.Virol.763318-3328，2002；Kofler等，J.Virol.763534-3543，2002；Whitehead等，J.Virol.771653-1657，2003；Pletnev等，Virology 314190-195，2003；Pugachev等，Int.J.Parasitol.33567-582，2003；Bredenbeek等，J.Gen.Virol.841261-1268，2003；美国专利第6184024 B1号；WO 02/095075；WO 03/059384；WO03/092592；WO 03/103571；WO 2004/045529；和WO 2006/044857)。在另一方法中，使用转座子检测该ChimeriVaxTM-JE包膜蛋白E的允许插入位点。根据这一方法，用预期外源肽替代活突变病毒的插入转座子(参见，例如WO 02/102828)。
Mason和其同事最近发表了基于假感染性病毒颗粒(PIV)的黄病毒疫苗(RepliVax)构建方法(Mason等，Virology 351432-443，2006)。在黄病毒PIVs(迄今描述了YF 17D和WN病毒)中，该衣壳蛋白基因缺失，除了占据C约20个N端密码子的5’环化信号序列。在以反式提供C蛋白的细胞中增殖PIV。C蛋白对于PIV包装入子代病毒(PIV)颗粒中是必需的。收集细胞培养上清中已包装的PIVs并用作单周期复制疫苗，其可诱导强效的抗体应答(由于空病毒颗粒的分泌)以及几乎完整的T细胞应答武器库。这一方法的强效部分是由于黄病毒(例如，YF 17D)以及PIV感染树突状细胞和活化多重TLR途径增强免疫应答的能力(Palmer等，J.Gen.Virol.88148-156，2007；Querec等，J.E.M.203413-424，2006)。
除了用作抗黄病毒感染的疫苗之外，已提议使用黄病毒例如嵌合黄病毒作为传递其他非黄病毒抗原的载体。在这一使用的一个实施例中，描述了向YF17D包膜蛋白E中插入外源肽的合理方法，这基于对黄病毒颗粒四级结构的认识，如冷冻电子显微镜分析并将已知的E蛋白二聚体X射线结构拟合入电子密度图中(Rey等，Nature375291-298，1995；Kuhn等，Cell 108717-725，2002)。已分析出融合后构象的E蛋白三聚体的三维结构(Modis等，Nature 427313-319，2004；Bressanelli等，EMBO J.23728-738，2004)。Galler和其同事检测了E蛋白二聚体和三聚体的3D结构并推论二聚体化结构域II的fg环应以二聚体和三聚体构象暴露与溶剂中。他们使用该环向YF17D病毒的E蛋白中插入疟疾的体液和T细胞表位并回收一些活突变体(Bonaldo等，J.Virol.798602-8613，2005；Bonaldo等，J.Mol.Biol.315873-885，2002；WO 02/072835)。然而使用这一方法不能确保就有效病毒复制、免疫原性和稳定性而言所选位点允许/最适于插入各预期的外源肽(Galler等一些数据所证明)。而且，这一方法不可用于3D结构未知的病毒蛋白(例如，黄病毒的prM/M、NS1和大多数其他NS蛋白)。
在其他方法中，如果在病毒ORF中基因间插入则可在黄病毒载体中表达外源免疫原蛋白/肽。例如，Andino及其同事尝试在YE17D病毒多聚蛋白的数个位点表达侧接病毒NS2B/NS3蛋白酶裂解位点的模型8-氨基酸抗肿瘤CTL表位，例如NS2B/NS1连接(McAllister等，J.Virol.749197-9205，2000)。其他人已使用NS2B/NS1位点表达流感病毒的免疫显性T细胞表位(Barba-Spaeth等，J.Exp.Med.2021179-1184，2005)。Tao等在YF 17D病毒中的NS2B-NS3连接表达了疟疾寄生虫的10-氨基酸CTL表位并显示出对被寄生虫攻击小鼠的良好保护(Tao等，J.Exp.Med.201201-209，2005)。最近我们在E/NS1连接表达了流感病毒的M2e肽(美国序列号60/900672)，Bredenbeek也成功在E/NS1连接表达了拉沙病毒的糖蛋白前体(Bredenbeek等，Virology345299-304，2006)。也可使用其他基因连接。在其他方法中，已双顺反子表达外源肽(例如，在3’UTR中)。在其他方法中，单周期黄病毒已开发成抗各种病原体的候选重组疫苗，并验证了出重组复制子的免疫原性潜质(Jones等，Virology 331247-259，2005；Molenkamp等，J.Virol.771644-1648，2003；Westaway等，Adv.Virus.Res.5999-140，2003；Herd等，Virology 319237-248，2004；Harvey等，J.Virol.777796-7803，2003；Anraku等，J.Virol.763791-3799，2002；Varnavski等，J.Virol.744394-4403，2000)。在复制子中，缺失prM和E包膜蛋白基因或C-prM-E基因。因此，其可在细胞内复制但不能生成病毒子代(因此为单周期复制)。当以反式提供prM-E或C-prM-E基因时其可包装入病毒颗粒中。感兴趣的外源抗原可适当插入缺失部位。就RepliVax而言，免疫后为单周期复制，不会进一步扩散至周围细胞/组织，得到对已表达的异种抗原的免疫应答。或者可通过接种裸露DNA或RNA形式的复制子进行免疫。在其他方法中可在RepliVaxPIVs中表达外源免疫原，例如取代缺失的C基因(Mason等，Virology351432-443，2006)。
流冒背景知识。在这一应用中流冒免疫原用作模型抗原。流感病毒是全世界急性呼吸疾病的主要诱因。仅在美国每年的爆发可引起多于100000人住院以及20000至40000人死亡(Brammer等，MMWRSurveill.Summ.511-10，2002Lui等，Am.J.Public Health 77712-6，1987；Simonsen，Vaccine 17S3-10，1999；Thompson等，JAMA289179-186，2003)。由于每年的流感世界范围内约20％的儿童和5％的成人生病。历史上有三种亚型的流感A病毒在人群中传播，H1N1、H2N2和H3N2。从1968年以来，几乎只有H1N1和H3N2传播(Hilleman，Vaccine 203068-3087，2002；Nicholson等，Lancet 3621733-1745，2003；Palese等，J.Clin.Invest.1109-13，2002)。流感B病毒，其只有一种确定的亚型，也在人类中传播，但是通常只引起比流感A病毒更轻微的疾病。目前的灭活疫苗包含三种组分，基于筛选的H1N1和H3N2流感A株和流感B株(Palese等，J.Clin.Invest.1109-13，2002)。周期性大流行病，例如1918年的H1N1大流行病可引起数百万人的死亡。流感专家认为另一种流感大流行病是不可避免的并且可能即将来临(Webby and Webster，Science 3021519-1522，2003)。目前H5N1禽流感的爆发-史上最大的一次，由对人类高致死株引起-可能(通过变异和/或遗传重组)成为可造成严重后果的大流行病株。2003年在荷兰发生了又一次令人震惊的状况，在养禽业工作者中爆发了高致病性H7N7禽流感。可引起大流行病的其他亚型为H9和H6病毒。虽然比H5和H7的毒力小，但是在过去10年中二者已从水禽传播至家禽。此外，在猪和人中已检测到H9N2病毒(Webby and Webster，Science3021519-1522，2003)。尽管在过去数年中对禽病毒的大量关注，但人们仍然对传统的H1、H2和H3亚型病毒心存忧虑，因为由于新的抗原性不同株的引入可能会出现高毒力株。例如，H2病毒属于高风险类别，因为它们是1957年“亚洲”流感流行的诱因，并持续地在野鸭和家鸭中循环。
目前预防和控制流感疾病的策略为每年针对当年可能传播的病毒株进行免疫。最被认可的流感疫苗由鸡胚蛋生产并由灭活的完整病毒粒子或部分纯化的病毒亚单位(“片段”疫苗)组成。这些疫苗在正常健康成人中70至90％有效(Beyer等，Vaccine 201340-1353，2002)。然而在老年人中的对抗疾病的有效性较低。美国和前苏联有鼻内给药的减毒活疫苗，其也由鸡胚蛋生产(Treanor等，InNew GenerationVaccines，第3版.Levine编辑，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557页，2004)。美国疫苗(

)未批准用于5岁以下的儿童和55岁以上的人，他们却是流感疫苗的主要目标人群。因为免疫系统识别的主要流感血凝素和神经氨酸酶蛋白经突变和重排不断变化，疫苗组分每年也需要改变以反映即将流行的病毒株的抗原性特征。因此现有疫苗必须每年制备，在流感季节之前制备并且不能贮存用于大流行病。此外，使用鸡胚蛋白生产的效率很低。每只蛋只能生产1至2人剂量的灭活疫苗。提供足够的无病原体的鸡蛋是目前生产传统疫苗的瓶颈。甚至在大流行病期间通常需要6个月生产足够量的年度流感疫苗(Gerdil，Vaccine 211776-1779，2003)。正努力进行多种研发以在细胞培养中生产流感疫苗。然而，这一方法也存在许多挑战，尤其是使用未经认可的细胞系。不论是使用鸡蛋或细胞培养进行疫苗生产都必须应用反向遗传学和遗传重排方法将预期生产疫苗的新流行病毒株转化成可复制足够滴度用于生产的生产株。所有这些与传统流感疫苗相关的特点流感在大流行病的情况下均不适用。
基于重组血凝素(HA)或由腺病毒或α病毒传递的HA研发新颖流感疫苗可提高生产效率，但是并不能解决每年遗传漂移的问题和每年重新构建疫苗的要求。
总而言之，公认目前的流感疫苗需面对以下挑战 1.就疫苗和病毒株匹配差而言的低效率；活适冷型病毒对年龄范围的限制。
2.需要每年生新疫苗以解决病毒的抗原改变。
3.疫苗产量低。
4.构建适当的重排病毒用于生产需要的时间。
5.生产能力不足以满足大流行病的需要。
6.大规模生产灭活抗原病毒中的生物安全问题。
7.对鸡蛋产品过敏的被接种者中或由于一些活适冷型病毒疫苗减毒不足引起不良反应(Treanor等，InNew Generation Vaccines，第3版.Levine编辑，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557页，2004)。
流感疫苗学的“圣杯”为可引起对所有流感株的广谱、长期保护性免疫并可高产量生产、成本低、可贮存的单一产品。
所有有效的传统流感疫苗可引起抗HA的病毒中和抗体，其目前代表了免疫相关保护。但是HA的免疫原性每年都会变化。近年来，其他流感病毒蛋白也吸引人们的注意成为疫苗靶标。M2蛋白，由其是M2的胞外区结构域(M2e)在流感A病毒中是高度保守的。图9A显示了我们对之前和最近的人和禽M2e序列的比对(来自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html)。不仅人流感病毒之间的M2e结构域保守，禽病毒M2e序列也紧密排列(closely aligned)。最高水平的序列保守位于M2e蛋白的N端部分。因此非常值得注意的是已显示M2e肽的N端13个氨基酸(比对中的阴影部分)是诱导保护性抗体的主要原因(Liu等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.35141-146，2003；Liu等，Immunol.Lett.93131-136，2004；Liu等，Microbes.Infect.7171-177，2005)。这引起通用流感A病毒疫苗的概念和希望。
M2e代表了M2的外23-氨基酸部分，其为病毒蛋白的一小部分。尽管在流感病毒粒子中不显著，但是M2在病毒-感染细胞的表面表达丰富。但是，在普通的流感病毒感染中或用传统疫苗接种时，对M2或M22决定簇的抗体应答非常小。而且，对于M2蛋白的非病毒中和单克隆抗体显示在被动转移的流感死亡小鼠模型中具有保护性(Fan等，Vaccine 222993-3003，2004；Mozdzanowska等，Vaccine 212616-2626，2003；Treanor等，J.Virol.641375-1377，1990)。基于这些结果，许多疫苗研发者对M2和其高度保守M2e结构域作为流感A疫苗组分具有极大的兴趣。
M2或M2e抗体不中和病毒而是充分降低有效病毒复制以保护免受症状性疾病。公认由M2引起的保护机制涉及NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。M2e胞外区结构域的抗体(主要是IgG2a亚类)可识别被病毒感染细胞上展示的表位，其决定了由NK细胞消除感染细胞(Jegerlehner等，J.Immunol.1725598-1605，2004)。由于由M2引起的免疫性不是杀灭性的，感染之后存在有限的病毒复制，其可用于激活广谱抗流感免疫应答。就理论而言，这可导致对之后遇到相同病毒或异源株更长更强的免疫记忆和更好的保护(Treanor等，InNew Generation Vaccines，第三版.Levine编辑，M.M.New York，BaselMarcel Dekker；第537-557页，2004)。
Walter Fiers及其同事(Ghent University，比利时)是验证基于M2e的疫苗潜质的先驱。他们将M2e决定簇基因融合至乙肝病毒核心蛋白，当在细菌中表达时可得到乙肝病毒核心蛋白表面上的M2e递呈(HBc)(Fiers等，Virus Res.103173-176，2004；Neirynck等，Nat.Med.51157-1163，1999)。这些HBc-M2e颗粒在小鼠和白鼬中显示出免疫原性并在各物种的流感病毒攻击模型中具有保护性。
另一种保守流感病毒结构域为HA前体蛋白的成熟裂解位点HA0。它的高度保守(Macken等，Osterhaus，A.D.M.E.，Cox，N.，Hampson A.W.编辑，Options for the control of influenza IV.ElsevierScience，Amsterdam，The Netherlands，第103-106页，2001)是由两个功能约束引起的。首先，该序列必须保持宿主蛋白酶的适当底物以释放两个成熟的HA亚单位，HA1和HA2。其次，HA2的N端包含对于感染非常重要的融合肽(Lamb和Krug，InFields Virology.第4版.Knipe编辑，D.M.，Howley，P.M.，Griffin，D.E.，等PhiladelphiaLippincottWilliams and Wilkins；第1043-1126页，2001)。融合肽在流感A和B病毒中均是保守的。在最近的报道中，Bianchi及其同事(Bianchi等，J.Virol.797380-7388，2005)验证了流感B病毒的结合HA0裂解肽可在小鼠中引起抗原性不同流感B病毒谱系致命攻击的保护性免疫。值得注意的是结合A/H3/HA0肽也可保护被免疫小鼠免受流感B病毒的攻击。-1位的严格保守精氨酸(裂解位点前的最后一个HA1残基)以及+3和+9苯丙氨酸残基(HA2的第3和第9个残基)对于单克隆抗体的结合非常重要。因此，肽的保守C端部分显示与保护相关，表明制备基于HA0裂解结构域的通用型A和B人流感病毒疫苗的可能性。我们对人(H1、H2、H3和B)HA0和所有可用禽流感HA0序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU/html)的比对得到图9B所示的共有序列(对于抗体结合和免疫原性重要的区域加阴影)。
最近，可适用可捕获各种表位数据(www.immuneepitope.org)的综合性在线数据库(The Immune Epitope Database and Analysis Resources(IEDB))。综合分析这些数据并鉴定出许多交叉保护流感表位，其可适用于构建通用疫苗(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007和补充表格)。鉴定了B细胞和T细胞二者的可能表位(包括我们下面使用的H3N2的HA保护性表位)。绝大多数B细胞表位具有构象，因此体积巨大。然而，可以通过本申请描述的直接随机插入法鉴定出这些更长表位的允许位点，例如在ChimeriVax病毒的分泌蛋白中。我们找到的用于更短插入片段的一些高度允许位点可允许长插入片段(例如，在ChimeriVax-JE的prM蛋白中，见下文)。
人们正在研究各种M2e亚单位疫苗方法，包括肽结合物和表位展示颗粒。然而这些方法需要强效的佐剂以增强这些弱免疫原的免疫原性。这就M2e(以及很可能HA0)而言尤其其重要。由于所提出的保护机制(ADCC)，需要高水平的特异抗体以达到效力。普遍认为正常血清IgG在NK细胞上与特异(抗M2e)IgG竞争Fc受体，其为保护的主要介导子。因此需要研发通用大流行流感疫苗的替代方法。上述流感的医学重要性、提高通用流感疫苗的需要以及流感病毒的适当表位/抗原的可用性提供了重要病原体的一个实例，可使用本申请描述的方法生产抗该病原体的新疫苗。本申请描述的方法可等同地应用于抗其他病原体的新/改良疫苗的构建，如下文所述。
发明概述 本发明提供生成包括一个或多个编码一个或多个异源肽的病毒基因组的方法。这些方法包括以下步骤(i)提供一个或多个目标病毒基因(例如，在一个或多个穿梭载体中或在完整病毒基因组背景(context)中)；(ii)诱变目标病毒基因以随机插入插入位点；以及(iii)将编码异源肽的核酸分子连接至目标病毒基因诱变的随机位点中。该方法可进一步包括步骤(iv)用基因组核酸文库转染细胞以启动病毒复制，然后(v)筛选活的(有效复制的)病毒重组子使可有效递呈插入的肽。当在一个或多个穿梭载体的背景下进行时，该方法可进一步包括将包括编码异源肽的核酸分子库的目标病毒基因引入可衍生该目标病毒基因的病毒基因组中以替代相应的无插入片段的病毒基因的步骤。
本发明方法也包括通过将病毒基因组引入细胞(例如Vero细胞)从病毒基因组生成病毒载体以及从细胞或其上清中分离病毒载体。此外，用于本发明方法的目标病毒基因可从之前用于本方法(或通过其他方法包含插入片段)的病毒或无插入片段的病毒获得。
本发明方法也包括诱变两个或更多(例如，2、3、4或更多个)包括两个或更多(例如，2、3、4或更多个)目标病毒基因的穿梭载体并向病毒基因组中引入两个或更多个(例如，2、3、4或更多个)包括编码一个或多个异源肽的核酸分子的目标病毒基因替代(in theplace of)无插入片段的对应病毒基因。
本发明方法的诱变步骤可涉及通过转座子诱变向目标病毒基因中同时或依次引入一个或多个转移引物(transprimers)。这些转移引物可通过内切核酸酶消化移除，然后可通过在限制性内切核酸酶消化位点的连接向目标病毒基因中引入编码异源肽的核酸分子。而且，本发明方法可涉及生成突变目标基因的文库。
应用于本发明方法的病毒基因组可为黄病毒基因组，例如嵌合黄病毒，例如包括一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白和第二种不同黄病毒的膜前(pre-membrane)和包膜蛋白的嵌合黄病毒。在这些实例中，第一和第二种黄病毒可独立选自例如日本脑炎、登革热-1、登革热-2、登革热-3、登革热-4、黄热病、墨累谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、昆津、罗氏脑炎、伊利乌斯脑炎、蜱传脑炎、俄罗斯春夏型脑炎、基亚萨努森林病、鄂木斯克出血热、跳跃病、波瓦生、根岸、阿布塞塔罗夫、汉萨洛瓦(Hansalova)、阿泊依(Apoi)和海普病毒。此外，本发明可应用完整的黄病毒基因组(例如黄热病毒基因组，例如YF17D)。
应用于本发明方法的目标病毒基因可例如选自编码包膜、衣壳、膜前、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的基因。
根据本发明方法引入病毒基因组的异源肽可包括一个或多个疫苗表位(例如，B细胞表位和/或T细胞表位)。该表位可衍生自病毒、细菌或寄生虫病原体的抗原。例如，该表位可衍生自流感病毒(例如人或禽流感病毒)。就流感病毒表位而言，该异源肽可包括例如流感病毒M2e肽或包括流感血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽。在另一个实例中，该表位衍生自肿瘤相关抗原或变应原。下文提供了其他可获得异源肽的来源(例如病原体)以及这些肽和表位的实例。
本发明也包括通过本文所述任何方法生成的病毒基因组或其组合。而且，本发明包括由这些病毒基因组编码的病毒载体，包括这些病毒载体的药物组合物以及药学可接受的载体或稀释剂，以及给予患者肽的方法，其涉及给予患者这些药物组合物。在该类方法的一个实例中，所述肽为抗原，进行给药以诱导针对该抗原衍生自的病原体或肿瘤的免疫应答。
本发明也包括包括不论是否由本文所述方法生产的黄病毒载体，其包括一个或多个被插入一个或多个选自衣壳、前膜、包膜NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的蛋白的异源肽。黄病毒可为例如黄热病毒(例如，YF17D)或嵌合黄病毒(例如，包括第一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白和第二种不同黄病毒的膜前和包膜蛋白的嵌合黄病毒)。第一和第二种黄病毒可独立选自例如日本脑炎、登革热-1、登革热-2、登革热-3、登革热-4、黄热病、墨累谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、昆津、罗氏脑炎、伊利乌斯脑炎、蜱传脑炎、中欧脑炎、基亚萨努森林病、俄罗斯春夏型脑炎、鄂木斯克出血热、跳跃病、波瓦生、根岸、阿布塞塔罗夫、汉萨洛瓦、阿泊依和海普病毒。
本发明进一步包括对应于上文和本文其他部分描述的黄病毒载体的核酸分子或其互补体；包括这些病毒载体的药物组合物和药学可接受的载体或稀释剂；以及通过给予这些组合物向患者传递肽的方法。在这些方法的一个实例中，所述肽为抗原，进行给药以诱导针对衍生该抗原的病原体或肿瘤的免疫应答。
在具体的实施例中，本发明包括本文描述的黄病毒载体，其包括在非结构蛋白1(NS1)的氨基酸236和237之间插入的异源肽。另一实例，其可单独存在或与其他插入片段组合组合(例如NS1插入片段)，为包括插入载体的膜前蛋白的氨基端区域的异源肽。该插入片段可位于例如衣壳/膜前裂解位点前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位(或其组合)。而且，该膜前蛋白插入可任选包括可辅助从膜前蛋白中移除肽的溶蛋白性裂解位点。
可包括于本发明载体中的肽的具体实例包括流感(例如人或禽)M2e肽或包括流感(例如人或流感)血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽。下文和本文其他部分提供了其他实例。此外，该载体可包括多于一种的异源肽，例如人和禽流感M2e肽。此外，本发明载体可包括一个或多个本文所述第二位点适应(adaptations)，其可提供改良的载体性质(例如，改良的生长特性) 本发明也包括对应于本文所述黄病毒载体基因组的核酸分子或其互补体。而且，本发明包括包括病毒载体的医药组合物。该组合物可任选包括一种或多种药学可接受的载体或稀释剂。此外，该组合物可任选包括佐剂(例如，铝化合物，例如明矾(alum))。组合物也可为冻干形式。
本发明也包括向受试者(例如人类患者或动物例如家养动物或家畜)传递肽的方法，其涉及给予本文所述的组合物。在一个实例中，进行给药以诱导针对衍生该抗原的病原体或肿瘤的免疫应答。在其他实例中，该方法涉及给予亚单位疫苗。在这些实例中，可同时给予黄病毒载体和亚单位疫苗，黄病毒载体可作为初次剂量给予，亚单位疫苗可作为加强剂量给予或将亚单位疫苗作为初次剂量给予而黄病毒载体作为加强剂量给予。该亚单位疫苗可包括例如与乙肝病毒核心蛋白融合的异源肽(例如，流感M2e肽或包括流感血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽)的乙肝病毒核心颗粒。这些肽可为如本文所述的天然或共有序列。
本发明也包括生产本文所述载体的方法，涉及将编码感兴趣的肽的序列插入经鉴定允许该插入的位点(使用例如本文所述方法)。这些载体可为黄病毒载体(例如，黄病毒载体或如本文所述的嵌合黄病毒(例如，ChimeriVaxTM-JE或ChimeriVaxTM-WN))。用于插入的示例性位点包括NS1-236和衣壳/膜前裂解位点前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位。
此外，本发明包括通过例如将本文所述任何载体与药学可接受的载体或稀释剂、一种或多种佐剂和/或一种或多种其他活性试剂(例如亚单位疫苗)混合生产药物组合物的方法。
本发明也包括在制备用于本文所述预防和治疗方法的药物中使用本文所述所有的病毒载体、核酸分子和肽。
本发明具有数个优点。例如，如本发明所使用的活疫苗病毒(例如ChimeriVaxTM，黄热病毒或其他活疫苗病毒)可在传递小分子多肽抗原分子(例如流感M2e或HA0裂解位点肽)方面提供提供显著的益处。使用活载体例如基于黄病毒的载体的优点包括(i)疫苗接种后增加抗原质量；(ii)不需要佐剂；(iii)对先天和获得性免疫应答的强烈刺激(例如YF17D为最强效的已知免疫原)；(iv)由于例如ChimeriVaxTM(YF17D)感染抗原递呈细胞例如树突状细胞和巨噬细胞的能力使得更有利进行抗原递呈的可能性；(v)获得可提供终生免疫的单次激发疫苗的可能性；(vi)ChimeriVaxTM疫苗病毒的包膜易于交换，使得可选择不同的重组疫苗，其中一些比其他在不同的地里区域更适合(生产双重疫苗，包括抗地方流行黄热病毒或避免群体中抗-载体免疫)；(vii)将完整活黄病毒载体修饰成被包装的、单周期复制复制子或上述PIVs以消除不良反应几率或最小化依次使用中抗-载体免疫作用的可能性；(viii)将使用本文所述直接随机诱变法插入的表位与其他基因间或双顺反表达或替代复制子中的缺失的抗原或PIVs结合以获得对一种病原体(如果表位和其他已表达的抗原属于相同病原体)或两种或多种病原体(如果表位和其他表达的抗原属于不同的病原体)更强效的免疫应答以及(ix)降低生产成本。
本发明提供的其他优点与以下事实相关本发明的嵌合黄病毒载体被充分减活以达到安全并仍可诱导对衍生嵌合体中蛋白质尤其是插入该嵌合体的肽的黄病毒的保护性免疫。其他安全性来自本发明使用的一些载体为嵌合的因此消除了回复至野生型的可能性这一事实。本发明使用载体的其他优点为黄病毒在细胞的细胞浆中复制，这样病毒的复制策略不涉及将病毒基因组整合入宿主细胞，提供了重要的安全措施。此外，如下文进一步描述，本发明的单一载体可用于传递单个抗原的多个表位或衍生自多于一种抗原的表位。
附加优点为本文描述的直接随机插入法可鉴定病毒蛋白中的广谱允许位点，其可直接用于插入各种其他表位(如下文例证的NS1中的插入位点)以及更长的插入片段。附加优点为一些在一种黄病毒中高度允许的插入位点在其他黄病毒中同样允许，这是由于不同黄病毒蛋白的结构/功能保守性。附加优点为负载表位的重组黄病毒可用作例如亚单位疫苗的加强剂或由例如亚单位或死疫苗组分组成的混合疫苗的协同组分，其与重组病毒组分一起给予使免疫应答显著提高(如下文例证的A25疫苗与ACAM-Flu-A亚单位疫苗混合)。此外，所述随机插入法可应用于任何已重排的黄病毒(或缺陷型黄病毒)基因组，例如在经修饰的TBE病毒中其中的结构蛋白基因被转移至基因组的3’端并在IRES元件的控制下在NS5之后表达(Orlinger等，J Virol.8012197-208，2006)。
从以下的详细描述、附图和权利要求中可显而易见本发明的其他特点和优点。
附图简述

图1为通过转座子介导随机插入共有M2e肽至病毒的prM、E和/或NS1蛋白构建ChimeriVaxTM-JE-flu的图解。使用本图所示的方法也可将C和NS2A-NS5靶向于插入外源肽(例如，T细胞表位) 图2为构建在prM/M、E和NS1基因中包含随机插入的M2e肽的ChimeriVaxTM-JE-flu质粒文库的图解。
图3显示了在ChimeriVaxTM-JE病毒的NS1蛋白中表达流感A病毒共有M2e保护性表位，如病毒空斑染色所显示。感染后4天用抗JE多克隆抗体(A)或抗M2e单克隆抗体染色35-mm孔中的病毒空斑。用抗M2e单克隆抗体(C)染色100-mm培养皿(包含数百个病毒空斑)中的M2e-阳性病毒空斑。
图4为一个表格和一张照片，显示了通过M2e MAb或JE多克隆抗体(左边的表格；滴度最高的克隆以粗体表示)测定的筛选纯化的ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒克隆(最后的纯化步骤之后P2水平的储备)的滴度分析结果，以及克隆之一的染色实例(右边的照片)。这些结果显示克隆的纯度并提供高遗传稳定性的证据。
图5为ChimeriVaxTM-JE载体病毒在NS1基因中具体位置以及通过对病毒克隆A11-A92(包括用于下文所述实验中的克隆A25)测序鉴定的M2e插入片段的核苷酸和氨基酸序列的图解。完整的105-核苷酸插入片段加亮表示。两边均含有侧接GG残基(加入以增加柔性)的M2e肽加框表示。BstBI限制性酶切位点加下划线。由于转座子的作用，在插入片段(加双下划线)的末端复制插入片段(SV)之前的两个病毒氨基酸。
图6A为ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e的克隆A25的图解，其显示了M2e插入片段在病毒基因组中的位置。图6B为显示用M2e和JE-特异性抗体染色在Vero细胞中传代10次的A25病毒空斑的照片。图6C为与ChimeriVaxTM-JE载体病毒相比A25病毒在P2和P12传代时的生长曲线图片。D组图为感染A25病毒或ChimeriVax-JE载体并用抗JE或抗M2e抗体染色的细胞的免疫荧光实例，也显示了A25病毒有效表达M2e肽。
图7为显示第54天M2e特异性IgG总量的图来自2和3免疫组的小鼠血清的连续稀释样品的ELISA OD450值见表5. 图8为表5所示被免疫小鼠在第55天用20 LD50小鼠适应A/PR/8/34流感病毒攻击后的存活曲线的图。
图9为流感A病毒的通用M2e(A)和HA0(B)表位的比对图解。最重要的序列部分(例如抗体结合)加阴影。
图10为可使用本文描述的随机插入法产生的多抗原构建体的实例表达多个流感A病毒免疫原作为多重机制大流行病疫苗的ChimeriVax-JE复制子，例如表达NA或HA替代prM-E基因，随机插入例如NS1中的M2e表位，例如NS3中的免疫显性T细胞表位和插入基因间位点之一(或更多)的附加免疫原。2A自体蛋白酶(来自EMCV或FMDV)可从糖蛋白的剩余部位裂解NA。或者，可使用该IRES元件替代2A自体蛋白酶以重新起始NS蛋白的翻译。可使用多个元件(例如，2A自体蛋白酶、泛素、IRES、用于NA基因的自发(autonomous)AUG)在所环绕位点产生NA的N端。相似地，可使用衍生自不同病原体的抗原产生抗数种病原体的疫苗构建体。
图11为用ChimeriVax-JE/NS1-M2e RNA文库转染并立即用琼脂覆盖以消除病毒克隆之间竞争的Vero细胞的M2e抗体染色培养皿的实例。用于转染的RNA在体外连接的DNA模板上合成，该DNA模板通过连接来自质粒pUC-AR03-rM2e的NS1-M2e基因文库至pBSA-AR3-stop载体获得。
图12.显示了在ChimeriVax-JE病毒的E蛋白中成功表达M2e肽用M2e MAb染色的插入片段突变体的聚集点(foci)。(A)第6天染色的包含起始35-氨基酸M2e的插入片段的变异体(实验2)。(B和C)第4天染色的分别含有17-氨基酸M2e和侧接2个甘氨酸残基的17-氨基酸M2e的变异体(实验3)。
图13显示了串联插入ChimeriVax-JE NS1-236插入位点的人M2e+禽M2e表位。插入片段的总大小为56氨基酸。(A)加入A25病毒的禽M2e表位的图解。(B)该病毒两个变异体的具体序列上组图显示使用禽M2e插入片段的天然密码子构建的M2e人/M2e禽病毒的序列(人M2e加下划线，禽M2e用阴影线加下划线)；底部组图显示相同内容，除了将禽M2e密码子改变成兼并密码子得到更高的遗传稳定性。(C)用JE和M2e抗体染色的M2e人/M2e禽病毒空斑。
图14显示在使用M2e表位鉴定的NS1-236插入位点上ChimeriVax-JE病毒耐受HAtag(流感H3)B/T细胞表位。(A)所回收活病毒的插入序列。(B)用抗HAtag MAb 12CA5染色Vero细胞上的病毒空斑。
图15显示黄病毒prM、E和NS1蛋白中不同形式的外源表位表达。
图16显示了prM蛋白中含有M2e的ChimeriVax-JE插入片段变异体。(A)与ChimeriVax-JE相比在一次实验中测定的M1、M2、M3、M6和M8克隆的空斑实例。(B)prM-M2e克隆对比ChimeriVax-JE载体的生长曲线。
图17为prM中含有Me插入片段的ChimeriVax-JE克隆序列的图解。显示了SignalP 3.0在线程序预测的最可能的信号肽酶裂解位点。
图18显示了A25(ChimeriVax-JE/M2eNS1-236)病毒的ChimeriVax-WN02类似物构建和第6天在琼脂覆盖下形成并用M2eMAb染色的空斑。
图19显示了ChimeriVax-WN02/A25和ChimeriVax-WN02/A25adapt病毒。(A)与A25原型病毒和ChimeriVax-WN02相比第5天在甲基纤维素覆盖下形成的空斑纯化病毒储备物的空斑。(B)Vero细胞中的生长曲线，MOI 0.001。
发明详述 本发明提供生成包括异源肽的病毒载体的方法、包括这些肽的病毒载体、通过给予该活载体例如以诱导对衍生被引入肽所的病原体的免疫应答传递这些肽的方法以及包括这些病毒载体的组合物。这些病毒载体、肽、方法和组合物的相详细容见下文。
本发明的中心特征涉及通过随机向减毒活疫苗病毒蛋白中插入多种病原性生物体的免疫原性肽构建活的重组疫苗以在被感染细胞中有效表达这些肽并递呈给免疫系统，目的在于诱导对目标病原体的强效、长期免疫。对于有效递呈而言，将代表例如B细胞表位的外源肽随机插入病毒蛋白中，例如仅是被感染细胞分泌(例如，NS1和黄病毒prM的氨基末端部分)或病毒颗粒(黄病毒的M和E包膜蛋白)中的蛋白以刺激强效的抗肽抗体应答。肽，例如包括T细胞表位的肽可随机插入非结构病毒蛋白中，其可在被感染细胞内部合成，导致通过MHC I/II复合物向免疫系统递呈外源肽以诱导强效的细胞免疫。在结构蛋白中插入也可导致有效的MHC介导的递呈。
如下文详细说明，根据本发明向病毒基因中随机方式的插入允许筛选最有效复制的重组病毒变异体，提供所插入肽的最大免疫原性(最佳肽构象)和最稳定的表达。也如下文所述，可商业购买的包括例如可移除转移引物的转座子介导插入体系可用作构建本发明重组子的工具。下文的实验实施例部分详细描述了本发明方法。简略而言，在这些实施例中，将在A型流感病毒株中高度保守的流感病毒(也包含T细胞表位)M2蛋白的共有B细胞表位M2e插入ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒的NS1、prM/M和E基因中。经抗M2e抗体识别在NS1、prM/M和E蛋白中观察到表达M2e肽的多个病毒克隆，将其中一些纯化并进一步进行体外/体内特性研究。此外，如下文所讨论，将NS1插入片段从ChimeriVaxTM-JE背景转移至ChimeriVaxTM-WN。
本发明方法的一个元素为转座子仅用于向预期基因(多多个基因)中随机插入一个或多个限制性酶切位点这一事实。然后将编码所需外源肽的DNA片段在限制性酶切位点处整合入该基因。接着可将突变基因文库整合入完整的病毒基因组中(RNA病毒的cDNA)，然后转染细胞并收获异源病毒子代。病毒为自己“选择”最适当的插入位点，而不影响其活力和有效复制。快速筛选足够数量的突变病毒克隆然后使用对插入肽特异的抗体检测高抗原性，通过免疫动物检测高免疫原性(适当的肽构象和向免疫细胞递呈)并检测抗肽免疫应答和/或对攻击的保护以及遗传稳定性，例如通过监控体外或体内多次传代突变病毒的过程中该肽的存在和表达，以及基因组测序显示对重组疫苗病毒的生物学表形具有价值的任何适应(例如，生产中产量更高、遗传稳定性更强和免疫原性更高)。结果鉴定出“最好”的疫苗病毒变体。这一“让病毒决定”的方法因此可提供许多益处。
提供了本发明方法基础的随机插入方法的原理图解于图1。在这一实施例中，将流感A的M2e肽引入结构prM/M和E蛋白以及非结构NS1蛋白中。该结构蛋白以病毒颗粒(也可能分泌prM的N端)从细胞释放，NS1被转运至感染细胞的表面，它的一部分分离并在胞外循环。胞外递呈是强效抗体应答的前提。因此使用NS1蛋白递呈M2e尤其引人注意，因为该肽被传递至细胞表面，模仿了流感病毒M2的天然情况，其对于M2介导免疫的一些方面是重要的；而prM和E蛋白递呈可导致更高的免疫应答，因为多个肽拷贝在假定为更强免疫原的病毒颗粒表面递呈。
首先使用可商业购买的试剂盒例如New England Biolabs(Beverly，MA)GPS-LS Tn7介导诱变试剂盒将限制性酶切位点(例如PmeI位点)随机整合入亚克隆的目标基因中(大部分为每个基因分子一个位点，尽管可根据需要改变这一频率，例如通过附加周期的诱变)。然后通过限制性内切核酸酶(例如PmeI)消化移除转座子的转移引物部分并用M2eDNA插入片段替代，从而生成突变基因质粒文库。将突变的基因分子连接至ChimeriVaxTM-JE的全长cDNA。体外转录DNA模板然后用RNA转录物转染细胞。分离活子代病毒的单个克隆并检测M2e肽的存在、免疫原性和遗传稳定性。该实施例的进一步细节描述于下文的实验实施例部分。
在上述方法的变体中，诱变发生在全部的完整病毒基因组中(例如在质粒中克隆的包含RNA的病毒的全长cDNA或DNA病毒的完整基因组分子)或包含数个病毒基因的DNA片段中，然后回收活的插入突变体。在这些实施例中，该病毒不仅在特异目标蛋白中“选择”最适当的外源肽插入位点，它也选择在完整基因组或基因组大片断中编码的最适当的目标蛋白。在另一变体中，其他载体生物体例如细菌(例如沙门氏菌等)的适当基因也可相似进行随机插入诱变然后筛选可作为疫苗的该生物体的重组变异体。
在本文所述方法的另一变体中，依次或同时使用多于一个的转座子诱变相同的基因以随机插入多于一个的免疫原肽，然后筛选携带一种病原体(例如以增强免疫源性/保护性)或数种病原体(例如以产生重组疫苗)的不同外源抗原决定簇的活病毒克隆。该随机插入法也可在病毒/载体生物体中与如上所述的其他表达平台(例如，McAllister等，J.Virol.749197-205，2000；Bredenbeek等，Virology 345299-304，2006)组合以生成表达一种抗原或不同抗原的数种抗体的候选疫苗。此外，附加表达的蛋白质可为免疫刺激分子，例如各种已知的细胞因子，其可刺激适当的免疫应答分支增强重组疫苗的免疫源性/效率。此外，该方法可用于鉴定广谱允许插入位点(例如NS1-236和prM的N端区域(例如，氨基酸1-5))。进一步而言，所筛选的候选重组子本身可用作疫苗或与其他(例如，亚单位或灭活或其他活的)疫苗组合作为初始剂或增强剂(如果依次应用不同的组分)或作为协同疫苗组分(如果同时接种不同的组分)。
本文所述方法值得注意的特点包括以下内容(i)使用可裂解的抗生素抗性基因(与表位插入片段一起)辅助质粒文库的生成(图2)；(ii)向全长质粒克隆(病毒cDNA)中引入终止密码子或移码以最小化插入片段少的病毒出现的几率(图2)；(iii)用PmeI酶处理包含随机插入片段的质粒文库以消除任何插入片段少的DNA模板或将转染细胞或用于转染的RNA进行梯度稀释以最小化插入突变体与插入片段少的病毒(E蛋白表达部分)之间的竞争；以及(iv)使用空斑纯化与细胞单层免疫染色组合简便分离包含插入片段的病毒克隆。
病毒载体 可用于本发明的嵌合病毒可基于ChimeriVaxTM病毒，如上所述其由结构蛋白被第二种病毒对应的结构蛋白取代的第一种黄病毒(例如，骨架黄病毒)组成。例如，嵌合体可由其中的prM和E蛋白被第二种黄病毒的prM和E蛋白取代的第一种黄病毒组成。
用于本发明的嵌合病毒可由任何病毒组合制备。可用于本发明作为第一和第二种病毒的具体黄病毒的实例包括蚊传黄病毒，例如日本脑炎、登革热(血清型1-4)、黄热病、墨累谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、昆津、罗西奥脑炎和伊利乌斯脑炎病毒；蜱传脑炎，例如中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春夏型脑炎、基亚萨努森林病、鄂木斯克出血热、跳跃病、波瓦生、根岸、阿布塞塔罗夫、汉萨洛瓦、阿泊依和海普病毒；以及肝炎病毒种的病毒(例如丙型肝炎病毒)。
可用于本发明嵌合病毒的具体实例为人黄热病毒疫苗株YF17D，其中的prM和E蛋白被另一种病毒的prM和E蛋白取代，例如日本脑炎病毒、西尼罗病毒、圣路易病毒、墨累谷脑炎病毒、登革热病毒或任何其他黄病毒，例如上文所列之一。例如以下批转保存日期为1998年1月6日在布达佩斯条约下保存于美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国典型培养物保藏中心(ATCC)的嵌合黄病毒可用于本发明嵌合黄热病17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JE A1.3；ATCC登录号ATCCVR-2594)和嵌合黄热病17D/登革热2型病毒(YF/DEN-2；ATCC登录号ATCC VR-2593)。
例如美国专利第6962708和6696281号；国际申请WO 98/37911和WO 01/39802；以及Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999中提供了制备可用于本发明的嵌合病毒的细节，其完整内容均以参考形式并于本文。此外，这些嵌合病毒可包括减毒突变，例如上文和本文所引用的参考文献(也可参见例如WO 2003/103571；WO 2005/082020；WO 2004/045529；WO 2006/044857；WO 2006/116182)中所描述者。例如在美国专利号6962708中提供了可用于制备本发明病毒的病毒序列信息(也可参见，Genbank登录号NP_041726；CAA27332；AAK11279；P17763；注这些序列仅为示例性；本领域已知许多其他黄病毒序列并可用于本发明)。附加实例包括Genbank登录号NC_002031，其以序列附录3(YF17D)提供于本文，Genbank登录号AF315119，其以序列附录4(JE-SA-14-14-2)提供于本文，以及Genbank登录号AF196835，其以序列附录5(西尼罗病毒)提供于本文。这些序列信息仅为示例性，有许多可用于本发明的其他黄病毒序列。此外，这些序列可包括本文(以及所引用文献)所述的突变，包含于如本文(和所引用的文献)所述的嵌合体中和/或包括本文所述的插入片段。
在使用ChimeriVaxTM疫苗作为载体的优点中，一个主要优点是包膜蛋白(其为抗黄病毒免疫的主要抗原决定簇，在这种情况下为抗载体免疫)易于交换，使得可使用相同的YF17D骨架(其可依次应用至相同的个体)构建数种不同的疫苗。此外，不同的重组ChimeriVax TM插入疫苗可测定为更适用于不同黄病毒流行的具体地理区域，作为抗地方流行黄病毒和另一种目标病原体的双重疫苗。例如，ChimeriVaxTM-JE-流感病毒更适用于JE流行的亚洲以保护免受JE和流感的攻击，YF17D流感疫苗更适用于YE流行的非洲和南美，ChimeriVaxTM-WN-流感更适用于WN流行的美国和部分欧洲和中东，ChimeriVaxTM-登革热-流感更适用于存在登革热病毒的热带。
除了嵌合黄病毒，其他黄病毒例如非嵌合黄病毒可用于根据本发明的载体。可用于本发明的这些病毒的实例包括减毒活疫苗，例如YF17D和衍生自YF17D株者，其本来由减毒野生型Asibi株获得(Smithburn等，“Yellow Fever Vaccination，”World Health Organization，第238页，1956；Freestone，in Plotkin等(编辑)，Vaccines，第二版，W.B.Saunders，Philadelphia，U.S.A.，1995)。可衍生可用于本发明的病毒的YF17D株的实例为YF17D-204(

Sanofi-Pasteur，Swiftwater，PA，USA；

，Sanofi-Pasteur，Marcy-L’Etoile，France；ARILVAXTM，Chiron，Speke，Liverpool，UK；

，BernaBiotech，Bern，Switzerland；YF17D-204 France(X15067，X15062)；YF17D-204，234 US(Ric等，Science 229726-733，1985))，而可使用的这些病毒株的其他实例为紧密相关的YF17DD株(GenBank登录号U17066)、YF17D-213(GenBank登录号U17067)以及Galler等，Vaccines16(9/10)1024-1028，1998描述的黄病毒17DD株。除了这些病毒株外，在人类例如人类患者中任何其他适当减毒的黄病毒疫苗株均可用于本发明。
除了嵌合黄病毒和完整黄病毒例如黄热病毒(例如YE17D疫苗)之外，本发明方法也可与其他非黄热病毒、减毒或疫苗病毒(RNA和包含DNA的病毒)一起使用。这些疫苗病毒的实例包括用于麻疹、风疹、委内瑞拉马脑脊髓炎(VEE)、单股反链病毒目(弹状病毒、副流感病毒等)和DNA病毒的减活株(例如，痘苗病毒、水痘病毒等)。
此外，除了上述活病毒之外，在复制子骨架蛋白(例如，NS1和其他NS蛋白以及C)中表达外源肽的已包装复制子可用于本发明。该方法可用于例如需要增强安全性或最小化抗载体免疫(中和抗包膜蛋白的抗体应答)的情况中以使用相同的载体制备可应用至相同个体的不同疫苗或在相同复制子构建体中表达数种抗原。该构建体的图解见图10。已建立了构建单周期复制子的技术，也已验证了复制子的免疫原潜质(Jones等，Virology 331247-259，2005；Molenkamp等，J.Virol.771644-1648，2003；Westaway等，Adv.Virus.Res.5999-140，2003)。在这些复制子的实例中，缺失了绝大多数的prM和E包膜蛋白基因。因此，其可在细胞内复制，但是不能产生病毒子代(因此为单周期复制)。当反式提供prM-E基因时其可被包装入病毒颗粒中。而且，当细胞被这些包装的复制子(例如，接种之后)感染时，之后进行单周期复制，不会进一步扩散至周围细胞/组织。此外，随机插入的免疫源肽可在PIVs(例如，Mason等，Virology 351432-443，2006)背景下与其他抗原和任何其他缺陷病毒疫苗构建体、完整载体病毒、重排病毒(例如，Orlinger等，J.Virol.8012197-12208，2006)通过基因间、双顺反子表达附加抗原替代PIV缺失等方式组合。
来自不同病原体的保护性表位可在一种病毒中组合得到三价、四价疫苗等。而且，可使用包含来自非地方流行性黄病毒包膜的ChimeriVaxTM变异体避免否则会限制接种在某一地理区域的有效性的群体中的天然抗载体免疫(例如ChimeriVaxTM-JE载体可用于不存在JE的美国)。
进一步而言，本发明包括病毒，例如黄病毒(例如黄热病毒如YF17D和嵌合黄病毒，如本文所述者)，其在选自C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的蛋白中包括一个或多个如本文所述的异源肽插入片段，不论是否采用本发明所述方法制备。本文试验实施例中描述的用于向prM、E和NS1中插入的方法精确地指导本领域技术人员如何诱变其他黄病毒蛋白(C和NS2A-NS5)以及其他载体病毒、细菌等的蛋白。由于C和NS2A-NS5黄病毒蛋白主要在细胞内表达(除了C，它也是病毒颗粒的一部分)，这些蛋白最适用于插入T细胞外源免疫原表位；但是也可插入B细胞表位，因为一些抗体应答在体内抗绝大多数(如果不是所有的)胞内病毒蛋白生成。
异源肽 本发明的病毒载体可用于传递任何具有预防或治疗价值的肽或蛋白。例如，本发明的载体可用于诱导对任何插入病毒蛋白(例如黄病毒的包膜、膜前、衣壳和非结构蛋白)中基于蛋白质的抗原的免疫应答(预防或治疗)。
本发明的载体可各自包含单一表位。或者，可向载体中的单一位点(例如，以多表位的形式，其中可通过柔性接头分离不同的表位，例如氨基酸的聚甘氨酸延伸)、不同位点或其任意组合插入多个表位。这些不同表位可衍生自单一病原体属或衍生自不同属和/或不同种。该载体可包括多个肽，例如如本文所列肽的多个拷贝或如本文所列肽的组合。作为实例，该载体可包括人或禽M2e肽(和/或其保守序列) 可用于本发明的抗原可衍生自例如感染因子如病毒、细菌和寄生虫。该感染因子的具体实例为流感病毒。来自流感病毒的抗原的具体实例包括衍生自血凝素(HA；例如H1-H6之一或其亚单位)(或亚单位HA1和HA2)、神经氨酸酶(NA；例如N1-N9之一)、M2、M1、核蛋白(NP)和B蛋白。例如，可使用包括血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽(A/H1株的NIPSIQSRGLFGAIAGFIE，A/H3株的NVPEKQTRGIFGAIAGFIE以及流感B株的PAKLLKERGFFGAIAGFLE)或M2e(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD)。流感病毒中保守的肽的其他实例可用于本发明并包括流感病毒B保守的NBe肽(共有序列MNNATFNYTNVNPISHIRGS)；流感病毒B的BM2蛋白的胞外结构域(共有序列MLEPFQ)以及来自HAN1禽流感病毒的M2e肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD)。可用于本发明的流感肽的其他实例以及可衍生(例如经片段化)该类肽的蛋白质描述于US2002/0165176、US 2003/0175290、US 2004/0055024、US 2004/0116664、US 2004/0219170、US 2004/0223976、US 2005/0042229、US2005/0003349、US 2005/0009008、US 2005/0186621、美国专利第4752473号、美国专利第5374717号、美国专利第6169175号、美国专利第6720409号、美国专利第6750325号、美国专利第6872395号、WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、WO96/10631、WO99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478、WO 2003/102165、WO2004/053091、WO 2005/055957，以及本文包含的序列附录1和2(以及本文引用的参考文献)，其内容均以参考形式并于本文。而且，可从www.immuneepitope.org数据库选择流感的保守免疫/保护性T和B细胞表位，其中已鉴定出许多可交叉保护的候选表位(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104246-251，2007和补充表格)，包括我们在下文中描述的H3N3病毒的HA表位。本发明可应用来自在线IEDB来源的任何肽，例如，包括上文中Bui等描述的保守B和T细胞表位的流感病毒表位。
来自人/兽病原体例如寄生虫(例如疟疾)、其他病原体病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV))的表位、单纯疱疹病毒(HSV)，人免疫缺陷病毒(HIV，例如gag)和丙型肝炎病毒(HCV)和细菌(例如结核分枝杆菌、艰难梭菌和幽门螺杆菌)的表位也可用于本发明载体。可从文献中轻易发现这些和其他病原体的各种适当表位。例如Schiller和其同事鉴定出乳突瘤病毒L2蛋白的交叉保护性表位/肽，其可诱导可保护不同HPV表型攻击的广谱交叉中和抗体，例如HPV16病毒(WO2006/083984 A1；QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV)的例如L2蛋白的氨基酸1-88，或氨基酸1-200，或氨基酸17-36。WO 2004/053091、WO03/102165、WO 02/14478和US 2003/0185854提供了可用于本发明的其他病原体以及来自这些病原体的抗原和表位的实例，其内容以参考形式并于本文。
可获得抗原的病原体的附加实例列于下文表1，该类抗原的具体实例包括列于表2者。此外，可插入本发明载体的表位的具体实例提供于表3。如表3所示，用于本发明载体的表位可为B细胞表位(例如，中和表位)或T细胞表位(即T辅助细胞和细胞毒性T细胞特异性表位)。
本发明载体可用于传递除病原体衍生抗原之外的抗原。例如，该类载体可用于传递肿瘤相关抗原用于癌症的免疫疗法。本领域已知多种肿瘤相关抗原并可根据本发明给予。癌症(以及对应的肿瘤相关抗原)的实例为黑色素瘤(NY-ESO-1蛋白(尤其是位于氨基酸157-165位的CTL表位)、CAMEL、MART 1、gp100、酪氨酸相关蛋白TRP1和2以及MUC1)；腺癌(ErbB2蛋白)；结直肠癌(17-1A、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌(PSA1和PSA3)。热休克蛋白(hsp110)也可用作抗原。
在本发明的其他实例中，可使用编码预期对其产生免疫应答的过敏诱导抗原表位的外源蛋白。此外，本发明载体可包括用于靶向载体以传递肽例如抗原至给予该载体的受试者的细胞(例如，包括配体受体的细胞)的配体。
插入本发明载体的肽或蛋白的大小可为3-1000个氨基酸的长度，例如5-500、10-100、20-55、25-45或35-40个氨基酸的长度，如本领域技术人员确定认为适当的长度。如本文其他部分所述，本文描述的氨基端前膜插入片段可提供插入更长片段的可能性(见下文)。进一步而言，本文描述的肽可包括附加序列或可降低长度，也可如本领域技术人员确定认为适当者。本文列出的肽可如本文所示存在于本发明载体中或通过例如替换或缺失一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的氨基酸)进行修饰。此外，该肽可为更大的肽存在于载体中。
本发明也包括鉴定和使用可插入多个不同肽的广谱允许插入位点，例如NS1-236，如两个不同嵌合体(见下文)的情况下所示。其他广谱允许位点包括嵌合病毒(包括ChimeriVaxTM-JE和ChimeriVaxTM-WN(见下文))的prM氨基端区域。可在这些病毒的1-50位，例如1-25、1-15、1-10或1-5的一个或多个位点进行插入。
进一步，本发明包括鉴别和使用从细胞(例如，Vero)培养获得的第二位点适应。这些适应可提供益处，例如增强复制等。可用于其他情况下的这些适应的具体实例如下文实验实施例所示。
生产和给药 可使用本领域的标准方法制备上述病毒。例如，可将对应于病毒基因组的RNA分子引入可从中(或其上清中)纯化子代病毒的原代细胞、鸡胚胎或二倍体细胞。可生产该类病毒的其他方法应用异倍体细胞，例如Vero细胞(Yasumura等，Nihon Rinsho 211201-1215，1963)在该类方法的实例中，可将对应于病毒基因组的核酸分子(例如，RNA分子)引入异倍体细胞，从细胞培养的培养基中收获病毒，用核酸酶(例如可降解DNA和RNA二者的内切核酸酶，例如，BenzonaseTM；美国专利第5173418号)处理收获的病毒，浓缩(例如，通过使用可截留例如500kDa分子的滤器进行超滤)经核酸酶处理的病毒，然后将已浓缩的病毒配置成疫苗。这一方法的细节提供于WO 03/060088 A2，其以参考形式并于本文。进一步而言，当提及嵌合病毒构建体的构建时上述引用的文献提供了生产嵌合病毒的方法。
以本领域技术人员可方便确定的量和方法给予本发明载体。就嵌合黄病毒和黄热病毒为基础的载体而言，该类载体可以与黄热病17D疫苗相同的方式给予和配置，例如以被感染鸡胚组织的澄清混悬液或从嵌合黄热病毒感染的细胞培养收获的流体。本发明载体可因此配置成包含100至1000000感染单位(例如，空斑形成单位或组织培养感染剂量)的无菌含水溶液以例如腹腔内、肌肉内、皮下或皮内途径给药(关于皮内接种方法的细节参见，例如，WO 2004/0120964)。此外，由于黄病毒可通过粘膜途径感染人类宿主，例如口腔途径(Gresikova等，“Tick-borne Encephalitis，”The Arboviruses，Ecology andEpidemiology，Monath(ed.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1988，Volume IV，177-203)，所以可通过粘膜途径给予这些载体。
当用于免疫方法时，该载体可作为可被具体病原体感染的成人和儿童的初免预防剂。该载体也可用作通过刺激抗衍生该肽抗原的病毒的免疫应答治疗患者的加强剂。例如，表达E6/E7蛋白的表位或完整E6/E7蛋白或HPV的重组子可用作治疗性HPV疫苗。
对于应用疫苗而言，任选使用本领域技术人员已知的佐剂。佐剂可用于增强嵌合载体的免疫原性例如脂质体制剂、合成佐剂，例如(如QS21)、胞壁酰二肽、单磷酸类脂A或聚磷嗪。虽然这些佐剂通常用于增强对灭活疫苗的免疫应答，它们也可用于活疫苗。就粘膜途径例如经口腔给药的嵌合载体而言，粘膜佐剂例如大肠杆菌的热稳定毒素(LT)或LT的突变衍生物可用作佐剂。此外，可将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入载体中。因此，编码细胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因可与外源抗原基因一起插入以生产可得到免疫应答增强的疫苗或调节更特异于细胞、体液或粘膜应答的免疫。或者，可通过已知方法(例如直接接种、裸DNA、用病毒载体等)分别从重组疫苗病毒同时或依次给予细胞因子。
本发明病毒可与其他免疫方法组合使用。例如可将病毒与包括相同或不同抗抗原的亚单位疫苗组合给予。本发明的组合方法可包括同时给予本发明病毒和其他形式的抗原(例如，亚单位形式或包括肝炎核心蛋白(例如包含在大肠杆菌产生的表面上的M2e肽的肝炎核心蛋白(HBc-M2e；Fiers等，Virus Res.103173-176，2004))的给药装置)。或者，本发明载体可与其他方法(例如亚单位或HBc方法)在初免-加强策略中组合使用，其中本发明载体或其他方法均可用作初免，然后使用另一种方法作为加强或相反。进一步，本发明包括使用本发明载体作为初免和加强二者的初免-加强策略。
除了疫苗应用外，如本领域技术人员可理解，本发明载体可用于向患者细胞中引入治疗性基因产品的基因治疗方法以及癌症疗法。进一步而言，包含免疫原表位的重组病毒例如本文所述嵌合或完整黄病毒可用于初免/加强方案中以增强亚单位或完整生物体死疫苗的药效，与重组α病毒复制子相似(US 2005/0208020 A1)。而且，下文中我们的一些数据也证明当将二者混合并同时接种时包含外源肽(例如，ChimeriVax-JE/NS1-M2e)的黄病毒和亚单位疫苗(例如HBc-M2e)之间存在强效的协同作用。后者可得到新的有效组合疫苗制剂，其不需要佐剂并可提供新的期望特点，例如免疫应答中的Th1移动(shift)。此外，可如本文所述在病毒颗粒表面(在prM-E)表达外源表位，然而不是使用重组病毒作为活疫苗，可例如使用福尔马林将其灭活并用作死疫苗。如果载体病毒为野生型病毒(其可对人/动物具有免疫原性)时该方法尤其适用。
实验实施例 以下实验实施例显示了向ChimeriVaxTM-JE中插入M2e序列以及HA表位。也将序列插入ChimeriVaxTM-WN构建体。这一实施例中描述的方法也可用于其他病毒，例如嵌合黄病毒和基于病毒的载体(例如，复制子和PIVs)以及上文所述的其他载体生物体以将序列插入其他蛋白质以及插入其他肽。
过去60年中黄热病17D(YF17D)减毒活疫苗株一直应用于人类，具有非常好的安全记录并可在单剂量给药后提供长期免疫。如上文所述，ChimeriVaxTM-JE为减毒活重组疫苗株，其中编码YF17D的某些结构蛋白(PrME)的基因被来自基因减毒日本脑炎(JE)病毒SA14-14-2的对应基因替代。与该嵌合体的胞内复制相关的衣壳和所有非结构(NS)基因衍生自YF17D疫苗株。相似地，ChimeriVaxTM-WN为减毒活重组疫苗株，其中编码YF17D的PrM和E蛋白的基因被西尼罗病毒株的对应基因替代。这一嵌合体的实例应用了西尼罗病毒株NY99-flamingo 382-99(GenBank登录号AF196835)的序列。在进一步的实施例中，本文中称作ChimeriVaxTM-WN02，NY99-flamingo382-99包膜序列107位的赖氨酸被苯丙氨酸取代，316位的丙氨酸被缬氨酸取代，440位的赖氨酸被精氨酸取代。
本部分描述图2显示的质粒构建步骤。构建以pBeloBac11低拷贝数载体为基础从包含ChimeriVaxTM-JE病毒的完整cDNA的pBSA单质粒构建体开始。通过将YFM5’3’SA14-14-2的ChimeriVaxTM-JE-特异cDNA部分(与SP6启动子一起)和YF5.2SA14-14-2质粒(ChimeriVaxTM-JE的两个起始质粒)装配在一个低拷贝数载体pBeloBac11(New England Biolabs，Beverly，MA)中构建该载体。该载体包含数个独特的适于基因亚克隆(图2中右上角质粒图中病毒基因组上面所显示)的限制性酶切位点。通过沉默位点定向突变(图2中的步骤1-3)将用于亚克隆prM、E和NS1基因的附加限制性酶切位点SphI、NsiI和EagI引入pBSA质粒。
向PUC18质粒载体(步骤6)中引入三个目标基因并使用Tn7转座子(步骤7)将所得质粒随机突变。使已转化的大肠杆菌在氯霉素存在下生长(氯霉素抗性基因由转座子的可移除转移引物编码)，制备由大量的细菌菌落代表的三个突变质粒文库。在制备突变质粒文库时，各文库菌落的数量应至少高于突变DNA序列中核苷酸数量的三倍以确保在每一个目标基因的核苷酸之后接着掺入了相关的外源插入片段(编码肽例如M2e)。各文库的菌落数量显示于图2。突变的prM、E和NS1基因文库被亚克隆至pUC18载体(步骤8)，通过PI消化和重新连接去除转移引物(步骤9)，每个基因分子中只剩下包含特异PmeI位点的15核苷酸的随机插入片段。为了辅助M2e的插入，首先装配包含M2e和卡那霉素抗性基因的SmaI-SmaI盒(步骤4-5)。通过在基因工程侧接BstBI位点处消化移除Kanr基因。从第九步开始将该盒插入文库的PmeI位点，使细菌在卡那霉素存在下生长筛选包含M2e的文库(步骤12)。用于该构建中的天然人流感AM2e共有序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD被修饰为两个半胱氨酸残基替换成丝氨酸以避免不需要的S-S桥连，其不会影响该肽的抗原性/免疫原性，并且在两边均添加甘氨酸残基以增加柔性(GGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGG)。通过用BstBI消化从所得包含随机M2e的基因文库中移除卡那霉素抗性基因(步骤13)。
在一个方法中(图2的方法A)，为了用随机插入病毒prM、E和NS1基因的M2e生产ChimeriVaxTM-JE-flu模板cDNA文库，将步骤9的突变基因文库(包含随机PmeI位点)克隆至步骤1-3的经修饰的pBSA质粒。然而，当我们第一次试图将M2e/Kanr盒插入步骤10的pBSA-AR3-rPmeI文库时所得在卡那霉素存在下生长的pBSA-AR3-rM2e/Kan文库的细菌菌落的数量比较低(步骤11)。尽管如此，这一方法允许快速构建包含任何免疫原表位的文库(例如，来自疟疾寄生虫、TB、病毒病原体等)。
在另一个方法中(方法B)，首先将终止密码子/移码突变修饰引入亚克隆的prM、E和NS1基因(步骤14)，将该包含病毒致死突变的经修饰基因引入pBSA-AR1-3质粒(步骤15)。这样可消除由于终ChimeriVaxTM-JE-flu模板文库中包含非突变模板部分的存在转染细胞后未突变ChimeriVaxTM-JE出现的可能性。最后，通过将步骤15文库中的目标基因片段替换成步骤13中包含随机M2e插入片段者获得ChimeriVaxTM-JE-flu病毒的全长模板文库(步骤16)。
为了用插入NS1的共有M2e序列生产ChimeriVaxTM-JE-flu病毒，用XhoI(位于病毒cDNA末端的XhoI位点)将pBSA-AR3-rM2e质粒文库线性化并用SP6RNA聚合酶(SP6启动子位于病毒cDNA的上游)体外转录，然后转染Vero细胞。在转染后3-6天当细胞病变作用可检测或明显时收获病毒子代。通过空斑测定法(甲基纤维素覆盖)测定所收获样品的病毒滴度，其中使用小鼠超免疫抗JE腹水(ATCC)染色甲醇固定单分子层以检测所有空斑，或可使用商业购买的抗流感M2e表位的单克隆抗体(Mab)14C2仅检测表达由Mab识别的M2e肽的空斑。总体滴度超过7 log10 pfu/ml。M2e阳性空斑易于检测并达到总空斑的0.4％(图3A和3B)。一些M2e阳性空斑与M2e阴性空斑一样大，表明有效的病毒复制。大多数总空斑为M2e阴性，这是由于NS1一些随机位点的插入片段不稳定，使得转染之后立即出现未突变ChimeriVaxTM-JE病毒。或者，存在该插入片段但是无法接近抗体。
可使用数种技术分离单个的阳性病毒克隆。我们将MAb染色(免疫聚焦测定法)与空斑纯化组合。在这一测定法中，用梯度稀释病毒转染的Vero细胞被琼脂覆盖。第5天时去除琼脂糖并用甲醇固定细胞单层(例如，在培养皿中，图3C)并用MAb染色。将琼脂糖与培养皿排列并回收对应于阳性M2e空斑的凝胶部分并冷冻。或者用Mab染色细胞单层但是不用甲醇固定。小心地从塑料上刮下阳性空斑中的细胞并冷冻。使用这一步骤分离了大约80个候选病毒克隆并通过1-2轮的空斑纯化进一步纯化。我们使用的另一种方法将病毒终稀释、收获细胞上清和在96孔板中用MAb染色细胞单层以鉴定最高可能稀释(最好由单个阳性病毒颗粒感染)的阳性孔组合。这一方法得到37个候选克隆。进一步的分析表明这些之一表现为纯克隆，而其它仍然与M2e阴性病毒混合。
接下来可检测足够大数量的M2e阳性克隆(例如，50-100)的免疫原性和对小鼠(和/或白鼬)中对野生型流感病毒攻击的保护效率(包括长期保护)，使用可获得的动物模型和方法以测量小鼠血清中的抗M2e抗体滴度(例如，使用ELISA(应用合成M2e肽)测量IgG/IgM或同型IgG1/IgG2抗体)以及在体外ADCC检测中的活性(或体内)，然后进行免疫聚焦检测和/或测序。
在进一步的研发中，在从转染后收获病毒进行的最后3-4次空斑纯化步骤之后通过在Vero细胞中的两次扩增传代生产13个克隆的病毒储备。这些经扩增的样品命名为P2研究病毒储备(纯化后的传代2)。储备的滴度测定为2.6×106-1.0×107pfu/mL。重要的是用M2eMAB和JEHIAF染色产生几乎相同的滴度(图4)，表明病毒储备是纯的。此外，这一结构是重组病毒遗传稳定性的第一个证据。如果病毒不纯或不稳定的话，未突变ChimeriVaxTM-JE病毒将生长超过表达M2e的重组子，而这不是现有的情况。此外，用甲醇固定细胞(检测胞内和表面蛋白)和不用甲醇固定(仅检测表面蛋白)均观察到病毒空斑的有效M2e染色。因此，包含M2e肽的NS1蛋白如预期正常转运至已感染细胞的表面并很可能被分泌。NS1因此可有效表面/胞外递呈肽，其对于诱导体内强效的抗M2e抗体应答是非常必要的。
对13个克隆(图4中的A11-92)的NS1基因进行测序以测定它们M2e插入片段的位点。令人惊讶的是，发现该35氨基酸插入片段位于所有13个克隆中相同的位点，在NS1蛋白的C端一半，在ChimeriVaxTM-JE病毒基因组的核苷酸3190之后，在病毒NS1氨基酸残基236和237之间。该插入片段的确切序列和周围的NS1核苷酸和氨基酸残基显示于图5。
对于该插入片段在所有13个克隆中的位点相同最可能的解释为当观察到CPE时这些克隆为来自感染Vero细胞6天后收获的病毒分离的空斑。不同起始变异体(在不同位点含有插入片段)之间的竞争发生在收获前的病毒复制过程中，在病毒群体中一种变异体变得占优势。因此，13个筛选的克隆表示一种插入变异体。
为了解决变异体之间竞争这一问题，可通过转染之后立即进行空斑筛选制备其他克隆(例如，如果必要的话寻找更多的免疫原候选疫苗)。在后一方法中，用体内合成的RNA转染Vero细胞并立即用琼脂覆盖，然后用M2e抗体染色细胞并从琼脂中收获阳性克隆。我们用RNA转录物进行转染进行这一尝试，其或由体内转录pBSA-AR3质粒文库(图2)或体内将来自质粒pUC-AR03-rM2e(其比pBSA-AR3文库更具有代表性)的NS1-M2e基因文库连接至pBSA-AR3-终止载体中产生(图2)。第4-5天去除琼脂覆盖，用M2eMAb染色细胞单层。观察到不同大小的多个阳性病毒聚集点。用体内DNA连接步骤获得的RNA转染的Vero细胞的染色培养皿的实例如图11所示。收集对应于数个更大的阳性空斑的琼脂糖部分并通过附加周期的空斑纯化进一步纯化。有趣的是，当测序新的变异体时，它们与A25病毒具有相同的M2e插入。这鉴定出NS1-236为NS1蛋白中的高度允许位点，其可产生高度有效的复制插入突变体，产生最大的空斑。然而，由图11中不同大小的聚集点判断，很明显该M2e插入片段间插(intercalate)在NS1的不同位点。一些形成中间体或小空斑的低效复制变异体具有实用价值。
我们也使用位于A25克隆(图5)M2e插入片段末端的BstBI限制性酶切位点在该NS1位点添加第二个流感保护性表位。例如，我们掺入了来自H5N1禽流感的被两个甘氨酸接头侧接的M2e表位以增加柔性(如图13A图解)并获得了活病毒。因此，后一插入突变体包含串联人流感M2e，其后为禽流感M2e。这一病毒可为通用疫苗，其可保护群体免受人流感A株和禽流感的攻击。在这一构建体中，首先将来自A25病毒的含有人M2e插入片段的NS1基因经反向遗传学的方法克隆至ChimeriVax-JE感染克隆中。然后通过在BstBI位点克隆一个由两个退火的磷酸寡核苷酸组成的双链DNA片段添加禽M2e序列。构建了两个版本的M2e人/M2e禽，一个具有H5N1流感病毒的天然M2e序列(除了倒数第二个半胱氨酸替换成丝氨酸；序列显示于图13B的上组)，另一个中的天然H5N1密码子被简并密码子取代以最小化与上游人M2e序列的核苷酸序列相似性(序列显示于图13B的下组)。后者是为了降低重组病毒中人M2e和禽M2e同源重组的几率，其应得到更高的病毒遗传稳定性。用JE和M2e特异性抗体(图13)对所构建病毒的空斑进行染色。空斑大小与A25母体病毒相比有所减小。转染后立即收获的P1病毒滴度较高(～5log10 pfu/ml)。虽然未在Vero细胞中进一步传代病毒，可预计P2和后续传代的滴度更高，因为与P1相比P2 ChimeriVax构建体的滴度通常更高。这一实验明显表明可将更长的插入片段(就56个氨基酸长度以及来自转座子的少数附加残基而言)掺入使用较短插入片段(A25病毒的35氨基酸M2e表位)鉴定的插入位点。另一个重要的结论是向人M2e序列插入禽M2e序列改变了与A25病毒相比NS1-236位点的全部插入序列(可能和结构)。这是该插入位点的广谱允许度的第一个实验证据。
此外，HA0流感A表位可以相似的串联方式与M2e组合。其他流感病毒表位，例如来自HA蛋白的病毒中和表位，或CTL表位可单独或以各种组合插入这一位点(或通过在NS1或其他病毒蛋白中一些其他位点的类似物)。
为了进一步验证NS1-236插入位点的广谱允许度，在N1-236残基之后构建流感H3病毒的SKAFSNCYPYDVPDYASL线性保护性表位(也称作HAtag表位)，其可提供对于各种H3流感株的保护(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007)，使用标准的二质粒方法生成重组病毒。两个甘氨酸在两边侧接该表位以增加柔性并且其半胱氨酸残基变成丝氨酸。所回收活病毒的插入序列如图17A所示。用抗HAtag MAb 12CA5染色病毒空斑(Vero细胞)(图14B)。因此，由随机插入M2e表位发现的NS1-236插入位点允许具有完全不同序列的表位(例如，HAtag)。与M2e插入片段相似，该实例验证了B细胞表位和T细胞表位的插入，因为HAtag表示B细胞和T细胞流感病毒表位二者(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104246-251，2007)。
ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒的遗传稳定性以及细胞培养的生长动力学 将在第二次传代具有最高滴度7log10 pfu/mL的A25病毒克隆的NS1基因(图6，A组)用于进一步的生物特性研究。图6中被M2e MAb(以及JE抗体)特异染色的A25感染细胞的免疫荧光附加验证了的M2e的有效表达。
为了测定该病毒是否遗传稳定，以约MOI 0.001pfu/mL在可用于疫苗生产的Vero细胞中将其传代10次至P12水平。当P12病毒在免疫聚焦测定法中被M2eMAB或JE HIAF染色时，所有空斑均被两种抗体染色并产生相同的滴度8log10pfu/mL(Fig 6B)。这表明传代12的病毒可稳定保持其插入片段。
由于病毒变得细胞病变性更强，一些Vero细胞适应发生在传代中，P12水平的空斑大于P2病毒的空斑。P12病毒空斑的平均直径变得与ChimeriVaxTM-JE载体病毒可比。当测序P12病毒的全部基因组时，检测到8个核苷酸改变(表4)。四个改变引起氨基酸替换E蛋白的残基E357处缬氨酸变成丙氨酸，NS4B-95处甲硫氨酸变成缬氨酸，以及紧接着上游来自M2e肽的2个替换(N1-235处丝氨酸至亮氨酸以及残基1ins处苯丙氨酸至亮氨酸)。后面的一些适应一定与空斑大小增加和更好的病毒复制(如下所示)相关。这些改变中没有ChimeriVaxTM-JE疫苗减毒标记的回复突变(如表4所示，也传代至P12并进行了测序的其他三个克隆A11、A79和A88中的突变稳定保持了M2e插入片段)。
在Vero细胞中比较P2和P12水平A25克隆与ChimeriVaxTM-JE母体载体病毒的生长动力学。图6C显示了一个代表性实验(MOI 0.001)的结果。P2病毒可有效生长，但是慢于ChimeriVaxTM-JE，第6天达到峰值，比载体病毒慢一天。相反P12病毒在第5天以高于ChimeriVaxTM-JE的滴度达到峰值，高于7log10pfu/mL。MOI 0.1时P12病毒的更有效复制更明显。因此，在Vero细胞中A25克隆在10次传代后可更有效复制。一些在P12时发现的序列改变有利于重组疫苗病毒的高产量生产。
使用ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e A25病毒建立用于分析ChimeriVaxTM-JE/flu重组子的免疫原性和保护效率的小鼠模型的中试研究 对于任何病毒疫苗载体，尤其是啮齿动物不是天然宿主者(例如，YF(YF17D的野生型原型)的天然宿主是猴和人)，建立相关和可用的小动物模型是充满挑战的。用这样的模型应可以比较多个表达各种构象的外源肽的重组病毒构建体的相对免疫原性。为了确定最佳的给药途径并获得ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e免疫原性的初步数据，用5log10pfu/剂量的A25克隆皮下(SC)或腹腔(IP)免疫(分别1和2组，表5)数组5周大的Balb/c小鼠(N＝10)。对照组3接受皮下10μg剂量的包含在大肠杆菌产生表面上的M2e肽的肝炎B核心颗粒(HBc-M2e；Fiers等，Virus Res.103173-176，2004)和明矾佐剂；相似地在第20天加强免疫该组。用ChimeriVaxTM-JE载体(5log10pfu)免疫阴性对照组4和5或模拟免疫(稀释剂)。
在第1、3、7、9和11天收集的血清中测定接种了病毒的单个动物中的病毒血症。两种途径下A25均不引起可检测的病毒血症。接种ChimeriVaxTM-JE病毒的10只动物中的2只仅在第1天具有低水平的病毒血症(50和275pfu/mL)，其很可能表示接种的病毒。因此，A25病毒不能通过这两种途径引起明显的系统感染。
第38天，取所有动物的血样并用ELISA测定各组血浆样品的抗M2e抗体应答。在病毒免疫组中，仅在2组(A25IP)中检测到低水平的应答，其总IgG和IgG2a滴度为100(没有可检测的IgG1)，而3组的滴度如预期较高总IgG、IgG1和IgG2a分别为218700、218700、和24300。由于这一原因，第40天用5log10pfu的各自病毒强化免疫1、2和4组1组皮下强化而其他组腹腔强化(IP)。(5组也接受腹腔剂量的稀释剂)。两周后(第54天)，再次取动物血样并在血清样品中检测M2e抗体应答(表5)。A25病毒强化导致2组(A25IP/IP)中抗体滴度的显著增加。这一组的总IgG滴度增加了约30倍至2700。3组(HBc-M2e)的总IgG滴度为72900。2组和3组的总IgG的450nmOD读数显示于图7。重要的是，尽管HBc-M2e免疫引起明显的IgG1应答，几乎所有A25病毒诱导的抗体为IgG2a亚型(表5)。IgG2a抗体是ADCC的主要介导子，其被认为是流感感染的M2e-诱导保护的主要机制。因此，用于测量ChimeriVaxTM-JE/flu重组子免疫原性的有效小鼠模型依赖IP免疫后IP加强建立。
第55天，用高剂量20LD50的小鼠适应A/PR/8/34流感病毒鼻内(IN)免疫动物。该剂量比用于HBc-M2e研究的4LD50免疫剂量高5倍，我们刻意选择高剂量以回答与HBc-M2e免疫相比当通过ChimeriVaxTM-JE病毒载体传递即使免疫后M2e抗体滴度更低是否可能产生更有效的保护这一问题。理论上而言，这可由于抗原递呈细胞的非特异性病毒刺激、CTL应答(M2e肽包含CTL表位)、诱导强效T细胞辅助以及一些固有免疫机制。免疫后存活曲线见图8。如预期给予攻击剂量，HBc-M2e免疫动物的存活不完全(50％)。用A25病毒IP/IP免疫的2组中两只动物存活，该组在两个A25-免疫组(20％存活)中具有最高的M2e抗体滴度。1组中存活一只动物(A25SC/SC)。阴性对照组4和5中的所有动物均死亡。从这些数据可显示保护水平与M2e抗体滴度之间的明显相关性，不论用重组病毒还是亚单位疫苗免疫动物。然而，应注意的是一些上述机制可能在A25免疫中发挥作用，因为给予小鼠的实际M2e的微克量未知并且可能由于病毒在这一模型中的有限复制而非常低。这一方面可在hamster模型中解释，其中预期更有效的外周病毒复制。在灵长类/人类中，ChimeriVaxTM-JE(以及ChimeriVaxTM和YF 17D疫苗)引起相对有效的系统感染，峰病毒血症滴度为约2log10pfu/Ml。因此，可预期相对低剂量单次接种病毒后对流感的强效M2e应答和保护。
使用A25病毒的小鼠实验2 用更年幼的4周大的小鼠(来自两个供应商)以A25病毒进行附加小鼠实验，使用更高的A25IP剂量(7log10pfu/ml)。实验设计见表6。在绝大多数组中使用A25P2病毒储备(其也用于之前的实验中)；该实验也包括接种上述Vero细胞适应A25P12病毒的组(#5)。阴性对照为ChimeriVax-JE和稀释剂(2、4和7组)。阳性对照Taconic小鼠SC接种与明矾佐剂混合的HBc-M2e颗粒(称作Acam-Flu-A)。在Jackson小鼠组中，产生两个组用于检测A25病毒和Acam-Flu-A之间的协同作用8组经IP途径仅接受Acam-Flu-A而且不需佐剂，9组IP接受与A29混合的Acam-Flu-A。在接种1个月后强化免疫所有的小鼠，在第59天用ELISA测定单独血清(用于总IgG))或各组血清混合(用于IgG同型)的特异抗体滴度(总IgG和IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3型)；也在第30天(加强之前)测定M2e特异性总IgG滴度。ELISA滴度见表7；给出单独血清中测定的总IgG的GMT值。该数据与之前的小鼠实验数据一致，除了A25免疫的动物具有显著较高的M2r特异抗体滴度。绝大多数接种了A25和Acam-Flu-A的动物在第一次剂量之后第30天发生血清转化。在第59天(强化后约1个月)A25和Acam-Flu-A组中的所有动物为血清阳性并且与第30天相比总IgG滴度显著增加。如预期，Acam-Flu-A/明矾佐剂免疫(3组)引起占优势的Th2型应答，与其他IgG同型相比IgG1滴度最高。A25(1、5和6组)免疫引起占优势的与更高IgG2a滴度相关的Th1型应答，IgG2a为经ADCC机制的M2e介导保护的需要类型；检测也与ADCC机制相关的IgG2b和IgG3抗体(Jegerlehner等，J.Immunol.1725598-5605，2004)。这在一次验证了插入ChimeriVax-JE NS1-236位点的M2e表位的高免疫原性。
本发明的一个重要发现为与单独接种Acam-Flu-A或A25病毒相比同时接种Acam-Flu-A与A25可显著增强抗M2e抗体应答(比较表7中的9组与8和6组)。第59天，9组和8组的总IgG GMTs分别为95940和35050(第30天的比例差值甚至更明显)。因此，观察到同时接种的强效协同作用。而且，尽管单独Acam-Flu-A可诱导绝大多数Th1型应答(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分别为72900、8100、300和900)，同时接种Acam-Flu-A与A25可导致明显的Th2移动，可由IgG1比例更低和其他抗体同型比例显著更高证明(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分别为72900、72900、8100和8100)。该协同作用不仅仅是由于被同时接种的动物中A25病毒引起抗原(M2e)质量增加，因为单独接种A25可引起中度的免疫应答(在Jackson balb/c小鼠中，见表7中的6组)。这些作用也可能是由于佐剂对例如接种位点的树突状细胞中病毒复制的作用。已报道在α病毒复制子中观察到该类佐剂作用(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1033722-3727，2006；Hidmark等，J.Virol.807100-7110，2006)。
随机插入ChimeriVax-JE E蛋白中的M2e的表达 进行三个实验测定是否可以随机插入M2e并在ChimeriVax-JE载体的E蛋白中表达于病毒颗粒表面。在第一个实验中，在pBSA-AR2-rM2e质粒文库上用SP6RNA聚合酶合成RNA(图2第16步)。使用lipofectamine用RNA转染Vero细胞。在收获的细胞上清中仅观察到未突变病毒空斑，其不能被M2e MAb染色。假定上，就随机插入NS1而言，由于插入片段在E的不稳定位点所以不携带M2e插入片段的病毒会快速出现并变得占优势。在第二个实验中，用NsiI和KasI从pUCAR02-rM2e中萃取E-M2e基因文库(图12第13步)并体外连接至pBSA-AR2终止载体(图2第15步)。用XhoI将连接产物线性化并体外转录。用合成RNA电穿孔Vero细胞，然后系列稀释感染细胞混悬液(以降低未突变和M2e阳性病毒之间的干扰)，将细胞稀释液置于培养皿中。向接种了更高稀释的已转染细胞液的培养皿中加入未转染的Vero细胞以确保细胞单层融合。结合后，用琼脂覆盖细胞单层。当6天后用M2e Mab染色细胞单层时(在去除琼脂糖覆盖之后)，在高转染细胞稀释(1∶4和1∶8)观察到数个阳性聚集点。图12A显示了该聚集点的一个实例。与NS1-M2e文库转染观察到的一些聚集点相比，这些聚集点的数量和大小较小，表明与NS1相比更难向E蛋白中插入35-氨基酸插入片段(用于pUC-AR02-rM2e中，与图5所示相同)。在第三个实验中，通过将两个互补的磷酸化引物退火生产较短的M2e插入片段(SLLTEVETPIRNEWGSR)。该插入片段的核酸序列如下所示5’-P-AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACGCCT ATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA-3’ 相似地生产相同的但是两端包含两个附加甘氨酸接头残基用于增加柔性的插入片段(总长度21个氨基酸)。第二个插入片段的核酸序列如下所示 5’-P-GGA GGA AGC CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG CCTATC AGA AAC GAA TGG GGG AGC AGA GGC GGC-3’ 将两个插入片段连接至pUC-AR02-rTn7enr文库的平端PmeI位点取代转移引物(步骤8，图2)。连接前将该载体质粒DNA脱磷酸化。分别制备两个新的质粒文库，pUC-AR2-17M2e和pUC-AR2-17gM2e。将两个文库的NsiI-KasI插入片段转移至pBSA-AR2终止载体，得到pBSA-AR2-17M2e和pBSA-AR2-17gM2e全长文库，其接着可用于体外转录。首先用PmeI消化后面的两个文库以去除任何不包含该插入片段的全长模板DNA分子(而在包含插入片段的分子中切除插入片段两端的PmeI克隆位点)。然后用XhoI将它们线性化并用SP6 RNA聚合酶转录。用转录物电穿孔Vero细胞并接种(不稀释)至培养皿并在细胞结合后用琼脂糖覆盖。为了避免插入片段少的病毒的干扰，早期即转染后第4天用M2e Mab染色细胞单层。两个转染中观察到多至约100个小聚集点。这些聚集点的实例见图12A和B，分别为包含E蛋白中17-氨基酸M2e插入片段的ChimeriVax-JE病毒和GG-17氨基酸-GG插入片段。因此，将插入片段从35个氨基酸缩短至17或21个氨基酸可显著增加重组病毒的回收。所观察到的一些M2e阳性变异体一旦被分离即可很好地复制。如果必要的话，可从附加转染中分离更有效复制的变异体。此外，可在例如Vero细胞中连续传代慢速复制的变异体以希望出现一些第二位点突变改善生长。这一实施例明显验证了向E蛋白中随机插入外源免疫原表位的可能性。
在ChimeriVax-JE载体病毒的prM蛋白中随机插入M2e表位 病毒糖蛋白(prM、E或NS1)中不同的表达方式见图15。插入E蛋白的表位将递呈于病毒颗粒(180拷贝)表面并因此可预期为免疫原性最强。NS1蛋白中的表达将插入的表位传递至被感染细胞表面以及在分泌型NS1寡聚体中传递至胞外。虽然上述实验实施例验证了后一方式的高免疫原性，但是这种情况下低于E中的表达(对于一些表位仍然足够高，例如病毒中和抗体表位，其与非中和表位例如流感的M2e相比可提供更强效的保护)。由于已知的在黄病毒颗粒的成熟过程中弗林蛋白酶对prM的不完全裂解所以prM中的表达将导致病毒颗粒表面上的部分递呈以及在由弗林蛋白酶裂解生成的分泌型prM N端部分附加胞外表达。这一表达方式也预期具有高免疫原性，比NS1中表达的免疫原性更高。如果可在成熟M蛋白(prM的C端部分)中插入表位，所有的表位分子均可递呈于病毒颗粒(180拷贝)的表面，与E中的表达相似。
为了在SphI和NsiI位点(SphI位于prM基因起始的上游)之间将M2e表位(插入片段总长35个氨基酸)插入ChimeriVax-JE的prM，构建pBSA-AR1-rM2e质粒文库(图2)。这一文库的代表性为约105克隆。将其用作体外转录的模板，所得RNA转录物用于使用lipofectamine转染Vero细胞单层。用琼脂糖覆盖已转染细胞并在第5-6天用M2e MAb染色。观察到M2e阳性空斑。从琼脂糖覆盖中收获对应于阳性空斑的M2e阳性病毒克隆并在另外几轮的空斑纯化中进一步纯化，然后扩增传代2次以制备5个纯病毒储备，命名为M1、M2、M3、M6和M8。
用M2e和JE抗体有效染色所有新的重组克隆，而用JE抗体染色ChimeriVax-JE载体病毒空斑。在标准空斑测定法(甲基纤维素覆盖)中第5天染色的空斑实例见图16A。与ChimeriVax-JE相比，M1、M2和M3插入片段突变体的空斑更大，而M6和M8克隆的空斑更小。(这一空斑大小的差异在琼脂糖覆盖下更明显)。因此，与载体病毒相比可M1-3克隆在体外更好地复制。这一点在生长曲线实验中得到证实(图16B)。M1-3克隆生长更快并且产生比ChimeriVax-JE更高的滴度，而M6和M7的滴度稍微较低。
通过测序测定插入片段的位置。结果见图17。有趣的是在M1、M2和M3中M2e插入片段添加入ChimeriVax-JE病毒的JE-特异性prM的N端，尽管在不同的氨基酸处。克隆M6和M8中的位置相同(在病毒ORF的Pro残基147之后；或prM-26)。在ChimeriVax-JE病毒中，prM的N端(MKLS...)由宿主细胞信号肽酶裂解形成(图17)。在克隆M1、M2和M3中，插入片段分别掺入了JE prM起始上游4、1和2个氨基酸残基处。因此在这些病毒中突变prM的N端包含M2e肽序列，其后为天然prM序列前的4、1、和2个病毒残基，然后是prM序列。用普通的SignalP 3.0在线程序使用两种不同的算法预测新的信号肽酶裂解位点(如图17所示)。在M1克隆中，两个可能的裂解位点可移除一个或三个M2e的N端氨基酸。强烈预测在M2中单个裂解可得到后面为完整M2e序列的N端甘氨酸。在M3中，或者该N端在M2中或者M2残基的三个被其他可能的裂解裂解掉。三个克隆的空斑可被M2e MAb有效染色这一事实表明M1和M3裂解中M2e残基损失最小。重要的是，所预测的信号肽酶裂解M1-3克隆的可能性大于ChimeriVax-JE(例如，M2克隆为0.387相对ChimeriVax-JE的0.073)。这可解释为什么M1-3病毒比ChimeriVax-JE母体生长的好。
因此，prM蛋白高度允许不同位点的插入，尤其是N端残基。基于已述结果(更大的空斑、Vero细胞内更有效的复制、更高预测的M1-3克隆中信号肽酶裂解可能性)，我们认为prM的N端(看上去对黄病毒颗粒的装配不重要)为广谱允许插入位点并可耐受各种其他插入片段，包括长插入片段(例如，50、100、200、400个氨基酸等)。我们因此在这一位点插入HIV gag，多至约200个HPV16 L2蛋白首个残基的肽、流感HA1和全长HA(长度约550个氨基酸)。将这些设计成在载体病毒prM序列之前包含与N端或prM融合的异源序列(如M1-3克隆中M2e的情况)，或通过掺入其他信号从prM裂解，或适当的蛋白酶裂解位点或自体蛋白酶。
构建A25病毒的ChimeriVax-WN类似物(在NS1-236包含M2e插入片段的ChimeriVax-JE) ChimeriVax-JE以及上述A25病毒不能在小鼠中有效复制(例如，没有可检测的接种后病毒血症)。然而，ChimeriVax-JE可在人类中更好地复制(～2 log10 pfu/ml病毒血症)(Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003)，因此A25病毒可在人体中诱导高M2e抗体应答并保护他们免受流感感染。我们最近验证了ChimeriVax-WN病毒(WN02人疫苗版本；WO 2004/045529)可在仓鼠中很好地复制(～3log10 pfu/ml病毒血症)(WO 2006/116182)，也可在人中很好地复制(～2 log10 pfu/ml病毒血症)(Monath等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1036694-6699，2006)。为了使用更强效的模型(仓鼠中ChimeriVax-WN02对比小鼠中ChimeriVax-JE)获得在ChimeriVax病毒的NS1-236位点表达的M2e表位保护的附加证据，构建A25病毒的ChimeriVax-WN02/M2eNS1-236类似物。使用标准克隆技术用ChimeriVax-WN02病毒的prM-E基因取代包含全长ChimeriVax-JEcDNA的pBSA中的JE-特异prM-E基因。这样得到pBWN02质粒(图18)。将包含来自A25病毒M2e插入片段的NS1基因(含有或不含M2e序列上游的Vero细胞适应)克隆至pBWN02。体外转录得到的两个质粒，用RNA转录物转染Vero细胞并用琼脂覆盖。在第6天观察到非常大的空斑，用M2e MAb染色(图18，底部组图)。
将ChimeriVax-WN02/M2eNS1-236的两个版本WN02/A25和WN02/A25adapt进行一次空斑纯化并通过在Vero细胞内扩增制备已克隆病毒的储备。与ChimeriVax-WN02和ChimeriVax-JE对比的空斑实例显示于图19A。Vero细胞中新病毒的生长曲线见图19B。WN02/A25病毒生长次于ChimeriVax-WN02(峰滴度分别为～7.5log10pfu/ml对比～8.7log10 pfu/ml)。与适应A25病毒(见图6C)相似，WN02/A25adapt版本(包含M2e序列上游2个氨基酸改变)生长得更好，几乎和ChimeriVax-WN02一样好。因此，原本引入ChimeriVax-JENS1蛋白的插入片段成功转移至ChimeriVax-WN02疫苗病毒。原本在A25病毒中观察到的两个细胞培养适应增强了WN02/A25病毒的生长。
结论 总之，我们成功进进行了转座子介导诱变ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒的prM/M、E和NS1基因以随机插入流感A病毒的共有M2e保护性表位，目的在于生成抗流感A的高效的通用疫苗。通过向prM和NS1蛋白中快速引入一定数量包含该插入片段的病毒突变体(可由抗M2e抗体识别)并将M2e肽插入E蛋白中验证了该方法的可行性。我们也表明ChimeriVaxTM-JE-NS1/M2e病毒的A25克隆和ChimeriVaxTM-JE-prM/M2e病毒的数个克隆可在Vero细胞中有效复制并鉴定出这些病毒中的M2e插入位点。而且，我们表明了A25病毒遗传稳定，因为它可以在体外10次低MOI传代中保持M2e插入片段。一些由本发明的直接随机诱变法鉴定的插入位点就插入片段大小和序列二者而言为广谱允许，如使用NS1-236位点例证。在一种黄病毒中发现的允许插入位点可用于其他黄病毒，如在我们的实验中通过将来自ChimeriVax-JE包含M2e的NS1基因转移至ChimeriVax-WN所例证。进一步而言，成功建立了分析小鼠中免疫原性的有效IP初免/IP强化模型并证明一个插入片段变异体具有高免疫原性。尽管不可检测小鼠的外周复制(包括IP接种后)，该病毒具有高免疫原性并诱导占优势的IgG2a M2e抗体，其对于M2e免疫的ADCC介导保护非常必要。我们实验中的另一新颖发现为同时接种表达M2e肽的病毒重组子和亚单位基于M2e的候选疫苗的协同作用。
如上所述，本文所述方法适用于所有其他ChimeriVaxTM目标蛋白以及其他作为载体的活疫苗病毒，包括YF17D或非黄病毒活疫苗，或非活载体生物体。这一方法可用于构建对人类公共健康和兽类具有重要性的大范围病原体的重组疫苗。
值得注意的是所列构建步骤的顺序(图2)可以变化并仍属于本发明范畴。而且，除Tn7之外转座子可用于直接随机插入随机限制性酶切位点或外源表位。后者以及使用限制性酶切位点而不是PmeI进行随机插入，或任何该构建步骤的不同筛选标记，或使用任何不同方法分离活突变病毒(例如所用被病毒感染的细胞上清的ELISA，或细胞分选以分离阳性细胞等)或体外或体内对病毒进行特性研究等不改变本发明含义。
表1-可衍生表位/抗原/肽的病原体的实例列表 病毒 黄病毒 黄热病毒 日本脑炎病毒 登革热病毒，1、2、3和4型 西尼罗病毒 蜱传脑炎病毒 丙型肝炎病毒(例如，基因型1a，1b，2a，2b，2c，3a，4a，4b，4c和4d) 乳多泡病毒科 乳头瘤病毒 逆转录病毒科 人免疫缺陷病毒，I型 人免疫缺陷病毒，II型 猴免疫缺陷病毒 人类嗜T淋巴细胞病毒I和II型 肝病毒科 乙肝病毒 小核糖核酸病毒科 甲肝病毒 鼻病毒 脊髓灰质炎病毒 疱疹病毒科 单纯疱疹病毒，I型 单纯疱疹病毒，II型 巨细胞病毒 爱泼斯坦巴尔病毒 水痘-带状疱疹病毒 披膜病毒科 α病毒 风疹病毒 副粘病毒科 呼吸道合胞病毒 副流感病毒 麻疹病毒 腮腺炎病毒 正粘病毒科 流感病毒 纤丝病毒科 马尔堡病毒 埃博拉病毒 轮状病毒科 轮状病毒 冠状病毒科 冠状病毒 腺病毒科 腺病毒 弹状病毒科 弹状病毒 细菌 产肠毒素大肠杆菌 肠道致病性大肠杆菌 空肠弯曲杆菌 幽门螺旋杆菌 伤寒沙门菌 霍乱弧菌 艰难梭菌 破伤风梭菌 化脓性链球菌 百日咳杆菌 脑膜炎奈瑟菌 奈瑟球菌 Legionella neumophilus 披衣菌属 嗜血杆菌属 志贺菌属 寄生虫 疟原虫属 血吸虫属 锥体虫属 弓形虫属 隐孢子虫属 肺孢子虫属 利什曼原虫属 表2-所列病毒筛选抗原的实例 表3-所列病毒/抗原的B和T细胞表位实例

表4 ChimeriVax-JE-NS1/M2e病毒以及克隆A11、A79和A88的遗传稳定性。在P12遗传稳定性传代时测序完整病毒基因组。显示核苷酸改变/异质性和氨基酸改变。


1NS1插入片段的位点和核苷酸/氨基酸.编号见图5. 表5 Balb/c小鼠第54天(1、2、4和5组加强后2周)的M2e抗体应答
1对于病毒而言，免疫和加强剂量为5 log10 pfu；对于HBc-M2e，剂量为10g颗粒+明矾。
2在第20天强化3组，而在第40天强化1、2、4和5组。
表6.设计使用A25病毒的小鼠实验#2(来自两个供应商的4周大雌性balb/c小鼠)。第59天测定ELISA抗体滴度(约强化后一个月)。

表7.实验2中小鼠的M2e-特异抗体应答

上文引用的所有参考文献的内容以参考形式并于本文。本文中单数形式例如“一个”和“该”的使用不排除对应复数形式的含义，除非文章中指明相反的情况。因此，例如，如果一项权利要求指明给予“一种”黄病毒，其也可理解为包含给予多余于一种黄病毒，除非另外指明。其他实施方案在以下权利要求中。
权利要求
1.生成包含编码异源肽的核酸分子的病毒基因组的方法，该方法包括以下步骤
(i)提供目标病毒基因；
(ii)诱变目标病毒基因；以及
(iii)将编码异源肽的核酸分子连接至目标病毒基因的诱变位点。
2.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤
(iv)用基因组核酸文库转染细胞以起始病毒复制；以及
(v)筛选活病毒重组子。
3.权利要求1的方法，其中在穿梭载体中提供所述目标病毒基因，并且在将编码异源肽的核酸分子连接至目标病毒基因的诱变位点之后所述方法进一步包括以下步骤将突变的目标病毒基因引入衍生目标病毒基因的病毒基因组，替代缺失该插入的对应病毒基因，以生成包含插入片段的病毒基因组。
4.权利要求3的方法，其中所述穿梭载体包含两个或多个目标病毒基因。
5.权利要求1的方法，其中在完整病毒基因组背景中提供所述目标病毒基因，并且所述方法生成包含插入片段的病毒基因组。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其进一步包括通过向细胞中引入包含插入片段的病毒基因组，从包含插入片段的病毒基因组生成病毒载体。
7.权利要求6的方法，其进一步包括从细胞或其上清中分离病毒载体。
8.权利要求3的方法，其包括诱变包含两或更多目标病毒基因的两种或更多穿梭载体，并将两个或更多个包含编码一个或多个异源肽的核酸分子的目标病毒基因引入衍生该目标基因的病毒基因组中替代缺失插入片段的对应病毒基因以生成包含插入片段的病毒基因组。
9.权利要求1的方法，其中所述诱变步骤包括通过转座子诱变向目标病毒基因中引入一个或多个转移引物。
10.权利要求9的方法，其中由内切核酸酶消化移除一个或多个转移引物，并通过在限制性内切核酸酶消化位点的连接将编码异源肽的核酸分子引入目标病毒基因。
11.权利要求1的方法，其进一步包括生成突变目标病毒基因的文库。
12.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述目标病毒基因包括在被再次应用于该方法之前由权利要求1的方法引入的插入片段。
13.权利要求1的方法，其中所述病毒基因组为黄病毒基因组。
14.权利要求13的方法，其中所述黄病毒为嵌合黄病毒。
15.权利要求14的方法，其中所述嵌合黄病毒包含第一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白以及第二种不同黄病毒的膜前和包膜蛋白。
16.权利要求15的方法，其中所述第一种和第二种黄病毒独立选自日本脑炎、登革热-1、登革热-2、登革热-3、登革热-4、黄热病、墨累谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、昆津、罗西奥脑炎、伊利乌斯脑炎、蜱传脑炎、中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春夏型脑炎、基亚萨努森林病、鄂木斯克出血热、跳跃病、波瓦生、根岸、阿布塞塔罗夫、汉萨洛瓦、阿泊依和海普病毒。
17.权利要求1的方法，其中所述目标病毒基因选自编码包膜、衣壳、膜前、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白的基因。
18.权利要求1的方法，其中所述异源肽包含疫苗表位。
19.权利要求18的方法，其中所述疫苗表位为B细胞表位或T细胞表位。
20.权利要求18的方法，其中所述表位衍生自病毒病原体、细菌病原体、寄生虫病原体、变应原抗原，或肿瘤相关抗原。
21.权利要求20的方法，其中所述病毒病原体为流感病毒。
22.权利要求21的方法，其中所述异源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽。
23.权利要求21的方法，其中所述流感病毒为禽或人流感病毒。
24.权利要求1的方法，其中所述病毒基因组包含编码多于一个异源肽的核酸分子，并且所述异源肽包含人和禽流感M2e肽。
25.由权利要求1-24中任一项的方法生成的病毒基因组或其互补体。
26.由权利要求25的病毒基因组编码的病毒载体。
27.包含插入选自衣壳、膜前、包膜、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白中的异源肽的黄病毒载体。
28.权利要求27的黄病毒载体，其中所述黄病毒为黄热病毒。
29.权利要求27的黄病毒载体，其中所述黄病毒为嵌合黄病毒。
30.权利要求29的黄病毒载体，其中所述嵌合黄病毒包含第一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白和第二种不同黄病毒的膜前和包膜蛋白。
31.权利要求30的黄病毒载体，其中第一和第二种黄病毒独立选自日本脑炎、登革热-1、登革热-2、登革热-3、登革热-4、黄热病、墨累谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、昆津、罗西奥脑炎、伊利乌斯脑炎、蜱传脑炎、中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春夏型脑炎、基亚萨努森林病、鄂木斯克出血热、跳跃病、波瓦生、根岸、阿布塞塔罗夫、汉萨洛瓦、阿泊依和海普病毒。
32.权利要求27-31中任一项的黄病毒载体，其中所述黄病毒载体包含插入非结构蛋白1(NS1)的氨基酸236和237之间的异源肽。
33.权利要求27-32中任一项的黄病毒载体，其中所述黄病毒载体包含插入载体膜前蛋白的氨基端区域的异源肽。
34.权利要求33的黄病毒载体，其中所述异源肽插入在衣壳/膜前裂解位点前的-4、-2或-1位或膜前蛋白的26位。
35.权利要求33或34的黄病毒载体，其进一步包含辅助从膜前蛋白移除所述肽的溶蛋白裂解位点。
36.权利要求27-35中任一项的黄病毒载体，其中所述异源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽。
37.权利要求36的黄病毒载体，其中所述流感病毒为禽流感病毒或人流感病毒。
38.权利要求27-37中任一项的黄病毒载体，其中所述病毒基因组包含编码多于一种异源肽的核酸分子，并且所述异源肽包含人和禽流感M2e肽。
39.权利要求27-38中任一项的黄病毒载体，其进一步包含一个或多个第二位点适应。
40.对应于权利要求27-39中任一项的黄病毒载体基因组的核酸分子或其互补体。
41.包含权利要求27-39中任一项的病毒载体的药物组合物。
42.权利要求41的药物组合物，其进一步包含药学可接受的载体或稀释剂。
43.权利要求41或42的药物组合物，其进一步包含佐剂。
44.权利要求43的药物组合物，其中所述佐剂包含铝化合物。
45.权利要求44的药物组合物，其中所述铝化合物为明矾。
46.给予患者肽的方法，所述方法包括给予患者权利要求41-45中任一项的组合物。
47.权利要求46的方法，其中所述肽为抗原并且进行给药以诱导对所述病原体或衍生所述抗原的肿瘤的免疫应答。
48.权利要求47的方法，其进一步包括给予亚单位疫苗。
49.权利要求48的方法，其中同时给予所述黄病毒载体和亚单位疫苗，以初免剂量给予所述黄病毒载体，以强化剂量给予所述亚单位疫苗，或以初免剂量给予所述亚单位疫苗，以强化剂量给予所述黄病毒载体。
50.权利要求48或49的方法，其中所述亚单位疫苗包含乙肝病毒核心颗粒，其包含与乙肝病毒核心蛋白融合的异源肽。
51.权利要求50的方法，其中所述融合的异源肽包含流感M2e肽或包含流感血凝素前体蛋白裂解位点(HA0)的肽。
52.权利要求27-39中任一项的黄病毒载体、权利要求40的核酸分子、权利要求41-45中任一项的药物组合物、权利要求25的病毒基因组、权利要求26的病毒载体或权利要求1-24或46-51中任一项的方法，其中所述异源肽或肽源选择本文其他部分包括表格和序列附录列出的。
53.制备病毒载体的方法，所述方法包括向黄病毒的允许所述插入的位点插入编码相关肽的序列。
54.权利要求53的方法，其中所述病毒载体包含黄病毒或嵌合黄病毒。
55.权利要求54的方法，其中所述插入在所述病毒载体的NS1-236位或所述载体膜前蛋白的氨基端部分进行。
56.权利要求55的方法，其中所述氨基端插入位于衣壳/膜前裂解位点前的-4、-2或-1位，或膜前蛋白的26位。
57.制备药物组合物的方法，所述方法包括将权利要求27-39中任一项的黄病毒载体与药学可接受的载体或稀释剂、佐剂和/或附加活性剂混合。
全文摘要
本发明提供病毒载体，例如嵌合黄病毒载体，包括插入载体目标蛋白的外源肽，制备和使用这些载体的方法以及包这些载体的组合物。
文档编号A61K39/12GK101528254SQ200780034274
公开日2009年9月9日 申请日期2007年7月16日 优先权日2006年7月14日
发明者K·V·普加乔夫, A·A·鲁缅采夫 申请人:赛诺菲巴斯德生物制剂公司