专利名称：一种猪细小病毒病活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属兽医生物新医药技术领域，涉及猪细小病毒病疫苗，尤其涉及一种猪细
小病毒病活疫苗及其制备方法。
背景技术：
猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)感染而引起的猪繁殖 障碍性疾病之一。PPV感染主要引起胚胎和胎儿的死亡，妊娠母猪表现流产，产死胎，木乃伊 和弱仔等，尤其以产木乃伊胎多见。同时，PPV能加重猪圆环病毒引起的断奶仔猪多系统衰 竭综合征，与其他免疫抑制性疾病并发感染时常给猪场带来毁灭性打击。本病广泛分布于 世界各地，给养猪业造成巨大的经济损失。 自Mayr于1966年首次分离报道该病毒以来，已相继从欧洲、美洲和亚洲等很多 国家分离到猪细小病毒和检测到抗体。我国在20世纪80年代初就有本病的报道，1983 1985年间，侯世宽、潘雪珠、邬捷分别在黑龙江、上海、四川等地分离到PPV。近年来，在湖 北、河南、山东、福建、广西、新疆等地均有PPV感染的报道。调查表明，PPV在猪群中的感染 率呈上升趋势，在我国经产母猪和种公猪感染率高达92%。感染的公猪及母猪是主要的传 染源，病毒常由胎盘感染和交配感染传给胎儿，也可通过被污染的食物、环境由呼吸道、消 化道传给易感动物，鼠类是重要的传播媒介。 本病的流行常发生于春秋产仔季节，常见于初产母猪，一般呈地方性流行或散发。 一旦PPV传入阴性猪场，增殖、传播迅速，于3个月内几乎100%的猪只都会受到感染，在本 病发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败。母猪怀孕期感染后，其胚胎死亡率 可达80% 100%。近年来由于规模化、集约化养殖程度越来越高，PPV感染呈现越来越严 重的流行趋势，给我国养猪业也造成严重危害。 PPV感染目前还没有有效的治疗方法，同其它许多病毒病的防制一样，该病也主要 以疫苗免疫预防为主。由于PPV血清型单一、免疫原性高，使得疫苗接种成为控制PPV感染 的一种行之有效的方法。目前已有10多个国家研制出了 PPV疫苗，包括灭活疫苗与弱毒活 疫苗。
1.灭活疫苗 自1976年开始，国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报道，并于20世纪80年代在 美国、澳大利亚、法国等国家普遍应用。我国潘雪珠等(1987)首先成功研制了PPV灭活疫 苗，此后邬捷、韩孝成、肖驰、叶向阳等先后成功研制出PPV灭活疫苗。 目前我国已经取得新兽药证书的猪细小病毒病疫苗有上海农科院畜牧兽医研究 所研制的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗((94)新兽药证字第04号)、武汉中博生化有限公司 猪细小病毒病灭活疫苗(CP-99株)(2006)新兽药证字08号、华中农业大学、武汉科前动物 生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司联合研制的猪细小病毒病灭活疫苗(wH-l 株)((2006)新兽药证字71号)。在市场上销售猪细小病毒灭活疫苗的厂家主要有上海 佳牧生物制品有限公司(技术依托为上海农业科学院畜牧兽医研究所)、齐鲁动物保健品前动物生物制品有限责任公司、上海海利生物药品有限公司、上海松江生 物药品有限公司等。 灭活苗的使用剂量大，副反应也较大，促进了活疫苗的研发。
2.活疫苗 PPV弱毒活疫苗在国外已有商品化产品，最早发现和应用于临床的是美国的PPV
NADL-2弱毒株，该毒株是将PPV强毒在实验室利用细胞培养连续传代50次以上致弱的。日
本学者Fujisaki等将PPV野毒PPV 90HS在猪肾细胞上低温(30°C )连续传54代，产生HT
变异株，在此基础上，Akihiro等将HT株在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代，获得了
安全性更好的HT-SK-C株，利用该毒株生产的弱毒活疫苗已在日本商品化。 由于PPV强毒株的大量存在，人们对病毒重组及弱毒返强的担心使弱毒活疫苗的
应用受到一定限制，但是上述活疫苗在临床上的多年应用效果证实，其是安全可靠的。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种具有良好安全性和免疫原性的猪细小病毒病活 疫苗及其制备方法。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 —种猪细小病毒病活疫苗，其特征在于，该活疫苗采用猪细小病毒弱毒PP、—A株， 接种长势良好的猪睾丸(ST)传代细胞，收获细胞培养物，加入适宜的稳定剂，经冷冻真空 干燥制成，所述的活疫苗的每头份病毒含量》105°TCID5。。 所述的猪细小病毒弱毒PPVS—^株为PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续传代至第 40代以上致弱获得的弱毒株，其HA效价> 29， TCID5。 > 107°/ml。
所述的稳定剂包括5%蔗糖脱脂奶冻干保护剂。 —种猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤
(1)按照常规方法制备猪睾丸细胞，生长液为含5% _8%新生牛血清的1^1，当细 胞长成2/3以上单层时接毒； (2)取猪细小病毒弱毒PP、—^株按0. 1%稀释，接种步骤(1)得到的长势良好的 猪睾丸细胞单层，37t:吸附1. 5小时，加细胞维持液，置37t:静止或旋转培养；
(3)当75%以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次；
(4)取上清液测定毒价和HA效价； (5)将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，按照1 : l的体积比例加入稳定剂， 充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量^ 1055TCID5。； (6)迅速进行冷冻真空干燥，制成猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量 > 105°TCID5。。 所述的猪细小病毒弱毒PPVS—^株为PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续传代至第
40代以上致弱获得的弱毒株，其HA效价> 29， TCID5。 > 107°/ml。 所述的步骤(2)中的细胞维持液为含2%新生牛血清的MEM的细胞维持液。 所述的步骤(3)中反复冻融后于-2(TC以下保存，保存时间不超过30日。 所述的步骤(5)中检验合格的细胞毒液的病毒含量^ 10^TCID5。/ml，红细胞凝集
价HA > 29。
4
所述的步骤(5)中的稳定剂包括5%蔗糖脱脂奶冻干保护剂。 我所的潘雪珠等于1982年首先在上海郊区的发病猪场分离到猪细小病毒，并于 1987年在国内率先成功研制了 PPV灭活疫苗，在1994年获得新兽药证书，由上海佳牧生物 制品有限公司生产。在此基础上，进行了猪细小病毒弱毒株的培育和研究，将PP、—工毒株在 猪睾丸细胞系(ST)上连续传代至第40代致弱获得弱毒株，命名为PP、—A株。PPVS—^弱毒 株在ST细胞上出现病变规律，经测定HA效价> 211， TCID5。稳定在107 5 108°/0. lml。以 4ml剂量肌肉注射PPV HI抗体阴性猪，无明显临床症状，从接种猪血浆、内脏及鼻肛分泌物 均没有分离到病毒。试验证实PP、—^毒株具有良好的安全性和免疫原性，不引起病毒血症、 不排毒。 本发明采用PPVS—A弱毒株，接种生长良好的ST细胞，待75%以上细胞出现病变时 收获冻融，经测定HA效价^ 29， TCID5。 > 107 7ml。 与现有技术相比，本发明的猪细小病毒病活疫苗免疫原性好、免疫后产生抗体快，
产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前几周进行疫苗注射可使 怀孕母猪于易感期保持坚强的免疫力，是预防猪细小病毒病的极佳选择，采用的制备方法
工艺合理，价格较低，极大降低养殖业的成本负担。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 —种猪细小病毒病活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤 (1)按照常规方法制备ST细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成
2/3以上单层时接毒； (2)取生产用猪细小病毒弱毒PPVS—^株毒种(PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续 传代至第40代以上致弱获得的弱毒株，其HA效价^ 29， TCID5。 > 107.%1)按0. 1%稀释， 接种长势良好的ST细胞单层，37t:吸附1. 5小时，加含2%新生牛血清的MEM细胞维持液， 置37t:静止或旋转培养； (3)每日观察2次，记录细胞病变情况，当75%以上细胞出现细胞病变时，收获细 胞培养物，反复冻融3次，-20°C以下保存，不超过30日； (4)取上清液测定毒价和HA效价，病毒含量^ 107°TCID5。/ml，且红细胞凝集价 HA > 29 ; (5)将检验合格的细胞毒液混合于同一灭菌容器内，按照1 : l的体积比例加入 5%蔗糖脱脂奶冻干保护剂，充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量应> 1055TCID5。；
(6)分装后迅速进行冷冻真空干燥，制得猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量应 > 105°TCID5。。 应用本发明研制的猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量应>105，(:105。。免疫猪 后1周全部出现抗体反应，免疫后7个月攻毒仍能抵抗PPV强毒的攻击，对猪的免疫持续期 至少可维持6个月，_201:保存期为18个月。 猪体接种疫苗后无不良临床应，食欲、体温正常，精神状态良好，不引起接种猪的 病毒血症和排毒，不经胎盘感染，安全性良好。接种母猪的生产性能得到了提高，产生了良好的社会和经济效益，对于预防细小病毒引起的母猪繁殖障碍起到了积极的作用。 本发明制得的疫苗的使用及注意事项 1.作用与用途 用于预防猪细小病毒病。 2.用法与用量 按瓶签注明的头份，用灭菌生理盐水或专用稀释液稀释疫苗，深部肌肉注射，l头 份/头。母猪配种前2 3周免疫，公猪于6月龄时首免，以后每半年免疫1次。
3.注意事项 3. 1疫苗在运输、保存、使用过程中应防止高温、消毒剂和阳光照射。 3.2疫苗稀释后限4小时内用完。 3. 3应对注射部位进行严格消毒。 3. 4剩余的疫苗及用具，应经无害化处理后废弃。 3. 5本疫苗只对由PPV引起的母猪繁殖障碍有效，对由其它传染病引起的母猪繁
殖障碍没有预防作用，在使用该疫苗的同时，应注意预防其它传染病。 4.贮藏 -15°C以下，有效期为18个月。
实施例2 —种猪细小病毒病活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤 (1)按照常规方法制备ST细胞，生长液为含5%新生牛血清的MEM，当细胞长成
2/3以上单层时接毒； (2)取生产用猪细小病毒弱毒PPVS—^株毒种(PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续 传代至第40代以上致弱获得的弱毒株，其HA效价^ 29， TCID5。 > 107.%1)按0. 1%稀释， 接种长势良好的ST细胞单层，37t:吸附1. 5小时，加含2%新生牛血清的MEM细胞维持液， 置37t:静止或旋转培养； (3)每日观察2次，记录细胞病变情况，当75%以上细胞出现细胞病变时，收获细 胞培养物，反复冻融3次，-20°C以下保存，不超过30日； (4)取上清液测定毒价和HA效价，病毒含量^ 107°TCID5。/ml，且红细胞凝集价 HA > 29 ; (5)将检验合格的细胞毒液混合于同一灭菌容器内，按照1 : l的体积比例加入 5%蔗糖脱脂奶冻干保护剂，充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量应> 1055TCID5° ;
(6)分装后迅速进行冷冻真空干燥，制得猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量应 > 105°TCID5。。 应用本发明研制的猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量应>105，(:105。。免疫猪 后1周全部出现抗体反应，免疫后7个月攻毒仍能抵抗PPV强毒的攻击，对猪的免疫持续期 至少可维持6个月，_201:保存期为18个月。
权利要求
一种猪细小病毒病活疫苗，其特征在于，该活疫苗采用猪细小病毒弱毒PPVS-1A株，接种长势良好的猪睾丸(ST)传代细胞，收获细胞培养物，加入适宜的稳定剂，经冷冻真空干燥制成，所述的活疫苗的每头份病毒含量≥105.0TCID50。
2. 根据权利要求1所述的猪细小病毒病活疫苗，其特征在于，所述的猪细小病毒弱毒 PPVS—A株为PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续传代至第40代以上致弱获得的弱毒株，其HA 效价> 29， TCID5。 > 107°/ml。
3. 根据权利要求1所述的猪细小病毒病活疫苗，其特征在于，所述的稳定剂包括5%蔗 糖脱脂奶冻干保护剂。
4. 一种如权利要求1所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包 括以下步骤(1) 按照常规方法制备猪睾丸细胞，生长液为含5% _8%新生牛血清的1^1，当细胞长 成2/3以上单层时接毒；(2) 取猪细小病毒弱毒PP、—A株按O. 1%稀释，接种步骤(1)得到的长势良好的猪睾 丸细胞单层，37t:吸附1. 5小时，加细胞维持液，置37t:静止或旋转培养；(3) 当75%以上细胞出现细胞病变时，收获细胞培养物，反复冻融3次；(4) 取上清液测定毒价和HA效价；(5) 将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，按照l : 1的体积比例加入稳定剂，充分 摇匀，定量分装，每头份病毒含量^ 1055TCID5。；(6) 迅速进行冷冻真空干燥，制成猪细小病毒病活疫苗，每头份病毒含量^ 105°TCID5。。
5. 根据权利要求4所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪细 小病毒弱毒PPVS—^株为PPVS—工毒株在猪睾丸细胞系上连续传代至第40代以上致弱获得的 弱毒株，其HA效价^ 29，TCID5。 > 107 7ml。
6. 根据权利要求4所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2) 中的细胞维持液为含2X新生牛血清的MEM的细胞维持液。
7. 根据权利要求4所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3) 中反复冻融后于-2(TC以下保存，保存时间不超过30日。
8. 根据权利要求4所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (5)中检验合格的细胞毒液的病毒含量^ 10^TCID5。/ml，红细胞凝集价HA > 29。
9. 根据权利要求4所述的猪细小病毒病活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (5)中的稳定剂包括5%蔗糖脱脂奶冻干保护剂。
全文摘要
本发明涉及一种猪细小病毒病活疫苗及其制备方法，该活疫苗采用猪细小病毒弱毒PPVS-1A株(HA效价≥29，TCID50≥107.0/ml)，经接种长势良好的猪睾丸(ST)传代细胞，收获细胞培养物，加入适宜的稳定剂，经冷冻真空干燥制成，所述的活疫苗的每头份病毒含量≥105.0TCID50。与现有技术相比，本发明的猪细小病毒病活疫苗免疫原性好、免疫后产生抗体快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前几周进行疫苗注射可使怀孕母猪于易感期保持坚强的免疫力，是预防猪细小病毒病的极佳选择，采用的制备方法工艺合理，价格较低，极大降低养殖业的成本负担。
文档编号A61K39/125GK101745106SQ20081020426
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者倪建平, 叶向阳, 张婉华, 徐平, 曹伟明, 朱永军, 李春华, 潘雪珠, 邹勇 申请人:上海佳牧生物制品有限公司;上海科立特农科(集团)有限公司