专利名称：一种复合生物材料及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种复合生物材料以及它的制备方法。更具体的说，本发明 涉及一种含有交联透明质酸衍生物和羟基磷灰石的复合生物材料、其制备方法和应用。
背景技术：
关节软骨组织代谢活性低，损伤难以自身修复，最终可引起关节表面的退变。通过关节 软骨成型术、微骨折、自体软骨移植等外科手术方法可暂时改善病人的临床症状，但由于存 在供体来源不足、免疫排斥、生成软骨不佳、远期效果不好等问题，远不能满足临床应用的 需要。利用组织工程方法修复软骨缺损，具有需要供体组织少、可根据要求塑形等优点，有 望成为一种新的治疗模式。
组织工程研究包括种子细胞、细胞支架和包括细胞生长因子在内的周围环境三个方面， 其中细胞支架材料选择的成功与否是成败的关键环节，因而使其成为研究的热点。理想的组 织工程支架材料应具备良好的生物相容性、适宜的生物降解性、利于种子细胞的黏附和增殖、 孔径和孔隙率适宜的三维多孔结构以及具有一定机械强度、易于塑形和固定于缺损部位等条 件[参考文献何森，张其清.关节软骨组织工程的研究进展.国际生物医学工程杂志，2007， 30(4): 247 251]。
目前常用支架材料按来源可分为天然生物材料、人工合成材料和复合材料。天然生物材 料包括胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺聚糖(透明质酸和硫酸软骨素)、藻酸盐、 蚕丝蛋白、松质骨骨基质、脱细胞基质等。人工合成材料包括聚乙烯醇、磷酸三钙、聚氧乙 烯、聚氨酯、聚己内酯、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸一羟基乙酸(PLGA) 等。天然生物材料、人工合成材料各自存在一些不足，如尽管天然材料含有能识别细胞表面 受体的配体，具有良好的生物相容性和细胞亲和性，但生物力学强度、降解速度快或较快。 此外胶原、明胶等材料由于来源于动物组织，还存在抗原性和传播病原的可能。人工合成材 料虽然容易加工成型，可以根据需要调整物理、化学、生物力学和降解性能，但普遍存在着 与细胞的亲和力和黏附性差、亲水性不好等缺点。目前运用较广泛的、生物相容性较好的人工合成材料是聚乳酸类材料，其中PGA、 PLA已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于 组织工程支架材料，但研究发现其降解产物偏酸性可导致炎症反应，还有一定的免疫原性[参 考文献Rotter N, Ung F， Roy AK， " a/. Role for interleukin lalpha in the inhibition of chondrogenesis in autologous implants using polyglycolic acid-polylactic acid scaffolds. Tissue Engineering, 2005， 11: 192~200.]。
单独应用一种或一类材料难以获得理想的生物支架，将两种或几种具有互补特征的可降 解材料按一定比例和方式组合可设计出结构与性能优化的三维材料。尤其是天然材料和人工 合成材料的复合，利用前者良好生物相容性、细胞表面识别信号和后者合适的机械性能等特 性可获得理想的软骨支架材料。
透明质酸(Hyaluronan, HA)是软骨基质组成成分之一，作为软骨细胞生长的基质，能 促进软骨细胞代谢，并维持软骨细胞表型、促进软骨基质分泌，是构建复合软骨细胞支架的 首选材料。但天然HA缺乏支架所必须的力学性能，通过HA交联改性或与其它材料复合可解 决这一问题。研究表明HA与胶原、明胶、壳聚糖、硫酸软骨素和藻酸盐的一种或两种构建的 复合材料，有较强亲水性，软骨细胞能够生物黏附在复合材料支架上，且增殖分化良好，体 外培养可形成软骨样组织[参考文献①张其清，阁继红，等.胶原-透明质酸-硫酸软骨素复 合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究.中国修复重建外科杂志，2006, 20(2): 130 133. ②Yan J， Li X, Liu L， a/. Potential use of collagen-chitosan-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering. Artif Cells Blood Substit Biotechnol, 2006， 34(1): 27 39.③Chang CH, Liu HC, Lin CC， W a/, Gelatin-chondroitin-hyalouronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering. Biomaterials, 2003， 24(26): 4853 4858.]。
交联透明质酸(Cross-linkedhyaluronan， cHA)增强了天然HA的抗降解性，并保留了HA 良奵的牛物相容性和非免疫原性，其降解产物为小分子HA，无毒、不致炎，与内源性HA代 谢途径一致。目前cHA己广泛用于骨科关节炎治疗、手术防粘连、软组织修复和美容整形填 充。有研究报道采用cHA (Hylan)用于重建大鼠主动脉的心脏瓣膜[参考文献Ramamurthi A, Vesely I. Evaluation of the matrix-synthesis potential of crosslinked hyaluronan gels for tissue engineering of aortic heart valves. Biomaterials. 2005, 26(9): 999-1010]，作为动脉平滑肌细胞支
4架可诱导形成类似天然的弹性蛋白基质的形成。有人把分离培养的成纤维细胞加入cHA注射 产品(Restylane)中，发现明显比单纯的cHA注射产品降解慢[参考文献:Yoon ES, Han SK, Kim WK. Advantages of the presence of living dermal fibroblasts within restylane for soft tissue augmentation. Ann Plast Surg， 2003, 51(6): 587-592.]。cHA在骨和软骨组织工程方面的研究未见 报道。
羟基磷灰石(Hydroxyapatite， HAP)是人和动物骨骼、牙齿的主要无机成分，通过多种 人工合成方法可获得高纯度微粒和超细微粒。HAP能够引导骨的生长，植入肌体后能在短时 间内与人体软、硬组织紧密结合形成一体，是目前最佳的骨缺损修复材料。由于HAP抗疲劳 强度不佳，脆性大，易断裂，降解性差，通常与其它材料结合用于软骨组织工程。研究表明， 分层柱状的胶原/HAP复合支架具有良好的细胞相容性和亲水性，较纤维具有更强的力学性能 [参考文献卢华定，蔡道章，冯智英，等.柱状分层的胶原一羟基磷灰石复合支架负载软骨细 胞体外培养.中国修复重建外科杂志，2006, 20(2): 144 147.]。 HAP纳米微粒/PLA复合物和胶 原/HAP多层复合支架也被认为是具有前景的人工软骨支架材料[参考文献①Hong Z, Zhang P, He C. a/. Nanocomposite of poly(L-lactide) and urface grafted hydroxyapatite: mechanical properties and biocompatibility. Biomaterials, 2005, 26 (32): 6296 6304.②吴冈lj，王迎军，陈晓 峰，等.多层软骨组织工程支架的制备.中国生物医学工程学报,2007， 26(4): 612-617]。
至今为止，含有cHA和HAP的复合生物材料还未见研究报道。
交联使链状的HA形成整体大分子的网架结构，调节交联程度可获得适宜降解速度和适 宜细胞生长的孔隙，cHA具有高亲水性、 一定的弹性和韧性，但机械强度稍差。HAP具有良 好的生物相容性和骨传导作用，但其抗疲劳强度不佳，脆性大，易断裂，降解性差。本发明 将cHA和HAP组合构建复合生物材料，HAP较强的力学性能和骨传导作用结合cHA适宜的 降解速度和一定的弹性和韧性，将成为一种较理想的软骨细胞支架材料。
本发明cHA/HAP复合生物材料与含有胶原或其它异体蛋白成分的复合材料相比，避免 了抗原性和传播病原的可能，与含有聚乳酸类成分的复合材料相比，减少了致炎和致敏的可 能。由此，本发明复合生物材料在生物相容性和安全性方面更具优势，可以为今后组织工程 技术提供一种新的细胞支架材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有交联透明质酸衍生物(Cross-linked hyaluronan， cHA)和 羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)的复合生物材料、其制备方法，以及该复合生物材料在 制备用于制备组织工程用途的细胞支架中的应用，如制备用于骨或软骨修复的细胞支架等。
本发明复合生物材料，特征在于含有cHA和HAP。
本发明复合生物材料，其特征还在于cHA与HAP的质量比为1000:1 1:1000，优选 100:1 1:跳更优选10:1 1:10。
本发明复合生物材料中所含有的HAP的平均粒径为0.1 1500pm，优选1 1000pm，更 优选50 250pm。
本发明复合生物材料中所含有的cHA来源于酰肼交联透明质酸衍生物、环氧甘油醚交联 透明质酸衍生物和二乙烯基砜(DVS)交联透明质酸衍生物中的一种、任意两种或三种的混 合物。
本发明复合生物材料可用于制备组织工程用途的细胞支架，例如制备用于组织工程技术 中骨组织或软骨组织的细胞支架等。
本发明复合生物材料可以采用先将透明质酸或其可溶性盐与HAP混合均匀后进行交联 反应获得，也可以采用先反应制备cHA，然后再与HAP混合均匀获得。
根据本发明制备方法得到的复合生物材料，形式上可以是多样的，例如可以是含水的半 固体凝胶，也可以是颗粒状或细粉状固体，还可以是具有一定形状的块状固体。
本发明复合生物材料可用于制备组织工程用途的细胞支架，可以是注射型的细胞支架， 也可以是植入型的细胞支架。
本发明复合生物材料集合了 HAP和cHA的优点，即具备较强的力学性能和骨传导作用， 又具有cHA适宜的降解速度和一定的弹性和韧性，且生物相容性好，使用更安全，是一种非 常有前景的细胞支架材料。
具体实施例方式
以下实施例是为了更好地说明本发明，不是限制本发明。 实施例一
61,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)交联的cHA凝胶和HAP组成的复合生物材料。制备 方法如下
方法l.l: (1)将lg透明质酸钠(SH，平均分子量100万道尔顿)和0.25gHAP (平均 粒径100 500nm)混匀后，与含有50mg BDDE的l%NaOH溶液5ml混合，于50。C反应2 4h，加入蒸馏水40ml， 25'C静置8 16h，获得块状凝胶。(2)将块状凝胶冷冻干燥6 12h， 生理盐水纯化10h，乙醇脱水，减压干燥，切割或破碎，环氧乙烷灭菌，即得。
方法1.2: (1)按方法1.1中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积1.8% 氯化钠溶液浸泡4h，再用生理盐水纯化4 6h，切割或破碎，冷冻干燥6 12h，环氧乙烷灭 菌，即得。
方法1.3: (1)按方法l丄中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积2 倍等渗浓度的磷酸盐缓冲液(PBS)(每1000ml含有NaH2P04 21120 90 mg， Na2HP04 *12H20 1.12g， NaCl 17g)浸泡4h,再用等渗PBS (每1000ml含有NaH2P04 2H20 45mg， Na2HP04 12H20 0.56 g， NaCl 8.5g， pH 7.2)纯化4 6h，切割或破碎，121。C灭菌15min，即得。
方法1.4: (1)按方法1.1中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶用50% 70% 乙醇纯化4 12h，无水乙醇脱水，减压干燥，切割或破碎，环氧乙垸灭菌，即得。
方法1.5: (1)将lg SH (平均分子量75万道尔顿)与含有60mg BDDE的l%NaOH溶 液15ml混合，再加入10gHAP (平均粒径50 200nm)混匀后，于50。C反应2 4h，加入蒸 馏水40ml， 25'C静置8 16h，获得块状凝胶。(2)按方法1.1歩骤(2)操作，即得。
方法1.6: (1)按方法1.5中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法1.4中的歩骤(2) 操作，即得。
方法1.7: (1)将lg SH (平均分子量120万道尔顿)与含有50mg BDDE的l%NaOH 溶液6.5ml混合，于50'C反应2h，加入蒸馏水40ml， 25'C静置8 16h，加入等体积2倍等 渗浓度的PBS浸泡4h，再用等渗PBS纯化4 6h，破碎，得到凝胶颗粒。(2)加入0.05gHAP (平均粒径10 100pm)混合均匀，12rC灭菌15min，即得。
方法1.8: (1)按方法1.7中的步骤(1)得到凝胶颗粒。(2)加入10g HAP (平均粒径0.1 100pm)混合均匀，12rC灭菌15min，即得。
方法1.9: (1)将lg SH (平均分子量120万道尔顿)与含有50mg BDDE的l%NaOH 溶液14ml混合，于50。C反应2 4h，加入lg HAP (平均粒径50 250pm)混合均匀，减压 除去约50%水分，25。C静置8 16h，得到块状凝胶。(2)按方法一中的步骤(2)操作，即 得。
方法1.10: (1)按方法1.9中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法1.2中的步骤(2) 操作，即得。
方法l.ll: (1)按方法1.9中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法1.3中的步骤(2) 操作，即得。 实施例二
己二酸二酰肼(ADH)交联的cHA凝胶和HAP组成的复合生物材料。制备方法如下
方法2.1: (1)将L25g SH (平均分子量120万道尔顿)溶解于50ml蒸馏水中，加入 ADH 125mg和乙基(WA^-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI) 0.3g，滴加0.5 mol/L盐酸溶 液调节pH值6.0，搅拌反应4h，加入等体积2倍等渗浓度的PBS浸泡4h，再用等渗PBS纯 化4 6h，破碎，得到凝胶颗粒。(2)加入0.05gHAP (平均粒径10 100pm)混合均匀，100 'C流通蒸汽灭菌30min，即得。
方法2.2: (1)按方法2.1中的步骤(1)得到凝胶颗粒。(2)加入10g HAP (平均粒径 0.1 10pm)混合均匀，12rC灭菌15min，即得。
方法2.3: (1)将1.25gSH (平均分子量57万道尔顿)溶于50ml Tris-HCl (pH4.0)缓冲 溶液中，加入217mg ADH和0.75g HAP (平均粒径50 250|am)，另取EDCI 0.3g溶解于lml Tris-HCl (pH4.0)缓冲溶液中，然后倒入上述SH和ADH的混合溶液中，迅速混匀，反应得 到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积1.8%氯化钠溶液浸泡4h，再用生理盐水纯化4 6 h， 切割或破碎，冷冻干燥6 12h，环氧乙烷灭菌，即得。
方法2.4: (1)按方法2.1中的歩骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积2 倍等渗浓度的PBS浸泡4h，再用等渗PBS纯化4 6h，切割或破碎，IO(TC流通蒸汽灭菌30min， 即得。方法2.5: (1)按方法2.1中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶用50% 70% 乙醇纯化4 12h，无水乙醇脱水，减压干燥，切割或破碎，环氧乙垸灭菌，即得。
方法2.6: (1)将1.0gSH (平均分子量81万道尔顿)溶解于50ml蒸馏水中，加入ADH 3.5g和EDCI0.9g，滴加0.5mol/L盐酸溶液调节pH值4.8，搅拌反应4h，用去离子水和25% 乙醇溶液交替透析，得到反应产物。(2)力n入0.5gHAP (平均粒径500 1200pm)混合均匀， 减压除去50% 70%水分，冷冻干燥6 12h，切割或破碎，环氧乙烷灭菌，即得。
方法2.7: (1)按方法2.6中的步骤(1)得到反应产物。(2)加入2.5gHAP (平均粒径 100 500pm)混合均匀，减压除去50% 70%水分，50% 95%梯度乙醇脱水，减压干燥， 切割或破碎，环氧乙烷灭菌，即得。
方法2.8: (1)按方法2.6中的步骤(1)得到反应产物。(2)加入25g HAP (平均粒径 0.1 50pm)混合均匀，减压除去50% 70%水分，冷冻干燥6 12h，切割或破碎，环氧乙 烷灭菌，即得。 实施例三
二乙烯基砜(DVS)交联的cHA凝胶和HAP组成的复合生物材料。制备方法如下
方法3.1: (l)将lgSH(平均分子量100万道尔顿)和0.25g HAP(平均粒径100 500nm) 混匀后，与含有0.2gDVS的1。/。NaOH溶液25ml混合，于25。C反应lh，加入蒸馏水25ml， 25'C静置8 12h，获得块状凝胶。(2)将块状凝胶冷冻干燥6 12h，生理盐水纯化10h，乙 醇脱水，减压干燥，切割或破碎，环氧乙垸灭菌，即得。
方法3.2: (1)按方法3.1中的歩骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶用50% 70% 乙醇纯化4 12h，无水乙醇脱水，减压干燥，切割或破碎，环氧乙烷灭菌，即得。
方法3.3: (1)按方法3.1中的歩骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积2 倍等渗浓度的PBS纯化4 6h，切割或破碎，12rC灭菌15min，即得。
方法3.4: (1)将lg SH (平均分子量75力'道尔顿)与含有0.4g DVS的0.5%NaOH溶
液25ml混合，再加入15gHAP (平均粒径50 200nm)混匀后，于25。C反应lh，加入蒸馏
水40ml， 25。C静置8 12h，获得块状凝胶。(2)按方法3.1中的歩骤(2)操作，即得。
方法3.5: (1)按方法3.4中的歩骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法3.2中的步骤(2)操作，即得。
方法3.6: (1)将lgSH (平均分子量120万道尔顿)与含有0.4gDVS的l%NaOH溶液 30ml混合，于25t反应lh，加入蒸馏水40ml， 25'C静置8 16h，加入等体积2倍等渗浓度 的PBS浸泡4h，再用等渗PBS纯化4 6h，破碎，得到凝胶颗粒。(2)加入0.1g HAP (平 均粒径100 500pm)混合均匀，12rC灭菌15min，即得。
方法3.7: (1)按方法3.6中的步骤(1)得到凝胶颗粒。(2)加入25g HAP (平均粒径 0.1 10nm)混合均匀，12rC灭菌15min，即得。
方法3.8: (1)将lgSH (平均分子量120万道尔顿)与含有0.2gDVS的0.5%NaOH溶 液25ml混合，于25。C反应lh，加入lgHAP (平均粒径1 500pm)混合均匀，减压除去约 50%水分，25'C静置8 12h，得到块状凝胶。(2)按方法3.1中的步骤(2)操作，即得。
方法3.9: (1)按方法3.8中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法3.2中的步骤(2) 操作，即得。
方法3.10: (1)按方法3.8中的歩骤(1)得到块状凝胶。(2)按方法3.3中的步骤(2) 操作，即得。
方法3.11: (1)按方法3.8中的步骤(1)得到块状凝胶。(2)将块状凝胶加入等体积1.8% 氯化钠溶液浸泡4h，再用生理盐水纯化4 6h，切割或破碎，冷冻干燥6 12h，环氧乙烷灭 菌，即得。
10
权利要求
1、一种复合生物材料，特征在于该复合生物材料中含有交联透明质酸衍生物和羟基磷灰石。
2、 权利要求1所述的复合生物材料，其特征在于所述的交联透明质酸衍生物与羟基磷灰石的质量比为1000:1 1:1000，优选100:1 1:100，更优选10:1 1:10。
3、 权利要求1或2所述的复合生物材料，其中所述的羟基磷灰石的平均粒径为0.1 1500)am， 优选1 1000pm,更优选50 250nm。
4、 权利要求1或2所述的复合生物材料，其中所述的交联透明质酸衍生物来源于酰肼交联透 明质酸衍生物、环氧甘油醚交联透明质酸衍生物和二乙烯基砜交联透明质酸衍生物中的一种、 任意两种或三种的混合物。
5、 权利要求1或2所述的复合生物材料在制备用于制备组织工程用途的细胞支架中的应用。
6、 权利要求1或2所述的复合生物材料的制备方法，特征在于先将透明质酸或其可溶性盐 与羟基磷灰石混合均匀后进行交联反应获得。
7、 权利要求1或2所述的复合生物材料的制备方法，特征在于先制备交联透明质酸衍生物， 然后再与羟基磷灰石混合均匀获得。
8、 权利要求6或7所述的制备方法制得的复合生物材料。
9、 权利要求8所述的复合生物材料在制备组织工程用途的细胞支架中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种含交联透明质酸衍生物和羟基磷灰石的复合生物材料及其制备方法。本发明复合生物材料的特征在于含有交联透明质酸衍生物和羟基磷灰石。本发明复合生物材料可以采用先将透明质酸或其可溶性盐与羟基磷灰石混合均匀后进行交联反应获得，也可以采用先制备交联透明质酸衍生物，然后再与羟基磷灰石混合均匀获得。本发明复合生物材料生物相容性好，具有适宜的降解速度、力学性能、孔径和孔隙率，可以作为细胞支架应用于骨或软骨组织工程。
文档编号A61F2/82GK101596328SQ200810110418
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月2日 优先权日2008年6月2日
发明者凌沛学, 杰 刘, 敏 汪, 荣晓花, 贺艳丽, 陈建英 申请人:山东省生物药物研究院