专利名称：：2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物及其制备方法和应用的制作方法2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物及其制备方法和应用
技术领域：
：本发明涉及一类新型抗菌化合物及其制备方法，即2-羟基卤代苄基氨基酸、化合物的酯类及肼类衍生物及其制备方法和抑杀菌活性作为抗菌剂的应用。
背景技术：
：近年来发现，氨基酸作为药物的有效载体，可以增强药物的脂溶性，促进细胞对药物的吸收。氨基酸引入药物分子以后，在体内通过水解，往往又释放出氨基酸，从某种程度上可以缓解药物对细胞的毒性。某些a-氨基酸本身就有生物活性，并且还可以辅助药物的活性母体，提高抑菌作用。文献报道水杨醛縮氨基酸类席夫碱及其金属络合具有良好的杀菌、抗癌、抗病毒、除草等生物活性，但与其相对应的还原席夫碱类化合物及其卤代衍生物甚是少见。自1997年，McMurrayLM等研究发现2，4，4'-三氯-2'-羟基二苯醚杀菌机理表明，邻羟基苯结构对该类化合物抑杀病原菌的活性起着关键作用。因此，含有邻羟基苯结构的化合物，对新型杀菌、抗病毒及防治传染病药剂的设计和研制具有重要意义。
发明内容本发明的目的是为了解决靶向抗菌、抗病毒化合物品种稀缺问题，同时为研制出具有更高效的广谱杀菌剂，而提供一种2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物及其制备方法，该类化合物因为分子中具有卤代邻羟基苯结构，与病原菌的特异性酶具有良好的亲和性，因此具有良好的抑菌、杀菌活性，同时引入了氨基酸侧链，可以增强药物的脂溶性,促进细胞对药物的吸收，可以辅助药物的活性母体，提高抑菌作用，是一类良好的潜在抗菌药物。为实现本发明的目的，本发明公开了一种2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物，其结构通式(I)为其中X,X4=H;F;CI;Br或I;R产-H;-CH3;_CH(CH3)2;-CH2CH(CH3)2;-CH2SH;_CH2Ph;-CH(OH)CH3;—CH2OH;-CH2CH2COOH:—CH(CH3)CH2CH3;_CH2CH2SCH3;—<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>Ia时R2=-OH;Ib时:R2=-OCH3;-0CH2CH3;-OC(CH3)3或-OCH2Ph;Ic时R2=-NH-NH2。本发明还公开了这种2-羟基卤代苄基氨基酸、化合物的酯类及肼类衍生物的制备方法，其特征在于以水杨醛为起始原料，先卤化，然后在碱性条件下与L-a-氨基酸縮合得卤代水杨醛縮氨基酸类席夫碱，经还原、酸化得到产物K，经酯化后得到K、最后肼解得到I。，合成路线为其中XtX4=H;F;CI;Br或IR产—H;-CH3;_CH(CH3)2;—CH2CH(CH3)2;-CH2SH;—CH2Ph;-CH(OH)CH"-CH2OH;-CH2CH2COOH;-CH(CH3)CH2CH3;-CH2CH2SCH3;-CH2COOH;H2-C-C=CHIa时R2=—OH;Ib时:R2=-OCH3;-OCH线;-OC(CH3)3或-0CH2Ph;Ic时R2=-NH-NH2。本发明还公开了这种2-羟基卤代苄基氨基酸、化合物的肼类衍生物的另一种制备方法，其特征在于先将氨基酸酯化，然后与卤代水杨醛縮合、还原得到K，最后进行肼解得到I。，合成路线为其中XtX4=H;F;CI;Br或IR,=-H;-CH3;_CH(CH:,)2;-CH2CH(CH,)2;-CH2SH;-CH2Ph;-CH(OH)CH.,;-,H;-CH2CH2COOH;-CH(CH.,)CH,CH:,;_CH2CH2SCH3;-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>Ib时R2=-OCH3;-OCH2CH3;-OC(CH3)3或-OCH2Ph;Ic时R2=_NH-NH2。为实现本发明的目的，本发明还公开了2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物在抑菌方面的活性及其作为制备杀菌剂、抗病毒剂的应用。依据GB15979-2002《一次性使用卫生用品标准》，在样品O.05%和0.5%(以10。/。DMF的水溶液溶解)浓度下，对发明的2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物及其酯类及肼类衍生物进行了抑杀菌活性的测试，测试结果表明，化合物对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)具有较强的抑杀作用，对白色念珠菌(ATCC10231)和大肠杆菌(8099)有不同程度的抑杀作用。本发明的有益效果是本发明2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物即2-羟基卤代苄基氨基酸(K)、酯类衍生物(Ib)及肼类衍生物(1。)，以卤代邻羟基苯为母核，与病原菌的特异性酶具有良好的亲和性，因此具有良好的抑菌、杀菌活性，同时引入了氨基酸侧链，可以增强药物的脂溶性，促进细胞对药物的吸收，可以辅助药物的活性母体,提高抑菌作用。本发明设计的2-羟基卤代苄基氨基酸及其酯类及肼类衍生物合成路线简易，化合物收率普遍较高，反应条件温和，操作方便。本发明设计的2-羟基卤代苄基氨基酸及其酯类及肼类衍生物具有良好的抑菌活性，可作为杀菌剂、杀菌剂的前体化合物、生物制剂原料等使用，适用于杀菌、抗病毒、除臭和去除皮肤外表的附加物等，可用作抗菌、抗病毒药物、杀菌消毒药剂以及日化产品、卫生整理剂等的杀菌成分等。是对目前国内外缺乏靶向杀菌化合物及制备方法的重要补充。具体实施方式本发明合成路线一以水杨醛为起始原料，先卤化，然后在碱性条件下与L-ci-氨基酸縮合得卤代水杨醛縮氨基酸类席夫碱，经还原酸化得到K，然后酯化得到K，最后肼解得到I。。所用碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾、乙醇钾或氨水等碱中的一种或两种或两种以上混合碱，且L-a-氨基酸与碱的用量比为0.25:1(摩尔比)，以0.41(摩尔比)较佳。所用卤代水杨醛与L-a-氨基酸或L-a-氨基酸酯类化合物的用量比为0.25:1(摩尔比)，以11.1:1(摩尔比)较佳。席夫碱縮合反应在0.910h完成。合成路线二先将氨基酸酯化，然后与卤代水杨醛縮合、经硼氢化钠还原得到Ib，最后进行肼解得I。。氨基酸的酯化可以用酸性酯化、碱性酯化及酯交换的方法。2-羟基卤代水杨醛与L-a-氨基酸或L-a-氨基酸酯类化合物的用量摩尔比为0.25:1。在两种制备方法中，为了提高反应体系的流动性和反应效果，席夫碱縮合反应需加入一定量的溶剂，所用的溶剂可以是甲醇、乙醇、丙醇或乙二醇等极性溶剂中的一种或两种或两种以上的混合溶剂。席夫碱縮合反应的温度为一2(TC12(TC的任何温度，以1(TC2(TC较佳。席夫碱縮合反应时，体系中介质基本保持在pH=89，加入碱的量需根据L-a-氨基酸酸性的变化而变化。疏水的脂肪R基氨基酸，如缬氨酸，加入l倍当量的碱即可；亲水性R基氨基酸，如谷氨酸，需加入2倍当量的碱。还原剂与L的摩尔比为0.35:1。Ia的还原反应，适用的温度范围-l(TC4(TC。K在还原剂的条件下直接还原，通过酸析直接析出。为了提高重结晶的效果，化合物I提纯时，用甲醇、乙醇、丙醇、水中的一种、两种或两种以上的混合物作为重结晶溶剂。不同性质的氨基酸侧链使用的重结晶溶剂也不尽相同。疏水性R基氨基酸，如缬氨酸，苯丙氨酸，可以直接用甲醇、乙醇或丙醇醇类溶剂或水和醇类溶剂的混合溶剂作重结晶溶剂。使用混合溶剂时，醇类与水的体积比为11:10。其中亲水性R基氨基酸，如苏氨酸，谷氨酸，用水和乙醇的混合溶剂作重结晶时，乙醇的比例应小于水的比例，以水乙醇为3:14:1较佳。实例1:5-溴-2-羟基苄基谷氨酸的合成在lOOmL单口圆底烧瓶中加入lOmmolL-a-谷氨酸，用30mL乙醇溶解，在溶液中加入20mmol氢氧化钠，室温下搅拌，使得氨基酸成钠盐，10min后分批加入5-溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，并逐渐伴随有黄色沉淀的生成，室温下搅拌1.5h，反应整个过程需基本保持p^8左右，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制pH=67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，溶液无色澄清，TLC监测反应完全，用稀盐酸调溶液pH:3-4，调节过程中产生大量的白色沉淀。静置，过滤，用水、乙醚洗涤，将粗品用水和乙醇的混合溶剂重结晶，得纯品，收率81.2%。熔点173174°C。实例2:5-溴-2-羟基节基半胱氨酸的合成在lOOmL单口圆底烧瓶中加入lOmmolL-a-半胱氨酸，用30mL甲醇溶解，在溶液中加入lOmmol氢氧化钠，室温下搅拌，使得氨基酸成钠盐，10min后分批加入5-溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，并逐渐伴随有黄色沉淀的生成，室温下搅拌1.5h，反应整个过程需基本保持pH:8左右，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制P^67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，溶液无色澄清，TLC监测反应完全，用稀盐酸调溶液pt^3-4，调节过程中产生大量的白色沉淀。静置，过滤，用水、乙醚洗涤，将粗品用水和乙醇的混合溶剂重结晶，得纯品，收率72.7%。熔点197198°C。实例3:3，5-二溴-2-羟基苄基缬氨酸的合成在lOOmL单口圆底烧瓶中加入lOmmolL-a-缬氨酸，用30mL甲醇溶解，在溶液中加入10mmol氢氧化钠，室温下搅拌，使得氨基酸成钠盐，10min后分批加入3，5-二溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，并逐渐伴随有黄色沉淀的生成，室温下搅拌O.5h，反应整个过程需基本保持p^8左右，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制P^67,分批加入ll醒ol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，溶液无色澄清，TLC监测反应完全，用稀盐酸调溶液P^3-4，调节过程中产生大量的白色沉淀。静置，过滤，用水、乙醚洗涤，将粗品用水和乙醇的混合溶剂重结晶，得纯品，收率82.3%。熔点185186°C。实例4:3，5-二溴-2-羟基苄基苯丙氨酸的合成在lOOmL单口圆底烧瓶中加入10mmolL-a-苯丙氨酸，用30mL甲醇溶解，在溶液中加入lOmmol氢氧化钠，室温下搅拌，使得氨基酸成钠盐，10min后分批加入3，5-二溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，并逐渐伴随有黄色沉淀的生成，室温下搅拌5h，反应整个过程需基本保持pH二8左右，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制PH=67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，溶液无色澄清，TLC监测反应完全，用稀盐酸调溶液pH-3-4，调节过程中产生大量的白色沉淀。静置，过滤，用水、乙醚洗涤，将粗品用水和乙醇的混合溶剂重结晶，得纯品，收率88.4%。熔点200°C。实例5:5-溴-2-羟基苄基亮氨酸乙酯的合成在lOOmL单口圆底烧瓶中加入lOmmolL-a-亮氨酸，用30mL乙醇溶解，在溶液中加入lO隱ol氢氧化钠，室温下搅拌，使得氨基酸成钠盐，10min后分批加入5-溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，并逐渐伴随有黄色沉淀的生成，室温下搅拌2h，反应整个过程需基本保持p^8左右，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制pH=67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，溶液无色澄清，TLC监测反应完全，用稀盐酸调溶液pH-3-4，调节过程中产生大量的白色沉淀。静置，过滤，用水、乙醚洗涤，将粗品用水和乙醇的混合溶剂重结晶，得5-溴-2-羟基苄基亮氨酸，收率91.5%。在100mL三口瓶中加入5mmo15-溴-2-羟基苄基亮氨酸，用30mL乙醇溶解，用恒压滴液漏斗滴加12mL二氯亚砜，保持反应体系的温度在0。C一下，反应3h,回流温度下反应5h，蒸除剩余的乙醇和二氯亚砜，冷藏固化，用乙醇/乙醚作重结晶，得纯品，收率65%。实例6:5-溴-2-羟基苄基苯丙氨酸苄酯的合成在100mL单口圆底烧瓶中加入10mmolL-a-苯丙氨酸，用15mLDMF溶解，加入lOmmol碳酸钠，在冰浴下滴加1.8mL滴加溴化苄，冰浴中反应3h，室温下反应过夜，用饱和食盐水终止反应，乙酸乙酯萃取(3X100mL)，合并有机相，依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，柱分离(洗脱剂为V(石油醚)V(乙酸乙酯)=10:1)，得纯品L-ci-苯丙氨酸苄酯，收率68.3%。在lOOmL单口圆底烧瓶中加入5mmolL-a-苯丙氨酸苄酯，用30mL乙醇溶解，室温下分批加入5mmo15-溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，室温下搅拌2h，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制PH=67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，TLC监测反应完全，减压蒸除乙醇，用乙酸乙酯萃取(3X50mL)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，柱分离(洗脱剂为V(石油醚)V(乙酸乙酯)=8:1)，得纯品5-溴-2-羟基苄基苯丙氨酸苄酯。收率56.2%实例7:3,5-二溴-2-羟基苄基甘氨酰肼的合成在100mL三口瓶中加入lOmmolL-a-甘氨酸，用30mL乙醇溶解，用恒压滴液漏斗滴加13mL二氯亚砜，保持反应体系的温度在O'C以下，反应3h，回流温度下反应4h，蒸除剩余的乙醇和二氯亚砜，冷藏固化，用乙醇/乙醚作重结晶，得L-a-甘氨酸乙酯，收率82%。在100mL三口圆底烧瓶中加入lOmmolL-a-甘氨酸乙酯，用30mL甲醇溶解，室温下分批加入3，5-二溴水杨醛，加入后溶液的黄色立即加深，室温下搅拌2h，TLC监测反应基本完全，然后用冰浴冷却，稳定后用稀盐酸将溶液体系调制pH-67，分批加入llmmol硼氢化钠，随着硼氢化钠的加入，溶液迅速消色，半小时后，TLC监测反应完全，减压蒸除乙醇，用乙酸乙酯萃取(3X50mL)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤减压蒸除溶剂，将粗产品直接用于下一步反应，用30mL乙醇溶解，加入12mmol水合肼，在回流温度下搅拌5小时，TLC监测反应几乎完全，减压蒸除溶剂，柱分离(洗脱剂为V(石油醚)V(乙酸乙酯)=5:l—3:1)，得纯品3，5-二溴-2-羟基苄基甘氨酰肼。收率56.7%。实例8:化合物的抑菌活性测试实例实验检测依据以及菌悬液、活菌计数均参照GB15979-2002《一次性使用卫生标准》。本实验所用菌株，包括白色念珠菌(ATCC10231)、大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，均由中国科学院微生物研究所提供；所用的培养基为沙氏琼脂培养基和营养琼脂培养基。试验样品浓度为质量分数0.05%;空白溶液为DMF:水二5:45。具体操作如下将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为用100yL滴于对5mL样液内，回收菌数为1X1049X104cfu/mL)。取被试样液(5mL)和对照样液(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4管。取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液上滴加100yL，均匀混合，开始计时，作用20min，用无菌移液管分别将样液(0.5mL)投入含5mLPBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中23个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个培养皿，用凉至4045'C的沙氏琼脂培养基(酵母菌)15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35。C土2。C培养48h(细菌)，作活菌菌落计数。实验重复1次，按下式计算抑菌率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>式中X,—一抑菌率，％;A—一对照样品平均菌落数；B—一被试样品平均菌落数。具体抑菌测试数据见表1。表1抑菌率数据<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注抑菌率〉90%，具冇较强抑菌作用。抑菌率>50%,具有抑菌作用。抑菌率<50%，无抑菌作川。实例9:化合物的杀菌活性测试实例实验检测依据以及菌悬液、活菌计数均参照GB15979-2002《一次性使用卫生标准》。本实验所用菌株，包括白色念珠菌(ATCC10231)、大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，均由中国科学院微生物研究所提供；所用的培养基为沙氏琼脂培养基和营养琼脂培养基。试验样品浓度为质量分数0.5%;空白溶液为DMF:水=5:45。具体操作如下将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为用100uL滴于对5mL样液内，回收菌数为lX1049X104cfu/mL)。取被试样液(5mL)和对照样液(与试样同质材料，同等大小，但不含抗菌材料，且经灭菌处理)各4管。取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液上滴加100uL,均匀混合，开始计时，作用20min，用无菌移液管分别将样液(0.5mL)投入含5mL中和剂试管内，充分混匀，10min后，然后取其中l个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个培养皿，用凉至4045'C的沙氏琼脂培养基(酵母菌)15mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35'C士2。C培养48h(细菌)，作活菌菌落计数。实验重复1次，按下式计算抑菌率-X2=(A-B)/AX100%式中X2—一杀菌率，％;A—一对照样品平均菌落数；B——被试样品平均菌落数。具体杀菌测试数据见表2。表2杀菌率数据<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注杀菌率》90%，产品有杀菌作用。权利要求1.一种2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物，其特征在于它的结构通式为其中X1～X4＝H；F；Cl；Br或I；R1＝-H；-CH3；-CH(CH3)2；-CH2CH(CH3)2；-CH2SH；-CH2Ph；-CH(OH)CH3；-CH2OH；-CH2CH2COOH；-CH(CH3)CH2CH3；-CH2CH2SCH3；-CH2COOH；或IaR2＝-OH；IbR2＝-OCH3；-OCH2CH3；-OC(CH3)3或-OCH2Ph；IcR2＝-NH-NH2。2.—种权利要求1的2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物的制备方法，其特征在于以水杨醛为起始原料，先卤化，然后在碱性条件下与L-a-氨基酸縮合得卤代水杨醛縮氨基酸类席夫碱，经还原、酸化得到产物K，经酯化后得到K、最后肼解得到I。，合成路线为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中XtX4=H:F;CI;Br或I;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.—种权利要求1的2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物的制备方法，其特征在于先将氨基酸酯化，然后与卤代水杨醛缩合、还原得到K，最后进行肼解得到I。，合成路线为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，L-a-氨基酸应先与碱形成羧酸盐，所用碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾、乙醇钾、氨水中的一种、两种或两种以上的混合物，且L-a-氨基酸与碱的摩尔比为0.25:1。5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，2-羟基-卤代水杨醛与L-a-氨基酸或L-a-氨基酸酯类化合物缩合生成席夫碱在有机溶剂中进行，所用溶剂为甲醇、乙醇、丙醇或乙二醇中的一种、两种或两种以上的混合物。6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，2-羟基卤代水杨醛与L-a-氨基酸或L-a-氨基酸酯类化合物的用量摩尔比为0.25:1。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，2-羟基卤代水杨醛与L-a-氨基酸或L-a-氨基酸酯类化合物縮合反应，适用的温度范围-2(TC120'C。8.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，还原反应，适用的温度范围-10°C~40°C。9.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于化合物I提纯时，用甲醇、乙醇、丙醇、水中的一种、两种或两种以上的混合物作为重结晶溶剂；使用醇和水的混合溶剂时，醇与水的体积比为11:10。10.—种权利要求l所述的2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物在抑杀菌方面的活性及其作为制备杀菌剂、抗病毒剂的应用。全文摘要本发明公开了一种2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物及其制备方法和应用。本发明设计的2-羟基卤代苄基氨基酸类化合物的制备技术简单，且由于化合物分子中含有氨基酸结构，可以增强化合物的脂溶性，促进细胞对化合物的吸收。氨基酸引入药物分子以后，在体内通过水解，往往又释放出氨基酸，从某种程度上可以缓解药物对细胞的毒性。因此，该类化合物可作为杀菌剂、杀菌剂的前体化合物、生物制剂原料等使用，适用于杀菌、抗病毒、除臭和去除皮肤外表的附加物等，可用作抗菌、抗病毒药物、杀菌消毒药剂以及日化产品、卫生整理剂等的杀菌成分等。文档编号A61K31/185GK101274900SQ20081000362公开日2008年10月1日申请日期2008年1月11日优先权日2007年7月10日发明者芳刘,卢俊瑞,马霞苗申请人:天津理工大学