专利名称：：一种酸性缓冲液在稳定花粉变应原活性中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物药物
技术领域：
，具体涉及一种酸性缓冲液在常温条件下长时间稳定花粉变应原活性中的应用。
背景技术：
：过敏性疾病是当今世界上最常见、最顽固的疾患之一，是一种严重威胁人类健康的疾病。过敏性疾病的发病率大约占人口的20%，从新生儿到中老年人各年龄段都有可能发生，没有明显的性别倾向，但有明显的遗传性倾向。速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。表现的病症主要为变应性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠胃炎以及湿疹、荨麻疹、斑疹、丘疹、划痕症、异位性皮炎、风团皮疹、皮肤搔痒等过敏性皮肤病。引起过敏的主要变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，其中花粉是一类重要的过敏原。据调査发现30%的过敏性疾病患者对花粉过敏。机体首次接触花粉变应原，体内产生IgE抗体，结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞，再次接触时，花粉变应原与上述细胞表面两个或两个以上的临近IgE分子搭桥结合，致肥大细胞脱颗粒，释放生物活性介质，引起鼻粘膜、眼结膜和支气管卡他炎症，甚至哮喘发作。花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。由于全球各地区地理环境及气候状况各异，加之绿化植物种类、使用农药除草剂等人为因素的影响，致敏花粉种类与空气含量分布具有明显的地区性差异。开展气传致敏花粉调査对当地花粉症的防治有指导意义。国内广泛采用的调查方法是暴片法将花粉取样器悬挂于空中，使气传花粉自然降落于载玻片上，然后进行计数和分类。较先进的方法是将一定积的空气通过压縮装置排出，使其中的花粉粒沉积在玻片上，然后再进行计数和分类。气传花粉调查内容包括当地植物种类调査、花粉计数、气象记录和花粉变应原皮肤试验等。根据上述资料总结该地区气传致敏花粉的分布及飘逸规律，探讨气候因素对其影响，结合皮肤试验确定优势致敏花粉种类，还可绘制花粉地图，建立花粉日历，为花粉症流行病学的研究提供基础资料。国外许多地区已进行了气传致敏花粉调査。美国阿拉斯加90年代初就建立了标准花粉日历。1997年Kosisky等报道了美国华盛顿哥伦比亚区树木优势气传致敏花粉调查结果橡树花粉粒计数50%以上，其次为松科、柏科、桑科、桦树等。一年中2月至7月空气花粉含量较大。西班牙马德里15年气传致敏花粉调査发现花粉计数依次为栎属17%、悬铃木属15%、乔木科15%、柏科11%、橄榄属9%、松属7%、杨属4%、车前属4%;花粉变应原皮肤试验结果牧草类94%、橄榄属61%、车前属53%、悬铃木属52%、柏科20%。由以上资料可见，尽管有些花粉在空气中含量大，但花粉变应原皮肤试验阳性率不高，可能与这些花粉蛋白的致敏性较弱有关；空气含量低而变应原皮肤试验阳性率高者可能系这些花粉蛋白的致敏性强或与其它花粉变应原间存在交叉反应；某些当地罕见花粉的皮肤试验阳性率较高，推测系交叉反应所致。在气传致敏花粉调査与变态反应临床工作中，不断发现一些新花粉变应原。早在50年代以前，变态反应学者认为豚草花粉系我国花粉症的主要致敏原，但经调查发现我国豚草生长较少，且豚草花粉变应原皮肤试验阳性率不高，而蒿属花粉是我国花粉最重要的致敏原。1995年叶世泰等报道空气中萚草花粉计数仅次于蒿属花粉，其皮肤试验及血清特异性IgE(slgE)阳性率分别为76%和67%，认为萚草花粉是中国花粉症的另一重要致敏原。1997年Varela等根据悬铃木属花粉变应原皮肤试验、slgE测定及免疫印迹等资料提出悬铃木属是马德里地区花粉症的重要致敏原，其主要致敏成分是一种分子量为17kd的蛋白。在欧洲，油菜生长普遍，曾有学者提出其花粉可能系一新的潜在致敏原。但Fell等研究发现，当地花粉症对油菜花粉过敏者不及0.2%。随花粉变应原研究的不断深入及地球地理气候因素的变迁，可能不断涌现出新花粉变应原，而一些现在认为重要的花粉变应原有待进一步证实，有些亦可能被淘汰。关于过敏性疾病的治疗国内外都还不能完全解决，目前主要的预防和治疗措施包括避免接触变应原、对症药物治疗和特异性免疫治疗。1998年WHO正式宣布检测变应原并进行特异性免疫治疗是唯一可以影响过敏性疾病自然进程的对因治疗方法，并可防止新的过敏发生。特异性免疫治疗法是将不能避免的并经皮肤试验或其他方法证实或怀疑的主要抗原性物质(变应原)，制成一定浓度的变应原制剂，以逐渐递增剂量及浓度的方法进行注射或舌下含服，通过反复使病人接触特异性抗原，促使体内产生相应的抗体。这类抗体属于IgG型，当这些特异性抗体在体液中提高之后，如再度接受外来特异性过敏原时，此类抗体首先与之结合，与体内原连续脱敏治疗以后逐渐下降，到过敏反应阈值以下时，即能防止过敏反应的发生，因而达到脱敏的目的。如果确定过敏原是花粉，所用的变应原制剂是从天然花粉中提取的变应原，制成一定浓度的溶液，或者经吸附剂或佐剂将其修饰后制成的用于诊断、预防和治疗过敏病的生物产品。然而，由于花粉变应原物质本身的组成与结构复杂，易受物理或化学因素的影响而失去活性、降低效价。因此，为了确保用于特异性免疫治疗的花粉变应原药物的疗效，花粉变应原药物一般都不能在常温下长期保存，其运输也必须在低温环境中进行，这给储藏、使用和运输带来了极大的不便。因此，本领域中迫切需要提供一种安全、廉价、高效的能在常温条件下长时间稳定花粉变应原活性的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种安全、廉价、高效的能在常温条件下长时间稳定花粉变应原活性的方法。本发明的另一目的是提供一种花粉变应原药物组合物，该药物组合物可以在常温条件下储藏、使用和运输。为实现上述目的，本发明涉及一种pH值为3.0-6.0(更佳的pH值为4.0-5.0)酸性缓冲液在稳定花粉变应原活性中的应用。在一个优选的实施方案中，所述pH值为3.06.0(更佳的pH值为4.05.0)的酸性缓冲液选自磷酸氢二钠-拧檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液。在一个更优选的实施方案中，所述酸性缓冲液选自pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-拧檬酸缓冲液、pH4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。在一个较佳的实施方案中，所述花粉变应原的来源选自蒿属花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、萚草属花粉、藜属花粉、苋属花粉、木麻黄属花粉、桦木属花粉、松属花粉、云杉属花粉、柳杉属花粉、悬铃木属花粉或其组合。在另一个较佳的实施方案中，所述花粉变应原呈液态形式。本发明还提供了一种药物组合物，它含有至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.0~6.0(更佳的pH值为4.05.0)酸性缓冲液、以及药学上可接5受的载体。在一个实施方案中，本发明的药物组合物是由至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.06.0(更佳的pH值为4.0-5.0)酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体组成。在一个较佳的实施方案中，所述pH值为3.06.0(更佳的pH值为4.0-5.0)的酸性缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液。在一个还要佳的实施方案中，所述酸性缓冲液选自pH3.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-拧檬酸缓冲液、pH4.0的拧檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述花粉变应原的来源选自蒿属花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、萚草属花粉、藜属花粉、苋属花粉、木麻黄属花粉、桦木属花粉、松属花粉、云杉属花粉、柳杉属花粉、悬铃木属花粉或其组合。在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物呈液态。在还有一个优选的实施方案中，所述药物组合物的剂型选自口服液、注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂。本发明的优点在于，在酸性条件下(优选pH值为3.0~6.0，更优选pH值为4.0~5.0)，花粉变应原可以在常温条件下长时间保持变应原活性的稳定。这大大方便了患者，使其可以在常温条件下储藏、使用、携带花粉变应原药物。具体实施方案具体而言，本发明涉及一种pH值为3.06.0(更佳的pH值为4.05.0)的酸性缓冲液在稳定花粉变应原活性中的应用。在本发明的一个优选实施方案中，所述花粉变应原的来源选自蒿属花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、萚草属花粉、藜属花粉、苋属花粉、木麻黄属花粉、桦木属花粉、松属花粉、云杉属花粉、柳杉属花粉、悬铃木属花粉或其组合。本发明所述变应原可以呈液体形式或固体形式(优选液体形式的变应原)；可以是从商业途径购买，也可以使用任何现有技术中不使变应原降解或失活的方式从天然物质或动植物中提取的方法获得，还可以通过基因工程手段获得任何种类的具有生物活性(变应原活性)的"重组变应原"。发明人在长期的变应原药物研发中，一直致力于寻找能使变应原在常温条件下长时间稳定活性的方法。尤其是花粉变应原药物，因其来源复杂，提取工艺不够成熟，花粉变应原易受物理或化学因素的影响而失去活性、降低效价。所以常规的做法是在低温(4°C，甚至-20'C)条件下储藏、运输，这给使用该药物的患者带来了极大的不便，也不利于脱敏治疗的应用、推广。天然蛋白质的严密结构在pH值严重偏离其等电点时，蛋白特定的空间结构易被破坏，从而导致生物学活性的丧失，易被蛋白酶分解。因此，pH值是影响蛋白生物活性的重要因素。选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定十分重要。经过长期的实验筛选，发明人发现，酸性缓冲液(优选pH值为3.06.0，更优选pH值为4.05.0)的使用克服了上述花粉变应原药物只能在低温条件下储藏、运输的不足，使患者可以在常温条件下方便地使用、储藏、携带花粉变应原药物。在本发明的一个较佳实施方案中，所述pH值为3.0~6.0(更佳的pH值为4.05.0)的酸性缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液，更优选自pH3.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液。本发明中所使用的"缓冲液"是本领域技术人员所熟知的，并可以安全用于药学制剂中，包括但不限于甘氨酸-盐酸缓冲液，邻苯二甲酸-盐酸缓冲液，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，拧檬酸_氢氧化钠-盐酸缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，Tris-盐酸缓冲液，硼酸-硼砂缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，硼砂-氢氧化钠缓冲液，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，PBS缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-氯化钠缓冲液)等。本领域技术人员可以通过市售获得以上缓冲液，也可根据需要配制一定pH值的缓冲液。除非另有所述，本发明中所述的"pH值"都是在25'C条件下所测的pH值。在本发明中，假设花粉变应原制剂最初的活性为100%，在一定条件下经过一段时间，使用同样的检测手段，其活性改变为最初活性的70%以上(优选80%以上，更优选90%以上)，就认定该花粉变应原的活性是"稳定"的，其用于特异性免疫治疗的疗效也是可以得到保证的。需要特别指出的是，"变应原活性"的稳定性不同于一般所谓的酶蛋白或者活性蛋白的热稳定性。本发明中的术语"变应原活性"是指可以使机体产生变态反应，并引起组织损伤或生理功能紊乱。变应原引起变态反应的具体过程是变应原进入机体后，诱导B细胞产生IgE抗体。IgE与耙细胞有高度的亲和力，牢固地吸附在肥大细胞、嗜碱粒细胞表面。当相同的变应原再次进入致敏的机体，与IgE抗体结合，就会引发细胞膜的一系列生物化学反应，启动两个平行发生的过程脱颗粒与合成新的介质。运用花粉变应原药物进行脱敏治疗，即在非急性期使患者与花粉变应原制剂反复接触，剂量由小到大逐渐递增，至最佳维持剂量，提高患者对其耐受性，从而达到控制或减轻过敏症状。当然，花粉变应原药物中的花粉变应原组分必需是具有前文所述的稳定的"变应原活性"，否则，脱敏治疗的疗效就不能保证。本发明还提供了一种药物组合物，它含有至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.06.0(更佳的pH值为4.0-5.0)酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体。此处的术语"含有……"指的是该药物组合物中还可以含有任何其它组分，这些组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分对于本发明的药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果没有实质性的影响，以及不改变本发明药物组合物中酸性缓冲液的pH值与缓冲能力即可。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物是由至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.0~6.0(更佳的pH值为4.05.0)酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体组成。术语"药学上可接受的载体"应当与本发明药物组合物中的变应原相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在治疗过敏性疾病方面的效果，或者改变本发明药物组合物中酸性缓冲液的pH值与缓冲能力。可作为药学上可接受的载体包括但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖、蔗糖；淀粉，如玉米淀粉、土豆淀粉；纤维素或其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油、可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇；氨基己酸，海藻酸；乳化剂，如吐温；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；药用防腐剂；无热原水；等渗盐溶液等，或其组合。在本发明中，优选的药学上可接受的载体包括多元醇与药用防腐剂。本发明中多元醇的作用是赋予变应原药物适宜的渗透张力。多元醇包括但不限于，丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇等。多元醇的浓度优选20%80%(v/v)，更优选30%70%(v/v)，还要优选40%60%(v/v)，最优选45%~55%(v/v)。在本发明的一个实施方案中，使用50。/c)(v/v)的甘油。本发明中的药用防腐剂是本领域技术人员所熟知的，它的作用是防止或抑制病原微生物的生长。药用防腐剂包括，但不限于，苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类(尼泊金类)、苯甲醇、苯乙醇等，或其组合。药用防腐剂的用量一般与防腐剂的种类，药物的种类、剂型、pH值等多种因素有关。优选药用防腐剂的浓度为0.0P/。3.0。/o(w/v)。在本发明的一个实施方案中，pH4.0左右(较佳pH4.0±0.5，更佳pH4.0土0.3，还要佳pH4.0士0.2，最佳pH4.0土0.1)的花粉变应原舌下含服剂选用了0.1。/。(w/v)苯甲酸作为药用防腐齐U。在本发明的另一个实施方案中，pH5.0左右(较佳pH5.0土0.5，更佳pH5.0士0.3，还要佳pH5.0士0.2，最佳pH5.0±0.1)的花粉变应原舌下含服剂选用了0.05。/。(w/v)尼泊金乙酯作为药用防腐剂。除非另有具体描述，本文以及所附权利要求中涉及"酸性缓冲液"时均指采用"缓冲有效量"的酸性缓冲液。术语"缓冲有效量"是指所述酸性缓冲液的浓度足以使所述药物组合物的pH值维持在一个特定pH值(优选pH3.06.0，更优选pH值4.05.0)±0.5(更佳±0.3，还要佳±0.2，最佳土O.l)个pH单位内。例如但不限于，pH4.0士0.2(艮卩pH3.84.2)'pH5.0士0.3(即pH4.75.3)等。具体所述酸性缓冲液的浓度与酸性缓冲液的种类、pH值、整个药物组合物的具体组成等因素有关，其可由本领域技术人员根据有限次的常规实验来方便地确定。一般，所述酸性缓冲液的浓度为5mM500mM(优选10mM300mM，更优选20mM200mM，还要优选30mM100mM)。在本发明一个实施方案中，所使用的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液是由0.2M磷酸氢二钠溶液与0.1M柠檬酸溶液配制而成的。在本发明的另一个实施方案中，所使用的柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液是由0.1M柠檬酸溶液与0.1M柠檬酸钠溶液配制而成的。在本发明还有一个实施方案中，所使用的乙酸-乙酸钠缓冲液是由0.3M乙酸溶液与0.2M乙酸钠溶液配制而成的。在配制以上酸性缓冲液时，所述两种溶液的具体比例是本领域技术人员所熟知的；或者，也可以根据所要配制酸性缓冲液的具体pH值，由本领域技术人员根据有限次的常规实验方便地确定。在本发明中，除非另有所述，术语"花粉变应原"与"来源于花粉的变应原"含义相同，可互为替换使用。花粉的来源包括但不限于，蒿属花粉(^"tom'^z)、豚草属花粉(」m6m^a)、蓖麻属花粉C^dm^)、萚草属花粉(/^mm/w力、藜属花粉(C/ze"/;WMm)、苋属花粉(iZc/"w力、木麻黄属花粉(Casuarina)、桦木属花粉(SWw/a)、松属花粉(A'm^)、云杉属花粉(尸/cea)、柳杉属花粉(0，to腿^)、悬铃木属花粉(P/atom^等。本领域技术人员可以是从商业途径购买来源于花粉的变应原，也可9以使用任何现有技术中不使花粉变应原降解或失活的方式从天然花粉中提取的方法获得，或者使用基因工程手段获得的具有生物活性(变应原活性)的花粉变应原，即"重组变应原"。应当理解，本发明所述的"花粉变应原"或"来源于花粉的变应原"可以是单一成分的花粉变应原(例如Artv4重组变应原)，也可以是来源相同(单一来源)的花粉变应原混合物(例如艾蒿花粉变应原混合物)，在不影响变应原自身活性和效价的前提下，也可以是多种花粉来源的、以任何方式混合的花粉变应原组合物(例如艾蒿花粉变应原与豚草花粉变应原的组合物)。在本发明的一个实施方案中，所述变应原的来源是艾蒿花粉，该变应原可用以下方法制得用丙酮对艾蒿花粉进行脱脂直至静置后上层丙酮为无色透明，除去丙酮，对脱脂后的花粉样品进行粉碎，加入碳酸盐一盐水提取液提取40-60小时，过滤，得到的滤液为艾蒿花粉变应原浸提液。在本发明的另一个实施方案中，所述变应原的来源是萚草花粉，该变应原可用以下方法制得用丙酮对揮草花粉进行脱脂直至静置后上层丙酮为无色透明，除去丙酮，对脱脂后的花粉样品进行粉碎，加入碳酸盐一盐水提取液提取40-60小时，过滤，得到的滤液为萚草花粉变应原浸提液。在本发明的还有一个实施方案中，所述变应原的来源是法国梧桐花粉，该变应原可用以下方法制得用丙酮对法国梧桐花粉进行脱脂直至静置后上层丙酮为无色透明，除去丙酮，对脱脂后的花粉样品进行粉碎，加入碳酸盐一盐水提取液提取40-60小时，过滤，得到的滤液为法国梧桐花粉变应原浸提液。对于本发明药物组合物中花粉变应原的浓度并没有太多限制，只要其能够起到有效治疗即可(即治疗有效量的花粉变应原)。蛋白类药物制剂中所含生物活性蛋白浓度较低时，易出现蛋白降解、生物大分子变性或蛋白被管壁吸附等现象。所以，一般而言，药物组合物中变应原的浓度越高则其生物活性(变应原活性)越稳定。另外，变应原药物的蛋白浓度与变应原的种类、变应原提取的方法、变应原药物的剂型等诸多因素有关。一般，所述药物组合物中花粉变应原(浸提液)的总蛋白浓度优选为0.01ug/ml~10mg/ml，更优选为0.1ug/ml~lmg/ml。根据特异性免疫治疗(脱敏治疗)的要求，本发明的药物组合物在临用前还可被稀释成体积比1:10至l:100000000范围内的多个浓度的制剂；或者在制备制剂时就按相应比例稀释。此外，本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂优选口服液、注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂等10多种液态剂型。在本发明中，本领域技术人员可以根据需要，将固体粉末状的花粉变应原溶解在本发明所述缓冲有效量的pH值为3.0~6.0(更佳的pH值为4.0~5.0)的酸性缓冲液中，再混入药学上可接受的载体(优选多元醇与药用防腐剂)制成药物制剂。也可以直接使用液态形式的花粉变应原浸提液，但由于花粉类材料是偏酸性的，为了提高浸提效率，花粉变应原的提取一直采用碱性缓冲液，因此，在制备本发明所述药物组合物时，需要用本发明所述的酸性缓冲液替换碱性浸提液，再混入药学上可接受的载体(优选多元醇与药用防腐剂)制成药物制剂。其中替换缓冲液的方法是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于，超滤、透析等方法。替换缓冲液的方式要尽可能温和，最大限度保留原有花粉变应原的生物活性(变应原活性)。在本发明的一个实施方案中，首先用碱性缓冲液浸提花粉变应原，再用超滤的方法将pH5.0的拧檬酸-拧檬酸钠缓冲液替换碱性浸提液，并且在配制舌下含服剂时再使用pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释上述原液，最后加入尼泊金乙酯(终浓度0.05。/。w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂。在本发明的另一个实施方案中，首先用碱性缓冲液浸提花粉变应原，再用超滤的方法将pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替换碱性浸提液，并且在配制舌下含服剂时再使用pH4.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液稀释上述原液，最后加入苯甲酸(终浓度O.P/。w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂。在本发明的还有一个实施方案中，首先用碱性缓冲液浸提花粉变应原，再用超滤的方法将pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液替换碱性浸提液，并且在配制舌下含服剂时再使用pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释上述原液，最后加入苯甲酸(终浓度0.1%w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂。本发明实施例中制得的艾蒿花粉舌下含服剂在室温条件下(25°C)放置18个月后用于动物药效学实验。发明人建立了三种动物艾蒿花粉变应原过敏模型，艾蒿花粉舌下含服剂免疫治疗能明显减轻致敏豚鼠、致敏大鼠和致敏小鼠抗原攻击后引起过敏性鼻炎症状和鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞浸润；能明显降低豚鼠和大鼠气道高反应性，改善肺功能下降；能明显减轻致敏豚鼠、致敏大鼠和致敏小鼠抗原攻击后引起支气管肺泡炎症细胞聚集，尤其是嗜酸性粒细胞聚集反应。病理检査发现，艾蒿花粉舌下含服剂免疫治疗能明显减轻致敏豚鼠、致敏大鼠抗原攻击后引起肺组织嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的浸润。生化检查发现，艾蒿花粉舌下含服剂免疫治疗能明显降低致敏大鼠和致敏小鼠的血清IgE水平，也能显著降低大鼠血清IgG水平，但对小鼠清IgG水平无明显影响。长时间室温存放后，艾蒿花粉舌下含服剂中艾蒿花粉变应原的活性是稳定的，其免疫治疗的疗效也是肯定的，其作用机制可能与降低血清IgE和IgG含量，降低肺组织Th2细胞因子升高Thl细胞因子有关。下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例l不同pH值的艾蒿花粉变应原浸提液的制备(1)艾蒿花粉自然干燥至恒重；(2)丙酮脱脂数次，直至丙酮层无色；(3)丙酮彻底挥发后，经高速分散器对样品进行粉碎(3000g，30次，5s/次)，以上操作均在4'C下进行；(4)按每克花粉加入10mlcoca，s(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000ml)，于4'C浸泡48小时，期间用磁力搅拌器搅拌几次，每次20分钟；(5)浸出后离心取上清液，得到粗提液；(6)依次用0.45pm、0.22pm滤膜依次过滤，除去不溶性小颗粒物质；(7)浓缩将上述过滤后的浸提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，分别反复加入pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH4.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替换浸提缓冲液，除去小分子色素等杂质，并使得浸提液浓縮至原体积的1A0左右；(8)蛋白浓度测定对上述浓縮后的浸提液进行总蛋白浓度测定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)。并分别使用对应pH值的相应缓冲液稀释，调节蛋白浓度，使不同pH值的浸提液蛋白浓度相同(1.0mg/ml)。实施例2不同pH值的萚草花粉变应原浸提液的制备(1)萚草花粉自然干燥至恒重；(2)丙酮脱脂数次，直至丙酮层无色；(3)丙酮彻底挥发后，经高速分散器对样品进行粉碎(3000g，30次，5s/次)，以上操作均在4'C下进行；(4)按每克花粉加入10mlcoca's(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000ml)，于4。C浸泡48小时，期间用磁力搅拌器搅拌几次，每次20分钟；(5)浸出后离心取上清液，得到粗提液；12(6)依次用0.45pm、0.22pm滤膜依次过滤，除去不溶性小颗粒物质；(7)浓縮将上述过滤后的浸提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，分别反复加入pH3.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、pH4.0的柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、pH5.0的拧檬酸-拧檬酸钠缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液替换浸提缓冲液，除去小分子色素等杂质，并使得浸提液浓縮至原体积的1/10左右；(8)蛋白浓度测定对上述浓縮后的浸提液进行总蛋白浓度测定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)。并分别使用对应pH值的相应缓冲液稀释，调节蛋白浓度，使不同pH值的浸提液蛋白浓度相同(1.0mg/ml)。实施例3不同pH值的法国梧桐花粉变应原浸提液的制备(1)法国梧桐花粉自然干燥至恒重；(2)丙酮脱脂数次，直至丙酮层无色；(3)丙酮彻底挥发后，经高速分散器对样品进行粉碎(3000g，30次，5s/次)，以上操作均在4'C下进行；(4)按每克花粉加入10mlcoca，s(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000ml)，于4。C浸泡48小时，期间用磁力搅拌器搅拌几次，每次20分钟；(5)浸出后离心取上清液，得到粗提液；(6)依次用0.45^m、0.22pm滤膜依次过滤，除去不溶性小颗粒物质；(7)浓縮将上述过滤后的浸提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，分别反复加入pH3.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替换浸提缓冲液，除去小分子色素等杂质，并使得浸提液浓縮至原体积的1/10左右；(8)蛋白浓度测定对上述浓縮后的浸提液进行总蛋白浓度测定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)。并分别使用对应pH值的相应缓冲液稀释，调节蛋白浓度，使不同pH值的浸提液蛋白浓度相同(1.0mg/ml)。实施例4变应原活性的测定将待测花粉变应原分别与其对应的标准血清混合物(浙江我武生物科技有限公司提供)等体积混合，混合均匀，同时用对应的标准血清混合物作为对照，在37'C温箱温育1小时，然后取出静置于4'C冰箱中过夜(9一12小时)。将4'C过夜后的样品转移至已灭菌的玻璃试管内，用UnicaplOO仪器(瑞典法玛西亚公司)进行slgE含量测定。(根据瑞典法玛西亚公司的ImmunCAP诊断系统，UniCAP自动体外检测过敏原系统说明书操作。)艾蒿花粉标准血清混合物测得的SIgE相对含量为82.52KUA/L，萚草花粉标准血清混合物测得的slgE相对含量为84.78KUA/L。法国梧桐花粉标准血清混合物测得的slgE相对含量为83.55KUA/L。标准血清混合物含有针对某种变应原的特异性IgE(slgE)。待测品中的变应原活性成分会与血清中的sIgE结合生成复合物，使血清中游离的sIgE浓度降低，再用UniCAP系统检测血清中slgE的含量。待测品中变应原活性越高，标准血清混合物与待测品作用后，其sIgE浓度就会降的越低。此时用UniCAP系统检测会发现标准血清混合物中游离的slgE会相应减少，通过比较待测品加入前后标准血清混合物sIgE浓度的变化就可以得到待测品中变应原的活性。在血清中slgE未被待测品中变应原完全结合的情况下，此过程中变应原活性与血清slgE浓度的降低程度是正相关的。根据sIgE的抑制率可以得到待测品中变应原的活性，slgE的抑制率越高，待测品中变应原活性越高。实施例5艾蒿花粉变应原稳定性实验将实施例1中得到的不同pH值的艾蒿花粉变应原浸提液与甘油、防腐剂等配制成以下配方的混合液配方1:pH3.0的艾蒿花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;配方2:pH4.0的艾蒿花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;配方3:pH5.0的艾蒿花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH5.0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液加至1000ml;配方4:pH6.0的艾蒿花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;对照1:使用实施例1中(1)—(6)的方法制得的艾蒿花粉变应原浸提液5ml(浸提液蛋白浓度1.0mg/ml)，甘油500ml，硫柳汞O.lg，用生理盐水加至1000ml;对照2:使用实施例1中(1)—(6)的方法制得的艾蒿花粉变应原浸提液5ml(浸提液蛋白浓度1.0mg/ml)，甘油500ml，苯酚4g，用碱性的coca's液(5.0g氯化钠、2.75g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000ml)加至1000ml;将上述配方的混合液过滤除菌之后分别放置在25°C、4CTC条件下进行稳定性试验，于3、6、9、12、18、24个月取样品，检测变应原活性(实施例4)与pH值(置于4(TC条件下的样品，使其自然冷却到25i:，再检测pH值)。以O个月时14的活性为100%，其他时间测定的数值与O个月时的数值对比进行比值分析，检测不同时间点的活性变化，判断不同pH值的缓冲液对艾蒿花粉变应原活性的影响。本实施例中不同配方的花粉变应原活性的稳定性及pH值测定结果见表1、表2。从实验结果可知，不同配方混合液的pH值都很稳定，且在酸性条件(pH值为3.06.0)下，艾蒿花粉变应原的活性可以长时间保持稳定。而使用生理盐水或者coca's液稀释艾蒿花粉变应原浸提液的对照配方混合液，其pH值的波动范围较大，而且也无法有效的稳定艾蒿花粉变应原的活性。表l不同pH值对艾蒿花粉变应原活性的影响(25°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例6萚草花粉变应原稳定性实验将实施例2中得到的不同pH值的萚草花粉变应原浸提液与甘油、防腐剂等配制成以下配方的混合液配方1:pH3.0的萚草花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;配方2:pH4.0的萚草花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加至1000ml;配方3:pH5.0的萚草花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加至1000ml;配方4:pH6.0的萚草花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;将上述配方的混合液过滤除菌之后分别放置在25°C、4(TC条件下进行稳定性试验，于3、6、9、12、18、24个月取样品，检测变应原活性(实施例4)与pH值(置于4(TC条件下的样品，使其自然冷却到25"C，再检测pH值)。以O个月时的活性为100%，其他时间测定的数值与O个月时的数值对比进行比值分析，检测不同时间点的活性变化，判断不同pH值的缓冲液对萚草花粉变应原活性的影响。本实施例中不同配方的花粉变应原活性的稳定性及pH值测定结果见表3、表4。从实验结果可知，不同配方混合液的pH值都很稳定，且在酸性条件(pH值为3.06.0)下，萚草花粉变应原的活性可以长时间保持稳定。表3不同pH值对萚草花粉变应原活性的影响(25°C)活性(。/。)/pH值配方1配方2配方3配方40月薩pH3.02100/pH3.95100/pH4.91100/pH5.883月99.21/pH3.0899.37/pH3.9198.57/pH4.8897.34/pH5.816月96.85/pH3.1397.25/pH3.8795.49/pH4.8395.73/pH5.779月97.59/pH3.1998.00/pH3.8497.60/pH4.7993.28/pH5.7312月95.77/pH3.2495.48/pH3.8093.84/pH4.74卯.35/pH5.7018月90.34/pH3.2790.97/pH3.7588.87/pH4.7085.20/pH5.6824月87.86/pH3.3085.78/pH3.7284.32/pH4.6781.66/pH5.6116表4不同pH值对萚草花粉变应原活性的影响(40°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例7法国梧桐花粉变应原稳定性实验将实施例3中得到的不同pH值的法国梧桐花粉变应原浸提液与甘油、防腐剂等配制成以下配方的混合液配方l:pH3.0的法国梧桐花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;配方2:pH4.0的法国梧桐花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，苯甲酸lg，用pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液加至1000ml;配方3:pH5.0的法国梧桐花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液加至1000ml;配方4:pH6.0的法国梧桐花粉变应原浸提液5ml，甘油500ml，尼泊金乙酯0.5g，用pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加至1000ml;将上述配方的混合液过滤除菌之后分别放置在25°C、40'C条件下进行稳定性试验，于3、6、9、12、18、24个月取样品，检测变应原活性(实施例4)与pH值(置于40'C条件下的样品，使其自然冷却到25'C，再检测pH值)。以O个月时的活性为100%，其他时间测定的数值与O个月时的数值对比进行比值分析，检测不同时间点的活性变化，判断不同pH值的缓冲液对法国梧桐花粉变应原活性的影响。本实施例中不同配方的花粉变应原活性的稳定性及pH值测定结果见表5、表6。从实验结果可知，不同配方混合液的pH值都很稳定，且在酸性条件(pH值为3.06.0)下，法国梧桐花粉变应原的活性可以长时间保持稳定。表5不同pH值对法国梧桐花粉变应原活性的影响(25°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例8花粉变应原舌下含服剂的配制将实施例1中pH4.0的艾蒿花粉变应原浸提液用pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释，根据治疗所需浓度，稀释成l:10(V/V)至l:100000000(V/V)范围内的多个浓度的制剂；再加入苯甲酸(终浓度0.1%w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂，分装、灌封；过滤除菌，即得舌下含服剂。将实施例2中pH5.0的萚草花粉变应原浸提液用pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释，根据治疗所需浓度，稀释成l:10(V/V)至l:100000000(V/V)范围内的多个浓度的制剂；再加入尼泊金乙酯(终浓度0.05。/。w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂，分装、灌封；过滤除菌，即得舌下含服剂。将实施例3中pH4.0的法国梧桐花粉变应原浸提液用pH4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，根据治疗所需浓度，稀释成l:10(V/V)至l:100000000(V/V)范围内的多个浓度的制剂；再加入苯甲酸(终浓度0.1%w/v)、等体积甘油，制成变应原药物制剂，分装、灌封；过滤除菌，即得舌下含服剂。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。权利要求1.一种pH值为3.0～6.0酸性缓冲液在稳定花粉变应原活性中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pH值为3.06.0酸性缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液。3.根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述花粉变应原的来源选自蒿属花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、萚草属花粉、藜属花粉、苋属花粉、木麻黄属花粉、桦木属花粉、松属花粉、云杉属花粉、柳杉属花粉、悬铃木属花粉或其组合。4.根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述花粉变应原呈液态形式。5.—种药物组合物，其特征在于，它含有至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.06.0的酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体。6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.06.0酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体组成。7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述pH值为3.0~6.0酸性缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液。8.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述花粉变应原的来源选自蒿属花粉、豚草属花粉、蓖麻属花粉、萚草属花粉、藜属花粉、苋属花粉、木麻黄属花粉、桦木属花粉、松属花粉、云杉属花粉、柳杉属花粉、悬铃木属花粉或其组口。9.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈液态。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自口服液、注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂。全文摘要本发明公开了一种pH值为3.0～6.0(更佳的pH值为4.0～5.0)酸性缓冲液在稳定花粉变应原活性中的应用。本发明还公开了一种药物组合物，它含有至少一种来源于花粉的变应原、缓冲有效量的pH值为3.0～6.0酸性缓冲液、以及药学上可接受的载体。该药物组合物可以在常温下储藏、使用和运输。文档编号A61P37/00GK101496901SQ20081003347公开日2009年8月5日申请日期2008年2月3日优先权日2008年2月3日发明者秦承学申请人:浙江我武生物科技有限公司