专利名称：：一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜及制备方法，属于生物材料领域。
背景技术：
：通过对医用高分子材料的表面改性，一方面可以提高血液相容性，另一方面还可保持其原有的良好物理机械性能。材料表面改性的方法包括(l)吸附或涂层，技术简便有效但改性表面不能长效稳定存在。(2)等离子体、辉光放电和电晕放电技术，应用广泛但表面接枝不均一，工艺难以放大。(3)表面接枝聚合，可以将特定的官能团固定在材料表面，具有长效性。(4)表面分子自组装，分子自发通过化学键牢固吸附在固体表面而形成的一种有序分子组合体。这些表面改性的方法可以综合分为共价和非共价的改性。其中，共价改性的稳定性最好，在医用材料领域更能延长生物活性分子的寿命，防止代谢和持续活性。因此，近年来利用共价连接生物组分对高分子进行修饰改性成为高分子材料领域的研究焦点。在抗凝血材料的研究中，表面肝素化是直接且行之有效的方法。在人体内，内皮细胞等与血液接触的细胞能够分泌硫酸肝素或肝素等物质，保持血液在循环的过程中不凝固。肝素是由硫酸D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸组成的粘性多糖，作为目标抗凝血药物需要测到极微量，正常人血浆中含量极少，仅0.09mg/L。其抗凝血作用主要通过抗凝血酶ni和肝素辅助因子n、活化的蛋白抑制物发挥抗凝作用，其中ATin占80n/。。利用肝素提高医用高分子材料的抗凝血性能已经有几十年的历史，众多的实验及临床效果早已肯定了肝素对提高材料抗凝血性能的积极作用，而且近年来的研究结果表明肝素可减少高分子材料介入所引起的细菌感染。肝素可以通过物理或化学的方法与医用高分子材料结合。物理方法具有简单、有效的优点，但有效期短。物理方法主要有物理共混(包括表面共混和、均相共混)和物理吸附(涂层法)。从肝素的利用效果考虑，物理方法不够理想。化学方法是通过化学键将肝素固定于材料上，肝素利用率高，长期效果较好。如果直接把肝素固定在材料表面，会影响肝素的活性。一般是采用先在材料表面接上间隔臂，再将肝素固定在间隔臂上。目前抗凝血药物主要有肝素、水蛭素、香豆素类，以及抗凝血酶m、尿激酶等，化学接枝的方法由于苛刻的反应条件，容易破坏药物的生物活性。因此，亟待开发一种方法，不仅能够保持抗凝血药物生物活性、而且能够使材料具有缓释长效的抗凝血功能。微胶囊是药物控释应用广泛的方法，而且微胶囊能够将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封在选择透过性膜中，形成"生物微胶囊"，对生物活性分子控释的同时也起到很好的保护作用。通过两种或两种以上带相反电荷的聚合物电解质在模板核上凝聚而成的，即层层自组装(layer-by-layerself-assembly)的微胶囊技术，层层自组装法制备条件温和，微囊大小、厚度和释放可调控，而且微胶囊结构和性能多样。聚乳酸是继聚乙醇酸之后第二类经FDA批准可用于人体的可降解聚合物材料。相对于其他的人工合成高分子材料，它具有良好的生物相容性、可降解吸收性和一定的机械强度等优点。本发明通过引入层层自组装的微胶囊对抗凝血物质进行保护与可控释放，然后利用共价连接将微胶囊固定在聚乳酸膜材料表面，最终获得了具有良好抗凝血活性的抗凝血材料。
发明内容本发明的目的在于提供一种应用在抗凝血医用材料上的利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜及其制备方法。本发明的目的由以下技术方案实现的本发明的一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，由共价键连接的聚乳酸膜和载肝素微胶囊组成，其中载肝素微胶囊是以海藻酸钙模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。其组分质量百分比如下聚乳酸膜90%~99%海藻酸钙微球0.1%~10%聚烯丙胺0.001%~1%肝素0.001%~1%所述的聚乳酸膜厚度为50100pm，聚乳酸的分子量为200~500Kd。所述海藻酸钙微球尺寸大小250|im，载肝素含量150pg/个微胶囊。本发明的一种利用载肝素微胶囊表面修饰聚乳酸膜的方法，其具体制备步骤如下步骤一、将聚乳酸在温度140。C180。C，压力2025MPa的高温高压条件下在注塑机器中制成厚度为50100,的聚乳酸膜。步骤二、室温下将异辛垸、司班(span)85和1%4%wt海藻酸钠水溶液以50:1:50~200:1:200的质量比混合，超声乳化560min，再加入异辛烷和吐温(Tween)85，继续超声乳化20min以上，然后逐滴加入10%wtCaCl2溶液，充分搅拌20min以上，离心即可得到海藻酸钙微球；其中再次加入的异辛烷和Tween85与一次乳化后混合液质量比为1:2;200，CaCb与二次乳化后的混合液体积比l:1;步骤三、采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊；步骤四、将第一歩制备好的聚乳酸膜用0.05%wt的NaOH溶液活化5分钟以上，其中聚乳酸膜与NaOH溶液的质量比为1:1，再用去离子水洗干净；在室温，将活化好的聚乳酸膜与l-乙基-3-(3-二甲基氨丙萄-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在pH为4~7的醋酸-醋酸钠缓冲液中活化10120min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜。其中，EDC/NHS的摩尔比例为1:1h8，EDC/NHS与聚乳酸膜的材料质量比为1:1~1:5。步骤五、将第三步制得的微胶囊经过99.5°/。wt的三乙胺清洗5min以上，其中微胶囊与三乙胺的质量比为1:3~1:10;清洗后的微胶囊与第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜，在pH为4~7的醋酸-醋酸钠缓冲液孵化10120min，其中微胶囊、具有羧基中间体的聚乳酸膜和醋酸-醋酸钠缓冲液的质量比为1:100:5001:200:1000;之后将取出孵化后的聚乳酸膜用10%Wt的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液摇床清洗5分钟以上，其中每lg的聚乳酸膜需要100ml的SDS水溶液清洗，最后用去离子水洗干净，即得目标产物。本发明的一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，可应用于制备具有高效抗凝血活性的复合生物医用材料，例如人工血管，心脏瓣膜等血液接触性有效结果本发明的利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，无毒，生物相容性好、可降解、具有良好的力学性能和稳定长效的抗凝血性能，能够干燥储存和运输，可以广泛用于抗凝血材料和药物控制释放材料。图l层层自组装的载肝素微胶囊表面电位；图2层层自组装的载肝素微胶囊的红外光谱对比图3聚乳酸膜和共价连接微胶囊的聚乳酸膜红外光谱对比图。具体实施例方式本发明以聚乳酸膜为基质材料，采用层层自组装技术制备的抗凝血微胶囊，采用EDC/NHS催化的共价键连接，将微胶囊固定在聚乳酸膜表面，得到力学性能好、抗凝血性能持续时间长、活性高的聚乳酸膜。本发明所述的载肝素微胶囊表面修饰聚乳酸膜的制备方法，以下结合实施例进一步说明实施例l1.聚乳酸膜的制备将5公斤聚乳酸放入已经预设好温度140C，压力25MPa，预设厚度100)om的不锈钢注塑机器中成膜。2.海藻酸钙微球模板的制备异辛垸50g、lg的span85和1%(wt)海藻酸钠水溶液50g，室温混合，超声乳化20min，再加入lg的异辛烷和2g的Tween85，继续超声乳化20min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液与10%(wt)CaCl2体积比l:1，充分搅拌20min，离心即可得到海藻酸钙微球。3.采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。微胶囊囊尺寸、质量、载肝素含量不限制。4.载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的制备将第一步制备好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH溶液5min，用去离子水洗干净；将活化好的聚乳酸膜与EDC/NHS以10:4:1的比例在pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液活化15min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜。5.将第三步制得的微胶囊经过0.002M99.5%(wt)的三乙胺清洗5min;微胶囊和第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜在pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中反应20min，之后用10%(wt)十二烷基磺酸钠(SDS)摇床清洗5分钟，最后用去离子水洗干净，得到目标产物。实施例21.聚乳酸膜的制备将5公斤聚乳酸放入已经预设好温度150C，压力25MPa，预设厚度lOOpm的不锈钢注塑机器中成膜。2.海藻酸钙微球模板的制备异辛烷、span85和2%(wt)海藻酸钠水溶液50:1:50,室温混合，超声乳化30min，再加入异辛烷lg和Tween852g，继续超声乳化20min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液与10°/。(wt)CaCl2体积比l:1，充分搅拌20min，离心即可得到海藻酸钙微球。3.采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。微胶囊囊尺寸、质量、载肝素含量不限制。4.载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的制备将制备好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5min，用去离子水洗干净；将活化好的聚乳酸膜与EDC/NHS以10:5:l的比例，在pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液活化10min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜。5.将第三步制得的微胶囊经过0.002M99.5。/。(wt)的三乙胺清洗5min;微胶囊和第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜在pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中反应30分钟。之后用10%(wt)十二垸基磺酸钠(SDS)摇床清洗5分钟，最后用去离子水洗干净，得到目标产物。实施例31.聚乳酸膜的制备将5公斤聚乳酸放入已经预设好温度160C，压力25MPa，预设厚度50|im的不锈钢注塑机器中成膜。2.海藻酸钙微球模板的制备异辛烷150、span852g禾卩2%(wt)海藻酸钠水溶液150g，室温混合，超声乳化40min，再加入异辛烷lg和Tween852g，继续超声乳化60min，逐滴加入10%(wt)CaCb溶液，混合液与10°/。(wt)CaCl2体积比l:3，充分搅拌20min，离心即可得到海藻酸钙微球。3.采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。4.载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的制备将制备好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5min，用去离子水洗干净；将活化好的聚乳酸膜与EDC/NHS以10:4:3的比例，在pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液活化20min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜。5.将第三步制得的微胶囊经过0.002M99.5Q/。(wt)的三乙胺清洗5min;微胶囊和第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜在pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中反应60分钟。之后用10%(wt)十二烷基磺酸钠(SDS)摇床清洗5分钟，最后用去离子水洗干净，得到目标产物。实施例41.聚乳酸膜的制备将5公斤聚乳酸放入己经预设好温度170C，压力25MPa，预设厚度lOOpm的不锈钢注塑机器中成膜。2.海藻酸钙微球模板的制备异辛烷200、span85lg和2%(wt)海藻酸钠水溶液200g，室温混合，超声乳化50min，再加入异辛垸lg和Tween852g，继续超声乳化60min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液与10%(wt)CaCl2体积比l:4，充分搅拌20min，离心即可得到海藻酸钙微球。3.采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。4.载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的制备将制备好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5分钟，用去离子水洗干净；将活化好的聚乳酸膜与EDC/NHS以10:4:4的比例，在pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液活化20min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜。5.将第三步制得的微胶囊经过0.002M99.5。/。(wt)的三乙胺清洗5min;微胶囊和第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜在pH7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中反应120分钟。之后用10%(wt)十二烷基磺酸钠(SDS)摇床清洗5分钟，最后用去离子水洗干净，得到目标产物。上述获得的载肝素层层自组装微胶囊经过表面Zeta电位分析(如图1)和红外光谱表征(如图2)。微胶囊表面电位表现出有规律的正负交替变化，电位比较稳定，即说明PAH成功地吸附到海藻酸钠胶体粒子上，肝素也吸附在PAH包裹胶体粒子的表面。海藻酸钙微球的表面带有较强的负电，这使得带正电的PAH纳米膜吸附在海藻酸钙微球的表面，从而微球表面电性改变，呈正电性。带负电的肝素又吸附到微球的表面，所以微胶囊表面的电荷发生正负交替变化。海藻酸钠、肝素、和PAH/Hep的海藻酸钙微球的红外表征见图2，在1590cm'11470cm"左右是N-H和C-H的特征峰，1115cnf^1170cm"是-SC^的特征峰，1740cm"1540cm"是酰胺的特征峰，表明PAH膜上含有胺基基团，海藻酸钠表面含有羰基基团。3000cm"处的竖峰是制备样品中的空气峰。海藻酸钠具有在15卯cm—11470cm'1左右是N-H和C-H的特征峰，PAH在2800cm"处有C=C的特征峰和2000cm"左右的苯环特征吸收峰，肝素具有1115cm—11170cm"是-SC^的特征吸收峰，(PAH/Hep/PAH)膜的海藻酸钙微微胶囊兼具海藻酸钠、肝素和PAH的特征峰。上述获得的载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的经电镜照片观察，显示聚乳酸膜保持平整，微胶囊的形态保持完好，聚乳酸膜上的微胶囊数量大于0.1±0.021个/,2。如图3，红外光谱表明15701670cm"之间出现特征峰，说明存在酰胺键(酰胺I，1550-1670cm";酰胺II，1500-1570cm")，23002900cm—1之间出现卤化氨基(PAH)的特征峰。2700-3200cm"之间的羟基峰显著减少，16201820cm'1之间的羰基峰也显著减少，说明羧基与氨基发生縮合反应。载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜的凝血时间实验将载肝素微胶囊共价连接聚乳酸膜精密裁成3x5mm的小片，置于血凝仪比色杯底部，进行凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定。从表l中可以看出载肝素微胶囊共价连接的聚乳酸膜能显著延长血浆的血凝时间。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，其特征在于由共价键连接的聚乳酸膜和载肝素微胶囊组成，其中载肝素微胶囊是以海藻酸钙模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊，其组分质量百分比如下聚乳酸膜90％～99％海藻酸钙微球0.1％～10％聚烯丙胺0.001％～1％肝素0.001％～1％。2、如权利要求1所述的一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，其特征在于所述的聚乳酸膜厚度为50~100ixm，聚乳酸的分子量为200~500Kd，海藻酸钙微球尺寸大小2~50|^im，载肝素含量150pg/个微胶囊。3、一种利用载肝素微胶囊表面修饰聚乳酸膜的方法，其特征在于具体制备步骤如下步骤一、将聚乳酸在温度140。C180。C，压力2025MPa的高温高压条件下在注塑机器中制成厚度为50100pm的聚乳酸膜；步骤二、室温下将异辛烷、span85和1。/b4。/。wt海藻酸钠水溶液以50:1:50~200:1:200的质量比混合，超声乳化560min，再加入异辛烷和Tween85，继续超声乳化20min以上，然后逐滴加入10%wtCaCl2溶液，充分搅拌20min以上，离心即可得到海藻酸钙微球；其中再次加入的异辛烷和Tween85与一次乳化后混合液质量比为l:2:200，CaCl2与二次乳化后的混合液体积比l:1;步骤三、采用静电层层自组装技术，以带负电的海藻酸钙微球作为模板，聚烯丙胺作为聚阳离子、肝素作为聚阴离子，制备具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊；步骤四、将第一步制备好的聚乳酸膜用0.05%wt的NaOH溶液活化5分钟以上，其中聚乳酸膜与NaOH溶液的质量比为1:1，再用去离子水洗干净；在室温，将活化好的聚乳酸膜与l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在pH为4~7的醋酸-醋酸钠缓冲液中活化1(K120min，得到表面具有羧基中间体的聚乳酸膜；其中，EDC/NHS的摩尔比例为h8，EDC/NHS与聚乳酸膜的材料质量比为1:5;聚乳酸膜海藻酸钙微球聚烯丙胺肝素卯％99%0.1%10%0扁％~1%0鹿％~1%。步骤五、将第三步制得的微胶囊经过99.5。/。wt的三乙胺清洗5min以上，其中微胶囊与三乙胺的质量比为1:31:10;清洗后的微胶囊与第四步制得的具有羧基中间体的聚乳酸膜，在pH为47的醋酸-醋酸钠缓冲液孵化10120min，其中微胶囊、具有羧基中间体的聚乳酸膜和醋酸-醋酸钠缓冲液的质量比为1:100:5001:200:1000;之后将取出孵化后的聚乳酸膜用10%Wt的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液摇床清洗5分钟以上，其中每lg的聚乳酸膜需要100ml的SDS水溶液清洗，最后用去离子水洗干净，即得目标产物。4、本发明的一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜，其特征在于用于制备具有高效抗凝血活性的复合生物医用材料。全文摘要本发明涉及一种利用载肝素微胶囊表面修饰的聚乳酸膜及制备方法，属于生物材料领域。本发明由共价键连接的聚乳酸膜和载肝素微胶囊组成，其中载肝素微胶囊是以海藻酸钙模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊。本发明将采用静电层层自组装技术制备的具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺结构的3层膜微胶囊与经EDC/NHS处理后聚乳酸膜反应，得到目标产物。本发明无毒，生物相容性好、可降解、具有良好的力学性能和稳定长效的抗凝血性能，能够干燥储存和运输，可以广泛用于抗凝血材料和药物控制释放材料。文档编号A61L33/10GK101444647SQ20081019296公开日2009年6月3日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者娟李,杨新林申请人:北京理工大学