专利名称：一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及无机材料表面改性技术，特别涉及人工器官材料Ti-0薄膜表 面的生物化改性方法。
背景技术：
钛基金属已被广泛应用于生物医学领域，而其表面自然形成的Ti-0薄层 被认为是钛具有良好生物相容性的主要原因。但是，就临床应用而言，钬基金 属的生物相容性远未满足临床需要。
在生物材料表面进行生物大分子固定已经成为提高其表面生物相容性的 最优方法之一，另外，在材料表面引入细胞膜受体所能识别的生物特异性蛋白， 将促进受体-配体作用，改善生物相容性。层粘连蛋白(Ln)是胚胎发育中出 现最早的细胞外基质成分，因此材料表面固定Ln生物分子可促进细胞的粘附 和生长。但层粘连蛋白的长久稳定固定通常要求材料表面具有可与其发生反应 的活性基团，如羟基(-0H)、氨基(-NH2)、羧基(-C00H );而Ti-0薄膜为 无机材料，无法直接与生物分子发生作用而将其固定。目前也无将层粘连蛋白 固定到Ti-O薄膜的文献才艮道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法， 用该种方法可在Ti-O薄膜表面牢固固定层粘连蛋白，Ti-O薄膜具有良好的血 液相容性和内皮细胞相容性。
本发明实现以上发明的目的采用的技术方案是， 一种在Ti-0薄膜表面固 定层粘连蛋白的方法，其步骤为
A、 Ti-O薄膜清洗将Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸馏水进行超声波清 洗，获得洁净的薄膜表面，干燥；
B、 强碱活化在50-80。C振荡条件下，将洁净的Ti-0薄膜放入浓度为 8-12% WT的NaOH溶液中浸泡1-5小时，然后用双蒸水冲洗，再干燥；
C、 强酸活化将98% (WT) H2S04与30% (WT) HA按体积比1: 0. 5-3配制
混合液，在60-95。C下，将B步获得的Ti-0薄膜用该混合液浸泡l-4小时，然 后用双蒸水冲洗，再干燥；
D、 偶联配制1 - 3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE )的乙醇溶液作为 偶联剂溶液，在50-7(TC下，将C步获得的Ti-0薄膜浸泡到该偶联剂溶液中 24-72小时，然后回流漂洗2-6小时，之后在蒸馏水中超声清洗，从而在Ti-0 薄膜表面形成偶^:剂单层，然后干燥；
E、 生物分子固定配制20-60mg/L浓度的层粘连蛋白溶液，滴入5-15mL/L 的水溶性碳二亚胺(EDC)催化剂，并用0. 22ijm虑膜过滤；在无菌条件下，将 D步获得的Ti-0薄膜浸泡入该蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒温孵化箱静置6-24 小时，使层粘连蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸盐缓冲液中振荡漂洗， 常温晾干，即得。
参见说明书附图1，本发明的反应过程与机理是，通过强碱与强酸及HA 溶液浸泡，在Ti-O薄膜表面获得轻基，然后通过r-氨丙基三乙氧基硅烷的乙 醇偶联剂溶液浸泡，使Ti-0薄膜表面的羟基与偶联剂的乙氧基团反应，而在 Ti-O薄膜表面形成偶联剂单层，最后，通过在加有水溶性碳二亚胺(EDC)催 化剂的层粘连蛋白溶液中浸泡，使偶联剂的氨基与层粘连蛋白的羧基发生反 应，从而在Ti-O薄膜表面固定上层粘连蛋白单层。
与现有技术相比，本发明的有益效果是
一、 创造性的选择出活化方式、偶联剂和生物分子，从而借助特别的表面 活化-偶联-生物分子固定的方法，先将Ti-0薄膜表面活化形成羟基，再通 过羟基构建一层偶联剂中间层，该中间层与Ti - 0薄膜和生物分子层均能形成 化学键合。这样， 一方面使层粘连蛋白在Ti-0薄膜表面的固定均匀牢固，另 一方面使得Ti-0薄膜具有优异的生物相容性。试验也证明，用同样方法固定 纤粘连蛋白，其血小板粘附数量增加，血液相容性差，而本发明方法在Ti-0 薄膜表面固定层粘连蛋白后同时具有良好的血液相容性和内皮细胞相容性，即 生物相容性好。
二、 由于整个过程均采用浸泡方式进行，因此可以实现工业上具有复杂体 型结构的生物医用装置如人工心脏瓣膜、血管支架、血栓滤器等表面层粘连蛋 白生物化修—饰，其适用范围广。
三、 由于整个过程操作简单，无需特殊昂贵的设备，其制作成本低。
下面结合附图和实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。
图1为本发明方法各步骤在Ti-0薄膜表面所对应产生的共价接枝过程的 示意图。
图h为未固定层粘连蛋白的Ti-O薄膜表面粘附的血小板的扫描电镜图。 图化为用本发明方法園定层粘连蛋白后的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的 扫描电镜图。
图3a为未固定层粘连蛋白的Ti-0薄膜表面生长的内皮细胞的扫描电镜图。
图3b为用本发明方法中固定层粘连蛋白后的Ti-O薄膜表面生长的内皮细 胞的扫描电镜图。
具体实施例方式
实施例1
参见图1,本发明的第一种具体实施方式
是， 一种在Ti-0薄膜表面固定 层粘连蛋白的方法，其步骤为
A、 Ti-0薄膜清洗将锐钬矿晶型Ti-0薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸馏水 进行超声波清洗，分别IO分钟，获得洁净的薄膜表面，放入净化室干燥箱中 进行干燥；
B、 强碱活化在50。C振荡条件下，将洁净的Ti-0薄膜放入浓度为10% WT 的NaOH溶液中浸泡3小时，然后用双蒸水冲洗，再真空干燥；
C、 强酸活化将98% (WT) H2S(h与30% (WT) HA按体积比1: 1配制混合 液，在9(TC下，将B步获得的Ti-0薄膜用该混合液浸泡2小时，然后用双蒸 水冲洗，再真空干燥；
D、 偶联配制1% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作为偶 联剂溶液,在6(TC下，将C步获得的Ti-0薄膜浸泡到该偶联剂溶液中48小时， 然后回流漂洗4小时，之后在蒸馏水中超声清洗3分钟，从而在Ti-0薄膜表 面形成偶联剂单层，然后真空干燥；
E、 生物分子固定配制40mg/L浓度的层粘连蛋白溶液，滴入10mL/L的 水溶性碳二亚胺(EDC )催化剂，并用0. 22pm虑膜过滤；在无菌条件下，将D 步获得的Ti-0薄膜浸泡入该蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒温孵化箱静置12小
时，使层粘连蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸盐緩冲液中振荡漂洗3 分钟，常温晾干，即得。 实施例2
一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法，其步骤为
A、 Ti-0薄膜清洗将以锐钛矿为主的锐钛矿与金红石混合晶型Ti-0薄 膜依次用丙酮、乙醇、蒸馏水进行超声波清洗，分别8分钟，获得洁净的薄膜 表面，放入净化室干燥箱中进行干燥；
B、 强碱活化在80。C振荡条件下，将洁净的Ti-0薄膜放入浓度为8% WT 的NaOH溶液中浸泡1小时，然后用双蒸水冲洗，再真空干燥；
C、 强酸活化将98% (WT) HzS04与30% (WT) HA按体积比1: 3配制混合 液，在60'C下，将B步获得的Ti-0薄膜用该混合液浸泡4小时，然后用双蒸
水冲洗，再真空干燥；
D、 偶联配制3% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作为偶 联剂溶液,在5(TC下，将C步获得的Ti-0薄膜浸泡到该偶联剂溶液中72小时， 然后回流漂洗6小时，之后在蒸馏水中超声清洗3分钟，从而在Ti-O薄膜表 面形成偶联剂单层，然后真空干燥；
E、 生物分子固定配制60mg/L浓度的层粘连蛋白溶液，滴入15mL/L的 水溶性碳二亚胺(EDC )催化剂，并用0. 22pm虑膜过滤；在无菌条件下，将D 步获得的Ti-O薄膜浸泡入该蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒温孵化箱静置6小时， 使层粘连蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸盐緩冲液中振荡漂洗3分钟， 常温晾干，即得。
实施例3
一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法，其步骤为
A、 Ti-0薄膜清洗将锐钬矿晶型Ti-0薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸馏水 进行超声波清洗，分别5分钟，获得洁净的薄膜表面，干燥；
B、 强碱活化在60。C振荡条件下，将洁净的Ti-0薄膜放入浓度为12% WT 的NaOH溶液中浸泡5小时，然后用双蒸水冲洗，再干燥；
C、 强酸活化将98% (WT) H2S(X与30% (WT) &02按体积比1: 0. 5配制混 合液，在95。C下，将B步获得的Ti-0薄膜用该混合液浸泡1小时，然后用双 蒸水冲洗，再干燥；
D、 偶联配制1.5% wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作为 偶联剂溶液，在7(TC下，将C步获得的Ti-0薄膜浸泡到该偶联剂溶液中24 小时，然后回流漂洗2小时，之后在蒸馏水中超声清洗3分钟，从而在Ti-0 薄膜表面形成偶联剂单层，然后干燥；
E、 生物分子固定配制20mg/L浓度的层粘连蛋白溶液，滴入5mL/L的水 溶性碳二亚胺(EDC )催化剂，并用0. 22|jm虑膜过滤；在无菌条件下，将D步 获得的Ti-0薄膜浸泡入该蛋白溶液，并于37 ± 0. 5。C恒温孵化箱静置24小时， 使层粘连蛋白固定到Ti-0薄膜表面，最后在磷酸盐緩冲液中振荡漂洗3分钟， 常温晾干，即得。
本发明方法中薄膜清洗时，用丙酮、乙醇、蒸馏水进行超声波清洗对时间 没有严格要求，只要能将薄膜清洗干净即可。
实验结果证明，用本发明方法生物改性后的Ti-0薄膜具有良好的生物相 容性
图2a为未固定层粘连蛋白的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的扫描电镜图。 图2b为用本发明方法固定层粘连蛋白后的Ti-0薄膜表面粘附的血小板的扫描 电镜图。图2b及图2a可以看出，用本发明方法固定层粘连蛋白后，Ti-O薄膜 表面血小板粘附的数量显著减少，几乎没有。这说明用本发明方法生物改性后 的Ti-0薄膜表面血液相容性明显改善。
图3a为未固定层粘连蛋白的Ti-0薄膜表面生长的内皮细胞的扫描电镜 图。图3b为用本发明方法中固定层粘连蛋白后的Ti-0薄膜表面生长的内皮细 胞的扫描电镜图。图3b及图3a可以看出，用本发明方法固定层粘连蛋白后， Ti-O薄膜表面内皮细胞的生长良好，细胞增殖明显。这说明用本发明方法生物 改性后的Ti-0薄膜表面细胞相容性明显改善。
权利要求
1、一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法，其步骤为A、Ti-O薄膜清洗将Ti-O薄膜依次用丙酮、乙醇、蒸馏水进行超声波清洗，获得洁净的薄膜表面，干燥；B、强碱活化在50-80℃振荡条件下，将洁净的Ti-O薄膜放入浓度为8-12％WT的NaOH溶液中浸泡1-5小时，然后用双蒸水冲洗，再干燥；C、强酸活化将98％(WT)H2SO4与30％(WT)H2O2按体积比1∶0.5-3配制混合液，在60-95℃下，将B步获得的Ti-O薄膜用该混合液浸泡1-4小时，然后用双蒸水冲洗，再干燥；D、偶联配制1-3％wt r-氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)的乙醇溶液作为偶联剂溶液，在50-70℃下，将C步获得的Ti-O薄膜浸泡到该偶联剂溶液中24-72小时，然后回流漂洗2-6小时，之后在蒸馏水中超声清洗，从而在Ti-O薄膜表面形成偶联剂单层，然后干燥；E、生物分子固定配制20-60mg/L浓度的层粘连蛋白溶液，滴入5-15mL/L的水溶性碳二亚胺(EDC)催化剂，并用0.22μm虑膜过滤；在无菌条件下，将D步获得的Ti-O薄膜浸泡入该蛋白溶液，并于37±0.5℃恒温孵化箱静置6-24小时，使层粘连蛋白固定到Ti-O薄膜表面，最后在磷酸盐缓冲液中振荡漂洗，常温晾干，即得。
2、 根据权利要求1所述的一种在Ti-0薄膜表面固定层粘连蛋白的方法， 其特征在于所述Ti-0薄膜为锐钬矿晶型或以锐钛矿为主的锐钬矿与金红石 混合晶型。
3、 根据权利要求1所述的一种在Ti-0薄膜表面固定层粘连蛋白的方法， 其特征在于所述B、 C、 D步骤中的干燥为真空干燥。
全文摘要
本发明公开了一种在Ti-O薄膜表面固定层粘连蛋白的方法。在Ti-O薄膜表面，通过强碱与强酸活化在Ti-O薄膜表面形成反应性官能团羟基-OH，然后用硅烷偶联剂氨丙基三乙氧基硅烷(APTE)在Ti-O薄膜表面与生物分子层之间构建一层与两者分别具有化学键合能力的偶联层，以提高后续所固定生物分子的稳定性。最后以水溶性碳二亚胺(EDC)为固定蛋白的催化剂，固定层粘连蛋白分子，从而在Ti-O薄膜表面牢固形成层粘连蛋白生物化层。本发明在Ti-O薄膜表面牢固结合固定层粘连蛋白生物化层，显著提高Ti-O薄膜表面的血液相容性和内皮细胞相容性。
文档编号A61L31/12GK101357240SQ20081004604
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者万国江, 冷永祥, 熹 吴, 鸿 孙, 苹 杨, 游天雪, 进 王, 葛胜男, 赵安莎, 陈俊英, 楠 黄 申请人:西南交通大学;成都交大麦迪克科技有限公司