专利名称：抑制或治疗与细胞内形成蛋白纤维状内含体或聚集体相关的疾病的方法
技术领域：
本发明涉及抑制细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体，和溶解预 先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体，和涉及用于抑制或治疗与细 胞内形成蛋白纤维状内含体或聚集体相关的疾病的方法和药物组合物。
相关技术描述斑形成疾病特征在于在脑中存在淀粉状蛋白斑沉积物以及神 经变性。淀粉状蛋白沉积物由聚集成不溶团块的肽形成。在不同疾病中肽 的性质是不同的，但是在大部分情形中，所述聚集体具有P-褶皱的折叠结 构，并且用刚果红染料染色。除了阿尔茨海默病(AD)，其包括早期发作性 阿尔茨海默病、晚期发作阿尔茨海默病和症状发生前阿尔茨海默病，其它 以淀粉状蛋白沉积物为特征的疾病是，例如，SAA淀粉样变，遗传学冰岛 综合征，多发性骨髓瘤，和朊病毒疾病。在动物中的最常见的朊病毒疾病 是绵羊和山羊的痒病和牛的牛海绵状脑病(BSE) (Wilesmith禾B Wells， 1991)。在人类中己经鉴定了4种朊病毒疾病(i)库鲁病,(ii)克罗伊茨费 尔特-雅各布病(CJD)， (iii)格-施-沙病(GSS),和(iv)致命的家族性失眠症 (FFI) (Gajdusek, 1977;和Tritschler等.1992)。朊病毒疾病涉及正常细胞朊病毒蛋白(PrPC)向对应的痒病同 种型(PrPSc)的转化。分光镜测量表明，PrPC向痒病同种型(PrPSc)的转化 涉及主要的构象转变，暗示朊病毒疾病，同其它淀粉状蛋白生成疾病一样， 是蛋白构象紊乱症。从PrPC向PrPSc转变伴随着ot-螺旋二级结构的减少(从42%到30%)和卩-折叠含量的显著增加(从3%到43%) (Caughey等, 1991;和Pan等，1993)。这种重排与异常的生理化学性质相关，包括在非 变性去污剂中的不溶性和对蛋白质水解的部分抗性。先前的研究已经表明 与人PrP的残基106-126 (PrP106-126)同源的合成肽表现出PrPSc的一些 致病和生理化学特征(Selvaggini等，1993; Tagliavini等，1993;和Forloni等, 1993)。该肽表现出显著的构象多态性，在不同环境中获得不同的二级结构 (DeGioia等，1994)。在缓冲溶液中它倾向于采取(3-折叠构象，并且聚集成 淀粉状蛋白纤维，该淀粉状蛋白纤维部分抵抗蛋白酶消化。最近，抗体3F4 及其肽表位(Prpl04-113)的复合物的X-射线结晶研究提供了这一柔性区域 的结构图，该柔性区域被认为是对于发展朊病毒疾病所必需的构象重排的 成分(Kanyo等，1999)。参与折叠-解折叠和/或增溶-聚集过程的序列的种类 鉴定可以为斑形成疾病的治疗打开新的方向，其是基于防止聚集和/或诱导 解聚集(Silen和Agard， 1989; Frenkel等，1998; Horiuchi禾卩Caughey， 1999)。
阿尔茨海默病(AD)是导致老年痴呆的进展性疾病。广义来说， 该病分成两类晚期发作性，其在老年(典型地超过65岁)时发生，和 早发作性，其在老年期之前例如在35-60岁就充分发展。在这两种类型的 疾病中，病理是相似的，但是在从更早的年龄就开始的病例中，异常倾向 于更严重和广泛。该疾病特征在于在脑中的两种类型的损伤，老年斑和神 经原纤维缠结。老年斑是跨越多达150 mm的无组织嗜中性粒细胞的区域， 在中央有细胞外淀粉状蛋白沉积物，通过脑组织切片的显微镜分析可以看 到。神经原纤维缠结是tau蛋白的细胞内沉积，其由成对的彼此缠绕的两 个细丝组成。老年斑的主要组成要素是叫作淀粉状蛋白P(Af3)或P-淀粉状肽 ((3AP或(3A)的肽。淀粉状蛋白(3肽是叫作淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的前 体蛋白的39-43个氨基酸的内部片段。在APP蛋白内部的一些突变与阿尔 茨海默病的存在相关(Goate等，(1991)，缬氨酸717到异亮氨酸；Chartier Harlan等，(1991),缬氨酸717到甘氨酸；Murrell等，(1991),缬氨酸717到 到苯丙氨酸；Mullan等，(1992),双突变，赖氨酸595-甲硫氨酸596变成天 冬酰胺595-亮氨酸596)。认为这样的突变通过增加或改变APP向(3-淀粉状蛋白的加工、特别是APP向增加量的长形式的P-淀粉状蛋白(即，A(31-42和A卩l-43) 的加工而引起阿尔茨海默病。认为在其它基因诸如早老蛋白基因，即PS1 和PS2中的突变间接影响APP的加工，产生增加量的长形式的(3-淀粉状 蛋白(参见Hardy, TINS 20, 154, 1997)。这些观察表明P-淀粉状蛋白，并且 特别是其长形式，是阿尔茨海默病中的病因要素。其它具有自我聚集迹象的肽或蛋白也是己知的，诸如，但不限 于，支链淀粉(Yoimg等，1994);铃蟾肽，蛙皮縮胆囊肽，縮胆囊素八肽，章 鱼唾腺精(eledoisin),胃泌素相关的五肽，胃泌素四肽，促生长素抑制素 (还原的)，物质P;和肽，促性腺素释放素，促生长素抑制素N-Tyr (Banks 和Kastin, 1992)。下表1提供与神经变性相关的一些构象疾病的列表。
表l
与神经变性相关的构象疾病 蛋白质
病症 阿尔茨海默病 帕金森病 朊病毒疾病
肌萎縮性侧索硬化病
脊髓小脑共济失调(SCA1)
脊髓小脑共济失调(SCA3)
脊髓小脑共济失调(SCA6)
脊髓小脑共济失调(SCA7)
亨廷顿病
Entatombral-pallidoluysian萎縮
脊髓和延髓肌肉萎縮
遗传性大脑淀粉状蛋白血管病
家族性淀粉样变
额颞叶痴呆
英国/丹麦痴呆
家族性脑病
淀粉状蛋白-P
(x-突触核蛋白
PrP
SODI
共济失调蛋白-1 共济失调蛋白-3 转通道
共济失调蛋白-7 亨廷顿蛋白(Huntington) 萎縮蛋白-1 雄激素受体
半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的片段
运甲状腺素蛋白/溶菌酶
突变的tau蛋白
突变的briPP蛋白片段
突变的神经丝抑蛋白
9
关于淀粉状蛋白纤维的出版物表明圆柱形的(3-折叠是与一些
x-射线和电子显微镜数据相一致的唯一的结构，并且阿尔茨海默A|3片段 和变体的纤维可能是由两个或三个同中心圆柱形P-折叠组成(Peretz等， 2002)。完整的A|3肽包含42个残基，恰好是为圆柱形外壳提供核心的准 确数目；这一发现和在不存在脯氨酸时在由A(3肽组成的P-折叠中的许多 可能的强静电相互作用解释了该Af3肽形成在阿尔茨海默患者中发现的细 胞外淀粉状蛋白斑的倾向性。如果这种解释是正确的，则淀粉状蛋白由具 有中央充满水的腔的狭窄的管(纳米管)组成。淀粉状蛋白斑体外生长的 可逆性提示在斑中和在溶液中的卩A之间的稳定状态平衡(Maggio和 Mantyh, 1996)。 (3A聚合作用对肽-肽相互作用形成|3-皱褶的折叠原纤维的 依赖性，以及其它蛋白对该反应的刺激影响，表明淀粉状蛋白形成可以进 行调节。已经进行了许多尝试来发现能够干扰淀粉状蛋白形成的物质。其 中研究最多的化合物是抗体、由(3-断裂者(breaker)氨基酸如脯氨酸组成的 肽、向识别基序上添加带电荷的基团和将N-甲基化的氨基酸用作构建组件 (由Gazit, 2002综述)。由交替的D和L残基组成的环肽形成这样的纳米管，该纳米 管通过将它们自身插入到膜中并且将它们去极化而杀死细菌(Peretz等, 2002)。存在一些暗示，表明一些淀粉状蛋白纤维可能是导体并且通过相同 的机制杀死细胞。可以将它们自身插入到螺旋转角之间的缝隙中的芳香化合物 诸如刚果红可能使所述圆柱形外壳不稳定，并且起始该过程，但是预防将 是更有效的，并且可能更易于实现(Peretz等,2002)。
细胞内聚集体-构象疾病的特点蛋白错误折叠和构象变化是一些类型的疾病中的表现和进展 的主要起因(Raso等，2000)，并且在下表2中显示了构象疾病以及它们相 关的蛋白成分和细胞内含体的列表(Goedert等，1998)。在一些情形中，不 止一种蛋白参与病症，共存在斑中或使得斑的形成更容易。
表2在神经变性和其它类型的疾病中的蛋白纤维状内含体
疾病蛋白成分细胞内含体
神经变性
阿尔茨海默病rau, A(3 42肽神经原纤维缠结
皮克病i:au皮克体/细胞质
进展性核上瘫痪(PSP)Tau，热激蛋白神经原纤维缠结
具有雷维小体的痴呆症oc-突触核蛋白雷维小体/细胞质
帕金森病a-突触核蛋白，晶体神经丝/细胞质
亨廷顿病亨廷顿蛋白的延伸的核内内含体
Glu重复
脊髓小脑共济失调共济失调蛋白1、 3、 7核内内含体
(SCA)的延伸的Glu重复
可传播性海绵状脑病朊病毒蛋白，组织蛋白内体样细胞器
(TSE)酶B
系统淀粉样变
2型糖尿病支链淀粉
血液透析相关的AP-2微球蛋白
反应性淀粉样变淀粉状蛋白A
囊性纤维化CFTR蛋白在阿尔茨海默病(AD)中，其代表西方国家老年人口中的主要问 题，主要蛋白成分是APP，其是一种约700个氨基酸残基的跨膜蛋白。在 其异常加工过程中，在细胞外产生Ap(l-40)肽，并且沉积为斑。AD的另 一个标记是另一种蛋白Tau (tau)的神经原纤维缠结，其在细胞内观察到。 Tau是参与稳定神经元中位于细胞内的轴突微管的微管-相关蛋白。在帕金森病中，其是第二最常见的神经变性病，涉及一些蛋白， a-突触核蛋白，synphilin (—种a-突触核蛋白相互作用蛋白)和帕金蛋白 (Ciechanover，2001)。帕金森病的特征是存在细胞内雷维小体，其在零星的 帕金森病病例中、在具有雷维小体的痴呆症和阿尔茨海默病的雷维小体变体中发现(Chung等.，2001)。 a-突触核蛋白是雷维小体的主要成分 (Spillantini等.，1997)。 a-突触核蛋白和synphilin 二者都是形成雷维小体所 必需的，其中可能发生synphilin的遍在蛋白化(Ciechanover, 2001;和 Chung等"2001)。朊病毒疾病，构象疾病的另外实例， 一定范围的可传播性海绵 状脑病(人类的库鲁、克罗伊茨费尔特-雅各布病和致死性家族失眠症，牛 的牛海绵状脑病，绵羊的痒病，和鹿的慢性萎縮病)具有许多与细胞内淀 粉样变(amyloidose)共有的特征，并且最可能是"构象的"(Soto, 2001)。 迄今为止，已经在多种构象病中的蛋白质沉积(proteinaceous deposites)中发 现约20种人蛋白。这些没有表现出任何序列或结构同源性。认为共同的 事件是构象改变，导致缺乏生物学功能或获得毒性活性，并且可能地，形 成淀粉状蛋白原纤维。关于纤维聚集物和淀粉状蛋白噬斑是否是一些其它病理学的 副产物或它们是否是所述疾病的主要原因是争论的主题。蛋白聚集物与退 化组织的共同定位以及它们的存在与疾病症状的相关性是构象疾病的发 病机理中sheji淀粉状蛋白沉积的强指征(Soto, 2001)。在一些神经变性疾 病的家族性原因(表1和2)中，已经获得关于在突变的蛋白质形成原纤 维的能力和病理迹象出现之间的直接联系的证据(Goedert等，1998;和 Conway等，1998)。利用转基因动物的研究也已经证实突变在促淀粉状变 蛋白(amyloidgenic protein )和疾病发病机理中的贡献(Soto, 2001; Scherzinger等，1997;禾口 Tu腿ine等，2000)。
在不同蛋白质中的淀粉状蛋白形成的相似性 Dobson与合作者提议淀粉状蛋白-原纤维形成是蛋白质的共有 特征(Guijarro等，1998; Fandrich等，2001;禾Q Dobson, 1999)。常见的观察是 纤维化从中间体状态起始，所述中间体状态即部分解折叠的或部分折叠 的、熔珠或天然样中间体(Rochet等，2000)。具有cx-螺旋结构的部分必须 进行a-向P-转化，并且然后P-链缔合成规则的纤维结构。在体外，通过改变pH或加入有机溶剂而改变溶剂条件(Buck, 1998)可以导致部分解折叠以及随后的蛋白质原纤维形成(Chiti等，1999a
12和1999b)。在体内，部分解折叠可以作为由于突变、在膜处的pH的局部 变化、氧化和热压力引起的降低的蛋白质稳定性的结果而发生，而部分折
叠可以在暴露于环境疏水物质如杀虫剂时发生(Uversky等，2001)。原纤维的共有特征是与原纤维的长轴垂直排列的卩-链(间隔 4.7A)和与该轴平行延伸的J3-折叠(Serpe11, 2000)。所述(3-链形成具有在每 115或250A处的常见重复的卩-螺旋弯曲(Serpell，2000;禾BDing等，1999)。
理解淀粉状蛋白-原纤维形成可以有助于解决一些目前最有破 坏性的疾病，并且至少增加对蛋白质结构、折叠和稳定性的常识。已经显 现了淀粉状蛋白原纤维的多种特性纤丝和原纤维的共有结构(Serpell,
2000) ，成核依赖性动力学(Lomakin等，1996)，低聚体中间体的作用(Harper 等，1999;和Walsh等，1999)以及由高能屏障隔开的至少两种蛋白质构象的 存在，其表现出两种肉眼可见的状态(Ferreira等，2001;和Schlunegger等,
2001) 。
家族性肌萎縮致死性硬化病(fALS)家族性肌萎缩致死性硬化病(fALS)， 一种先天性神经变性病， 其中运动神经元被损害并且丢失，占ALS病例的10% (Cudkowicz等. 2004,-和Gonzalez de Aguilar等.2007)。在20%的这些病例中，病理学特征 在于蛋白质超氧化物歧化酶1 (S0D1)的突变形式的细胞内累积，其导致淀 粉状蛋白-样纤丝和聚集体的形成(Bruijn等，1998; Watanabe等，2001; Taylor等，2002;Elam等，2003; Wood等，2003;和Mats腿oto等，2005)。 尽管fALS是归因于在SOD1基因中的导致S0D1蛋白质的错误折叠形式 的许多已知的突变，但是尚未证明缺乏在该S0D1基因中的任何已知突变 的其余80%的ALS患者是否经受S0D1聚集体，所述SOD1聚集体可能 是翻译后修饰或迫使SOD1蛋白错误折叠的其它环境条件的结果。在研发了突变的人S0D1蛋白的一些转基因小鼠模型后，获得 了 ALS研究的进展。这些模型中的一种携带G93A突变的SOD1蛋白，其 导致SODl累积和运动损伤(Watanabe等.2001; Wong等.2002; Julien禾口 Kriz2006;和Umshitani等.2007)。这些小鼠是最好也是最常用的ALS研 究模式动物。解决和预防细胞内聚集体的治疗途径新的治疗途径是针对实现下述目的之一抑制和/或逆转构象 改变，或者溶解较小的聚集体并且分解淀粉状蛋白原纤维。在参考文献中 已经引用了一些成功的尝试，其包括利用与蛋白的活性构象结合并且因此 抑制构象改变的单克隆抗体。在阿尔茨海默病中，开始进行接种，在这种
情形中，靶向较小的低聚体和前纤维(prefibrillar)聚集体(Ingram等，2001)。 Soto与同事已经设计了所谓的"小-蛋白伴侣"，也称为'P折叠破坏剂' (Soto等，2001)，其是与负责自我缔合的蛋白质区域的序列结合的肽。在朊 病毒疾病中，与阿尔茨海默病相似，开始使用防止构象改变的单克隆抗体 进行试验(Jones, 2001)。已经筛选了一些己经用于其它目的的药物，并且 发现一些药物如果用于早期千预延迟或逆转神经变性，并且还在非常危险 的病例中改善疾病状态，如由Prusiner组报告的(Korth等，2001)。这些药 物中的一种，米帕林，是一种抗疟药，以及另一种，氯丙嗪，用来治疗精 神分裂症。已经发现了淀粉状蛋白原纤维形成的其它阻断剂，在从刚果红 衍生物、抗癌和抗生素药到烟碱和褪黑激素的范围内(Findeis, 2000)。
用于噬菌体向细胞内的内在化的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽 22年前在fibronectin中发现精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)细 胞黏附序列(Pierschbacher等，1984a)。在非常大的蛋白质中仅3个氨基酸 将形成细胞的主要识别位点的这一令人惊讶的发现最初受到一些怀疑。然 而，关于纤维结合素的观察很快得到证实并且扩展到其它蛋白质。如在关 于RGD的最初的论文中所预测地，结果是所述RGD序列是许多其它黏附 蛋白的细胞黏附位点(Pierschbacher等，1984b; Yamada等，1984; Gartner等， 1985; Plow等，1985; Suzuki等，1985;和Gardner等，1985)。在另一种内在 化肽中，人免疫缺陷病毒(HIV)的Tat蛋白，是一种具有细胞黏附活性的含 有RGD的蛋白质。Tat与细胞的相互作用是重要的，原因在于Tat可以被 细胞内在化，因此允许由一个细胞产生的Tat进入另一个细胞，并且开始 潜在HIV的生产(Ensoli等，1990)。包含Arg-Gly-Asp(RGD)黏附位点的蛋白，以及作为它们的受
14体的整联蛋白，组成关于细胞黏附的主要识别系统。所述RGD序列是大 量黏附细胞外基质、血液、和细胞表面蛋白的细胞黏附位点，并且多于20 种的已知整联蛋白的几乎一半识别在它们的黏附蛋白配体中的该序列。另 一些整联蛋白结合在它们的配体中的相关序列。黏着蛋白的结合整联蛋白
的活性可以由含有RGD序列的短合成肽重现。当在表面上不溶时，这样 的肽促进细胞黏附，并且在溶液中呈递到细胞时抑制它。通过环化具有在 RGD周围的选择序列的肽和通过合成RGD模拟物，可以设计与唯一的或 一些RGD-导向的整联蛋白选择性结合的反应齐lJ。因为整联蛋白-介导的细 胞黏附影响并且调节细胞迁移、生长、分化和程序性细胞死亡，所以RGD 肽和模拟物可以用来探测在不同生物系统中的整联蛋白功能。
由通过经由RGD环肽的整联蛋白受体的受体介导的胞吞作用引起的噬菌 体与哺乳动物细胞的结合和内在化含有RGD序列的环形肽可以以高亲和力结合整联蛋白分子， 并且因此允许通过与假结核耶尔森氏菌(j /^"^^Z^cm/o^)的侵染素-介 导的内在化相似的机制内在化。在丝状噬菌体展示系统中，结合整联蛋白 的、含有RGD的环形肽融合到具有fd噬菌体的主要衣壳蛋白基因，即基 因VIII的外源DNA序列上(Greenwood等，1991;禾Q Hart等，1994)。该方 法的目的是展示多个拷贝的整联蛋白-结合肽，以最大化噬菌体和细胞之间
相互作用的机会。衣壳包含野生型pvm和融合pvni亚基的杂交混合物
(Greenwood等，1991;和Hart等，1994)。 Hart设计了编码该环形肽序列 GGCRGDMFGC (SEQ IDNO:l)的DNA寡核苷酸，以在噬菌体上以多个拷 贝展示。该肽最初在噬菌体展示文库中在基因HI-编码的丝状噬菌体小外 壳蛋白中分离并且得到描述，并且证明具有高整联蛋白-结合亲和性(O'Neil 等，1992)。在它们的主要外壳蛋白亚基上展现该肽的噬菌体fd粒子还具有 针对整联蛋白的高结合亲和力。在噬菌体M13的pVm主要外壳蛋白上呈递的环形肽序列 EFGACRGDCLGA (SEQ ID NO: 2)显示出以高效率结合哺乳动物细胞 (Ivanenkov等，1999;和Masliash等，2000)。本文对任何文件的引用不意欲作为承认所述文件是相关的现有技术，或者认为是关于本申请任何权利要求的专利性的材料。关于任何 文件的内容或日期的任何陈述是基于本申请人在提交时可获得的信息，并 且不是构成对关于这样的陈述的正确性的承认。
发明概述本方法提供一种抑制或治疗与蛋白纤维状内含体或聚集体的 细胞内形成相关的疾病的方法。所述方法包括向需要其的哺乳动物受试者 施用有效量的治疗剂，所述治疗剂携带被展示的含有哺乳动物细胞黏附序 列的肽序列，以便能够将所述治疗剂内在化在细胞内，从而抑制或治疗所 述疾病。.本发明还提供用于抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内 形成或用于解聚(溶解)预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体的 方法。本发明还提供一种包含有效量的治疗剂的药物组合物，所述治 疗剂在本方法中用作活性成分。
附图简述
图1A-1C是显示使用夹心ELISA进行的内在化噬菌体动力学 的定量分析的图。在图1A中，将CHO细胞用噬菌体RGD(菱形)、WT(正 方形)、或PBS (三角形)以6.6X10"个噬菌体/平板的终浓度培养一些时延 (time lapse): 15分钟和30分钟，1、 2、 5和22小时。然后，裂解细胞， 并且将总细胞裂解物应用到用小鼠抗-M13抗体包被的96孔微量滴定平板 上。在细胞内的噬菌体水平用多克隆兔抗噬菌体抗体然后用山羊抗兔HRP 缀合的抗体检测。在细胞内的噬菌体浓度与通过分光光度计监测的具有 405nm处参照的492nm处的光学密度成比例。图1B是图1A的放大，其 允许显现达到2小时的短时延。图1C是噬菌体RGD校准曲线。图2A-2C是显示如通过夹心ELISA测量的噬菌体从CHO细 胞清除的动力学的图。在图2A中，将CHO细胞用噬菌体RGD (菱形)、 WT (正方形)、或PBS (三角形)以6.6X10^个噬菌体/平板的终浓度培养2 小时初始内在化。然后，清洗细胞，并且更换培养基。在一些时间点后即2, 5, 48和72小时后裂解细胞。将细胞裂解物应用到用小鼠抗M13抗体包 被的96孔微量滴定平板上。细胞内的噬菌体水平用多克隆兔抗-噬菌体抗 体然后是山羊抗兔HRP缀合的抗体进行检测。在细胞内的噬菌体浓度与 通过分光光度计监测的具有405nm处参照的在492nm处测量的光学密度 成比例。图2B是图2A的放大，其允许显现达到10小时的短时延。图2C 显示用噬菌体RGD、 WT、 PBS或硫柳汞温育1周的其它CHO细胞平板 的MTT存活性测定。图3A和3B是显示在转基因小鼠的海马(图3A)和皮层(图 3B)中的雷维小体染色的图。组A/对照用水剂bidest每周处理一次，持续 8周(11=5)。组B/噬菌体慢性用丝状噬菌体每周处理一次，持续8周(11=5)。 评估在~15月龄的海马和皮层(11=3/组)中的a-突触核蛋白免疫反应性。 在每天处理2次持续3天的急性处理组(8月龄)中没有作用。图4是显示用噬菌体处理的SOD1小鼠的转棒取样器 (Rotorod)运动表现的图。此处描述的转棒取样器结果在估测的小鼠疾病 发作年龄评估运动表现。结果计算为3次操作/小鼠/周的平均时间。可以 看出，经处理的小鼠比未处理的小鼠具有更好的运动表现，并且保持该能 力更长的时间，其转化为疾病发作的延迟。在所有组中，完全运动功能障 碍在大约相同的年龄达到终点。图5是显示用展示RGD的噬菌体处理的SODl ALS模式小鼠 的存活率的图。深色粗线显示未处理的小鼠的存活率。浅色细线显示UV-灭活的噬菌体-处理的小鼠的存活率，其显示出相对于对照组的26天的死 亡发作延迟，和在最老的小鼠中死亡的14天延迟。50%的存活平均数估计 比对照组长10天。深色细线显示活噬菌体-处理的小鼠的存活率，这显示 出相对于对照组的15天死亡发作延迟，和在最老的小鼠中死亡的19天延 迟。50%存活平均数估计比对照组长8天。图6A-6E是来自SOD1和噬菌体免疫组织化学和共聚焦显微 镜结果的图像，其中图6A显示利用单克隆抗体抗-人SOD1的cy2标记 (Santa Cruz l:5 0)在皮层中的神经元SODl染色。在皮层中可以看到大量 的SOD1阳性神经元。图6B显示使用cy3标记的兔多克隆抗-M13噬菌体 (l:500)的噬菌体标记。箭头指向一些噬菌体阳性皮层神经元和所述噬菌体
17在神经元细胞质内的存在。图6C显示使用兔多克隆抗-MB噬菌体的cy3 标记(1:500)对星形胶质细胞(仅通过形态学)的噬菌体标记。图6D和E 显示S0D1神经元和M13噬菌体的双重标记证明噬菌体向SOD1阳性神 经元的内在化以及它们在细胞质内的存在。图7是显示噬菌体感染在四环素培养基上生长的TG1细菌的 能力的培养皿图像，其中在对照培养皿中，给予PBS的TG1不生长，但 是当TG1被给予M13噬菌体时，然后作为赋予该细菌四环素抗性的感染 噬菌体的结果，它们可以在四环素培养基上生长。图8是显示噬菌体的UV照射防止噬菌体感染TG1细菌的能 力的培养皿图像，其中培养皿A是阳性对照…-用M13噬菌体感染的TG1 细菌，因此能够在四环素上生长；培养皿B-用经过一个200,000 pjUV灭 活周期因此失去它们感染细菌的能力的M13噬菌体感染的TG1细菌，；培 养皿C -用经过两个200,000 |ij UV灭活周期的M13噬菌体感染的TG1细 菌；培养皿D -用经过三个200,000 ^ UV灭活周期的M13噬菌体感染的 TG1细菌；培养皿E -用经过四个200,000 UV灭活周期的M13噬菌体 感染的TG1细菌；和培养皿F -用经过五个200,000 nj UV灭活周期的M13 噬菌体感染的TG1细菌。图9A和9B是UV照射的噬菌体的电子显微照片(条100 nm)。 图9A显示处于它们天然的丝状结构的野生型噬菌体，并且图9B显示UV-照射的噬菌体。在所述UV-照射的噬菌体中的噬菌体丝状结构未被破坏。图10是显示用A(31-40聚集体评估噬菌体干涉的ThT测定的 结果的图。淀粉状蛋白含量在435nm处激发后在485nm波长处用分光荧
发明详述 P-淀粉状蛋白肽((3A)是两种阿尔茨海默病标志中的一种。该肽 在脑组织中形成仅可以被强变性剂溶解的纤维状毒性聚集体。由于这些神 经毒性特性与肽聚集形成相关，己经投入了许多努力以开发减少或消除脑 中的淀粉状蛋白纤维沉积的程度的治疗途径。在生理条件下，合成的(3A采取聚集的形式，并且还表现出从
18神经突的改变，这促进对海马神经元的神经毒性作用。已经表明(3A的聚 集依赖于pH、肽浓度、温度和温育时间。在本发明人的实验室中，使用在结构和遗传水平上充分了解的 丝状噬菌体M13、 fl和fd (Greenwood等，1991)。本实验室最先表明丝状 噬菌体表现出向中枢神经系统的渗透特性，同时保持载体的惰性特性和携 带外源分子的能力(Frenkel和Solomon, 2002)。本发明人的实验室还已经令人惊讶地发现在体外丝状噬菌体 本身具有防止(3A聚集的能力，以及溶解已经形成的聚集体。丝状噬菌体是一组结构相关的病毒，其包含环形单链DNA基 因组。它们在生产性感染过程中不杀死它们的宿主。感染包含F质粒的大 肠杆菌(&c/zen'c/z^co//)的噬菌体统称为Ff噬菌体。它们不感染哺乳动 物细胞。丝状噬菌体是约l-2微米长且直径为6 nm的柔软的棒状，在 DNA核心周围有蛋白亚基的螺旋外壳。两种主要外壳蛋白，即蛋白pIII 和主要外壳蛋白pVin，在所展示的蛋白拷贝数目上不同。尽管pIII以4-5 个拷贝存在，发现pVIII以 3000个拷贝存在。约50个残基的主要外壳蛋 白pVIII亚基主要是ot-螺旋，并且该cx-螺旋的轴与病毒体的轴形成小角度。 蛋白外壳可以以三个面考虑外表面，由该亚基的N端区域占据，富含酸 性残基，所述酸性残基与周围溶剂相互作用并且赋予该病毒体低等电点； 外壳的内部，其包括19个残基的无极性侧链片段，其中蛋白亚基主要彼 此之间相互作用；和内表面，由该亚基的C端区域占据，富含碱性残基， 所述碱性残基与DNA核心相互作用。实际上所有蛋白侧链相互作用处于 外壳蛋白阵列的不同亚基之间而不是在亚基内的事实使其成为研究大分 子装配中的ci-螺旋亚基之间的相互作用的有用的模式系统。丝状噬菌体的 独特结构使其能够渗透到脑中，尽管它具有约16.3MD的质量，并且由于 噬菌体结构本身与淀粉状蛋白原纤维相似，可能有助于其妨碍卩A纤维化 的能力。考虑上述，本发明人的实验室已经检验了丝状噬菌体妨碍(3-淀粉状蛋白肽聚集过程的能力，并且发现在体外用不同比例的P-淀粉状蛋 白肽以不同时间间隔培育野生型丝状噬菌体导致防止和/或解聚P-淀粉状蛋白。此外，所述丝状噬菌体表现出对细胞存活性的保护作用。因此，本发明人的实验室已经证明丝状噬菌体M13对淀粉状 蛋白-P肽(A(3P)聚集的体外调节作用，以及该噬菌体针对聚集的A|3介导的 毒性的神经保护活性。表明丝状噬菌体的线性结构在体外和体内均赋予针 对A(3的抗-聚集特性，抑制淀粉状蛋白形成，并且溶解已经形成的聚集体。 修饰噬菌体的线性结构并且使其成为球形消除了其解聚以及穿透能力。本发明人的实验室最近表明，由于它们的线性形状，丝状噬菌 体具有向不同种类的膜的高透过性。这种独特的结构使得它们穿透到 CNS，而不管它们的高M.W.。加工这些噬菌体以展示抗-A(3抗体，并且通 过鼻内施用递送至转基因小鼠脑部，且与A(3斑共同定位。近来，提议了 针对可卡因滥用的相似治疗策略，其利用鼻内施用在其表面上展示可卡因 -螯合抗体的加工的丝状噬菌体Q这些噬菌体粒子是CNS渗透的有效载体， 并且能够结合可卡因，由此在啮齿动物模型中阻断其行为作用(Carrem等， 2004)。在温育丝状噬菌体-(3-淀粉状蛋白原纤维与在载玻片上生长的 小胶质细胞后获得数据。如果P-淀粉状蛋白的确活化小胶质细胞，在不活 化小胶质细胞的条件下，该噬菌体溶解其。噬菌体技术提供了一种新的且 实践上不受限制的(3-淀粉状蛋白抗聚集剂来源，防止可能通过Fc受体过 度活化小胶质细胞的抗体的有害作用。与动物病毒相比，噬菌体作为基因和/或递送载体(vehicles) 具有独特的优点。它们是简单的系统，其大规模生产和纯化是非常有效的， 并且比动物病毒载体的大规模生产和纯化更廉价。另外，在噬菌粒载体中 可以有效包装DNA大片段。己经设计了原核感染、装配和复制，噬菌体 不可以在哺乳动物细胞内复制，也不显示出对哺乳动物细胞的天然向性。 这最小化了非特异性基因递送的机会。噬菌体载体比病毒潜在安全得多， 原因在于它们更不可能在动物细胞中产生能够复制的实体(Monaci等， 2001)。本发明提供一种抑制或治疗与蛋白纤维状内含体或聚集体的 细胞内形成相关的疾病的方法，该方法通过给需要其的哺乳动物受试者施 用有效量的治疗剂进行，所述治疗剂携带被展示的包含哺乳动物细胞黏附序列的肽序列，以能够将所述治疗剂内在化在所述哺乳动物受试者的细胞 内，从而抑制或治疗所述疾病。通过本发明方法抑制或治疗的疾病是指与蛋白纤维状内含体 或聚集体的细胞内形成相关的那些疾病，所述蛋白纤维状内含体或聚集体 诸如细胞内神经原纤维缠结、皮克体、雷维小体、神经丝、细胞内内含体
和由蛋白成分组成的内体样细胞器，所述蛋白成分如tau、 A(31-42肽、热 激蛋白、(x-突触核蛋白、cystallins、亨廷顿蛋白或共济失调蛋白的延长的 Glu重复、朊病毒蛋白、组织蛋白酶B、支链淀粉、淀粉状蛋白A和卩-2 微球蛋白等，如在表l中所公开。优选地，所述疾病是阿尔茨海默病、帕 金森病、具有雷维小体的痴呆症，或肌萎縮性侧索硬化病(ALS)。尽管该 疾病的优选实施方案与脑有关，本方法还可以治疗在机体内其它部位与蛋 白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成相关的疾病。当用于本发明时，所述治疗剂可以是抑制蛋白纤维状内含体或 聚集体的细胞内形成的或解聚(溶解)预先形成的细胞内蛋白纤维状内含 体或聚集体的任何试剂，只要所述治疗剂携带由所述治疗剂展示的包括哺 乳动物细胞黏附序列的肽序列，从而能够将所述治疗剂内在化在细胞内， 以解聚或抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的形成。携带所述肽序列的治疗 剂的优选实施方案是在其表面上展示该肽序列的丝状噬菌体，优选地具有 这样的限制条件，即所述丝状噬菌体除了该肽序列之外还不展示抗体或非 丝状噬菌体抗原。所述治疗剂的其它非限制性实例包括其它类型的噬菌体 和病毒，以及与所述哺乳动物细胞黏附序列融合的肽、蛋白和其它治疗化 合物。所述肽的非限制性实例包括在美国专利6,462,171和Soto等.(2001) 中公开的抑制性肽。所述哺乳动物细胞黏附序列可以是作为细胞黏附的结果促进 内在化的任何序列。优选地，所述哺乳动物细胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。最优选地，所述RGD细胞黏附序列包括SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2，并且是环形的。细胞黏附序列的另一个非限制性实例 是来自HIV的Tat肽。所述丝状噬菌体可以是任何丝状噬菌体，诸如M13, fl,fd,或 其混合物。尽管在下述实施例中使用M13，但是认为任何其它的丝状噬菌体以相似的形式表现和行使功能，原因在于它们具有相似的结构，并且因 为它们的基因组具有大于95%的基因组相同性。所述丝状噬菌体优选地进 行UV-照射且灭活，其中UV-照射和灭活使该噬菌体的丝状结构未受损害， 以致其保留其抑制细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体形成的能力或其解 聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体的能力。当所述方法用来抑制或治疗在脑中发生的疾病时，所述丝状噬
菌体优选地以鼻内施用，以将活性成分通过受体的嗅觉系统引入到受体的体内。作为所述治疗剂的优选实施方案，丝状噬菌体M13具有许多 优点。它是无毒的、用于表达肽或蛋白的充分确定的系统。它稳定在其外 壳蛋白上表达的肽或蛋白，易于递加至大规模生产，没有针对哺乳动物细 胞向性，并且促进向脑的渗透。本发明还提供一种用于抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细 胞内形成的方法。该方法包括使得治疗剂与能够形成蛋白纤维状内含体或 聚集体的细胞内肽或多肽接触，以抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞 内形成，所述治疗剂携带被展示的包含哺乳动物细胞黏附序列的肽序列， 从而能够将所述治疗剂内在化至哺乳动物细胞内。本发明还提供一种用于解聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内 含体或聚集体的方法。本发明的这一实施方案包括使得治疗剂与预先形成 的细胞内纤维内含体或聚集体接触，以解聚所述预先形成的细胞内蛋白纤 维状内含体或聚集体，所述治疗剂携带被展示的包含哺乳动物细胞黏附序 列的肽序列，从而能够将所述治疗剂内在化至细胞内。所述丝状噬菌体关于(3A原纤维形成或解聚的抗聚集或解聚特 性可以通过公知的硫黄素T (ThioflavinT, ThT)结合测定测量。中断(3A 原纤维结构形成以及预先形成的13A原纤维的解聚由ThT荧光的显著减少 指不。为了本说明书和附上的权利要求的目的，术语"受试者"、"患 者"和"受体"可互换使用。它们最优选地是人，但是可以是任何哺乳动物， 包括小鼠、大鼠、猴子、牛、绵羊、山羊、猪、马、狗、猫等，其是预防、 实验或治疗性处理的对象。
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术语"(3淀粉状蛋白肽"与"(3-淀粉状蛋白肽"、"(3AP"、 "f3A"和 "A卩"同义。所有这些术语是指来源于淀粉状蛋白前体蛋白的形成斑的肽。
当用于本发明时，"PrP蛋白"、"PrP"、"朊病毒"是指在适当的
条件下能够诱导负责斑形成疾病的聚集体形成的多肽。例如，在这样的条 件下，正常的细胞朊病毒蛋白(PrPC)转化成相对应的痒病同种型(PrPSc)， 其负责斑形成疾病，诸如但不限于，牛海绵状脑病(BSE)、或疯牛病、猫 的猫科(feline)海绵状脑病、库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、和致死性家族性失眠症(FFI)。当用于本发明时，术语"解聚"是指典型通过非共价键保持在一 起的聚集的蛋白的增溶(溶解)。术语"治疗"意欲意指基本上抑制、减缓或逆转疾病的进展，基 本上改善疾病的临床症状或基本上防止疾病临床症状的出现。因为与上述疾病相关的大部分淀粉状蛋白斑(也称为淀粉状蛋 白沉积)定位在脑部，所以任何提议的关于细胞外斑的治疗方式必须表现出 穿过血脑屏障(BBB)的能力以及溶解淀粉状蛋白斑的能力。通常，能够穿 过BBB的分子的平均大小约为2 kDa。越来越多的证据表明，在AD的临床阶段早期影响中枢嗅觉途 径中的嗅觉缺失和退化改变。此外，AD中涉及的解剖模式提示嗅觉途径 可能是AD发展的初始阶段。嗅觉受体神经元是双极细胞，其定位在鼻腔的上皮层中。它们 的轴突横穿筛板，并且突出到在脑嗅球中的嗅觉途径的第一突触。这种构型使得它们成为病毒或其它转运的物质可以获得穿过BBB到达CNS的
"大路"。如先前所示，鼻内施用(Mathison等，1998; Chou等，1997; Draghia等，1995)能够使病毒和大分子直接进入脑脊液(CSF)或CNS。在参考文献中报道了利用嗅觉受体神经元作为腺病毒载体到 脑的递送点。据说该方法使得报告基因在脑中表达持续12天而没有明显 的毒性(Draghia等，1995)。本发明所述的药物制剂包括有效量的治疗剂作为活性成分，所 述治疗剂携带被展示的肽序列，以能够将所述治疗剂内在化在细胞内。本发明所述的制剂可以本身被施用到生物体，或者处于与适当 的载体或赋形剂混合的药物组合物中。当用于本发明时，"药物组合物"是指本文所述的一种或多种 活性成分与其它化学成分如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合 物的目的是促进化合物向生物体的施用。在本发明中术语"活性成分"是指负责生物学作用的制剂。在下文，可以互换使用的短语"生理上可接受的载体"和"药 用载体"是指不引起对生物体的显著刺激且不消除所施用的化合物的生物 学活性和特性的载体或稀释剂。在这些短语中涵盖佐剂。在本发明中术语"赋形剂"是指添加到药物组合物中进一步促 进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸 钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。用于配制和施用药物的技术可以在"雷明顿药物科学 (Remington's Pharmaceutical Sciences)," Mack出版公司,Easton， PA,最新 版本，中找到，其通过引用结合于此。适当的施用途径可以包括，例如，口服、直肠、透粘膜特别是 透鼻的、小肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接 的心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。备选地，人们可以以局部而非系统模式施用制剂，例如，通过 将制剂直接注射到患者的脑部。本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，例如，通过常规混合、溶解、粒化、做糖衣丸、研磨、乳化、包封、包载(entrapping) 或冻干程序制备。因此，用于本发明的药物组合物可以以常规方式使用一种或多 种生理上可用的载体配制，所述生理上可用的载体包括赋形剂和佐剂，其 促进将活性成分加工到可以药用的制剂中。适当的制剂依赖于所选用的施 用途径。对于注射，本发明的活性成分可以配制在水溶液中，优选地在 生理相容的缓冲剂如Hank's溶液、林格溶液、或生理盐水缓冲液中。对于 透黏膜施用，在所述制剂中使用适合透过屏障的渗透剂。所述渗透剂在本 领域内是公知的。对于口服施用，治疗剂可以容易地通过将活性成分与本领域公 知的药用载体组合而配制。所述载体能够将所述治疗剂配制为片剂、丸剂、 糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、结晶浆液、混悬液等，用于由患者口 服摄取。用于口服应用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，如果需要的 话，加入适当的佐剂后，任选地碾磨所得到的混合物，并且加工颗粒的混 合物，以获得片剂或糖衣丸核。适当的赋形剂特别是填充剂如糖，包括乳 糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纤维素制剂，诸如例如，玉米淀粉、小麦 淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪树胶(gumtragacanth)、甲基纤 维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可用的聚合物， 诸如聚乙烯吡咯垸酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联的聚 乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。为糖衣丸核提供适当的包衣。为了该目的，可以使用浓缩的糖 溶液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝 胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquersolution)和适当的有机溶剂或溶 剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣中添加染料或色素，用于识别或表征 活性成分剂量的不同组合。可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入-拟合式胶 囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的软的、密封的胶囊。所述 推进-拟合式胶囊可以包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、滑润剂如滑石 或硬脂酸镁、以及任选地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成
25分可以溶解或混悬在适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二 醇中。另外，可以加入稳定剂。所有用于口服施用的制剂应该以适合所选 施用途径的剂量存在。对于口腔施用，所述组合物可以采用以常规方法配制的片剂或 锭剂形式。对于通过鼻吸入施用，按照本发明使用的活性成分便利地以喷
雾剂形式从利用适当的推动剂如二氯二氟甲垸、三氯氟甲垸、二氯四氟乙
烷或二氧化碳的加压包装(pressurized pack)或喷雾器递送。在压縮的气 溶胶的情形中，剂量单位可以通过提供阀门递送计量的量而确定。用于分 配器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有所述化合物和适当的粉末 基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
.
本发明所述的制剂可以配制用于肠胃外施用，例如，通过大丸 剂(bolus)注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如， 存在于安瓿或在多剂量容器内，任选地具有添加的防腐剂。所述组合物可 以是在油性或水性赋形剂中的混悬液、溶液或乳液，并且可以包含配方试 剂如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水 溶液。备选地，可以将活性成分的混悬液制备成适当的油性或基于水的注 射混悬液。适当的亲脂溶剂或赋形剂包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪 酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬液可以包含增加该混 悬液的粘性的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所 述混悬液还可以包含适当的稳定剂或增加活性成分的溶解性的试剂，以允 许制备高度浓缩的溶液。备选地，所述活性成分可以以粉末形式存在，以用于在使用前 用适当的赋形剂如无菌、无热原质的基于水的溶液构建。本发明的制剂还可以使用例如常规栓剂基质如可可油或其它 甘油酯配制在直肠制剂中，诸如栓剂或保留灌肠剂。适用于本发明的情形的药物组合物包括这样的组合物，其中以 获得有意目的的有效量包含活性成分。更具体地，治疗有效量意指有效预 防、减轻或改善疾病症状或延长被治疗的受试者的存活的活性成分的量。它还可以意指抑制或减少蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成或解 聚/溶解预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体的有效量。治疗有效量的确定是充分处于本领域技术人员的能力范围内 的，特别是依据本发明提供的详细公开内容。对于用于本发明方法的任何制剂，最初可以从体外和细胞培养
测定估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制实现需要的效 果的剂量。这样的信息可以用来更准确地确定在人中的有效剂量。本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过标准药学方 法在体外、细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外和细胞培养物测定 和动物研究中获得的数据可以用于配制一定范围的用于人的剂量。所述剂 量可以依赖于所用的剂型和所用的施用途径而不同。可以由个体医师考虑 患者的条件选择准确的制剂、施用途径和剂量(参见，例如，Fingl等，在" 治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)"，第1章第 1页(1975)中)。剂量的量和时间间隔可以进行个体调节，以提供足以防止聚集 或解聚已存在的聚集物的丝状噬菌体血桨或脑水平(最小有效浓度， MEC)。 MEC将随每种制剂不同，但是可以从体外数据确定。获得MEC 所需要的剂量将取决于个体特征和施用途径。结合测定可以用来确定血浆 浓度。剂量时间间隔也可以使用MEC值确定。制剂应该使用在 10-90%的时间、优选在30-90%并且最优选在50-90%的时间保持血浆水平 高于MEC的方案施用。取决于待治疗的病症的严重性和响应，给药可以是单次或多 次施用，治疗疗程持续数天至数周，或直到实现治愈或获得疾病状态的减 轻。要施用的组合物的量当然应该取决于被治疗的受试者、痛苦 的严重性、施用方式、开处方医师的判断等。本发明的组合物，如果需要的话，可以存在于包装或分配器 装置中，诸如FDA核准的试剂盒中，其可以包含一个或多个含有活性成 分的单位剂型。例如，所述包装可以包括金属或塑料箔，诸如泡状包装。所述包装或分配器装置可以附有施用说明。所述包装或分配器还可以包纳 与容器相关的公告，所述公告采用政府机构指定的形式，调节药物的制备、 使用或销售，所述公告反映所述机构对所述组合物的形式或人或兽医施用 的批准。例如，这样的公告可以是由美国食品药品管理局对处方药物批准 的标记，或是批准的产品插页。包括配制在相容药物载体中的本发明的制 剂的组合物也可以制备、放置在适当的容器中，并且标记用于适应征的治 疗，如同上文更详细所述那样。现在已经概述了本发明，通过参考显示下述实施例将更容易 理解本发明，所述实施例通过举例说明的方式提供，并不意欲限制本发明。
阿尔茨海默病实验
材料和方法
电镜(EM)
丝微朦特淀微餅游被/锁将噬菌体和AP样品黏附到在200#栅板上蒸发的formvar包 被的碳上，持续10分钟，并且进行印迹。为了区分丝状噬菌体粒子和A卩 原纤维，进行用针对APP的EFRH氨基酸残基(SEQ ID NO: 3)生产的单克 隆抗体(mAb)196 (在本发明人的实验室中生产)免疫标记，以检测A(3， 使用兔多克隆抗M13 (在本实验室中生产)来标记所述噬菌体。所述免疫 标记分别通过12 nm金缀合的山羊抗小鼠抗体和6 nm金抗兔抗体显现(电 镜科学(Electron Microsc叩y Sciences),华盛顿)。将样品用一抗温育10 分钟，用0.1% BSA/TBS洗涤5次，然后用二抗温育30分钟，洗涤，用 水性乙酸双氧铀(2。/。wt/vol)(西格玛(Sigma))负染色，并且在JEOL 1200 EX 电镜下观察(Ingram, 2001)。野生型M13噬菌体防止A(3P聚集的能力通过将A(3Pl-40 (97 ^M)用不同量的噬菌体(2xlO"噬菌体^10 nM, 2xl01Q噬菌体=1.1 nM,禾口 2xl08噬菌体=0.01 nM)在37°C温育9天进行证实。加入PBS作为对照。 将lOjil来自具有或不具有噬菌体的APP溶液的样品按上述处理。对于解聚实验，将溶解在PBS中的A卩Pl-40在37°C温育9天形成聚集体。向样品(A(31-40 97 一)中加入噬菌体(^1012噬菌体=55 nM, 1乂101()噬菌体=0.55 nM)，在37。C共同温育16小时，并且处理用于EM 分析。
构建噬菌体RGD
縱舰吝乂厲微将不同的大肠杆菌菌株(K91Kan， DH5a禾卩XL-1 blue)在37°C 摇动(250 RPM)下在2ml 2YT培养基(分别含有100 |ig/ml卡那霉素，20 pg/ml四环素或无抗生素)中生长过夜。然后，将600 pl过夜培养物转移到 60mlSOB培养基中，并且生长至早期对数阶段(O.D.(600nm) 0.3)。将生 长的细菌在冰上温育10分钟，然后在4°C以5000 rpm离心10分钟。将 细菌团块重悬在20ml CCMB中，并且在冰上温育20分钟，然后在4°C以 5000 rpm离心10分钟。将沉淀的细菌重悬在5ml CCMB中，整分并且保 存在-70。C，直到使用时。
克隆噬菌体RGD
F飼泰辦靴,分耍使用DNAmidi纯化试剂盒，从"88型"fd文库克隆(由George Smkh提供)分离f88-4载体。将F88-4载体用HindIII和Pstl限制性酶消化。 将包含15吗dsDNA, l(_d Pstl和l^il HindIII, 4^1 3号限制酶缓冲液X10的 40[al总反应体积在37。C温育2小时，然后在70°C灭活5分钟。然后，向 所消化的载体中加入1^1南极磷酸酶(Antarctic Phosphatase),在37°C持续 30分钟，以去除DNA的5'-磷酸基团。将该产物在0.7%琼脂糖凝胶上电 泳。使用DNA提取试剂盒从凝胶上纯化线性处理的载体。
薪乂A虔縱.'翁乂微彌腳麟鹏乂将两种互补的引物，每种50 pMol，与2.5^1 T4激酶缓冲液 X10, 1^1 T4激酶和16.5^1 DDW混合，并且在37°C温育2小时，然后在 70°C灭活激酶10分钟。然后，将20 pmol的每种引物混合至lOOpl的总 体积，并且在95°C温育5分钟。然后，实施逐渐降低的温度，以允许引物退火。在这一阶段退火的引物(插入片段)是由HindIII和PstI粘端组 成的dsDNA。
遂辭〃靴将处理的载体和退火的引物(插入片段)分别以分子比例l:
3连接，如下将100ng载体，1.423ng插入片段，1.5(^1 T4 DNA连接酶缓冲 液X10和1 pl T4 DNA连接酶加入到15^1总体积中，并且在室温温育2小 时，然后在4。C温育过夜。为了评价载体自连率，制备仅由载体组成的另 一份混合物。利用热激步骤，将连接产物转化到感受态K91Kan细菌中， 按下述进行
将10^1连接混合物加入到lOOpl解冻的细菌中，并且在冰水温育30 分钟，然后在42°C温育2分钟，并且立即在冰水再温育3分钟。然后， 向所述细菌中加入lml 2YT，并且在以150rpm的摇动下将培养物在37 °C 生长1小时，以表达抗生素抗性基因。将细菌以两倍稀释接种到含有 100jag/ml卡那霉素和20吗/ml四环素的2YT平板上，并且在37°C生长过 夜。
鉴定A維遊将已经在Kan/Tet平板上生长的转化菌落进行菌落PCR。将每个 菌落与7nl准备好的混合物、lpl(10pmol)的每种引物(插入片段引物作为 正向引物，并且与f88-4载体的pVIII互补的引物作为反向引物)和5^1无 菌ddH20混合，然后进行PCR反应如下95。C6分钟，然后29个下述 循环在94°C 30秒，在55°C 30秒，和在72°C 1分钟。通过在72°C继 续5分钟而进行最后的链延伸。然后，将PCR产物上样到2。/。琼脂糖凝胶 上，以检测35bp条带，该条带指示RGD插入片段的确连接到所述载体中。 然后，使用在PCR中所用的反向引物对阳性菌落测序。
麟粒产将用包含PEP插入片段的fB8-4载体以及野生型克隆(其为 "裸"f88-4载体)转染的K91Kan大肠杆菌，在37。C， 250rpm在包含100吗/ml卡那霉素和20(ig/ml四环素的2ml 2YT培养基上生长过夜。将 lml过夜生长起始物加入到包含100)ig/ml卡那霉素、20pg/ml四环素和 lmM IPTG的1升2YT培养基中，并且在37°C， 250rpm温育过夜。第二 天，将接种体在4°C以6500rpm离心20分钟，以除去细菌。收集上清， 并且用PEG/NaCl以5:1 (v/v)的比例在4°C温育过夜，以能够沉淀噬菌体。 然后，将噬菌体在4°C以9000 rpm离心1小时进行沉淀。在倒掉上清后， 将沉淀物重悬在20ml无菌PBS中，并且通过在4。C用PEG/NaCl 1:5比例 过夜温育再沉淀一次。通过在4°C以9000 rpm离心1小时沉淀噬菌体粒 子，重悬在l ml无菌PBS中，并且然后用0.45(i滤器尖端过滤，以去除 任何痕量的细菌。按照通过分光光度计测量的在269nm和作为参照的320 nm的吸收，按照下式确定回收的噬菌体粒子浓度
n幼M, ' [O.D.(269nm)-O.D.(32。nm)].6.1016
噬菌体/ml =-井乂士+ i & 、-
载体大小(bp)
,微微翻層都環)澄微蘑粒产将ELISA 96孔微量平板每孔用稀释在总体积5(^1的包被缓 冲液中的数种浓度的噬菌体RGD或噬菌体WT包被。在37°C温育2小 时后，将所述平板用PBST洗涤两次，并用PBS洗涤两次。然后，将所述 平板用在PBS中的3%牛奶(200^1每孔)在37°C封闭3小时，然后洗涤， 如上述。将l: 1000稀释在1%牛奶中的5(^1兔抗M13多克隆抗体洗涤， 并且在37。C温育1.5小时，然后洗涤，如所述。加入山羊抗兔HRP缀合 的抗体(5(Hi1)，并且在37。C温育1小时，然后洗涤，如所述。对每个孔用 50|il底物O-苯二胺(OPD) (15mg OPD在7.5ml柠檬酸缓冲液中，并且加 入3pl的30%H2O2)对所述平板显色。用25^1的4NHCL终止反应。使 用ELISA读数仪，通过用405nm参照在492 nm处的吸收而监测颜色密度。
, 乙、五迪定着藩膽歸疆,动力,为了确定噬菌体内在化的准确时间并且为了定量在一些短时 间点的内在化噬菌体的量，与所述相似，将所述噬菌体与CHO细胞温育， 不同的是，在该测定中，所述时间点是15和30分钟、1、 2、 5和22小时。裂解细胞，并且测定蛋白浓度。将96孔微量滴定平板用小鼠抗M13单克
隆抗体包被，所述抗体以1:250稀释在包被缓冲液中，每孔50iLtl，并且在 4。C温育过夜。次日，将所述平板用PBST洗涤两次，然后用PBS洗涤两 次，并且在总体积50卩的在PBS中的1%牛奶中标准化相等的蛋白浓度后， 一式三份加入。使用在该方法中以在总体积5(^1的在PBS中的1%牛奶中 几次连续稀释施用到细胞中的相同的噬菌体RGD生产制作噬菌体校准曲 线。样品在37。C温育2小时，然后用PBST洗涤两次，然后用PBS洗涤 两次。将所述平板用100^1/孔在PBS中的3%牛奶在4°C温育过夜。次日， 在用PBS洗涤一次后，加入1:1500稀释在1。/。牛奶中的兔抗-M13多克隆 抗体，50fal/孔，在37。C温育1.5小时。在所述平板用PBST洗涤两次并用 PBS洗涤两次后，加入1:2500稀释在1%牛奶中的山羊抗兔HRP缀合的二 抗，并且在37°C温育1小时。通过用PBST洗涤孔两次并用PBS 洗涤两次而去除未结合的二抗。将所述平板用每孔50|_d底物O-苯二胺 (OPD)(在7.5 ml柠檬酸缓冲液中的15mg OPD，并且加入3)id 30% H202) 显色。反应用25^1 4NHC1终止。使用ELISA读数仪，通过用405nm参照 在492 nm处的吸收而监测颜色密度。
定蘆玄C//(9潘應^游耱朦银臂餘动力学
为了在初始内在化到CHO细胞中后确定噬菌体清除动力学， 进行了清除测定。该测定是基于大部分噬菌体PEP粒子至多在约2小时后 内在化到细胞中的事实。在37。C、 90%相对湿度和5% C02，将5xl()S个 细胞接种在处于CHO生长培养基(含有10%血清)中的10 cm平板上。 在90%汇合时，将细胞用无菌PBS洗涤，并且向所述细胞中加入无血清 生长培养基。在2小时温育后，向细胞施用6xlO"噬菌体RGD或WT或 施用PBS作为对照(未处理的)。噬菌体粒子与所述细胞温育2小时，此 后，细胞用PBS彻底洗涤3次。向细胞中加入无血清培养基，并且在一些 时间间隔后裂解细胞2小时，5小时,48小时和72小时。测定细胞提取物 的蛋白浓度。同样进行关于噬菌体从细胞的清除的定量ELISA。为了证实 噬菌体清除不是细胞死亡的结果，在另一个用噬菌体RGD或WT或用PBS 温育1周的CHO细胞的10cm平板上进行MTT测定。储雌麟沐船D在潘谢定泣戯资微为了内在化的噬菌体在细胞内的特定定位，使用特异性抗体
和由细胞内标记组成的质粒进行细胞的细胞器与噬菌体粒子的共同定位。
CHO细胞从平板底部分离，用锥虫蓝方法计数，并且在具有13mm0玻 璃盖玻片的无菌24孔平板上以5xl(^个细胞/孔在CHO生长培养基(包含 10%血清)(700pl/孔)在37°C， 90%相对湿度和5% C02中培养。在约60% 的汇合，将细胞用1吗处于CMV启动子下的EEA1-GFP (早期内体标记)， Lgp-120 - YPP (溶酶体标记)，GalT - GFP (高尔基标记)或Sec61-GFP (E. R. 标记)的DNA转染。转染用FuGENE 6转染试剂或用TransIT-LTl转染试 剂按照供应商的用法说明进行，并且将所述平板保持在银纸上。24小时后， 彻底洗涤细胞，并且每孔用1011个噬菌体RGD, WT或PBS在无血清培养 基中温育24小时。次日，将细胞用无菌PBS洗涤3次，并且每孔用500W 4M低聚甲醛在40。C固定30分钟，然后用700jil "/。NH4Cl洗涤3次，每 次5分钟。将细胞在RT用20(^1 1%皂苷渗透15分钟(未渗透的细胞用 PBS洗涤)，然后用PBS彻底洗涤3次。用封闭缓冲液在RT进行封闭15 分钟(未渗透的孔用无皂苷的封闭缓冲液洗涤)。向每个孔中加入20(Hil 以1:500稀释在封闭缓冲液中的小鼠抗M13—抗，并且在RT温育1小时。 然后，将细胞用1%皂苷洗涤3次(未渗透的孔用PBS洗涤)，并且加入 以1:500稀释在封闭缓冲液中的山羊抗小鼠cy3缀合的二抗，在RT持续1 小时。然后，将细胞用PBS洗涤4次。向载玻片加入ProLong抗褪色溶液 (封固剂)，并且用盖玻片(含细胞)盖在其上。在40。C2天后，细胞用 共聚焦显微镜观察。
/^玄众游^^蘑银/ GD游潘應^/遂径游免瘦黄f为了揭示与特定的内吞细胞器相关和在一些时间点的细胞内 噬菌体途径，将细胞用包含在CMV启动子下的EEA1-GFP (早期内体标记) 或Lgp-120 - YFP (溶酶体标记)质粒转染。将噬菌体粒子应用到所转染的细 胞，如所述；然而，在该方法中，温育的时间为15分钟，30分钟，1小时, 2小时和5小时。在温育后，将细胞用无菌PBS彻底洗涤，并且将细胞固定、染色并显现，如所述。 结果
丝状噬菌体的抗聚集特性
辦魏 ThT实验表明噬菌体的解聚活性比其防止细胞外原纤维形成 的能力更有效。当在丝状噬菌体的存在下温育肽A(3时，观察到AI3P聚集 中的26%的减少，而向预先聚集的A(3中加入噬菌体导致淀粉状蛋白原纤 维中的45%减少。
银被邀噬菌体的解聚特性通过将噬菌体脑内注射到过量表达人淀粉 状蛋白前体蛋白的转基因小鼠中而在体内显现。丝状噬菌体结合转基因小 鼠的A|3斑的能力由AD模型脑切片的免疫组织化学染色证明。由M13, fl, 和fd组成的丝状噬菌体家族(Ff)在结构和遗传上都是充分研究的。己经设 计原核感染、装配和复制，所述噬菌体缺少针对哺乳动物细胞的向性。它 们的丝状结构(900 nm长，7 nm直径)使它们能够渗透到CNS中。Ff病毒体 由包装在由主要外壳蛋白pVIII组成并且在末端由4或5个拷贝的四种小 外壳蛋白中的每一种封闭的管中的单链DNA基因组组成。本发明人的实 验室已经发现丝状噬菌体的线性结构赋予针对A卩P的抗聚集特性。修饰所 述噬菌体的线性结构并且使其成为球形消除了它的解聚能力。丝状噬菌体 妨碍A(3P聚集过程，并且溶解己存在的AP原纤维，这表明这些发现对 AD治疗以及其它淀粉样变疾病的治疗相关性。
噬菌体-RGD内在化噬菌体-RGD早在施用后15分钟就内在化到CH0细胞内(图 1B，菱形)。在与细胞温育2小时内检测到高水平的噬菌体RGD，并且直 到22小时的时延即所检验的最后一个时间点一直持续内在化(图1A，菱 形)。相反，噬菌体WT仅在22小时的长时间温育后表现出中等的内在化 (图1A，正方形)，并且直到该时间点才给出与未处理的细胞在所有时间点所测量的相同的测量。即使如此，其在该时间的内在化等于仅在15分
钟之内的RGD内在化。在校准曲线(图1C)评估后，O.D.492 = 0.5近似 于2)^109个噬菌体粒子。可以假设与细胞温育15分钟后内在化的噬菌体 RGD的量是2xl09。误差条表示从3次独立实验每次实验重复3次计算的 标准偏差值。观察到噬菌体RGD与用融合到GFP上的早期内体标记 EEA1-GFP或用溶酶体标记Lgpl20-YFP转染的细胞的显著共同定位。然 而，当检验其它细胞细胞器时，ER蛋白sec61-GFP和高尔基蛋白 GalT-GFP，没有检测到噬菌体的共同定位。这些结果表明噬菌体RGD确 实通过内在化的胞吞途径机制内在化。
在AD转基因(Tg)小鼠模型中实验 Tg小鼠，在血小板衍生生长因子-P (PDGF-(3)启动子的调控控
制下表达野生型人a-突触核蛋白。选择该启动子是因为在神经变性疾病的 转基因模型中它己经成功地用于将其它人蛋白的表达靶向神经元(Masliah 等，2000)。人PDGF-(3链基因的5'-侧连区域的1480-碱基对(bp)片段分离 自psisCAT质粒(由哈佛医学院T. Collins馈赠)，并且置于Not I-Sal I片段 上游，所述Not I-Sal I片段从5'到3'由SV40剪接体,423 bp的编码全长野 生型a-突触核蛋白的人cDNA,和来自pCEP4载体(Invitrogen)提供多腺 苷酸化信号的SV40序列组成。得到的融合基因不含载体序列，纯化，并 且按照标准方法显微注射到单细胞胚胎(C57BL/6 x DBA/2 F2)中。通过尾 DNA的狭线-印迹分析鉴定13个转基因建立者，并且与野生型C57BL/6x DBA/2 Fl小鼠杂交，以建立转基因品系。通过尾DNA的聚合酶链式反应 (PCR)分析鉴定转基因后代。提取基因组DNA，并且在30个循环(93。C 30 s, 57。C30s,72。C 1.5min)中扩增，最后在72。C延伸5分钟。引物如下 5'-CCAGCGGCCGCTCTAGAACTAGTG (有义；SEQ IDNO:4)
和 5'-CCAGTCGACCGGTCATGGCTGCGCC (反义；SEQ ID NO:5)雷维小体的染色针对人a-突触核蛋白的抗体还识别在雷维小体疾病中发现 的特征性胞质内内含体。人(x-突触核蛋白免疫反应性内含体在最高表达者 品系的转基因小鼠中是最丰富的，并且在非转基因对照中检测不到。在转 基因小鼠中，所述内含体最经常在新皮质的较深层、海马的CA3区域、 和在嗅球中的神经元中观察到，并且在黑质中偶然观察到。在患有雷维小 体疾病的患者中，这些区域也典型地受到影响(Masliah等，2000)。
讨论丝状噬菌体M13具有许多应用优点。它是无毒的，充分确定 的表达肽或蛋白的系统，稳定在其外壳上表达的蛋白或肽，由简单的大规 模生产组成，并且对哺乳动物细胞没有向性。在本发明人实验室中还己经 表明丝状噬菌体能够进行脑渗透。在本实施例的实验中使用基于丝状噬菌体M13内在化到哺乳 动物细胞内的递送系统。EFGACRGDCLGA序列(SEQIDNO:2)，由包含 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D核心)的共有核心组成，R-G-D是结合 av整联蛋白家族所必需的最少的氨基酸序列(Ivanenkov等，1999a和 199%)。所述RGD核展示在通过两个半胱氨酸成环的噬菌体外壳蛋白上， 由此促进RGD核心肽的环化呈递。与非环化肽相比，环化肽的产生导致 更高的亲和力，并且允许靶向特异性。此外，环化肽呈递赋予更高的体内 稳定性(Stefanidakis和Koivunen， 2004)。因此，允许在噬菌体表面上 150个拷贝的多价肽呈递，这样 的呈递产生活性细胞输入受体介导的胞吞作用(RME)系统，该系统由与a-
整联蛋白受体的结合调控。使用免疫荧光标记，与WT噬菌体相比较，观察到噬菌体RGD 结合和向哺乳动物CHO细胞内的内在化。选择CHO细胞作为用哺乳动物 细胞表征噬菌体的细胞模型。这些细胞是常用的和充分确定的细胞模型， 并且具有成为黏附性的优点。与非黏附模型相反，整联蛋白在该细胞表面 上大量出现，允许它们与细胞内a-肌动蛋白相互作用，以进行结合和内在化。证明了施用至细胞的噬菌体RGD的剂量-依赖性内在化，以致当向细 胞施用更高量的噬菌体时，观察到更高的内在化。 —些细胞内靶向系统对细胞是有细胞毒性的，尤其是当以高 剂量施用时(Mountain， 2000; Lee和Jameson, 2005)。因此，通过两种不同 的比色实验检验了噬菌体施用对CHO细胞的影响。在向细胞施用噬菌体 RGD或WT后，通过锥虫蓝计数检查到细胞死亡，并且通过MTT测定评 估细胞存活性。进行该测定以确保噬菌体在细胞内的存在在温育2天后没 有任何不利的影响。在这两种实验中，施用噬菌体RGD或噬菌体WT的 细胞表现出与未处理的细胞相似的存活性，并且可以看出这两种相互的测 定给出相似的结果。为了揭示噬菌体RGD在细胞内的命运，发现其特异性定位并 且说明其在细胞内的途径，将细胞内噬菌体和细胞细胞器均进行双标记。 在温育的不同时刻，可以揭示按照胞吞途径的噬菌体RGD细胞内途径 在最初15分钟所述噬菌体定位在早期内体。在温育2小时后，更多的噬 菌体粒子定位在内体，并且在2-5小时内，大部分噬菌体粒子定位在溶酶 体，其表明内在化的胞吞途径。为了推论，本发明人在这里已经建立了一种用于细胞内靶向 哺乳动物细胞的系统。构建了由RGD核心肽组成的内在化的噬菌体，所 述RGD核心肽能够以高活性和亲和性进行细胞内内在化。该系统特征在 于在细胞内的内在化和清除动力学二者，因此所述噬菌体在施用后15分 钟内进行内在化，并且在细胞内发现的噬菌体的量随时间增加。在约一天 后，噬菌体粒子从细胞清除。还发现当应用在培养基中或一旦进入细胞内 时，所述内在化系统对细胞无毒性作用。通过整联蛋白介导的胞吞作用的 内体途径，并且在15分钟后，所述噬菌体定位在早期内体，然后在接下 来的2小时内重新定位在溶酶体，表明存在噬菌体细胞内途径。
实施例2 肌萎縮性侧索硬化病(ALS)实验
材料和方法使用肌蒌縮性侧索硬化病(ALS) B6SJL-Tg(SODl-G93A)lGur-J小鼠，其携带高拷贝数的突变形式的S0D1蛋白，所 述突变形式的SODl蛋白加速蛋白聚集、疾病发作和死亡。这些小鼠的平 均寿命估计为130-135天，疾病发作定义为在80-90天30%的运动性能丢 失(Umshitani等.2007)。将8只小鼠分成两组。4只小鼠使用微量移液器鼻内施用l(Vl 活的RGD-噬菌体，并且4只小鼠以相同方式用12 pl UV-灭活的RGD-噬 菌体处理。在每次施用中给与每只小鼠的噬菌体数目为2.5x1012。小鼠从 50日龄起处理2次/周，持续40天的期间(估计运动下降发作)，从第90天 起处理3次/周，直到将它们处死。34只未处理的小鼠用作对照评估存活 时间。 —周一次，使用转棒取样器鼓(Rotorod drum)(SDI,加利福尼 亚)检测小鼠的运动强度。监测在转棒取样器上的表现时间。设定达到 25RPM的加速模式(4级)。直到小鼠不同到达食物和水和/或当以它们侧 面放置后它们不能立即翻身以它们的腹部支撑时，评估存活率。将小鼠用 C02处死，并且取出它们的脑和脊骨，固定在PFA 4%中用于进一步的分 析和组织学。 _按照Ddmastro等.(1997)进行噬菌体的UV灭活。噬菌体溶 液以一些25 pl的液滴整分，每个液滴置于24孔平板的孔中。小滴用U. V. Stratalinker以200,000 (jj照射3个周期(周期之间暂停1分钟)。进行ThT结合测定，以与活噬菌体溶解这些聚集体的能力比 较评估UV-灭活的噬菌体溶解淀粉状蛋白聚集体的能力(体外)。淀粉状蛋 白-P原纤维形成通过硫黄素-T (ThT)结合测定定量，其对鉴定淀粉状蛋白 原纤维是特异性的。ThT迅速与聚集的原纤维缔合，产生在435-450 nm的 新激发(吸收)最大值，和在485 nm的增强的发射，这与游离的染料的 385 nm (激发)和445 nm发射相反。这种改变取决于聚集的状态，因为单 体或二体肽不反应，并且聚集体的胍解离破坏该信号(LeVineH. 1993)。使 用Perkin-Elmer模式LS-50分光荧光计测量样品发射，并且由任意单位表 示。
由于这种检测是比较性的(淀粉状蛋白-(3的聚集与所述肽和 噬菌体的聚集相比较)，绝对值不如相对聚集百分数那样重要。
聚集百分数以下述方式计算
%聚集=发射482 nm (用噬菌体温育的淀粉状蛋白B) X 100 发射482 nm (单独温育的淀粉状蛋白卩)
将淀粉状蛋白卩-聚集视作100%。总是测量噬菌体和缓冲溶液 的背景数值，并且那些值从所有结果得分中省略不计。在所有进行的检测 中，噬菌体溶液的数值几乎与缓冲液的数值相同；因此，结论是噬菌体不 形成ThT-阳性(3-折叠结构。将APP1-40在37°C温育20天以促进聚集。加入噬菌体或 PBS，并且与预先聚集的AP再温育72小时。按上述测量荧光。
结果与对照未处理组相比较，在UV-灭活的RGD-噬菌体和活 RGD-噬菌体的两个组中均观察到疾病发作延迟、以及存活率提高。在任 一组内没有可观察到的副作用。
运动表观尽管处理的和未处理的组均在相同年龄达到相同的运动损伤 终点，图4所示的转棒取样器结果表明处理的小鼠比未处理的小鼠在更长 的时间具有更好的运动表现，由此证明疾病发作的延迟。
存话率与未处理的组相比，在两个处理组中均观察到更长的寿命(图5)。
鄉学微
组织学结果(图6A-6E)表明噬菌体渗透到神经元和星形胶质 细胞。
"n微,銜城斷赠沟为了确保噬菌体失去它们的感染能力而没有进行由UV-灭活 导致的结构修饰，进行了一些实验
-通过照射失去噬菌体细菌感染性
-能够显现噬菌体的丝状结构的电镜照片
-淀粉状蛋白-P肽的体外解聚测定
通过照射失去噬菌体细菌感染性将携带四环素抗性基因的M13丝状噬菌体涂布在加入四环素 的2YT培养皿上。将平板接种TG1细菌。在所述噬菌体不感染它们并且 不赋予所述细菌四环素抗性基因的条件下，TG1培养物不能在这些平板上 生长。在图7中，当将PBS置于接种的TG1细菌上时，对照培养皿 没有显现出任何细菌生长。当将M13噬菌体接种TG1培养物上时，由于 感染的噬菌体赋予的四环素抗性，细菌能够生长。不同浓度的噬菌体(由 在培养皿上的数目表示)与能够生长的TG1培养物的数目和密度相关。当 通过UV照射时，噬菌体失去它们感染TG1细菌的能力，由此防止细菌生 长。发现对于噬菌体灭活， 一个周期的UV照射是足够的。
t/K-顺游麟鄉嵐颇拍摄UV-灭活的RGD-噬菌体的电镜图片(图9A和9B)，以确 保照射处理没有损坏噬菌体的丝状结构。
^藏贵,:r祭^^/定分桥"F-灭活游朦朦,与淀粉犹歪A覆桌银游互,本实验用展示RGD肽的UV灭活的噬菌体进行，以证明UV 灭活的噬菌体不但保持它们的结构，而且保留它们的功能和解聚淀粉状蛋白聚集体的能力。在本发明人的实验室中进行的先前的体外实验己经证实 活的噬菌体具有解聚A|3聚集体的能力。解聚检测-将58pM A(3p l-40温育20天。加入丝状噬菌体 并且共温育72小时。使用ThT检测淀粉状蛋白含量。当向预先聚集的A卩中加入RGD-噬菌体时，观察到A(3P聚 集的45%减少。使用未进行UV-照射的RGD-噬菌体观察到相同的结果。本实验证明UV-照射不损坏RGD-噬菌体解聚淀粉状蛋白聚 集体的能力。此外，本实验表明在所述噬菌体上展示以允许它们内在化到 神经元中的RGD肽不损坏所述噬菌体的解聚能力(与细胞内聚集体相关， 如在帕金森、亨廷顿和ALS中发现的那些)。
结论上述证据表明丝状噬菌体具有溶解和解聚已经形成的细胞内 淀粉状蛋白斑的能力。在ALS病的突变体-SODl-Tg小鼠模型中的实验表 明，在这些小鼠细胞的细胞质内形成的S0D1聚集体可以溶解并且导致小 鼠死亡的改善。这些小鼠的噬菌体处理不但提高它们的寿命预期，而且相 对于对照小鼠，将它们的运动能力和身体强度延长到更高水平。在噬菌体上的UV-灭活实验是开发用于人类的安全产品的另 一个步骤。UV-灭活的噬菌体保持它们的丝状结构不被损坏，并且因此保 留它们溶解淀粉状蛋白斑的解聚能力。现在已经充分描述了本发明，本领域的技术人员应该理解， 在不背离本发明的精神和范围的条件下，无需不必要的实验，本发明可以 在宽范围的等价参数、浓度和条件下进行。尽管己经结合其具体的实施方案对本发明进行了描述，但是 应该理解，它能够进一步改进。本申请意欲覆盖本发明的任何变化、用途 或应用，其通常遵循本发明的原理，并且包括与本公开内容的这样的背离， 所述背离在本发明相关领域内的已知或惯用实践内，并且可以应用到在上 文以及后附权利要求范围内描述的基本特征。本发明引用的所有参考文献，包括杂志论文或摘要，公布的 或相对应的美国或外国专利申请，授权的美国或外国专利，或任何其它参考文献，通过引用完全结合于此，包括所引用的参考文献中描述的所有数 据、表格、附图和正文。另外，在所述参考文献中所引用的参考文献的完 整内容也通过引用完全结合。对已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的 参考不以任何方式承认本发明的任何方面、描述或实施方案在相关技术领 域内被公开、教导或暗示。具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性
质，以致在不背离本发明的总观念的条件下，其他人通过利用本领域技术 内的知识(包括其中引用的参考文献的内容)可以容易地改进和/或修改所 述具体实施方案的各种应用，无需不必要的实验。因此，基于本发明描述 的教导和指导，这样的修改和改进意欲在所公开的实施方案的等价物的含 义和范围之内。应该理解，本发明的措词或术语是为了描述的目的而不是 限制，以致熟练的技术人员基于本发明所述的教导和指导，联系本领域普 通技术人员的知识，应该理解本说明书的术语或措词。参考文献
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权利要求
1.抑制或治疗与蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成相关的疾病的方法，所述方法包括向需要其的哺乳动物受试者施用有效量的治疗剂，所述治疗剂携带被展示的包含哺乳动物细胞黏附序列的肽序列，以能够将所述治疗剂内在化在细胞内，从而抑制或治疗所述疾病。
2. 权利要求1的方法，其中所述治疗剂是在其表面上展示包括所述哺乳动物细胞黏附序列的所述肽序列的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体不 展示除了所述肽序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗原。
3. 权利要求2的方法，其中所述丝状噬菌体选自由M13、 fl、禾口 fd 噬菌体、以及它们的混合物组成的组。
4. 权利要求2的方法，其中所述丝状噬菌体是M13。
5. 权利要求2的方法，其中约150个拷贝的所述肽序列被展示在所述 丝状噬菌体的表面上。
6. 权利要求2的方法，其中所述丝状噬菌体是保留其丝状结构的UV-灭活的丝状噬菌体。
7. 权利要求2的方法，其中有效量的所述丝状噬菌体是鼻内施用的。
8. 权利要求2的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
9. 权利要求l的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
10. 权利要求9的方法，其中包括所述RGD细胞黏附序列的所述肽序 列是环形的。
11. 权利要求10的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID N0:1 的所述RGD细胞黏附序列。
12. 权利要求10的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO: 2 的所述RGD细胞黏附序列。
13. 权利要求1的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默病。
14. 权利要求1的方法，其中所述疾病是具有雷维小体的痴呆症。
15. 权利要求l的方法，其中所述疾病是帕金森病。
16. 权利要求1的方法，其中所述疾病是肌萎縮性侧索硬化病。
17. 权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。
18. 抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成的方法，所述方法 包括使治疗剂与能够形成蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内肽或多肽 接触，以抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成，所述治疗剂携带 被展示的包括哺乳动物细胞黏附序列的肽序列，以能够将所述治疗剂内在 化在哺乳动物细胞内。
19. 权利要求18的方法，其中所述治疗剂是在其表面上展示包括所述哺乳动物细胞黏附序列的所述肽序列的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体 不展示除了所述肽序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗原。
20. 权利要求19的方法，其中所述丝状噬菌体选自由M13、 fl、和fd 噬菌体、以及它们的混合物组成的组。
21. 权利要求19的方法，其中所述丝状噬菌体是M13。
22. 权利要求19的方法，其中约150个拷贝的所述非丝状噬菌体肽序 列被展示在所述丝状噬菌体的表面上。
23. 权利要求19的方法，其中所述丝状噬菌体是保留其丝状结构的 UV-灭活的丝状噬菌体。
24. 权利要求18的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
25. 权利要求18的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
26. 权利要求25的方法，其中包括所述RGD细胞黏附序列的所述肽 序列是环形的。
27. 权利要求63的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:l 的所述RGD细胞黏附序列。
28. 权利要求26的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO: 2 的所述RGD细胞黏附序列。
29. 解聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体的方法，所述 方法包括使治疗剂与预先形成的细胞内纤维状内含体或聚集体接触，以解 聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体，所述治疗剂携带被展示的包括哺乳动物细胞黏附序列的肽序列，以能够将所述治疗剂内在化在细 胞内。
30. 权利要求29的方法，其中所述治疗剂是在其表面上展示包括所述 哺乳动物细胞黏附序列的所述肽序列的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体 不展示除了所述肽序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗原。
31. 权利要求30的方法，其中所述丝状噬菌体选自由M13、 fl、和fd 噬菌体、以及它们的混合物组成的组。
32. 权利要求30的方法，其中所述丝状噬菌体是M13。
33. 权利要求30的方法，其中约150个拷贝的所述非丝状噬菌体肽序 列被展示在所述丝状噬菌体的表面上。
34. 权利要求30的方法，其中所述丝状噬菌体是保留其丝状结构及其 解聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体的能力的UV-灭活的丝 状噬菌体。
35. 权利要求30的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
36. 权利要求29的方法，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
37. 权利要求36的方法，其中包括所述RGD细胞黏附序列的所述肽 序列是环形的。
38. 权利要求37的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:l 的所述RGD细胞黏附序列。
39. 权利要求37的方法，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:2 的所述RGD细胞黏附序列。
40. —种药物组合物，其包括药用载体或赋形剂和作为活性成分的有 效量的治疗剂，所述治疗剂携带被展示的包括哺乳动物细胞黏附序列的肽 序列，以能够将所述治疗剂内在化在细胞内。
41. 权利要求40的药物组合物，其中所述治疗剂是在其表面上展示包 括所述哺乳动物细胞黏附序列的所述肽序列的丝状噬菌体，其中所述丝状 噬菌体不展示除了所述肽序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗原。
42. 权利要求41的药物组合物，其中所述丝状噬菌体选自由M13、fl、fd、以及它们的混合物组成的组。
43. 权利要求41的药物组合物，其中所述丝状噬菌体是M13。
44. 权利要求41的药物组合物，其中约150个拷贝的所述非丝状噬菌 体肽序列被展示在所述丝状噬菌体的表面上。
45. 权利要求41的药物组合物，其中所述丝状噬菌体是保留其丝状结 构的UV-灭活的丝状噬菌体。
46. 权利要求41的药物组合物，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
47. 权利要求40的药物组合物，其中所述哺乳动物细胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
48. 权利要求47的药物组合物，其中包括所述RGD细胞黏附序列的 所述肽序列是环形的。
49. 权利要求48的药物组合物，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:l的所述RGD细胞黏附序列。
50. 权利要求48的药物组合物，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO: 2的所述RGD细胞黏附序列。
51. 治疗剂用于制备药物的应用，所述治疗剂携带被展示的包括哺乳 动物细胞黏附序列的肽序列，以能够将所述治疗剂内在化在细胞内。
52. 权利要求51的应用，其中所述治疗剂抑制或治疗与蛋白纤维状内 含体或聚集体的细胞内形成相关的疾病。
53. 权利要求52的应用，其中所述疾病是阿尔茨海默病、具有雷维小 体的痴呆症、帕金森病或肌萎縮性侧索硬化病。
54. 权利要求51的应用，其中所述治疗剂抑制蛋白纤维状内含体或聚 集体的形成。
55. 权利要求51的应用，其中所述治疗剂解聚预先形成的细胞内蛋白 纤维状内含体或聚集体。
56. 权利要求51-55中任一项的应用，其中所述治疗剂是在其表面上 展示包括所述哺乳动物细胞黏附序列的所述肽序列的丝状噬菌体，并且其 中所述丝状噬菌体不展示除了所述肽序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗 原。
57. 权利要求51-56中任一项的应用，其中所述哺乳动物细胞黏附序 列是Arg-Gly-Asp (RGD)细胞黏附序列。
58. 权利要求57的应用，其中包括所述RGD细胞黏附序列的所述肽 序列是环形的。
59. 权利要求58的应用，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:l 的所述RGD细胞黏附序列。
60. 权利要求58的应用，其中所述肽序列包括序列为SEQ ID NO:2 的所述RGD细胞黏附序列。
全文摘要
携带包含哺乳动物细胞黏附序列的肽序列的治疗剂可以用来抑制或治疗与细胞内形成蛋白纤维状内含体或聚集体相关的疾病，用来抑制蛋白纤维状内含体或聚集体的细胞内形成，并且用来解聚预先形成的细胞内蛋白纤维状内含体或聚集体。在其表面上展示非丝状噬菌体RGD细胞黏附序列而不是除所述RGD细胞黏附序列之外的抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体是这样的治疗剂的优选实施方案。
文档编号A61K35/76GK101553567SQ200780034953
公开日2009年10月7日 申请日期2007年7月19日 优先权日2006年7月21日
发明者奥代德·格林斯泰因, 诺亚·沙仑, 贝卡·所罗门 申请人:台拉维夫大学拉莫特