专利名称：：异体人红细胞膜蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体涉及治疗肿瘤的药物。技术背景恶性肿瘤的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗、中医中药治疗和免疫治疗。手术治疗是治疗肿瘤最有效的方法，但是单纯依靠手术很难防止肿瘤复发和远处转移，难以达到根治的目的；放射治疗虽然对某些肿瘤具有根治的效果，但还有一定的局限性。放射治疗是一种局部治疗手段，这能对局部病灶有治疗作用，不能预防肿瘤的远处转移；放射治疗是通过射线杀灭肿瘤细胞，对于一些射线不敏感的肿瘤细胞不能全部杀死，导致肿瘤残留和复发。化学治疗对某些肿瘤的治愈率比较高，但化学药物对肿瘤细胞杀伤的选择性不强，毒性较大；中医学在调动机体的抗病能力，减轻其他治疗方法的不良反应有独特的效果，但对肿瘤的局部控制效果较差，只能作为辅助治疗的手段。免疫治疗是指通过调动宿主的天然防卫机制或给予某些生物物质以取得抗肿瘤效应的治疗方法的总称，其基本思路是通过相关技术方法调动宿主的免疫系统的抗肿瘤免疫应答能力，消灭已经形成的肿瘤细胞或抑制其进一步发展，关键是克服宿主对肿瘤细胞的免疫忽视状态。用于免疫治疗的药物主要有以下几种类型(1)肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，因此称它为肿瘤特异性主动免疫治疗。肿瘤疫苗可加强和提高机体自身免疫功能和识别肿瘤抗原能力，避免肿瘤逃避免疫监视，启动自身主动的生理免疫抗瘤能力，以达到减少癌变发生、消除手术残留癌灶、防止转移复发的目的。目前研究较多的肿瘤疫苗有肿瘤细胞疫苗、肿瘤核酸疫苗、肿瘤多肽疫苗、肿瘤基因工程疫苗和抗独特型肿瘤疫苗等五种。其中，细胞疫苗研究的最早，核酸疫苗、多肽疫苗和基因工程疫苗是1990年后才发展起来的新疫苗。肿瘤细胞疫苗是以自身肿瘤组织经过研磨、照射、药物灭活等方法处理加佐剂后制成的肿瘤疫苗。这种疫苗临床上已试用于多种实体瘤，有一定疗效，但因科学性不高而受限制，对肿瘤异质性无很好作用，不能起到有效控制与治疗肿瘤的目的。肿瘤核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗。是由携带编码抗原基因的真核表达质粒制成，直接输入组织细胞内，使之在体内表达相应抗原而诱导机体产生相应特异性免疫反应。它的不利之处在于，被接种的肌肉细胞提呈抗原后导致免疫无能或免疫耐受，因此必须设法把DNA质粒转化到肌肉组织的抗原提呈细胞上。肿瘤多肽疫苗是由来自肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。抗独特型肿瘤疫苗是由抗独特型抗体制成的疫苗，其抗独特型抗体Ab2具有模拟肿瘤抗原和免疫调节的双重作用，可打破机体对肿瘤抗原的免疫状态。这种疫苗在一些动物及人体试验中已得到一些诱导保护性免疫的证据。但由于技术的限制，目前肿瘤疫苗的研究多停留在实验室或临床研究阶段，少有实际应用者，临床试验的效果多数不理想。同时肿瘤疫苗引发机体特异性抗肿瘤免疫反应的前提条件是必需找到肿瘤特异性抗原，而目前绝大多数肿瘤尚未发现肿瘤细胞特异性表达的抗原，多用肿瘤相关性抗原诱导机体的免疫反应，因此肿瘤疫苗的应用受到限制。(2)单克隆抗体即利用高度特异性的单克隆抗体为载体，将具有细胞毒性的杀伤分子带到肿瘤病灶处，可特异地杀伤肿瘤细胞。但是该方法对作为载体的单克隆载体的特异性要求非常高，即其相应的抗原在肿瘤组织中高表达，而在正常组织中含量较少。(3)细胞因子细胞因子是指由免疫细胞和某些细胞分泌的介导和调节免疫、炎性反应的小分子多肽，如淋巴因子等。细胞因子能增强一种或多种细胞的免疫功能，具有直接或间接的杀瘤效应，但是细胞因子是非特异性增强机体的免疫功能，不具有肿瘤细胞特异性杀伤作用。同时细胞因子要在临床上起到明显的治疗肿瘤作用，所需剂量大，导致毒副作用增加，因此应用受到限制。(4)具有抗肿瘤活性的免疫细胞，如淋巴细胞激活的杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞等，该类药物的优点是体外诱导效应细胞避开了肿瘤宿主村子的免疫抑制，易于活化和扩增，活化的杀伤细胞在体内可产生抗肿瘤效应，其缺点是不能产业化生产，制备繁琐，质量控制较难，成本高，治疗有效的瘤谱不够广泛。现有的各种免疫治疗方法未能取得较好疗效的最主要的原因是均不能改善肿瘤微环境中免疫功能抑制状态。研究发现抗原提呈细胞可迅速呈递大多数肿瘤抗原，肿瘤患者体内也确实存在针对肿瘤抗原而产生的免疫应答，免疫应答产物主要包括细胞免疫中针对特异性抗原表位的CD8+T细胞和体液免疫中B细胞分泌的肿瘤抗原特异性的抗体，并且免疫应答的过程在肿瘤发生的早期阶段就开始了。但免疫应答产物不能产生有效的抗肿瘤效应，并且多数免疫治疗方法能够增强患者全身的免疫功能，但抗肿瘤效果却与预期的相差很多。主要原因是肿瘤患者免疫功能状态并不能直接反应机体抗肿瘤免疫效应，即使患者全身的免疫功能得到改善，但肿瘤微环境内的免疫效应却是仍处于抑制状态。肿瘤微环境是肿瘤细胞在其发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所，肿瘤微环境内存在多种因素参与局部的免疫抑制状态的产生，包括局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫调节细胞Treg、细胞因子的免疫负调节作用、抑制性配体受体反应、效应细胞的代谢活性负调节、肿瘤细胞本身的作用等。在肿瘤组织微环境中，上述因素共同作用，形成了肿瘤局部微环境中免疫特有模式。肿瘤细胞不仅被动的逃避免疫系统的攻击，同时也主动的抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。目前尚没有较好的方法打破肿瘤内环境对免疫细胞的抑制作用。红细胞(redbloodcell,erythrocyte)是结构最简单的细胞，是研究膜结构的最好材料，对膜结构的认识许多来自对红细胞膜结构的研究。通过单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析红细胞膜蛋白，发现有15种主要的蛋白带，分子质量为15kDa到250kDa。其中有3种主要的蛋白，约占膜蛋白60%以上①血影蛋白(spectrin):又称收縮蛋白，位于红细胞膜下，不属于红细胞膜蛋白，是红细胞膜骨架的主要成分。是一种长的可伸缩的纤维蛋白，长约100nm，有两个亚基构成a-亚基分子质量200kDa;P-亚基分子质量220kDa。两个亚基链为反平行排列，扭曲为麻花状，形成异二聚体。两个异二聚体头头连接形成200nm长的四聚体。②血型糖蛋白A(glycophorinA):又称涎糖蛋白(sialoglycoprotein),富含唾液酸。属单次跨膜蛋白，由131个氨基酸构成，N端在外侧，结合16个低聚糖侧链。除A型外，血型糖蛋白还有B、C、D型，血型糖蛋白的基本功能可能是在它的唾液酸中含有大量的负电荷，防止红细胞在循环过程中相互聚集沉积在血管中。③带3蛋白(band3protein):属红细胞膜蛋白，在PAGE电泳中位于第3条带而得名。带3蛋白在红细胞膜中含量很高，约为红细胞膜蛋白的25%。是由两个相同的亚基组成的二聚体，每条亚基含有929个氨基酸，是一种糖蛋白，跨膜12-14次，为多次跨膜蛋白。具阴离子转运功能，被称为阴离子通道。除上述3种蛋白外，红细胞膜蛋白还包括肌动蛋白(actin):又称带5蛋白，是细胞骨架的主要成份，肌动蛋白纤维链长约35nm，其中含13个肌动蛋白单体和一个长35nm的原肌球蛋白分子。肌动蛋白纤维上有多个与血影蛋白结合的位点，通过与血影蛋白游离端的结合参与膜骨架结构的形成；锚定蛋白(ankyrin):又称带2.1蛋白，是一种比较大的细胞内连接蛋白，每个红细胞约含IO万个锚定蛋白，相对分子量为215000。锚蛋白一方面与血影蛋白相连，另一方面与跨膜的带3蛋白的细胞质结构域部分相连，因此，锚蛋白借助带3蛋白将血影蛋白连接到细胞质膜上，也就将骨架固定到质膜上；带4.1蛋白(band4.1protein):是由两个亚基组成的球形蛋白，它在膜骨架中的作用是通过与血影蛋白结合，促使血影蛋白与肌动蛋白结合。因为没有肌动蛋白结合位点，故其本身不与肌动蛋白结合；内收蛋白(adducin):是由两个亚基组成的二聚体，每个红细胞有30000个分子。其形态为不规则的盘状物，高5.4nm，直径12.4nm。内收蛋白可与肌动蛋白及血影蛋白的复合体结合，并且通过Ca2+和钙调蛋白的作用影响股价蛋白的稳定性，从而影响红细胞的形态。红细胞是研究膜结构的最好材料①数量大，取材容易，并极少有其他的细胞污染。②成熟的哺乳动物的红细胞中没有细胞核和线粒体等膜相细胞器，细胞质膜是其唯一的膜结构，所以分离后不存在其他膜污染的问题。红细胞膜蛋白的制备主要通过低渗溶解红细胞，高速离心洗涤去除血红蛋白后用等渗的盐水或PBS重悬。红细胞膜蛋白具有血型抗原活性，可与相应血型抗体反应，从而在红细胞血型鉴定中发挥作用。红细胞膜蛋白具有免疫调节功能，在体内可发挥红细胞免疫功能，结合循环免疫复合物，及调节T淋巴细胞及B淋巴细胞的功能。尚未有红细胞膜蛋白应用于肿瘤治疗的报道。
发明内容本发明的目的提供异体人红细胞膜蛋白在制药中的用途。本发明所提供的异体人红细胞膜蛋白的用途是制备治疗肿瘤的药物。本发明人发现同物种的红细胞膜蛋白在具有相应血型抗体的人体内具有很好的杀瘤效应，这是由于各种血型抗原在不同血型的人体内均存在相应的天然抗体，如ABO血型系统中，A型的人体内存在抗B型血抗原的天然抗体，B型的人体内存在抗A型血抗原的天然抗体，0型的人体内则同时存在抗A型血和B型血抗原的天然抗体；除ABO血型系统外，MN、P、Lewis等血型系统在人体内也存在相应的天然抗体，而人类的血型抗原主要分布在红细胞膜表面，将红细胞膜蛋白在具有相应血型抗体的人体里直接进行肿瘤内注射，可导致血型抗原和体内预存的天然抗体发生免疫反应，出现超急性炎症反应，细胞因子释放，炎症细胞募集，抗原提呈细胞激活，抑制性免疫调节细胞减少，并可使肿瘤抗原暴露，从而逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，导致肿瘤坏死，达到治疗肿瘤的目的。可见，红细胞膜蛋白可用于制备治疗肿瘤的药物，不仅解决了采用提高机体整体免疫功能的免疫治疗仍无法改变肿瘤微环境内处于免疫抑制状态而导致治疗效果不佳的问题，还同时绕过了寻找肿瘤特异性抗原的难题，对各种病理类型的肿瘤均有治疗作用。本发明还提供一种治疗肿瘤的注射液，该注射液由人红细胞膜蛋白和缓冲液组成，其中红细胞膜蛋白在缓冲液的浓度为10mg/mL30mg/mL，最佳是20mg/mL;所述的缓冲液为PH值78的磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水。本发明所述的注射液中所述的红细胞膜蛋白可采用公知的方法从人体血液中提取得到解决，其中含有所属物种体内存在的天然抗体的血型物质；所用的血液可以是各种血型系统，如AB0型、MN、P和Lewis等。本发明所述注射液可通过以下方法制备获得(1)取健康人血，加入35倍浓度为0.01mol/L的PBS,3000r/min离心20min，弃上清、白细胞层和血小板层，然后用预冷PBS洗涤24次分离得到红细胞，每次洗涤加入PBS的量为红细胞体积35倍，在4。C下5000r/min离心15min，弃上清；(2)取所得红细胞加入4050倍体积的预冷0.Olmol/LTril-HC1，混合，4。C放置2h;然后9000r/min离心20min，弃上清；(3)重复步骤(2)至无肉眼可见的红细胞为止，得沉淀物；(4)取步骤(3)所得沉淀物用0.Olmol/LPBS稀释并调整红细胞膜浓度为10mg/mL30mg/mL即可。本发明所述的注射液应于-20'C保存。本发明所述的注射液使用时，应根据肿瘤患者的血型抗体选择含有不同血型红细胞膜蛋白的注射液，直接肿瘤内注射即可。由于血型抗体和抗原所导致的非特异性免疫反应、逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态与肿瘤的病理类型无关，只要能实现肿瘤内注射，即可达到杀灭肿瘤的目的，因此本发明注射液可适用于各种类型的实体瘤。本发明所述的注射剂针对单个病灶的治疗，可激发明显的抗肿瘤免疫，对远处的病灶同样有治疗作用；可单独应用也可以联合其他的抗肿瘤手段同时应用；适用于中晚期肿瘤也适用于早期肿瘤的治疗；毒副作用低，患者耐受性好，制备工艺简单、成本低，治疗方法简单。下面将通过动物实验来证明本发明的技术效果。1、红细胞膜的制备取健康成人A型、B型或AB型抗凝混合血加0.Olmol/LPBS(pH7.4),离心3000r/min，20min，弃上清和上清下白细胞、血小板层，用相当于红细胞压积4倍的预冷PBS(pH7.4)冼涤3次(4。C，5000r/min，15min)，加预冷的0.Olmol/LTril-HCl(pH7.4)与红细胞(V:V=40:1)混合，4'C放置2小时，再以9000r/min离心20min，弃上清(重复3次)至无肉眼可见红细胞为止。沉淀物加0.Olmol/LPBS(pH7.4)稀释，采用Lowry氏法测定红细胞膜蛋白含量，调整浓度为20mg/ml，置-20'C分装、保存。以上操作在无菌条件下进行。2、细胞培养将冻存的细胞迅速放入38。C水浴中，并不时摇动，在l'分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。1000r/min离心510分钟，弃去上层液，加入10X新生牛血清+RPMI-1640,接种浓度1X107L，37°C5%0)2培养箱1天换液，传代计数，取0.5ml细胞小鼠腹腔注射传代。3、瘤细胞接种抽取S180小鼠腹水，生理盐水无菌条件下制成单细胞悬液，调整细胞数为1X107个/ml计数活细胞数〉95%,于小鼠背部皮下接种O.lml。4、动物分组40只昆明小鼠按体重随机分为4组，每组10只。I组红细胞膜蛋白0.2ml腹腔免疫，采用相同剂量l,4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射0.lml腹水瘤细胞及0.lml红细胞膜蛋白。观测肿瘤生长情况。II组红细胞膜蛋白0.2ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射0.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续3天瘤内注射红细胞膜蛋白O.lml，观测肿瘤生长情况。III组红细胞膜蛋白0.2ml腹腔免疫，采用相同剂量l，4，7天免疫，最后一次免疫两周后背部皮下注射0.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续3天瘤内注射0.lml生理盐水，观测肿瘤生长情况。IV组小鼠不免疫，和同组其余小鼠相同时间接种肿瘤，背部皮下注射0.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续3天瘤内注射红细胞膜蛋白0.1ml，观测肿瘤生长情况。V组小鼠不免疫，和同组其余小鼠相同时间接种肿瘤，背部皮下注射0.lml腹水瘤细胞。两周后测量背部肿瘤大小并连续3天瘤内注射生理盐水0.1ml，观测肿瘤生长情况。瘤体积测定使用卡尺测量小鼠背部瘤块长(a)，短径(b)。瘤体积-abV2抑瘤率=(1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)X100%。5、结果表1人红细胞对荷S180肉瘤小鼠肿瘤的影响(cm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>如表1和图1所示，I组肿瘤生长较其他组缓慢，第14天肿瘤体积与第III、IV、V组肿瘤体积比较有统计学意义(P=0.001，P=0.046，P=0.000)。II组第14天肿瘤体积比III、V组肿瘤体积小，差异有统计学意义(P=0.004,P=0.001)，说明经过红细胞膜蛋白免疫后小鼠体内产生抗血型抗原抗体，肿瘤内注射红细胞膜蛋白后产生免疫反应，抑制肿瘤生长。in、v组肿瘤内注射生理盐水不能产生免疫反应，不能抑制肿瘤生长。因此，红细胞膜蛋白注射液经过免疫后序贯瘤内注射可抑制肿瘤生长，且这种生长与产生的免疫反应有关。n组第i4天肿瘤体积比iv组肿瘤体积小，但无统计学意义(p=o.ii)。由于在动物体内进行实验，应用的是人红细胞膜蛋白，人红细胞膜蛋白本身对于昆明小鼠就是异种蛋白，因此不进行免疫也可以产生免疫反应，进而在一定程度上抑制肿瘤生长。免疫后注射红细胞膜蛋白注射液组与不免疫注射生理盐水组比较抑瘤率达79.91%。免疫后注射红细胞膜蛋白注射液组与免疫后注射生理盐水组比较抑瘤率达82.37%。图1是各组小鼠肿瘤体积变化的折线图，其中+表示I组小鼠的肿瘤体积变化情况，表示II组小鼠的肿瘤体积变化情况，+表示III组小鼠的肿瘤体积变化情况，+表示IV组小鼠的肿瘤体积变化情况，+表示V组小鼠的肿瘤体积变化情况。具体实施方式例l1、本发明注射液的制备(1)取健康人A型血，加入4倍浓度为0.01mol/L的PBS，3000r/min离心20min，弃上清、白细胞层和血小板层，用相当于红细胞体积4倍的预冷PBS洗涤4次，每次均在4'C下5000r/min离心15min分离红细胞与上清；(2)取所得红细胞加入45倍体积的预冷0.01mol/LTri1-HC1，混合，4匸放置2h;然后9000r/min离心20min,弃上清；(3)重复步骤(2)至无肉眼可见的红细胞为止，得沉淀物；(4)取步骤(3)所得沉淀物用O.01mol/LPBS稀释，采用Lowry氏法测定红细胞膜蛋白含量，调整浓度为20mg/ml，分装、-20'C保存。例2(1)取健康人B型血，加入5倍浓度为0.Olmol/L的PBS，3000r/min离心20min，弃上清、白细胞层和血小板层，用相当于红细胞体积5倍的预冷PBS洗涤3次，每次均在4'C下5000r/min离心15min分离红细胞与上清；(2)取所得红细胞加入50倍体积的预冷0.01mon/LTril-HCl，混合，4"放置2h;然后9000r/min离心20min,弃上清；(3)重复步骤(2)至无肉眼可见的红细胞为止，得沉淀物；(4)取步骤(3)所得沉淀物用0.Olmol/LPBS稀释，釆用Lowry氏法测定红细胞膜蛋白含量，调整浓度为30mg/ml，分装、-2(TC保存。例3(1)取健康人AB型血，加入3倍浓度为0.Olmol/L的PBS,3000r/min离心20min，弃上清、白细胞层和血小板层，用相当于红细胞体积3倍的预冷PBS洗涤3次，每次均在4'C下5000r/min离心15min分离红细胞与上清；(2)取所得红细胞加入40倍体积的预冷0.01mol/LTri1-HC1，混合，4'C放置2h;然后9000r/min离心20min，弃上清；(3)重复步骤(2)至无肉眼可见的红细胞为止，得沉淀物；(4)取步骤(3)所得沉淀物用O.01mol/LPBS稀释，采用Lowry氏法测定红细胞膜蛋白含量，调整浓度为10mg/ml，，分装、-2(TC保存。权利要求1、异体人红细胞膜蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。2、一种治疗肿瘤的注射液，该注射液由人红细胞膜蛋白和缓冲液组成；其中，所述的人红细胞膜蛋白是从人血液中提取获得，在缓冲液中的浓度为10mg/mL30mg/mL，所述的缓冲液为PH值78的磷酸盐缓冲液或生理盐水。3、如权利要求2所述的注射液，其特征在于所述的人红细胞膜蛋白在缓冲液中的浓度为20mg/mL。4、权利要求2或3所述的注射液的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)取健康人血，加入35倍浓度为0.Olmol/L的PBS，3000r/min离心20min，弃上清、白细胞层和血小板层，然后用预冷PBS洗涤35次分离得到红细胞，每次洗涤加入PBS的量为红细胞体积35倍，在4。C下5000r/min离心15min，弃上清；(2)取所得红细胞加入4050倍体积的预冷0.Olmol/LTril-HCl，混合，4'C放置2h;然后9000r/min离心20min，弃上清；(3)重复步骤(2)至无肉眼可见的红细胞为止，取沉淀物；(4)取步骤(3)所得沉淀物用缓冲液稀释使红细胞膜浓度为10mg/mL30mg/mL即可。全文摘要本发明涉及人红细胞膜在制备治疗肿瘤药物中的用途。本发明还提供了一种体现所述用途的注射液，该注射液由人红细胞膜蛋白和缓冲液成，人红细胞膜蛋白在缓冲液中的浓度为10mg/mL～30mg/mL，所述的缓冲液为PBS或生理盐水。本发明所述注射剂可治疗各种实体肿瘤。文档编号A61K38/17GK101327317SQ20081002954公开日2008年12月24日申请日期2008年7月18日优先权日2008年7月18日发明者孙丽斌,张积仁,胡喜钢申请人:南方医科大学