专利名称：聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基马来酸)及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)双嵌段聚合物及其制备方 法，以及其作为外用避孕药和抑制艾滋病病毒-1型(HIV-1)传染方面的医疗用途。
背景技术：
现有的外用避孕药，其主要成分为垸苯醇醚或壬苯醇醚。性生活前将外用避孕药置放于 阴道内，外用避孕药溶化后可以杀死精子或产生形成油膜和泡沫，使精子失去活动能力，而 起到避孕的作用。精子细胞表面表达有识别、结合卵子细胞表面甘露糖的蛋白受体(l、Youssef, H. M.; Doncel, G. F.; Bassiouni, B. A.; Acosta, A. A., Mannose-binding sites on human spermatozoa and sperm morphology. FeWz7 Sfen7 1996， 66, (4), 640-5)。甘露糖或甘露糖的衍生物结合精子细 胞表面的甘露糖受体后，可以抑制精子细胞与卵子的结合(2、 Mori, K.; Daitoh, T.; Kamada, M.; Maeda, N.; Maegawa, M.; Hirano, K.; Irahara, M.; Aono, T" Blocking of human fertilization by carbohydrates. i e/ rad 1993， 8, (10)， 1729-1732; 3、 Tanghe, S.; Van Soom， A.; Duchateau, L.; De Kruif, A., Inhibition of bovine sperm-oocyte fiision by the p-aminophenyl derivative of D-mannose. Mo/及e，odDev 2004， 67, (2), 224-322)。因此甘露糖的衍生物是新型潜在的外用避 孕药。但是由于甘露糖单糖与蛋白受体的结合力很弱，需要较高剂量的甘露糖才能达到有效 抑制精子与卵子的结合。
人的受孕过程与艾滋病病毒(HIV-l)的性感染都是在生殖系统进行的(4、 Fletcher, P. S.; Wallace, G. S.; Mesquita, P. M.; Shattock, R. J., Candidate polyanion microbicides inhibit HIV-1 infection and dissemination pathways in human cervical explants.及"ravZra/ogy 2006， 3， 46)。艾 滋病患者的精子与HIV-1是结合在一起的，而且精子可以促进HIV-1病毒的感染(5、 Lopez-Herrera, A.; Liu, Y.; Rugeles, M. T.; He, J. J.， HIV-1 interaction with human mannose receptor (hMR) induces production of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) through hMR陽mediated intracellular signaling in astrocytes.历ocW附历optysXcta 2005， 1741， (1-2), 55-64)。杀微生物齐廿 是性生活前应用于阴道内，能够直接杀灭或中和HIV- 1等病原体的、人工合成的或天然的 物质。已有预防HIV -1传播的杀微生物剂上市，更多的进入临床试验(6、Klasse, P. J.; Shattock, R.; Moore， J. P., Antiretroviral drug-based microbicides to prevent HIV-1 sexual transmission. JwwwMed 2008， 59, 455-71)。杀微生物剂的有效成分为带有多个负电荷的物质。这些物质与 HIV-1病毒表面的糖蛋白gpl20的带有多个正电荷的V3片段结合，从而阻碍gpl20与CD4 等受体结合，达到抑制HIV-1感染的目的(4、 Fletcher, P. S.; Wallace, G. S.; Mesquita, P. M.;
Shattock, R. J.， Candidate polyanion microbicides inhibit HIV-1 infection and dissemination pathways in human cervical explants. i e加v/ra/ogy 2006， 3, 46)。
本发明的目的在于提供一种聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)。 本发明的另一目的在于提供聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)作为外用避孕
药和抑制艾滋病病毒-l型(HIV-1)传染方面的医疗用途。
本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)的组成及其按质量百分比的
含量为聚苯乙烯30%，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)70%，分子量为22000，其结构
式为
式中，m， n为聚合度。
本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)可通过以下方法制备。 将聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-马来酸酐)溶解在二甲基甲酰胺溶剂中，在三乙胺的催化下， 加入含有氨基的甘露糖，搅拌反应，向反应体系中加入水，然后在超声波下超声后得到聚苯 乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒溶液。将聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基 马来酸)纳米颗粒溶液转移到透析袋中透析，除去反应体系中的含有氨基的甘露糖、二甲基甲 酰胺和三乙胺，得到表面连接甘露糖的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒 水溶液。
本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)可用于制备外用避孕药物。 本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)可用于制备外用抗艾滋病药物。
本发明将聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-马来酸酐)与含有氨基的甘露糖通过化学反应和超声
发明内容波处理得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒。
聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)颗粒与精子孵育后，在荧光共聚焦显微镜下 检测细胞表面，发现连接甘露糖的纳米颗粒与精子结合在一起，形成高度聚合体。
表达HIV-1病毒受体CD4、 CCR5、 CXCR4的Hela细胞(TZM-W细胞株)很容易被外 源HIV-1病毒感染。TZM-bl细胞株含有单拷贝报告基因pgal。 TZM-B1细胞被HIV-1感染后， 报告基因Pgal被激活导致P-半乳糖水解酶的表达。被HIV-1感染TZM-bl细胞内的P-半乳糖 水解酶催化水解底物X-gal后，产生蓝色颜料沉积在细胞内，细胞显蓝色。HIV-1病毒对细胞 的感染被聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒抑制后，由于没有p-半乳糖水 解酶的表达，TZM-bl与X-gd混合后，细胞不变色。因此通过计量显色细胞的比例可以得到 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒队HIV-1感染的抑制效果。
由此可见，本发明的有益效果是
(1) 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒与精子有较强的结合力，可以 置于阴道内，用于阻断精子与卵子的结合而达到避孕的效果。
(2) 该纳米颗粒对HIV-1的感染有很强抑制效果，达到半抑制率的剂量为lpg/mL。由 于对细胞的毒性很低，聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒可以作为有效的 杀微生物剂，置于阴道或者直肠内预防HIV-1的性传播。
(3) 制备的连接聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒表面含有多个甘露 糖。纳米颗粒表面的多个甘露糖与精子表面的多个甘露糖蛋白受体可以同时结合，得以大大 提高纳米颗粒与精子的结合力，在低剂量下可以抑制精子参与受孕。制备的聚苯乙烯-聚(苯 乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒表面含有多个带有负电荷的碳酸根集团，可以作为新型 杀微生物剂预防HIV-1传播。兼有杀精子作用的新型高效杀微生物剂是具有潜在的应用前景 和广泛市场。
(4) 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒与精子有很强的结合力，在抑 制精子参与受孕，作为外用避孕药方面有很好的应用前景；这些纳米颗粒高效抑制HIV-1对 T细胞的感染，可以作为潜在新型杀微生物剂预防HIV-1传播。
具体实施例方式
将0.4g聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-马来酸酐)溶解在3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中， 在三乙胺的催化下，加入0.3g含有氨基的甘露糖，搅拌反应5h。向反应体系中加入17ml水， 然后在超声波下超声30min后得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒水溶 液(50 110nm),转移到透析袋(MWCO: 3000)中透析，除去反应体系中的含有氨基的甘露糖、DMF和三乙胺，得到表面连接甘露糖的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米 颗粒的水溶液。将透析过的水溶液冷冻干燥得到聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸) 纳米颗粒的粉末状固体。
将得到的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒10mg与荧光分子罗丹明 (Rhodamine 6G) lmg溶解在0.3ml DMF中。向反应体系中加入2.7ml水后在超声波下超声 30min，得到包含有罗丹明6G的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒。
将精子细胞与包含有罗丹明的、聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒在 37'C孵育，20min后，离心分离细胞，除去没有与细胞结合的纳米颗粒。在荧光共聚焦显微 镜下观察，精子细胞表面含有高强度的荧光。说明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸) 纳米颗粒吸附在精子细胞表面。与不加入该纳米颗粒的参照对比，与聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交 替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒孵育的精子之间聚集成团，说明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露 糖基马来酸)纳米颗粒表面的甘露糖与多个精子细胞表面的蛋白受体结合力强，导致聚集。由 此可见，本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)可用于制备外用避孕药 物。
表达HIV-1受体CD4、 CCR5、与CXCR4的TZM-B1细胞，HIV-1病毒，与不同含量的 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒加入到DMEM中，于37。C在C02培养 箱培养48h。通过检测报告基因X-gal的表达量来测量纳米颗粒对HIV-1病毒感染的抑制作用。 聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒的半抑制率(ICso)为lpg/mL。由此可 见，本发明所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)可用于制备外用抗艾滋病药 物。
MT4细胞与不同剂量的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒在C02培养 箱37'C培养。每隔24h，用台盼蓝染色测量细胞的数量，以及死亡率。在剂量高达2pg/mL 时，6天以后细胞生长速度降低30%，但是细胞无明显死亡。在低剂量时，细胞生长速度没 有明显变化。说明聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)纳米颗粒的细胞毒性很低。
权利要求
1.聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基马来酸)，其特征在于其组成及其按质量百分比的含量为聚苯乙烯30％，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)70％，分子量为22000，其结构式为式中，m，n为聚合度。
2. 如权利要求1所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)在制备外用避孕药 物中的应用。
3. 如权利要求1所述的聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)在制备外用抗艾滋 病药物中的应用。
全文摘要
聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替甘露糖基马来酸)及其制备方法与应用，涉及一种聚苯乙烯-聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)以及其作为外用避孕药和抑制艾滋病病毒-1型传染方面的医疗用途。其组成及其按质量百分比的含量为聚苯乙烯30％，聚(苯乙烯-交替-甘露糖基马来酸)70％，分子量为22000。可用于制备外用避孕药物。可用于制备外用抗艾滋病药物。
文档编号A61P15/00GK101319022SQ20081007144
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者磊 李, 苏荣敏, 陈小平, 韩守法, 韩家淮 申请人:厦门大学