专利名称：Ldp蛋白作为肿瘤靶向药物导向载体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可与人体肿瘤组织特异性结合的LDP蛋白；本发明还涉及 LDP蛋白作为肿瘤靶向药物导向载体的新用途。
背景技术：
LDP蛋白是抗肿瘤抗生素LDM的两个组成成分之一。LDP由110个氨基酸残 基组成，分子量10.5 kDa，其对LDM的另一个组分烯二炔结构的发色团(AE) 起着保护作用，后者分子量843 Da，具有细胞毒作用但不稳定。所述两部分可 以拆分和重建，且重建后的分子与天然LDM的细胞毒作用相同。体内动物实验表 明，LDM对小鼠结肠癌26、移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693 等多种人体移植肿瘤均有显著疗效[中国抗生素杂志1994， 19 (2): 164-168]。 LDP蛋白含有110个氨基酸，羟基氨基酸如丝氨酸和苏氨酸，以及疏水氨 基酸如甘氨酸和缬氨酸所占比例较高，氨基端为丙氨酸，羧基端为甘氨酸。LDP 含有两个二硫键， 一个位于Cys (36)和Cys (45)之间；另一个位于Cys (86) 和Cys (91)之间。采用核二维核磁共振方法，对LDP的三维结构研究表明，LDP 是由3条反向平行的e片层组成，有一个疏水性口袋，发色团可结合到此疏水 性口袋中，其烯二炔位于口袋中心。本发明所涉及的抗LDP的单抗，来自稳定型杂交瘤细胞株3H8的无血清培 养细胞上清，为IgGl亚型单克隆抗体。本实验室首次采用免疫组织化学方法，结合组织芯片技术，证明LDP具有可 与多种肿瘤组织特异性结合的重要功能，其结合能力与相应正常组织比较具有显 著性差异，且LDP结合肿瘤组织的能力与某些肿瘤治疗靶点相关。涉及LDP具有 可与多种肿瘤组织特异性结合的重要新功能，迄今尚未见有相关报道。本发明的目的，在于通过组织芯片技术，检测LDP蛋白与肿瘤组织的特异 性结合；本发明的另一目的，在于提供LDP蛋白作为肿瘤靶向药物导向载体的应用。
发明内容
本发明提供了 LDP蛋白制备方法。本发明提供了 LDP蛋白可与人体肿瘤组织特异性结合的实验研究，具体包括组织芯片技术检测LDP与高密度多肿瘤组织芯片的结合； 组织芯片技术检测LDP在乳腺癌、肺癌、结肠癌与其相应正常组织的结合差异。本发明还提供了 LDP靶向肿瘤组织的能力与某些肿瘤治疗靶点相关性实验，具体包括组织芯片技术检测LDP与乳腺癌的结合能力及其与VEGF和HER2的相关性； 组织芯片技术检测LDP与肺癌的结合能力及其与VEGF和EGFR的相关性； 组织芯片技术检测LDP与结肠癌的结合能力及其与VEGF的相关性。 本发明也提供了 LDP可与体外培养肿瘤细胞结合的实验研究，具体包括 流式细胞术检测LDP与肿瘤细胞的结合； 激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞对LDP的内化。根据LDP蛋白能与肿瘤细胞特异性结合的特点，可将LDP蛋白作为肿瘤靶向 药物导向载体，采用常规方法，与多种具有抗肿瘤作用的相关活性蛋白或小分子 化合物进行融合或偶联，形成靶向药物用于临床治疗。 发明效果本发明的优点和积极效果在于，首次发现并证明，LDP蛋白具有和人体肿瘤 组织特异性结合的能力，且与相应正常组织比较具有明显差异，更进一步发现， LDP结合肿瘤组织的能力与某些肿瘤治疗靶点包括EGFR、 HER2、 VEGF显著相关， LDP可与体外培养的肿瘤细胞结合并能被内化。由于LDP本身具有特异性结合肿 瘤组织的能力，因此，可作为肿瘤耙向药物的导向载体。又由于其结合肿瘤组织 的能力与某些肿瘤治疗靶点显著相关，可利用基因工程的方法，将其与某些肿瘤 治疗靶点的配体制成一系列针对特定肿瘤的融合蛋白，从而进一步提高其导向能 力。因此，本发明在抗肿瘤新药研制以及肿瘤靶向治疗方面具有良好的应用前景。
图l-LDP与高密度多肿瘤组织芯片结合的典型图像其中A-胃癌；B-结肠癌；C-胰腺癌；D-甲状腺乳头状癌；E-皮肤鳞癌；F-4膀胱移行细胞癌；G-乳腺侵润性导管癌；H-子宫内膜癌；I-卵巢乳头状癌； J-前列腺癌。放大倍数100倍。 图2-组织芯片技术检测LDP与乳腺癌及其相应正常组织的结合其中A —乳腺癌组织，可见癌细胞呈阳性染色；B —正常乳腺组织，无阳性染色。放大倍数100倍。 图3-组织芯片技术检测LDP与肺癌及其相应正常组织的结合其中A —肺癌组织，可见癌细胞呈阳性染色；B —正常肺组织，无阳性染色。放大倍数200倍。 图4-组织芯片技术检测LDP与结肠癌及其相应正常组织的结合其中A—结肠癌组织，可见癌细胞呈阳性染色，放大倍数200倍；B —正常结肠组织，无阳性染色，放大倍数100倍。 图5-组织芯片技术检测LDP与乳腺癌的结合能力与VEGF及服R2相关其中A、 B和C一同一例乳腺癌，A显示LDP免疫染色阳性，B显示VEGF表达阳性，C显示HER2表达阳性。放大倍数均为200倍。 图6-组织芯片技术检测LDP与肺癌的结合能力与VEGF及EGFR相关其中A、 B和C为同一例肺癌，A显示LDP免疫染色阳性，B显示VEGF表达阳性，C显示EGFR表达阳性。放大倍数均为200倍。 图7-组织芯片技术检测LDP与结肠癌的结合能力与VEGF相关其中A、 B —同一例结肠癌，A显示LDP免疫染色阳性，B显示VEGF表达阳性。放大倍数均为200倍。 图8-流式细胞术检测LDP与肺癌细胞系NCI-H460的结合其中A—阴性对照；B—LDP 图9-激光共聚焦显微镜检测肺癌细胞系NCI-H460对LDP的内化其中FITC—绿色荧光，为LDP的结合部位；DAPI —复染细胞核，显示蓝色荧光；MERGE—两图的组合。
具体实施例方式以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。〈实施例1〉、 LDP蛋白的制备取力达霉素LDM精制品("抗肿瘤抗生素力达霉素的制备新方法"，ZL专利 号00121527. 2)溶于FPLC流动相中，在FPLC快速蛋白色谱仪上，经Waters径 向加压半制备(Delta-PAK C4 300A)柱分离，流动相为[乙腈0. 025%三氟醋酸 (23: 77)]，紫外检测波长280 nm。收集目的蛋白峰溶液，经冷冻干燥，即得 至IJLDP蛋白制品。<实施例2〉、组织芯片技术检测LDP与多肿瘤高密度组织芯片的结合 取多肿瘤高密度组织芯片(陕西超英公司，编号CCOO-08-001)， 二甲苯脱蜡 2次，每次15分钟；梯度酒精下行至水；在pH 6. 0的拧檬酸缓冲液中修复，92-98°C 15 分钟；冷却至室温后，以3°屈202室温孵育15分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟， 加入lmg/mL的实施例1制备的LDP， 4'C孵育过夜；PBS洗涤后，以抗LDP单抗3H8 培养液上清(1: IO稀释)室温孵育l小时；加入EliVision试剂盒(福州迈新公 司)中的试剂A室温孵育20分钟；PBS洗涤后，加入HRP标记的羊抗小鼠/兔IgG 多聚物，室温孵育30分钟；DAB显色，苏木素复染核，盐酸酒精分化，梯度酒精 脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察照相。LDP免疫染色位于肿瘤细胞 胞浆，肿瘤细胞的胞核也多见染色。由于在染色呈阳性的85%的组织芯片中，100% 的肿瘤细胞都有着色，因此，以染色强度对LDP免疫染色进行3级评分，0:无肿 瘤细胞着色；1:弱肿瘤细胞着色；2:强肿瘤细胞着色。多肿瘤高密度组织芯片的 检测结果显示，LDP与膀胱移行细胞癌的结合能力最强(94.4%)，与子宫内膜癌的 结合能力最弱(20. 0%), LDP与不同肿瘤组织的结合是有差异的(X2=64. 0，尸〈0. 001〉 (图1)、(表1)。表1LDP在多肿瘤组织芯片上的免疫染色组织例数LDP-阴性(％)LDP-阳性(％) *冃〗B5196/19 (31.6)13/19 (68.4)结肠癌194/19 (21. 0)15/19 (79.0)肝细胞癌195/19 (26.3)14/19 (73.7)胰腺癌186/18 (33. 3)12/18 (66.6)肺癌284/28 (21.4)24/28 (78.6)甲状腺癌2012/20 (60.0)8/20 (40.0)皮肤癌3010/30 (33.3)20/30 (66.7)淋巴瘤198/19(42. 1)11/19(57.9)脑星形细胞瘤2010/20(50.0)10/20(50.0)膀胱癌181/18(5. 56)17/18(94.4)肾癌204/20(20.0)16/20(80.0)乳腺癌297/29(24. 1)22/29(75.9)子宫内膜癌2016/20(80. 0)4/20(20.0)卵巢癌3419/34(55.9)5/34(44.D前列腺癌166/16(37.5)10/16(62.5)精原细胞瘤204/20(20.0)16/20(80.0)肉瘤2013/20(65.0)7/20(35.0)X2=64.0， P 〈0.001，不同肿瘤组织间存在显著性差异<实施例3〉、组织芯片技术检测LDP与乳腺癌及其相应正常组织的结合参照实施例2的方法，检测LDP与乳腺癌及其相应正常组织组织芯片(陕西 超英公司，编号CC08-11-005)的结合。结果表明，除去坏死、脂肪组织、脱 落等组织芯，在乳腺癌41例病例中，LDP染色阳性率为73.2% (30/41);在正常 乳腺组织31个组织芯中，LDP染色阳性率为48. 3% (15/31)。 LDP与乳腺癌及其 相应正常组织的结合有显著性差异(X2=4.63， /M).03)(表2)、(图2)。 表2 LDP与肿瘤组织及其相应正常组织的免疫结合性比较组另U_nLDP阳性例数(％) LDP阴性例数(％) X2 P乳腺 4. 63 0. 03乳腺癌 41 30 (73.2) 11 (26.8)正常组织31 15 (48.3) 16 (51.6)肺 28. 3 〈0. 001肺癌 48 40 (83.3) 8 (16.7)正常组织 50 15 (30.0) 35 (70.0)结肠 27 〈0.001结肠癌 45 36 (66.7) 9 (33.3)正常组织42 10 (23.8) 32 (76.2)<实施例4〉、组织芯片技术检测LDP与肺癌及其相应正常组织的结合参照实施例2的方法，检测LDP与肺癌及其相应正常组织组织芯片(陕西 超英公司，编号CC04-11-010)的结合。结果表明，除去坏死、脂肪组织、脱 落等组织芯，在肺癌48例病例中，LDP染色阳性率为83.3。/。 (40/48);在正常肺 组织50个组织芯中，LDP染色阳性率为30. 0% (15/50)。肺癌及其相应正常组织 的结合有显著性差异(X2=28. 3，代O.OOl)(表2)、(图3)。 <实施例5〉、组织芯片技术检测LDP与结肠癌及其相应正常组织的结合参照实施例2的方法，检测LDP与结肠癌及其相应正常组织组织芯片(陕 西超英公司，编号CC05-11-008)的结合。结果表明，除去坏死、脂肪组织、 脱落等组织芯，在结肠癌45例组织芯中，LDP染色阳性率为66.7。/。 (36/45);在 正常结肠42个组织芯中，LDP染色阳性率为23.8y。 (10/42)。结肠癌及其相应正 常组织的结合有显著性差异(X2=27， P〈0.00D (表2)、(图4)。 <实施例6>、 LDP与乳腺癌及与VEGF、服R2的相关性取乳腺癌组织芯片(陕西超英公司，编号CC08-11-008)，参照实施例2 的方法，检测LDP的免疫反应；取相同的两张组织芯片，免疫组化EliVision 二步法分别检测VEGF、 HER2的过表达，其中VEGF、 HER2的抗原修复液分别为 pH 8. 0的lmM EDTA，以及pH 6. 0的lmM柠檬酸，修复方法为微波修复，92-98'C15 分钟。结果表明，LDP与乳腺癌的免疫结合与VEGF以及冊R2的过表达相关(图5)。 90例组织芯中，除去坏死、脂肪组织、脱落等病例，可供VEGF/LDP分析的病例 为87例(96. 7%)，其中，在54例LDP阳性的病例中，VEGF阳性率为88. 9%(48/54)， LDP与乳腺癌的免疫结合能力与VEGF的过表达呈正相关(P 〈0. 005， ^0. 389〉； 可供HER2/LDP分析的例数为86例(95. 6%)，在54例LDP阳性的病例中，冊R2 的阳性率为84. 0% (42/54)， LDP与乳腺癌的免疫结合能力与服R2的过表达呈正 相关(尸〈0.01，产O. 287〉(表3)。表3乳腺癌治疗靶点VEGF、 HER2的表达与LDP免疫结合性的关系 VEGF表达 HER2表达VEGF+ VEGF- A r 服尺2+HER2- 尸，r15 〈0.001， 0.389 0.007， 0.287+48 6 42 12- 18 15 12 16n 66 21 54 28<实施例7>、 LDP与肺癌及与VEGF、 EGFR的相关性取肺癌组织芯片(陕西超英公司，编号CC04-01-007)，参照实施例2的 方法，检测LDP的免疫反应；取相同的两张组织芯片，免疫组化EliVision二步 法分别检测VEGF、 EGFR的过表达，其中VEGF的抗原修复方法是pH 8. 0的lmM EDTA，微波修复，92-98。Cl5分钟；EGFR的修复方法是胃蛋白酶消化液，37'CIO 分钟。结果表明，LDP与肺癌的免疫结合与VEGF以及EGFR的过表达相关(图6)。 80例组织芯中，可供VEGF/LDP分析的病例为71例(89%)，其中，在40例LDP 阳性的病例中，VEGF阳性率为60% (24/40)(尸〈0.01，尸0.341〉；可供EGFR/LDP 分析的病例为73例，在40例LDP阳性的病例中，EGFR的阳性率也为60%(24/40) (尸〈0.05, r=0.296〉(表4)。表4肺癌治疗耙点VEGF、 EGFR的表达与LDP免疫结合性的关系 VEGF表达 EGFR表达VEGF+ VEGF- 尸，r EGFR+EGFR- 尸，rLDP〈0.005， 0.3410.011， 0.296+24162416一8231023n32393439〈实施例8〉、 LDP与结肠癌及与EGFR的相关性取结肠癌组织芯片(陕西超英公司，编号CC05-01-005)，参照实施例2 的方法，检测LDP的免疫反应；取相同的两张组织芯片，免疫组化EliVision 二步法检测VEGF的过表达，其中VEGF的抗原修复液为pH 8. 0的lmM EDTA，修 复方法为微波修复，92-98'C15分钟。结果表明，LDP与结肠癌的免疫结合与VEGF的过表达相关(图7)。 80例组织芯中，可供VEGF/LDP分析的病例为62例(78. 5%)，在38例LDP阳性的病例 中，VEGF的阳性率为76. 3% (29/38)(尸〈0.Q5，户O. 271〉(表5)。表5结肠癌治疗靶点VEGF的表达与LDP免疫结合性的关系VEGF表达 VEGF+ VEGF-尸'rLDP0.033， 0.271+299—1212n4121〈实施例9〉、流式细胞术检测LDP与肺癌细胞系NCI-H460的结合将处于对数生长期的NCI-H460细胞在含有l幽LDP的RPMI-1640完全培养 基中孵育；8小时后，胰酶消化细胞，室温下用4%的多聚甲醛固定10分钟；0.2% 的Triton-X100破膜；2%的小牛血清封闭，37。C水浴20分钟；离心，弃上清， PBS洗涤，加抗LDP的单抗3H8抗体(1: 100倍稀释)，37。C水浴30分钟;离心， 弃上清，PBS洗涤，加入FITC标记的羊抗小鼠二抗(1: 100稀释)，37。C避光水 浴30分钟；PBS洗涤，离心，弃上清；加入500叱PBS，摇匀，上样，在流式细 胞仪上检测。阴性对照为不加LDP，其余同。结果表明，LDP可以与肺癌细胞系 结合，荧光强度明显高于对照(图8)。〈实施例10>、激光共聚焦显微镜检测肺癌细胞系NCI-H460对LDP的内化将对数生长期的NCI-H460细胞以3xl()5接种于六孔板中(内有小玻片)；24 小时后，更换新的培养液，加入终浓度为l幽的实施例1中的LDP; 8小时后， 弃上清，用PBS洗3次；将小玻片取出，冷丙酮固定5分钟，待干；PBS洗涤3次，每次5分钟，加入l: IO稀释的正常山羊血清稀释，封闭10分钟，倾去；加入抗LDP单抗3H8培养液上清，4'C孵育过夜；PBS洗涤，加入FITC标记的羊 抗小鼠二抗(h IOO稀释)，37'C孵育1小时;PBS洗涤，加入DAPI (lPg/mL)， 37'C孵育15分钟；PBS洗涤，将小玻片以200PL的甘油PBS倒贴于载玻片，激 光共聚焦显微镜下观察并照相。阴性对照为不加LDP，其余相同。结果表明(图 9)， LDP可被摄入肿瘤细胞内。
权利要求
1.LDP蛋白作为导向载体在制备肿瘤靶向药物中的应用，所说靶向药物系由LDP导向载体与具抗肿瘤作用的物质所组成。
2. 如权利要求1所述的应用，其具抗肿瘤作用的物质选自相关的活 性蛋白。
3. 如权利要求1所述的应用，其具抗肿瘤作用的物质选自相关的小 分子化合物。
4. 如权利要求1或2所述的应用，其肿瘤靶向药物系由活性蛋白与 LDP导向载体融合而成。
5. 如权利要求1或3所述的应用，其肿瘤靶向药物系由小分子化合 物与LDP导向载体偶联而成。
全文摘要
本发明涉及一种可与人体肿瘤组织特异性结合的LDP蛋白，还涉及LDP蛋白作为肿瘤靶向药物导向载体的新用途，研究证明，LDP可与人体多种肿瘤组织包括乳腺癌、肺癌、结肠癌等特异性结合，其结合与相应正常组织比较有显著性差异，与人体肿瘤组织结合的能力与某些肿瘤治疗靶点显著相关，显示了其作为肿瘤靶向药物导向载体的特异性，可望应用于研制新型肿瘤靶向药物。
文档编号A61K47/42GK101259287SQ200810094299
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者吴淑英, 悦 商, 甄永苏, 琳 蔡, 金莲舫 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所