减少磷酸盐吸收的方法

专利名称：减少磷酸盐吸收的方法
减少磷酸盐吸收的方法
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本申请要求2006年10月26日提交的美国临时申请序列第60/854,550 号的权益，其通过引用全文并入本文。
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背景技术：
磷是人类营养的必需元素并且在机体的生物化学、细胞完整性和生理 过程中起到必需的结构和功能上的作用。在含有动物或植物物质的食物 中，磷可作为无机磷酸盐(Pi)存在(例如，以其五价形式与氧结合为磷
酸盐(por")，其可以被容易地从肠胃道吸收。磷酸盐还可以作为生物大 分子例如蛋白质、核酸、脂类和糖类的构成部分存在。植物材料还可能富
含植酸(C6H6[OPO(OH)2]6)，其为许多植物组织(例如麸和种子)中磷酸 盐的主要贮存形式(植酸磷酸盐(phytic phosphate)),占植物中磷酸盐的 70%至80%。植酸或其盐(植酸盐) 一般不能被单胃动物所吸收而是随粪 便排出。植酸Z植酸盐可占到成年人每日膳食磷酸盐摄入的约25%。
由于成年人体中磷酸盐的约85%在矿化的细胞外基质例如骨和牙齿 中，磷酸盐是骨矿物质的必需组分。约15%的磷酸盐是细胞内的(例如在 软组织中)而大约0.1%存在于细胞外液(Tenenhouse等人，VitaminD (维 生素D)，第二版，Else窗，2005 )。细胞的磷酸盐也可以构成细胞膜结构 的磷脂的形式存在。磷酸盐还是核酸(例如DNA和RNA)以及核苦酸(例
4如腺芬三磷酸(ATP)和环腺香酸)的必需的结构组分，腺苷三磷酸(ATP)是 重要的能量贮存和传递分子，环腺苷酸是重要的细胞信号分子。细胞内磷
酸盐的其他生理学功能包括下列各项(1)为了活化许多蛋白酶、激素和 细胞信号分子而将它们磷酸化；(2)作为生理緩沖剂维持正常的酸碱平衡； 以及(3)使红细胞中包含含有磷酸盐的分子2,3-二磷酸甘油酸酯 (2,3-diphosphoglycerate, 2,3-DPG )。普通人含有约700至1,000克的磷(Lau K., Phosphate Disorders (磷酸盐病症).Saunders; 1986:398-470 )，并且以 P〇43U式每天食用并排泄约 一 克至约三克的磷。
人类依靠至少三条途径维持磷酸盐的体内平衡(phosphate homeostasis)——胃肠道、肾和骨。胃肠道作为磷酸盐的吸收和排泄/再吸 收的器官参与磷酸盐的体内平衡。骨起到磷酸盐贮库的作用，其可响应不 同生理学信号而被动员。膳食磷酸盐的胃肠吸收是非常高效的，吸收的主 要部位为十二指肠和空肠(Delmez JA等人，Am J Kidney Dis, 1992, 19:303-317 )。取决于饮食是植物来源(主要是不能利用的磷酸盐)还是动 物组织来源(主要是可消化的)，不同量的膳食磷酸盐(摄入量的10°/。至 80% );波排泄在粪便中。食物中的无机磷酸盐以两种方式4皮吸收，经由刷 状缘膜的主动跨细胞途径和经由细胞间紧密连接的被动细胞旁路途径 (paracellular route X Cross等人，Miner Electrolyte Metab 1990, 16:115-124, 和Walton J等人，Clin Sci 1979， 56:407-412 )。 一些基于大鼠研究的才艮道 指出结肠的磷酸盐运输主要是通过细胞旁路扩散途径介导的(Hu等人， Miner Electrolyte Metab， 1997， 23:7-12;和Peters等人，Res Exp Med (Berl)， 1988， 188:139-149 )。其他基于大鼠研究的报道提出跨细胞的主动运输是 跨小肠的磷酸盐吸收中的主要途径(Eto等人，Drug Metab Pharmacokinet, 2006， 21:217-221 )。
肾作为磷酸盐滤过、重吸收和排泄的器官参与磷酸盐的体内平衡。肾 是维持磷酸盐体内平衡的主要的调节器官。在健康的成年个体中，每天肾 的磷酸盐排泄等于每天胃肠磷酸盐吸收的量。然而，在磷酸盐缺乏的状态 下，肾将尿中的磷酸盐排泄减少至几乎为零(Knox F等人，Am.丄Physiol. 1977， 233:F261-F268 )。肾的磷酸盐重吸收主要发生在近端小管。磷酸盐的尿排泄分数可在0.1%至20%之间变化，因此代表了强有力的体内平衡机 制。在严重的肾衰竭情况下(诸如作为慢性肾病的结果)，高磷酸盐血症
(hyperphosphatemia)产生自不充分的肾的磷酸盐清除。
磷酸盐体内平衡的主要调控因子是血清磷酸盐和曱状旁腺素(PTH)。 增加的血清磷酸盐水平增强磷酸盐的尿排泄。PTH减少肾小管磷酸盐重吸 收并且增加可溶性磷酸盐向尿中的排泄。其他影响磷酸盐体内平衡的因子 包括，但不限于，年龄、饮食(即摄入的磷酸盐的量和/或摄入的磷酸盐的 化学形式)、疾病、药剂和昼夜变化。
维生素D尤其是它的活性形式1，25-二羟基维生素D (也称钙三醇) 也能够通过直接刺激磷酸盐的肠吸收而影响磷酸盐的体内平衡。另外，维 生素D通过将钙和磷酸盐动员至血浆中来增强骨的再吸收(Albaaj F & Hutchison A， Drugs 2003， 63:577-596)。
异常的磷酸盐体内平衡的一个实例是高磷酸盐血症，其可通过以下三 种机制中的一种或多种发生。第一种机制是过度的磷酸盐吸收。第二种机 制是磷酸盐排泄减少。第三种机制是将磷酸盐从细胞内间隙转移至细胞外 间隙。严重的高磷酸盐血症可导致瘫痪、惊厥和心脏骤停。高磷酸盐血症 发生在血清磷酸盐浓度高于5 mg/dl的情况下，其与升高的死亡危险相关 (Block G等人，J. Am. Soc. Nephrol. 2004， 15:2208-2218)。正常的生理学血 清磷酸盐浓度通常被认为是约2.4 mg/dl至约4.5 mg/dl之间的血清磷酸盐 浓度(Block G & Pott F, Am.丄Kidney Dis. 2000, 35:1226-1237 )。
肾功能受损的患者可能由于肾的磷酸盐的排泄降低而发展高磷酸盐 血症。在到肾的维管联结(vascular supply)变少或者肾小球受损并停止从血 液过滤磷酸盐时高磷酸盐血症接着发生。因此，高磷酸盐血症是肾病的一 种可预见的结果，并且大多数的肾病患者患有或者将会发展高磷酸盐血 症。这种肾病的例子包括但不限于终末期肾病、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、 多囊肾病、慢性肾病、急性肾小管坏死(例如肾动脉狭窄)、使肾功能衰 退的感染(例如败血症或者肾感染例如急性肾盂肾炎)、肾移植排斥和尿 路梗阻。
与慢性肾病相关的高磷酸盐血症导致了4丐和磷酸盐体内平衡的严重的病理生理学，特别是其如果在以后的时间里一直存在。这种病理生理学 包括但不限于甲状旁腺功能亢进、骨疾病(例如肾性骨营养不良)和关节、 肺、眼和脉管系统的4丐化。患有慢性肾病的患者的高磷酸盐血症与死亡风 险是独立相关的，并且高磷酸盐血症增加死亡风险的确切机制是未知的。 对于表现出肾功能不全的个体，血清磷酸盐在正常范围内的升高已与肾衰 竭进展和增加的心血管事件的风险相关。美国国家肾脏基金会的肾病结果
质量初步调查临床实践指南(The National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Clinical Practice Guidelines )针对骨代谢 和慢性肾病疾病建议，维持血清磷酸盐低于5.5 mg/dl，钙-磷酸盐(CaXP) 产物少于55 mg2/dl2,以及全段甲状旁腺素(iPTH )在150 pg/ml和300 pg/ml 之间。尽管病因还没有被完全证明，高的钙-磷酸盐产物已经被认为是软组 织4丐化和心血管疾病的原因。心血管疾病是所有透析患者的几乎一半死亡 的原因。
许多肾病患者需要服用活性形式的维生素D例如la,25-二羟基维生素 D3来维持钙的体内平衡和/或治疗或预防低血钙和/或继发性曱状旁腺功能 亢进，因为这些患者缺乏活性维生素D。维生素D3首先在肝中代谢为25-羟基维生素D3(也称为钙二醇)，之后在肾中代谢为la,25-二羟基维生素 D3。 la,25-二轻基维生素D3远比25-羟基维生素D3更有活性。功能受损的 肾不能将25-羟基维生素D3转化为la,25-二羟基维生素D3。低的la,25-二 羟基维生素D3水平激发甲状旁腺分泌更多的PTH并且接着发生甲状旁腺 增生和继发性甲状旁腺功能亢进。在患有慢性肾病的个体中继发性甲状旁 腺功能亢进的标准治疗包括活性维生素D或其类似物。同样地，约70%的 患有终末期肾病或衰竭的个体接受某种形式的维生素D。如之前所讨论过 的，维生素D激发磷酸盐的肠吸收。因此，服用维生素D例如la,25-二羟
基维生素D3的肾病患者更易患高磷酸盐血症，并且由于增加的磷酸盐吸收
和伴随的磷酸盐排泄减少相结合，也可使他们现有的高磷酸盐血症恶化。
减少血清磷酸盐水平的治疗上的尝试包括，但不限于，透析、减少膳 食磷酸盐摄入，施用烟酰胺以及口服施用不溶性磷酸盐结合剂。不溶性磷 酸盐结合剂的实例包括，但不限于，铝化合物(例如Amphojel⑧氢氧化铝凝胶)、钙化合物(例如碳酸钙、乙酸盐诸如PhosLo⑧乙酸钙片剂、柠檬 酸盐、藻酸盐和酮酸盐)、阴离子交换聚合物(例如第5,985,938、 5,980,881、 6,180,094、 6,423,754号美国专利和PCT公开WO 95/05184中描述的胺官 能聚合物、氯化物形式的Dowex⑧阴离子交换树脂、RenaGel⑧以及结合盐 酸胍的聚合物)、无机化合物例如四水合碳酸镧(FosrenalTM)、柠檬酸和乙 酸的铁盐和基于镧的多孔陶瓷材料(RenaZorb )。
发明概述
一方面，本发明涉及一种用于在人类或非人类动物受治疗者中减少磷 酸盐吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并且患 有高磷酸盐血症或处于发展高磷酸盐血症的风险。所述方法包括以有效减 少或维持受治疗者中血清磷酸盐浓度的量对所述受治疗者口服施用抗植 酸(C6H6[OPO(OH)2]6)抗体或抗植酸盐抗体的步骤。所述方法可进一步包 括观察血清磷酸盐浓度减少或稳定的步骤。例如，可测量并比较抗体处理 之前和之后的血清磷酸盐浓度。
此处公开的所述方法可被用于减弱或预防高磷酸盐血症。在某些实施 方案中，血清磷酸盐浓度被减小至或维持在下述水平或者低于下述水平 在可接受的正常范围内的最大生理学血清磷酸盐浓度的约150%、 125°/。、 120%、 115%、 110%或105%。在某些实施方案中，血清磷酸盐浓度被减 少至或维持在正常范围内的水平。对于人类受治疗者来说，最大的高-正常 血清磷酸盐浓度是5.0 mg/dl。在一个优选的实施方案中，人类受治疗者中 的血清磷酸盐浓度,皮减少至或维持在5.5 mg/dl或更低或者5.0 mg/dl或更 低。
在某些实施方案中，所述受治疗者(例如人类受治疗者)患有肾病、 接受维生素D化合物(例如la,25-二羟基维生素D3)，或二者，其中维生 素D化合物使饮食中的植酸磷酸盐可被吸收。在某些实施方案中，所述受 治疗者是服用维生素D化合物(例如la, 25-二羟基维生素D.0并且具有 高于5.0 mg/dl或5.5 mg/dl的血清磷酸盐水平的人类肾病患者。肾病的实 例包括终末期肾病、急性肾衰竭、多囊肾病、慢性肾病、急性肾小管坏死、
8使肾功能衰退的感染(例如败血症或者肾感染例如急性肾盂肾炎)、肾移 植排斥或尿路梗阻。
在某些实施方案中，用于所述方法的抗体是IgY抗体。在某些实施方 案中，所述抗体来源于卵(例如卵黄)并且特别地来源于禽类的卵例如鸡 卵。
在某些实施方案中，将所述抗植酸抗体或抗植酸盐抗体与磷酸盐结合 剂同时施用。在某些实施方案中，将所述抗植酸抗体或抗植酸盐抗体与食 物一起施用或接近含有膳食植酸磷酸盐的食物的食用时间(即在之前或之 后约一小时内)施用。
附图
简述
不适用。
发明详述
本发明部分地基于发明者的下述观察抗植酸抗体可通过减少被吸收 至动物血池中的植酸磷的量使血液磷酸盐水平降低。具体地说，在其中当 用含有植酸磷酸盐但缺乏易吸收的无机磷酸盐的饮食喂养时动物具有降 低的血液磷酸盐水平、并且用维生素D补充饮食提高了降低的血液磷酸盐 水平的动物模型中，发明者观察到对所述动物施用抗植酸抗体减少了由维 生素D导致的血液磷酸盐水平升高。本发明提供了用于在人类和非人类动 物受治疗者例如肾病患者中减少磷酸盐吸收的新的手段(tool),所述受治 疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并为了维持钙的体内平衡或其他目的 而需要服用维生素D化合物(例如la, 25-二羟基维生素D3 )，其中维生素 D化合物使饮食中的植酸磷酸盐可被吸收。尽管现有技术有口服施用的抗 体可被胃肠细菌降解并且还可在胃的酸性环境下失活的证据，但是此处发 明者已展示口服施用的抗植酸抗体在减少由维生素D增加的血液磷酸盐水 平上是有效的。
除非另外定义，否则此处所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属的领域中普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可将与此处 描述的方法和材料相似或同等的任何方法和材料用于本发明的实践或试 验，但现在描述优选的方法和材料。
在描述实施方案和要求保护本发明中，依照以下阐明的定义使用以下 术语。
如此处所用，"抗体"包括与特定抗原免疫反应性的免疫球蛋白分子， 并包括多克隆和单克隆抗体。所述术语还包括遗传改造的形式例如嵌合抗
体(诸如人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(heteroconjugate antibody)(诸如 双特异性抗体)。所述术语还包括二价分子或双特异性分子、双抗体 (diabody)、三链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)。 二价分子和双特异性 分子被描述于例如Kostelny等人，J Immunol 1992, 148:1547; Pack和 Pluckthun， Biochemistry 1992， 31: 1579; Zhu等人，Protein Sci 1997, 6:781; Hu等人，Cancer Res. 1996， 56: 3055; Adams等人，Cancer Res. 1993， 53:4026;和McCartney等人，Protein Eng. 1995, 8:301。术语"抗体，'还 包括抗体的抗原结合形式例如具有抗原结合能力的片段(例如Fab'、F(ab')2、 Fab、 Fv和rlgG )。所述术语还指重组单链Fv片段(scFv )。此外，术语"抗 体"包括具有与抗体共价连接以使所述抗体更稳定的稳定基团的抗体。本 发明中可使用具有1(r"M或更小的亲和力Kd的抗体。优选地，使用具有 ^10—5 M或^1(T6 M的亲和力Kd的抗体。更优选地，使用具有S10—7 M、 SlO—8 M或^10—9 M的亲和力Kd的抗体。
如此处所用，术语"高磷酸盐血症"被广义地用于描述受治疗者中的 病况，其中血清磷酸盐以高于医学上可接受的正常范围的浓度存在。
如此处所用，术语"减弱"或"预防"意为获得治疗性益处或预防性 益处。对于治疗性益处，我们意指改善或根除被治疗的潜在病症。例如， 在患有高磷酸盐血症的受治疗者中，治疗性益处包括潜在高磷酸盐血症的 改善或根除。治疗性益处还包括与潜在病症相关的一种或多种病理生理学 症状的改善或根除，以致在所述受治疗者中观察到改善，尽管所述受治疗 者可能仍旧被所述潜在病症折磨。例如，在患有肾功能不全和/或高磷酸盐 血症的患者中，治疗性益处不仅是指所述患者的血清磷酸盐水平的降低还指在所述患者中其他病症(例如异位钙化和肾性骨营养不良)方面的改善， 所述其他病症伴随肾衰竭和/或高磷酸盐血症。对于预防性益处，依据本发 明的抗体被施用于处于发展高磷酸盐血症风险的患者或被施用于即使未 作出高磷酸盐血症的诊断但报告了一种或多种高磚酸盐血症的病理生理 学症状的患者。例如，依据本发明的抗体可被施用于患有慢性肾病但没有 被诊断为高磷酸盐血症的患者。预防性益处包括高磷酸盐血症的预防或延 緩。
如此处所用，抗体的有效量是使患有高磷酸盐血症的受治疗者中的血 清磷酸盐降低，预防患有高磷酸盐血症或处于患有高磷酸盐血症风险的受 治疗者的血清磷酸盐升高，或者减少源自食物的磷酸盐的吸收(其可例如 通过增加的粪便磷酸盐或通过降低或稳定的血清磷酸盐水平来测量)的量。
如此处所用，"肾病"是指影响肾功能的任何疾病或病症，包括那些 导致差的磷酸盐滤过的肾疾病，并且包括影响肾供血的疾病以及肾的功能 和结构上的缺陷。肾病的实例包括，但不限于，终末期肾病、急性肾衰竭、 慢性肾衰竭、多嚢肾病、慢性肾病(例如，如按美国国家肾脏基金会的肾
病结果质量初步调查临床实践指南所分类的T、 II、 III、 IV或V期慢性肾 病，其表现为肾功能不全和处于晚期肾衰竭)、急性肾小管坏死(例如肾 动脉狭窄)、使肾功能衰退的感染(例如败血症或者肾感染例如急性肾盂 肾炎)、肾移植排斥和尿路梗阻。
如此处所用的，术语"维生素D"广义地指命名为維生素D2、维生素 D3、维生素D4等的有机化合物，并指它们影响钙和磷酸盐体内平衡的代 谢物和激素形式。维生素D化合物的实例包括，但不限于，维生素D2(麦 角钙化醇)、25-羟基维生素D2、 1a, 25-二羟基维生素D2、维生素D3 (胆 钙化醇)、25-轻基维生素D3、 la，25-二羟基维生素D3、任何上述化合物的 类似物或可充分占用细胞内维生素D受体的类似物、以及描述于Bouillon 等人，Endocrine Reviews (内分泌综述)1995, 16: 200-257中的那些化合物， 其通过引用全文并入本文。维生素D化合物还包括那些目前可商业获得或 处于临床试验的化合物，包括但不限于，19-去甲-la, 25-二羟基维生素D2(帕立骨化醇，Paricalcitol ) 、 la-羟基维生素D2 (多西骨化醇， Doxercalciferol )、 la-羟基维生素D3 (阿法骨化醇，Alfacalcidol )、来自Leo Pharmaceutical的研究药物包括EB 1089 (西奥骨化醇，Seocaldtol)、 KH 1060 (20-表-22-氧杂-24a,26a,27a-三同型-la,25- 二羟基 -D3(20-epi-22-oxa-24a,26a,27a-trihomo-la,25-dihydroxy-D3))、 MC 1288和 MC 903 (4丐泊三醇，Calcipotriol)、罗氏制药(Roche Pharmaceutical)药物 包括1,25-二羟基-16-烯-D3、 1,25-二羟基-16-烯-23-炔-D3和25-二羟基-16-烯-23-炔-D3、 Chugai Pharmaceuticals的22-氧杂钙三醇(22-氧杂-la,25-二 羟基~03)、来自University of Illinois (伊利诺伊大学)的la羟基Ds、来自 Institute of Medical Chemistry-Schering AG (医学化学研究所-先灵制药)的 药物包括ZK 161422和ZK 157202。
一方面，本发明涉及用于在人类或非人类动物受治疗者中减少磷酸盐 吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并已经发展 高磷酸盐血症或处于发展高磷酸盐血症的风险。所述方法包括以有效减少 或维持受治疗者中血清磷酸盐浓度的量对受治疗者口服施用抗植酸抗体 或抗植酸盐抗体的步骤。所述方法可进一步包括观察血清磷酸盐浓度减少 或稳定的步骤。例如，可测量并比较抗体处理之前和之后的血清磷酸盐浓 度。
此处公开的所述方法可被用于减弱或预防高磷酸盐血症。在某些实施
可接受的正常范围内的最大生理学血清磷酸盐浓度的约150%、 125%、 120%、 115%、 110%或105%。在某些实施方案中，血清磷酸盐浓度^皮减 少至或维持在正常范围内的水平。对于人类受治疗者来说，最大的高-正常 血清磷酸盐浓度是5.0mg/dl。在一个优选的实施方案中，人类受治疗者中 的血清磷酸盐浓度被减少至或维持在5.5 mg/dl或更低或者5.0 mg/dl或更 低。
处于发展高磷酸盐血症风险或已经发展高磷酸盐血症的患者包括但 不限于，具有以下情况的患者由于维生素D化合物的过量摄入的维生素 D中毒；过量磷酸盐摄入例如含有磷酸盐的緩泻药或灌肠剂的过量使用；肾病或肾功能不全例如此处所描述的急性或者慢性的肾衰竭；原发性曱状
旁腺机能减退；PTH抵抗状况例如肾小管抵抗PTH的综合症，包括不同 类型的假甲状旁腺机能减退(la、 lb、 lc和2)或严重的低镁血症，其损 害PTH分泌并导致外周的PTH抵抗；和/或其中细胞内磷酸盐转移至细胞 外间隙的状态，例如横紋肌溶解、肿瘤溶解、胰鸟素缺乏或急性酸中毒。
在某些实施方案中，本发明的方法被应用于在患有肾病、接受维生素 D化合物(例如la, 25-二羟基维生素D3)或两者的人类或非人类受治疗者 中减少-粦酸盐吸收。
制造抗植酸抗体或抗植酸盐抗体完全在本领域普通技术人员能力内。 在某些实施方案中，用于所述方法的抗体来源于卵(例如卵黄)，尤其来 源于禽类的卵例如鸡卵。通过引用全文并入本文的Poison, A.， M. B. von ^Vecllmar禾口 M.H. van Regenmortel, "Isolation of Viral IgY Antibodies from Yolks of Immunized Hens (来自于免疫母鸡卵黄的病毒IgY抗体的分离)，" Immunological Communications 9:475-493 (1980)中的方法可被用于卵黄抗 体制品的生产。可用偶联植酸/植酸盐的载体蛋白接种产卵母鸡。优选地， 可连同接种物(inoculation)—同施用适合的佐剂以增强免疫接种。可用于这 一目的的佐剂是油包水乳剂佐剂例如完全弗氏佐剂。植酸/植酸盐-载体蛋 白偶联物使母鸡产生抗植酸和抗植酸盐抗体，该抗体被被动转运至所述母 鸡所产的卵的卵黄中。含有所述抗体的卵黄或完整的卵可被收集并匀浆以 形成乳剂。所得到的乳剂可被千燥以形成含有所述抗体的粉末。接着将这 一粉末以适宜口服施用的方式配制并且之后对人类或非人类动物受治疗 者口服施用。制品可作为饮食或食品补充剂而被口服施用。
预期任何同种型类或亚类的抗体(例如IgY、 IgG、 IgM、 IgD、 IgA、 IgE、 IgGl、 IgG2、 TgG3、 IgG4、 TgAl和TgA2 )还有其片段(不管通过这 些抗体的酶促还是化学消化产生)以及通过合成方式或者通过编码这些抗 体或其片段的基因序列的表达制备这些抗体。在一个IgY的实施方案中， 禽类动物(例如鸡、雉、鸭、火鸡、鵝及类似动物)的卵黄中的抗体被用 于实践本发明(参见例如第5,080,895、 5,989,584和6,213,930号美国专利， 其每一个都通过引用全文并入本文)。商业上可获得的卵抗体纯化试剂盒，
13例如EGGstract⑧IgY纯化系统(Promega; Madison, WI)或Eggcellent 鸡TgY纯化(Pierce Biotechnology, Inc.; Rockford, TL)，可被用于纯化所述 抗体。也可基于抗体对肽或蛋白质片段的亲和力使用亲和纯化的标准方法 纯化抗体。可替代地，含有所述抗体的卵、卵黄、或干燥的卵黄粉末可直 接与食物混合以便口服食用或便于引入丸剂、片剂或胶囊中。使用这些抗 体通过完善的分子克隆或噬菌体展示技术还可鉴定编码这些抗体的基因， 以产生这些抗体的完整或者部分单克隆形式，其可单独或联合使用。
含有依照本发明的抗植酸或抗才直酸盐抗体的组合物可例如一天一次、 两次或三次给药。任选地，可将给药以一种方式细分，其中处方剂量的一 部分在食用食物或饮料前摄入，另一部分与食物或饮料一起摄入，而其他 部分在接近摄入食物或饮料后的时间摄入。活性成分可通过口服途径以颗 粒或粉末施用，所述颗粒或粉末撒在或散布在食物上或食物中；或者溶解 或悬浮在々欠料中；或者以药物的固体剂型(例如片剂、胶嚢和粉末)或液 体剂型(例如酏剂、糖浆剂和混悬剂)提供。在某些实施方案中，所述抗 体与食物一起施用或接近食用含有膳食磷酸盐的食物的时间(即之前或之 后约一小时内)施用。在某些实施方案中，所述抗体与磷酸盐结合剂同时 施用。
依照本发明的示例性药物组合物含有IgY和任选的卵组分，或IgY和 任选的卵黄组分，任选地带有其它的稳定剂或药学上可接受的载体。可乳 化完整的卵，或卵黄，或脂类被部分或大部分除去的卵黄，任选地与包嚢 化合物或冻千保护剂(lyoprotectant)混合，并经受喷雾干燥或冷冻千燥形成粉末。
可部分地纯化卵黄抗体，例如除去大量的脂类。参见CamemschC等 人，FASEB J. 1999， 13:81-88; AkitaE& Nakai S, J. Immunol. Methods 1993， 160:207-214,其每一篇都通过引用并入本文，如同以其全文4C出一样，以 及美国专利公开第2004/0087522号，其通过引用并入本文，如同以其全文 提出一样。
胶囊或片剂可包含控释制剂，所述控释制剂可以于羟丙基甲基纤维素提供。可使用已知的制药技术将固体剂型制造为缓释产品以提供数小时内 药物的连续释放。压制片剂可以经糖包衣或者薄膜包衣以掩盖任何令人不 快的味道并且保护所述片剂不受空气影响，或者包肠溶衣以便在胃肠道内 选择性的崩解。固体和液体口服剂型都可含有着色剂和调味剂以提高患者 的接受度。
稳定剂是维持抗体在变性条件例如热或酸下的结合活性的保护剂。稳 定剂不抑制抗体与靶抗原的相互作用，因此也保持了所需的生物学作用。 示例性的稳定剂包括卵白、清蛋白或糖类化合物。优选地，所述糖类化合
物以完整卵液体的约5%至30% (按重量)存在，并且更优选地以完整卵 液体的10%至20% (按重量)的量存在。将所述抗体与糖类化合物混合于 液态混悬剂中，之后千燥所述混悬剂以产生含有蛋白质和糖类的固体。用 作稳定剂的糖类化合物包括单糖、二糖、多糖、烷化单糖、烷化二糖、烷 化多糖、单糖醇和烷化单糖醇。优选地，这些糖类化合物主要由5或6碳 的单糖单元组成或以其为基础。单糖是具有式(CH20)n的单个糖残基，其 中n为3或者更大。单糖的实例包括但不限于葡萄糖、核糖、果糖、半乳 糖、塔罗糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖、木糖和赤藓糖。以所有异构形 式例如a-异构体、(3-异构体、D-异构体和L-异构体存在的单糖都具有活性。 二糖是具有通过糖苷键连接在一起的两个单糖残基的分子。可被用于本发 明的二糖的实例包括但不限于海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和乳 酮糖。多糖是具有以线性的不分支的链或支链连接在一起的三个或更多单 糖的分子。淀粉、糖原和纤维素是具有成百或甚至成千单糖残基的多糖的 实例。淀粉可包括线性的、不分支的链(直链淀粉)或高度支链(支链淀 粉)。糖原包括支链而纤维素包括线性的不分支的链。烷化单糖、烷化二 糖和烷化多糖是有至少 一个氢基团被烷基基团取代的单糖、二糖和多糖。 单糖醇是含有三个或更多羟基基团的无环多元醇。它们可通过将单糖的酮 或醛基团转化为羟基基团来形成。单糖醇的实例包括但不限于丙三醇、甘 露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖醇、异麦芽糖醇(isomalt)、麦芽糖醇和 氬化淀粉水解物。烷化单糖醇是有至少 一个氢基团被烷基基团取代的单糖 醇。为增强抗体的效力或稳定性的目的，也可将所迷抗体连接于基质(聚 合的或非聚合的)底物，之后施用。
考虑下列非限制性实施例后，将更充分地理解本发明。
实施例1
降低被la-幾基维生素D3增加的血清磷酸盐水平 才才并牛和方法
^f在雄^,W动參z单冠白来航鸡(Single Comb White Leghorn) 产卵母鸡用于抗体生产(3只母鸡)。植酸盐抗原通过使用标准的戊二醛程 序将植酸与牛y球蛋白偶联来制备。
尽管用于抗原与载体蛋白的偶联的程序(可从Pierce Scientific获得许多用于偶联的试剂盒)和载体蛋白的性质可有显著差异， 这一实施例中描述的研究中所用的方法包括用于将植酸偶联至载体蛋白 牛y球蛋白(BgG )的戊二醛程序的使用。将溶于0.8 ml的0.1M醋酸钠 緩冲液(pH=7 )的BgG ( 4 mg)与4 mg植酸(Sigma Chemical)混合。 将0.52 ml的0.02 M戊二醛(溶于0.1 M醋酸钠緩冲液中)滴加(以防止 形成泡沫)至植酸盐/载体蛋白混合物。搅拌所述混合物2小时。之后加入 20 mg甘氨酸终止反应。将混合物放置1小时之后经磷酸盐缓冲盐水 (pH=7)透析过夜(MW=6000-8000 )。之后将已透析的偶联物于-80"C冷 冻直至使用。
^,教备斧逆^:为给每只母鸡制备疫苗，0.5 mg的偶联物用0.5 ml PBS稀释至终浓度并与0.5 ml的弗氏完全佐剂(首次注射)或不完全佐剂 (强化接种)混合以形成能够在滴在冰水上时保持珠状的油包水乳化液 (emuisification )。之后给所述母鸡于四个部位(每条腿和每侧胸)肌内注 射0.25 ml的疫苗乳剂。不完全佐剂情况下，强化注射发生于7天之后。 给三只产卵母鸡注射植酸盐/载体疫苗。
在谬存品賴备.'峰值的抗体在21天时获得，因此从第21天至第110 天收集卵。在大约30天组中，将来自每只母鸡的卵黄从整个卵中分离，
16混合并冷冻千燥。含有所述抗体的干燥的卵黄粉末被贮存于室温直至用于
动物喂养研究。还可收集来自每只母鸡的卵，分离印黄并用Poison等人， Immunol. Commun. 1980, 9:475-493中描述的程序聚乙烯纯化IgY。
动參^Tf;无机磷酸盐(Pi)的膳食来源主要是矿物磷酸盐或来自动 物组织和产物(乳和卯)的磷酸盐。这些Pi来源可被单胃动物容易地吸收。 在磷的摄入需要干预的疾病中，患者通常被要求避免这些食物并服用Pi 结合剂。尽管这是在减少Pi的吸收中一种有效的策略，但在疾病例如终末 期肾衰竭的治疗期间吃替代食物(例如植物基础的食物)的患者面临着可 作为用于吸收的Pi库的另一种磷酸盐来源。在植物基础的食物中植酸磷 (PP)代表了所有磷的70%-80%。在单胃动物中，食用PP时，其通常不 可一皮吸收并随着粪便废物被排出。
本实施例中所用的动物模型是鸡模型，其中用导致低血清磷酸盐水平 的Pi缺乏饮食喂养鸡。对用Pi缺乏饮食喂养的鸡提供la-羟基维生素D3 升高了血清磷酸盐水平。因此，这一模型可被用于试验抗植酸抗体是否能 有效地降低由la-羟基维生素Di;引起的来自植酸来源的血清磷酸盐水平升高。
除了植酸抗体之外，这一研究中所用的模型描述于Biehl和 Baker, J. Nutr. 1997, 127:2054-2059。这一研究中所用的阴性对照是Pi缺乏 饮食(P^无机磷酸盐，其主要为矿物磷酸盐或来自动物组织和产物例如乳 和卵的磷酸盐)，其中使用的膳食磷为植酸磷酸盐。如下文的结果中所示， 这一膳食处理导致了低的血浆磷。阳性对照是同阴性对照一样的饮食，但 补充了 la-羟基维生素D.; (20昭/kg饮食，Sigma)。如下文的结果中所示， 与阴性对照相比，这一膳食处理通过植酸磷的释出升高血液磷水平。其余 的膳食处理是阳性对照加植酸抗体(如上文所述产生的lg千燥的卵黄粉 末)。给所述阴性和阳性对照喂食1 g/kg饮食的来源于注射了佐剂的母鸡 的千燥的卵黄粉末。这些卵黄粉末不具备特异性的抗体。
使用了共三组处理(阴性对照、阳性对照、阳性对照加才直酸抗体)。 给每组膳食处理分配6只一天大的雄性单冠白来航鸡雏鸡。以所述膳食处 理喂养雏鸡10天，称重，并血液取样以便使用罗氏/日立分析仪(Roche/Hitachi analyzer)确定血浆磷浓度(基于磷酸盐和钼酸铵无还原地形 成磷钼酸铵的反应)。在每组6只雏鸡的情况下收集排泄物(n=l )用于矿 物质分析。将雏鸡安乐死并收集每只雏鸡的右胫跗骨、干燥、醚提取，并 灰化以便确定无脂的干燥的骨的骨矿物质含量。
t-检验比较法用于确定是否(1) la-羟基维生素D3的加入相对于阴性 对照饮食改变了端点并且(2)对la-羟基维生素D3饮食(阳性对照)加 入植酸盐抗体降低了血浆磷酸盐水平。P值在下文显示的结果中给出。
结果
向磷以植酸形式存在的饮食(Pi缺乏的阴性对照饮食)加入la-轻基 维生素D3将血浆磷增加了 71% (表1 )，将骨灰增加了 8% (Pi缺乏饮食的 阴性对照组和维生素D阳性对照组的骨灰分别为34.65%和37.4%),将排 泄物磷减少了 22%( Pi缺乏饮食的阴性对照组和维生素D饮食阳性对照组 的排泄物磷分別为0.64%和0.5%)，将体重增益增加了 25% (表2)。向补 充了 la-鞋基维生素D3的Pi缺乏饮食加入植酸抗体将血浆磷减少了 36°/。 (表1 )，将骨灰增加了 4% (维生素D饮食的阳性对照组和增加了抗体的 维生素D组的骨灰分别为37.4%和39%)，将排泄物磷增加了 16°/。(维生 素D阳性对照组和增加了抗体的维生素D组的排泄物磷分别为0.5%和 0.58%),将体重增益减少了 21% (表2)。因此，所述抗植酸抗体减少了血 液磷水平而对骨矿化没有不利影响。
本实施例中呈现的数据表明植酸或植酸盐抗体可用于减少已增加的 流向动物血池中的植酸磷。相应地，这些抗体可用于减少服用维生素D化 合物的患者例如肾病患者中的磷酸盐吸收，其中维生素D化合物使植酸磷 酸盐可,皮吸收。
表1.用植酸抗体喂养对以添加有la-羟基维生素D;的植酸磷基础饮 食为食的雏鸡的血浆磷水平的影响、
18血浆裤酸盐
膳食处理 ， v _( mg/dL )_标准误差_
Pi缺乏 3.92 0.35
la-羟基维生素D32 6.70 0.51
抗才直酸抗体* 4.28 0.29
'以含有植酸磷的植酸盐磷(pi缺乏)饮食喂养一天大的来^i鸡雏鸡(n=6),所述饮食 仅加入了 la-羟基維生素D3 ( 20吗/kg饮食)或加入了 la-羟基维生素D3加上植酸卵抗 体(1 g/kg饮食的干燥的卯黄抗体粉末)。用所述饮食喂养10天后测量血浆磷。
2相对于Pi缺乏饮食喂养的雏鸡，维生素D饮食(la-羟基维生素D3)喂养的雏鸡具有 增加了的血浆磷(p=0.0004 )。
*在存在膳食维生素D的情况下以植酸抗体喂养的雏鸡相对于仅维生素D处理具有下 降了的血浆磷水平(p=0.001 )。
表2.用植酸抗体喂养对以添加有la-羟基维生素D3的植酸磷基础饮食为 食的雏鸡的体重增益的影响、
膳食处理_平均增益(g)_标准误差_
Pi缺乏 39.8 4.32
la-羟基维生素D.,2 49.7 7.06
抗4直酸抗体* 39.0 4.61
1以含有植酸磷酸盐的植酸盐磷(pi缺乏)饮食喂养一天大的来航鸡雏鸡(n=6 ),所述 饮食仅加入了 la-羟基维生素D3 ( 20昭/kg饮食)或加入了 la-羟基維生素D:,加上植酸 卵抗体(1 g/kg饮食的干燥的印黄抗体粉末)。用所述饮食喂养第一天和10天后测量体 重。增益是重量之间的差异。
2相对于Pi缺乏饮食喂养的雏鸡，维生素D饮食(la-羟基维生素D:,)喂养的雏鸡具有 增加了的体重增益(p=0.0587 )。
*在存在膳食维生素D的情况下以植酸抗体喂养的雏鸡相对于仅维生素D处理具有下 降了的体重增益(p=0.12)。降低腺噪呤诱导的尿毒症动物中血清磷酸盐水平 用于这一实施例的动物模型是腺。票呤诱导的尿毒症大鼠;漢型(参见例
i口 Yokazawa等人，Nephron 1986， 44:230-234; Katsumata等人，Kid Intl 2003, 64:441-450;和LeviR等人，J Am Soc Nephrol 2006 ， 17:107-112,
其中的每一篇都通过引用全文并入本文)。
以对照饮食或含有无机磷酸盐和植酸磷酸盐的诱导尿毒症的腺嘌呤 饮食(例如含有0.75%腺嘌呤)喂养大鼠(例如约175-250 g的雄性Sprague Dawley大鼠，每组至多IO只大鼠)几周的时间(例如3至5周或更长)。 所述腺嘌呤饮食喂养的大鼠将发展具有高于4.4 mmol/L的血清磷酸盐水平 的高磷酸盐血症。这些大鼠还将发展维生素D3( la-羟基维生素D3和la, 25-二羟基维生素D3)缺乏。以增加量的抗植酸或抗植酸盐抗体每日口服处理 这些腺噤呤饮食喂养的大鼠，将会导致血清磷酸盐水平的剂量依赖性下 降。如果在腺。票呤处理的最初四周内及之后供给所述抗体，那么这些抗植 酸或抗植酸盐抗体将会预防、延緩或逆转这些大鼠中高磷酸盐血症的发 展。
在其它组中，向含有植酸磷酸盐或无机磷酸盐和植酸磷酸盐两者的腺 嘌呤饮食喂养的大鼠提供某种形式的维生素D (例如25-羟基维生素D或 其衍生物，或者活性维生素D药剂例如la, 25-二羟基维生素D3)以预防 或医治活性维生素D缺乏。维生素D处理将使大鼠更易患高磷酸盐血症， 并且一旦发展将使这些大鼠中的高磷酸盐血症更加恶化。用增加剂量的抗 植酸或抗植酸盐抗体口服处理这些正在接受维生素D (例如la, 25-二羟基 维生素D3)的大鼠，将以剂量依赖的方式降低这些大鼠中的血清磷酸盐水 平。如果所述抗体在腺。票呤处理的最初四周内以及之后供给，这些抗植酸 或抗植酸盐抗体将预防或延緩高磷酸盐血症的发展或恶化。
可使用其他腺噤呤诱导的尿毒症动物例如犬、猪和猴进行相似的实验。实施例3
减少5/6肾切除的大鼠中血清磷酸盐水平
对于5/6肾切除术(参见例如Cozzolino M等人，Kidney Int. 2003,64:1653-61 ),左肾动脉的几个分支被结扎而右肾切除。对5/6肾切除的大鼠(例如约175-250 g的雄性Sprague Dawley大鼠，每组至多10只大鼠)喂食含有无机磷酸盐和植酸磷酸盐的高磷酸盐饮食(例如0.9%磷酸盐)。在术后几周(例如4至8周)这些大鼠将患有尿毒症并发展肾衰竭、高磷酸盐血症和活性维生素D3 ( la-羟基维生素"和la, 25-二幾基维生素D3)缺乏。用增加量的抗植酸或抗植酸盐抗体每日口服处理这些高磷酸盐^:食喂养的5/6肾切除的大鼠，将以剂量依赖的方式减少这些大鼠中的血清磷酸盐水平。如果所述抗体在手术之后的最初几周内以及之后供给，他们将预防或延缓这些大鼠中高磷酸盐血症的发展。
在其它组中，向含有植酸磷酸盐或无机磷酸盐和植酸磷酸盐两者的高
磷酸盐饮食喂养的5/6肾切除的大鼠提供某种形式的维生素D (例如25-
羟基维生素D或其衍生物，或者活性维生素D药剂例如la, 25-二羟基维
生素D3)以预防或医治活性维生素D缺乏。然而，这一处理将使大鼠更
易患高磷酸盐血症，并且一旦发展将使这些大鼠中的高磷酸盐血症恶化。用增加剂量的抗植酸或抗植酸盐抗体口服处理这些接受维生素D(例如la,
25-二羟基维生素D3)的大鼠，将降低血清磷酸盐水平。如果所迷抗体在手术的最初几周内以及之后供给，这些抗植酸或抗植酸盐抗体将预防或延緩这些大鼠中高磷酸盐血症的发展或恶化。
本发明不意为限制于前述的实施例而是包含如在所附的权利要求的范围内的所有这些修改和变化。
2权利要求
1.一种在人类或非人类动物受治疗者中减少磷酸盐吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并患有高磷酸盐血症或处于发展高磷酸盐血症的风险，所述方法包括如下步骤以有效减少或维持所述受治疗者中血清磷酸盐浓度的量对所述受治疗者口服施用抗植酸抗体或抗植酸盐抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者患有肾病。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述肾病选自终末期肾病、急 性肾衰竭、慢性肾衰竭、多嚢肾病、慢性肾病、急性肾小管坏死、使肾功 能衰退的感染和尿路梗阻。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者正在接受维生素D 化合物。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是JgY抗体。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体从禽类的卵获得。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体与磷酸盐结合剂一起施用。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者是人类受治疗者。
9. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在施用所述抗体之后 测量所述血清磷酸盐浓度并将所述浓度与施用所述抗体之前的血清磷酸 盐浓度比较的步骤。
10. —种在患有肾病、接受维生素D化合物并食用含有植酸或植酸盐 的饮食的人类受治疗者中减少磷酸盐吸收的方法，其中所述维生素D化合 物使所述饮食中的植酸磷酸盐可被吸收，所述方法包括如下步骤以有效减少或维持所述受治疗者中血清磷酸盐浓度的量对所述人类 受治疗者口服施用抗^f直酸抗体或抗^t酸盐抗体。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中所述肾病选自终末期肾病、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、多嚢肾病、慢性肾病、急性肾小管坏死、使肾功 能衰退的感染和尿路梗阻。
12. 根据权利要求IO所述的方法，其中所述抗体是IgY抗体。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体从禽类的卵获得。
14. 根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体与磷酸盐结合剂一起施用。
15. 根据权利要求10所述的方法，其进一步包括在施用所述抗体之 后测量所述血清磷酸盐浓度并将所迷浓度与施用所述抗体之前的血清磷 酸盐浓度比较的步骤。
全文摘要
此处公开了一种用于在人类或非人类动物受治疗者中减少磷酸盐吸收的方法，其中所述受治疗者食用含有植酸或植酸盐的饮食并且患有高磷酸盐血症或处于发展高磷酸盐血症的风险。所述方法包括以有效减少或维持受治疗者中血清磷酸盐浓度的量对受治疗者口服施用抗植酸(C₆H₆[OPO(OH)₂]_O)抗体或抗植酸盐抗体的步骤。
文档编号A61P3/12GK101583627SQ200780048219
公开日2009年11月18日 申请日期2007年10月23日 优先权日2006年10月26日
发明者埃里卡·希尔斯坦, 马丁·佩特科维奇, 马克·库克 申请人:威斯康星大学校友研究基金会;奥瓦科技公司