乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途的制作方法

专利名称：：乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物化学
技术领域：
。本发明公开了乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的的用途，通过实验表明乌索酸可以改变肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的分裂周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的细胞分裂。乌索酸可以制备抑制肿瘤细胞分裂的药物。
背景技术：
：乌索酸(Ursolicacid，UA)，又名熊果酸、乌苏酸，属五环三萜类化合物，据不完全统计，自然界己有34科108种植物中发现乌索酸，如玄参植物毛泡桐的叶，杜鹊花科植物熊果的叶、果实等。乌索酸为脂溶性物质，可以透过细胞膜发挥作用，并且具有广泛的生物学效应，其突出作用为抗肿瘤，保肝护肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生虫和促进造血系统功能恢复等药理等作用。毒性实验动物实验证明，UA剂量下未发现明显毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kgUA—次，观察72小时，未见动物死亡或明显毒副作用，体重、食欲、活动均未受到影响。小鼠口服UA的LD50为8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50为637mg/kg。家兔急性毒性实验表明，以2.4g/kg十二肠给药，观察24小时，对兔呼吸、血压、心电图无明显影响；亚急性毒性实验表明大鼠口服UA500mg/kg/日X30天，对大鼠的生长、血象、心电图、肝肾功能都无明显影响，其心、肝、脾、肺、肾组织病检也未发现明显异常改变。该剂量是临床成人每日用量(2.4mg/kg/印的208倍。实验结果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者服用UA未见明显毒性反应。用药期间进行心电图、肝功能、血、尿常规检查，未发现异常改变。认为目前口服剂量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。个别患者在服药初期或空腹服用时上腹部稍感不适，未经处理而自行消失。抗肝损伤在实验研究中发现，UA对CCU引起的大、小鼠急、慢性肝损伤具有明显的保护和治疗作用。能使动物血清SGPT1SB及肝甘油三酯显著降低，血清甘油三酯、e-脂蛋白、al、a2球蛋白、肝糖原、及肝脏羟脯氨酸含量明显增加，A/G比值倒置有改善作用，肝细胞变性、坏死明显减轻。证实UA对实验性肝损伤有显著的保护和治疗作用。实验研究还表明UA有明显抗慢肝和抗纤维化等作用。说明UA可以使肝脏合成较多的载脂蛋白，使TG从肝脏运输入血，从而减轻肝脂变。Liu报道UA可以降低由CCU(15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯化镉所至CF-1小鼠肝损伤的程度，使肝金属硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分异构体OA在降低化学试剂诱发的小鼠肝损伤方面更具优势。SaraSwatB,MiuraN等人的实验研究均证实UA具有明显抗肝损伤作用。利胆退黄实验研究表明UA能增加正常大鼠和胆汁瘀积性肝炎大鼠胆汁流量，使APIT模型动物的血清SB含量明显降低，肝组织病理损伤显著减轻，具有保肝、利胆、退黄的作用。抗肝炎临床预试采用病例随机分组，双盲给药，以齐墩果酸(OA)为对照的方法，用UA治疗甲、乙型急性病毒性肝炎102例，剂量为120mg/日，60mg/次，平均治疗时间21天，治愈率89.3%，优于同期IOO例OA对照组的效果(68%)(尸<0.01)。临床试验表明UA有显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，增进食欲和恢复肝功能的作用。服药60天后，对21例HBeAg阳性患者的转阴率为61.4%，对21例HBsAg阳性患者的转阴率为23.8%，对乙肝病毒具有一定的治疗作用。UA治疗的102例患者，停药l年后随访了卯例，结果89例肝功能复查正常，仅l例谷丙转氨酶反跳为110u，后经服用UA治疗又恢复正常，表明UA疗效稳定。UA在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用，不论将UA单独使用，还是与其它药物配合使用，只要制备成药品或保健药品均具有显著治疗病毒性肝炎的作用。抗肿瘤作用近年发现UA具有明显的抗肿瘤作用，其抗肿瘤谱广，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞有明显细胞毒作用、诱导分化作用及抗血管形成作用。对肿瘤的细胞毒作用UA能直接杀伤肿瘤细胞。Lee等用UA进行了多种细胞系的细胞毒试验，结果表明UA对P-388和L1210白血病细胞、A549人肺癌细胞有显著的细胞毒作用，ED50均小于4mg/L;对KB肿瘤细胞、人结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7显示边缘细胞毒作用。Young等从枇杷叶提取UA,腹腔注射能明显延长荷S180小鼠生存期，当UA的浓度为5、1Oumol/L时，S180细胞数明显减少，表明瘤重的减轻是由于UA对S180的细胞毒作用所致。Kim从白花蛇舌草中提取UA进行实验，结果显示UA对所测的肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。Simon、黄镜等实验证明:UA能抑制HL-60细胞增殖、生长及合成DNA，诱导HL-60细胞凋亡。Beek等实验表明胞内0&++信号增强与HL-60细胞凋亡是密切相关的。Kim等深入研究UA诱导肿瘤细胞凋亡的机制，实验结果表明UA能促进人肝癌(HepG2)细胞凋亡，降低HepG2细胞活力，并有时间依赖性和浓度依赖性，3Oumol/L的UA能引起DNA的断裂，产生亚二倍体细胞，增加细胞色素C的释放，增强细胞色素C依赖的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的激活。细胞周期分析结果显示，细胞主要被阻滞在G0期和G1期，并伴S期细胞数的下降，而且UA增加了p21WAF!的表达，在体外试验中，UA显著抑制SV40DNA复制的启始，并大大减少拓扑异构酶-l的DNA断裂，显著降低复制蛋白A的单链DNA的结合活性。这提示UA通过阻断起始阶段复制叉的建立，从而抑制DNA的复制，诱导细胞周期终止。因此认为，UA使p2lWAH表达增加，导致细胞色素C释放和caspase-3激活，抑制DNA复制，从而导致HepG2细胞凋亡和细胞周期终止。抗肿瘤血管形成作用新生血管形成是肿瘤生长和转移的至关重要的病理过程，而在肿瘤新生血管形成过程中，血管内皮细胞(VEC)的活化、增殖、迁移及小管形成是其关键步骤。事实证明，血管再生是实体瘤的增长和转移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以达到控制肿瘤生长和转移的目的。已经发现了许多血管再生抑制剂，如鱼精蛋白、干扰素、血小板因子-4等。这类抑制剂毒性很大，限制了其在临床上的应用。SohoKH等以鸡胚胎绒毛试验模型研究UA的抗血管作用，结果表明UA是很强的血管生成抑制剂，有效浓度为4nmol/egg，ID50为10nmol/egg。该浓度下无细胞毒作用，UA抑制血管内皮细胞增殖的ID50为5umo1/L。王杰军等用20o/。胎牛血清的培养液使VEC呈指数生长状态。而增殖期VEC具有增殖、迁移及小血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA对VEC增殖具有抑制作用，并有剂量依赖性。抑制肿瘤形成生长UA对肿瘤形成生长各阶段具有预防和抑制作用。UA能抗DNA突变、抑制癌变的启动。Ames试验研究发现UA能对抗致癌物如苯并芘[B(a)P]，黄曲霉毒素B1诱发基因突变。UA还具有抗诱变和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA诱导的Raji细胞EpsteinBar病毒早期抗体(EBV-EA)活化试验模型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂，发现UA对TPA诱导Raji细胞EBV-EA活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使Raji细胞的存活率更高;利用同位素标记的佛酯化合物SH-PDB2证明UA不影响TPA与受体的结合，即UA不是通过竞争TPA位点，而是有效地阻断促癌物与受体结合后的环节发挥作用。在二阶段致癌实验中，Huang等发现UA明显抑制TPA对二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的小鼠皮肤癌的促癌作用。实验证明UA对TPA诱导的表皮ODC活性增强有抑制作用。这些作用可能是由于UA阻断ODC，引起多胺枯竭，导致生长抑制，使细胞积累在G1期并出现分化。实验表明，UA可能通过抗氧化作用起到抗始发突变与抗促癌作用。活性氧自由基与肿瘤的发生发展密切相关，Balanehru和Nagarajan研究表明UA有较强的抗氧化作用和捕获O2-自由基的能力，在肝微粒体和P450单胺氧化酶系中对脂质过氧化均有较强的抑制作用。另有实验表明UA能抑制花生四烯酸代谢过程中5-脂氧合酶、环氧合酶活性，阻止前列腺素与白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明乌索酸能抑制人乳腺上皮细胞中的环氧合酶2的转录，也由此抑制前列腺素2生成。诱导癌细胞分化作用癌是一类生长失控，分化差或未分化的疾病。治疗癌的新途径是诱导癌细胞分化为良性或正常细胞。Lee等报道7.5umol/L的UA可以诱导F9畸胎瘤细胞成为内胚层细胞，并且引起与其分化有关的IV型胶原及维甲酸受体表达增加，且能导致M1细胞分化为巨噬细胞。UA诱导癌细胞分化成正常细胞可能因UA结构上类似于糖皮质激素通过与GS-R受体或类似的核受体结合发挥作用有关。Cha等对侵袭性最强的人HT1080纤维瘤细胞进行研究，实验表明UA能降低基质金属酶9(MMP-9)基因的表达从而对抗人HT1080纤维瘤细胞的侵袭性。增强免疫功能作用UA能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高，体内试验表明可明显增强机体免疫功能。You等研究发现UA能诱导小鼠休止巨噬细胞释放NO、TNF-a增多，并呈剂量依赖性，这是通过核因子-KB(NF-KB)复合物介导，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF-a的mRNA水平提高，从而上调iNOS和TNF-a的表达，增加NO、TNF-a的产生，增强抗肿瘤活性。Hsu等试验先给小鼠腹腔内注射UA，30分钟后再以亚致死量全身照射4Gy，结果显示UA能通过植物血凝素的介导，加强照射后脾母细胞化的反应，使效应T淋巴细胞、效应B淋巴细胞大量增多，加强外周血细胞的作用，从而减轻放射后造血组织的损伤。抗艾滋病病毒作用实验研究表明，从桑毛路边青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV蛋白酶的作用。抗炎抑菌作用Maria等实验结果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酉旨(EPP)诱发的耳水肿，剂量为015mg/耳，抑制率分别为73.4%、30.3%;抑制角叉菜胶诱发的水肿，口服剂量为100mg/kg，抑制率为35.5%;抑制由血清素诱发的水肿，剂量为50mg/kg，抑制率为48.6。/o;抑制由放射菌素D和放射菌素酮诱发的鼠爪水肿，剂量为50mg/kg，抑制率分别为47.5%、47.4%。另有报道大鼠每天腹腔注射12.5mg/kgX7d，有延缓植入羊毛球的发热过程，增加肝糖原，降低心、横纹肌及肌糖原，有糖皮质激素样作用，临床用作胶原抑制剂。UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生长，其最低抑菌浓度为300ug/ml、50-400ug/ml、200-800ug/ml、100-700ug/ml;能抑制羊毛小孢子菌的生长;降低暴露在Hepes单病毒中的Verd细胞的细胞病变程度。降血脂抗动脉粥样硬化作用苏联学者Parfentena等发现UA可以降低家兔和大鼠血胆固醇(44%)和P-脂蛋白水平(50%)，具有降血脂、抗动脉粥样硬化作用。
发明内容本发明的目的是提供一种乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的新用途，即乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的应用。无论将乌索酸单独使用，还是与其他药物配合使用，只要制备成药品或保健品均具有抑制肿瘤转移的作用。本发明所述的乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途，其特征在于所述的乌索酸可以改变肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的分裂周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的细胞分裂。本发明用MTT法证明乌索酸对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞分裂具有明显的抑制作用。MTT法是现代检测细胞存活率最经典的基本方法。该法利用活细胞具酶活性而死细胞无酶活性的原理设计。因为黄色的四氮唑[MTT]能接受脱氢酶给予的氢原子而转变为蓝紫色的甲次；活细胞因具脱氢酶，故能被染成蓝紫色。死细胞无活性脱氢酶，故不呈蓝紫色，培养液中活细胞越多，蓝紫色越深。进一步在细胞培养液中加入二甲基亚砜(DMSO)，可使蓝紫色的蓝次溶出。培养液中活细胞越多，蓝紫色越深，在酶标仪上测各孔的吸光值(测定波长490nm)可测得其光密度值(A值)，根据其与对照组A值相比，可定量折算相对抑瘤率相对抑瘤率=(处理孔的光密度值/空白对照孔的光密度值)X100%结果发现乌索酸即使在微量浓度下(5-60pg/ml),对人肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞都有显著的生长抑制作用。且抑制强度与药物浓度和作用时间呈正相关。即乌索酸浓度越高，作用时间越长，抑制率越高。乌索酸在30pg/ml的浓度下，作用1天，它对人肝癌细胞(Bel-7402)的抑制率为29.7%;作用2天，它对人肝癌细胞(Bel-7402)的抑制率为43.7%;作用3天，它对人肝癌细胞(Bel-7402)的抑制率为74.5%。结果还发现乌索酸抑制肿瘤细胞是通过抑制肿瘤细胞的分裂来实现的。通过流式细胞仪检测发现，乌索酸抑制肿瘤细胞分裂主要是将细胞分裂阻滞在Gl/S期。在临床使用中，可以将本发明乌索酸制成片剂、固体分散体、滴丸、纳米粒等口服制剂，建议临床成人每日用量(24mg/kg，d)，每日分3次服用，30天一个疗程。本发明将通过实施例进一步阐述本发明。具体实施例方式实施例1乌索酸的提取分离材料与方法材料枇杷叶药渣为水煎法生产枇杷糖浆的废弃物，外观小条形，色黑,由江西海尔思药业公司提供。试剂食用级95%乙醇(广西糖厂生产)；"YCXY21号"除杂剂(自制)，活性炭，分析纯(上海豪申化学试剂有限公司生产)；乌索酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)。仪器FC2204分析天平(上海天平分析仪器厂)；PerkinElmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)。方法工艺流程。采用"醇提凝析法"新工艺提取分离。枇杷叶药渣一加乙醇回流提取一回收乙醇一用除杂剂除杂一活性炭脱色一凝析分离一纯化精制一烘干一乌索酸。具体操作。取干燥的枇杷叶药渣lkg，共3份，分别用7倍量90%乙醇分2次于80'C回流提取各lh，合并提取液，回收乙醇后，用"YCXY21号"除杂剂除杂，再用活性炭脱色，经凝析分离、纯化精制即得。结果与分析乌索酸的产率将所得产品于105'C烘干24h，称重。性状鉴别产品为无色针状结晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于石油醚和水。定性鉴别L2B反应。取样品少许，以95%乙醇溶解，吸取乙醇溶液l滴，置试管中，力mml醋酐试剂，摇匀，力Blml浓硫酸试剂，在醋酐与浓硫酸界面上呈紫红色圆环。薄层鉴定。取活化后的硅胶G硬板，将样品的乙醇溶液点样，同时用乌索酸对照品作对照，以环己垸丙酮(3:1)为展开剂，展距10cm，取出晾干，喷雾10%硫酸乙醇溶液，于105。C加热510min，结果在与对照品相应的位置上显相同颜色的紫红色斑点，在365nm紫外光下显相同颜色的金黄色荧光斑点。红外光谱鉴定。产品IRKBrmax"/cm:3434(-OH)、2968、2927、2871(C-H)、1694(C=0)、1456、1384(CH3)、1031(C-O)。其特征吸收与乌索酸标准品的红外光谱完全一致。上述分析结果证明，所得产品为乌索酸。实施例2实验材料(以下细胞株均购自美国ATCC标准细胞库)品系名称相关描述A549人非小细胞肺癌细胞株Bel-7402人肝癌细胞株MGC803人胃癌细胞株MCF-7人乳腺癌细胞株K562人红白血病细胞株主要试剂RPMI1640培养基干粉GIBCO公司小牛血清GIBCO公司/杭州四季青公司Trypsin、DMSO、MTTFluka公司青霉素、链霉素Sigma公司Ursolicacid标准品宜春学院天然药物研究江西省重点实验室Cisplatin江苏森豪药业股份有限公司培养基及常用溶液肿瘤细胞培养基RPMI1640培养基加入10°/。的小牛血清。含2g/LNaHC03，，100U/ml和链霉素100U/ml,过滤除菌，4。C保存。PBS:800ml水中溶解0.2gKCl，0.44gNa2HPCX^a0.24gKH2P04，HCl调节pH关加水定容至1L，高压灭菌。消化液EDTA/PBS(无Ca2+Mg^)/胰蛋白酶缓冲液主要仪器C02培养箱美国ThermoForma公司酶标仪BioRad公司荧光倒置相差显微镜德国Leica公司高速冷冻离心机日本HITACHI公司超低温冰箱日本SANYO公司微量高速离心机TGF-16G南京大学仪器厂恒温水浴锅常州国华电器有限公司隔水式培养箱上海福玛公司高压灭菌锅超净工作台电子天平6孔、24孔及96孔细胞培养板上海三申医疗器械有限公司苏州净化设备厂上海民桥仪器有限公司CorningCostar公司实验方法MTT法测定肿瘤细胞生长的抑制作用将细胞(活细胞率295%)接种于96孔培养板，每孔含3-5><103个细胞，空白孔不接种细胞，置于37'C，5。/。C02饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞培养24hr贴壁后去掉培养基，加入不同浓度的受试药物，阴性孔和空白孔均加入无血清培养基作为对照，每孔200pl，细胞培养44hr后吸去培养基，每孔加入5mg/mlMTT20|J，温育4hr。弃上清，每孔加入DMSO150pl，酶标仪测定490nm值，按下式计算细胞生长抑制率并作图计算IC50。每个剂量浓度设3个平行孔，重复试验3次。InhibitionRatio(。/。^(阴性孔OD值-试验孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值>100°/0实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>n=6,mean±SD，重复3次，*为P<0.05(有显著差异)；**为P<0.01(有极显著差异)实验结果表明乌索酸能明显抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的增殖。实施例3UA对肿瘤细胞分裂周期的调控实验材料同实施例2主要试剂碘化丙啶Sigma公司转染试剂LipofectaminTM2000InvitrogenAnnexinV凋亡检测试剂盒BeckmanCoulter公司RnaseA上海生工生物工程技术有限公司RPMI1640培养基干粉Gibco公司胰蛋白酶Amersco公司MTTSigma公司主要仪器FACSCalibur流式细胞仪BectonDickinson公司荧光倒置显微镜Ldca公司主要溶液PBST缓冲液PBS缓冲液中加入0.1%Tween-20其它同实施例2实验方法细胞的培养肿瘤细胞在含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，37°C，5%。02的培养箱中培养。MTT检测法将4-5X103个细胞接种于96孔板的每孔，每孔180PL，每组平行8L，并设立空白，阴性药对照，阳性药。44h后，弃上清，每孔加20yL新配制的5g/LMTT，孵育4h,弃上清，加150WLDMSO溶解，混匀后用Bio-Rad型号的酶标仪490nm波长测定。流式细胞术检测用药后48h，细胞胰蛋白酶消化30s，收集细胞，PBS洗两遍，加入lmL乙醇固定过夜，去乙醇，PBS洗两遍，加入100uL浓度为10tig/mL的PI，混匀后室温避光孵育30min,在反应管中加400uLPBS，上机检测细胞周期变化。实验结果表明乌索酸能明显使肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞阻滞在Gl/S期。并与药物浓度呈现正相关性。在浓度为10ng/ml乌索酸作用48小时后，肺癌A549、肝癌Bel-7402、胃癌MGC-803、乳腺癌MCF-7和白血病细胞K562分别增加了21.4%、36.6%、19.2%、42.3%和12.8。/。的细胞被阻滞在G1/S。权利要求1、乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途。2、根据权利要求1所述的乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途，其特征在于所述的乌索酸可以改变肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的分裂周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的细胞分裂。3、根据权利要求1或要求2所述的特征在于乌索酸可以制备抑制肿瘤细胞分裂的药物。全文摘要本发明属于药物化学
技术领域：
。本发明公开了乌索酸在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途，通过实验表明乌索酸可以改变肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的分裂周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的细胞分裂。乌索酸可以制备抑制肿瘤细胞分裂的药物。文档编号A61K31/56GK101444516SQ20081013660公开日2009年6月3日申请日期2008年12月24日优先权日2008年12月24日发明者陆云华申请人:宜春学院