多肽膜及方法

专利名称：多肽膜及方法
多肽膜及方法
背景技术：
聚电解质多层膜是由带相反电荷的聚电解质层交替构成的
薄膜(如几纳米到几毫米厚)。在合适的基底上通过层叠组装，可以形
成这种膜。静电工艺("ELBL")中，静电是聚电解质结合的物理基础。 由于膜表面电荷密度符号在层连续沉积时发生反转，所以有可能形成积 层膜。带相反电荷的聚离子的ELBL沉积的一般原理如图1所示。鉴于 ELBL膜工艺的普遍性和相对简单的特点，可以将许多不同类型的聚电 解质沉积到许多不同类型的表面上。多肽多层膜属于聚电解质多层膜， 包含至少一个含带电多肽的层。多肽多层膜的主要优点是环保。ELBL 膜还可以用于封装工艺。多肽膜和微胶囊例如应用在纳米反应器、生物 感应器、人工细胞和药物释放载体等方面。美国专利(公开号20050069950)中最先阐述了将多肽加 到多层膜内的设计原理。简单来说， 一个多肽是否适用ELBL，与其净 电荷和长度有关。适于ELBL的多肽最好含有一个或多个氨基酸序列基 元，S卩，长度约5-15个氨基酸残基并且具有适于静电沉积用的合适线 性电荷密度的连续氨基酸序列。可以采用不同的方法设计适于ELBL的 多肽，如直接将多个氨基酸序列基元相互连接，或者用接头将多个氨基 酸序列基元连起来。具有合适长度和电荷特性的多肽可以很容易地通过 沉积形成一层或多层多肽多层膜。虽然多肽多层膜的基本设计原理已经阐述的很清楚，但是仍 然需要设计具有所需功能，尤其是具有所需生物功能的多肽多层膜。

发明内容
在一实施例中， 一种多层膜含有两个或多个聚电解质层，其 中，相邻层含有带相反电荷的聚电解质；第一聚电解质层包括含有一个 或多个第一氨基酸序列基元的第一多肽层；所述一个或多个第一氨基酸 序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个氨基酸残基的静电荷为0.4。 所述第一多肽层有至少15个氨基酸残基长，pH7时其电荷差(balance of charge)约大于或等于所述第一多肽层总长度的一半；所述第一多肽层 含有与其可逆连接的治疗剂。第二层包括含有分子量大于1，000且每个 分子带至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料的第二聚电解质 层，其中，所述第二层不含多肽。 —种从多肽多层膜中控释治疗剂的方法，其包括提供上述多 肽多层膜，然后将该膜与适于剌激治疗剂从所述可逆连接物中释放出来 的刺激物接触。在另一实施例中， 一种组装多肽多层膜的方法，其包括将第 二聚电解质层置于基底上，其中，所述第二聚电解质层含有分子量大于 1,000且每个分子带至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，第 二层不含多肽；将第一多肽层置于所述第二聚电解质层上，其中，所述 第一多肽层含有一个或多个第一氨基酸序列基元，所述一个或多个第一 氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个氨基酸残基的静电荷 为0.4。所述第一多肽层有至少15个氨基酸残基长，pH7时其电荷差约 大于或等于所述第一多肽层总长度的一半；所述第一多肽层含有与其可 逆连接的治疗剂。


图1是带相反电荷多肽的组装体示意图。图2显示了 DTNB与Nl中的Cys侧链的反应过程。TNB 基团通过二硫键与肽的巯基结合。
图3是在大范围透析除去未反应的DTNB之后但在加入 DTT之前(0h)和1.5h时LNl溶液的吸收光谱。1.5h吸收光谱中412nm 峰是由于含有TNB 二价阴离子所致，而328nm峰是由于含有TNB-硫 醇混合二硫化物所致。低于300nm时吸光度急剧增加是由于DTT所致。 在随后的时间点(图中未示)中275nm附近清晰可见的交接处是由于 DTT被氧化的缘故。图4所示为多层膜在190nm的吸光度(光学厚度)与层数 之间的关系。图5显示了在DTT向内扩散下TNB与LN1肽断开的过程。图6是10个P1/LN1纳米涂层在浸没到O.lmM DTT溶液中 0、 5、 30或60分钟后其液体介质环境的吸收光谱。图中，TNB吸光度 随时间增加。图7是10个P1/LN1膜的释放介质在412nm的吸光度与温 育时间之间的关系。"封顶"膜在外表面具有(P1/LN1) 2。 TNB动力 学与氧化还原电位和封顶层表现的物理行为有关。图8显示TNB在氧化还原作用刺激下从多肽多层纳米涂层 中被释放出来的示意图。为简便起见，DTT分子被省去。AE表示还原 电位降低，At表示时间。
具体实施例方式本发明涉及含有至少一层含第一多肽层的多肽多层膜，其 中，所述多肽含有与其可逆连接的治疗剂，如药物。聚电解质多层涂层 能用于药物释放，例如用于支架等医学植入物的药物释放。 一种途径是 在涂层形成后，将治疗剂加到所述涂层内，然后该治疗剂通过扩散释放 出来。另一种途径是将治疗剂封装到一多层涂层内，然后再通过扩散往 外释放。本文公开的一可选途径是，使所述治疗剂与所述第一多肽层之 间共价结合，其中，所述共价结合在某些生理条件下是可逆的。例如，
7通过形成二硫键，可以将含巯基的5，5'-二硫-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 分子模型"负载"到含Cys的32-mer (即由32个氨基酸残基组成)多 肽上，再利用ELBL工艺将"负载"的多肽加到多层膜内，然后改变周 围液体介质的氧化还原电位，使所述膜内的2-硝基-5-硫苯甲酸盐二价 阴离子(TNB)释放出来。所述负载和释放的过程已通过实验阐示。DTNB 又称Ellman试剂，能用于测定多肽和蛋白质中的游离巯基和二硫键的 数量。周围液体介质的还原电位增加，模拟展示出粒子涂层从生物活细 胞外部(外部环境具有氧化性)到其内部(内部具有还原性)的通道。 所以，本文所述途径能使通过二硫键与多层膜共价结合的治疗剂在环境 刺激下释放出来，所述二硫键对局部氧化还原电位敏感。在一实施例中，多层膜含有两个或多个聚电解质层，其中， 相邻层含有带相反电荷的聚电解质；第一聚电解质层包括含有一个或多 个第一氨基酸序列基元的第一多肽层；所述一个或多个第一氨基酸序列 基元由5-15个氨基酸残基组成，每个氨基酸残基的静电荷为0.4;所述 第一多肽层不是同聚体，有至少15个氨基酸残基长，pH7时其电荷差 约大于或等于所述第一多肽层总长度的一半。第二层包括含有分子量大 于1,000且每个分子带至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料的 第二聚电解质层，其中，所述第二层不含多肽。在一实施例中，所述膜 含有基底，所述第一多肽层是最外面的或暴露在溶剂中的那一层，也就 是说，离所述基底最远的那一层。本文还公开了从多肽多层膜中释放治疗剂的方法。本文中，"层"是指厚度增加体，例如经过吸附步骤后基底 上方厚度增加，形成膜。"多层"是指多个(即两个或两个以上)厚度 增加体。"聚电解质多层膜"是指包含一个或多个由聚电解质构成的厚 度增加体的膜。沉积后，多层膜各层可能不再是离散的独立层。事实上， 厚度增加体相互间，尤其是两个厚度增加体界面处的物质可能会有明显 混合。
8
本文所述的"聚电解质"包括分子量大于1,000、每分子至 少带5个电荷的聚阳离子和聚阴离子材料。合适的聚阳离子材料例如包 括聚胺。聚胺例如包括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基
丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、 聚(N,N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨 基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基 甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基 氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、 聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲 基氯化铵)、几丁质和包含前述至少一种或多种聚阳离子材料的组合。 合适的聚阴离子材料例如包括多肽、核酸、海藻酸、卡拉胶、帚叉藻胶、 果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、 硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多 糖和交联羧甲基纤维素、含有羧基侧链的合成聚合物和共聚物，以及包 含前述至少一种或多种聚阴离子材料的组合。"氨基酸"是指多肽的结构单位。本文中，"氨基酸"包括 20种常见的天然存在的L-氨基酸、其它所有天然氨基酸、所有非天然 氨基酸和所有类氨基酸，如类肽(peptoid)。"天然存在的氨基酸"是指20种常见的天然L-氨基酸，即 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、 赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。"非天然氨基酸"是指除20种常见天然L-氨基酸之外的氨 基酸。非天然氨基酸可以是L-型或D-型。"类肽"或N-取代的甘氨酸是指相应氨基酸单体的类似物， 与相应氨基酸的侧链相同，但侧链是与氨基的氮原子相连，而不是与该 残基的(x碳原子相连。所以，类多肽单体间的化学键不是肽键，可用来 限制蛋白质水解。
"氨基酸序列"和"序列"是指有至少两个氨基酸残基长的多肽链的连续长度。"残基"是指多聚体或寡聚体中的氨基酸；它是可形成多聚体的氨基酸单体的残基。多肽合成反应涉及脱水反应，也就是说，多肽链上每增加一个氨基酸就会失去一个水分子。"氨基酸序列基元"是指含有n个残基的连续氨基酸序列，
n是5-15。在一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。在另一实施例中，氨基酸序列基元中每个残基的净电荷数量大于或等于0.5。本文中，净电荷数量是指净电荷的绝对值，也就是说，所述净电荷可以是正电荷，也可以是负电荷。"设计出的多肽"(以下简称"设计多肽")是指含有一个或多个氨基酸序列基元的多肽，该多肽有至少15个氨基酸长，pH7.0时，相同极性的带电残基和与其极性相反的残基的数量差与多肽中残基总数的比值大于或等于0.4。换句话说，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。在一实施例中，pH7.0时，相同极性的带电残基和与其极性相反的残基的数量差与多肽中残基总数的比值大于或等于0.5。换句话说，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.5。虽然多肽长度没有绝对上限，但总的来说，适于ELBL沉积的设计多肽的实际长度上限为1,000个残基。"—级结构"是指多肽链中连续的线性氨基酸序列，"二级结构"是指多肽链中基本上规则的结构类型，通过非共价相互作用(通常为氢键)保持稳定。二级结构例如包括(X-螺旋、(3-折叠和(3-转角。"多肽多层膜"是指含有一条或多条多肽，如上述定义的设计多肽的膜。例如，多肽多层膜包括含设计多肽的第一层和含带有极性与该设计多肽相反的净电荷的聚电解质的第二层。例如，如果第一层的净电荷为正电荷，则第二层的净电荷为负电荷；如果第一层的净电荷为负电荷，则第二层的净电荷为正电荷。所述第二层含有另一种设计多肽或另一种聚电解质。"基底"是指一种固体材料，具有适于吸附水溶液中聚电解质的表面。基底表面基本上可以是平面、球形、棒状等任何形状。基底表面可以是规则或不规则的面。基底可以是晶体，也可以包括生物活性分子。基底尺寸从纳米级到宏观级大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的亚粒子。基底可以由有机材料、无机材料、生物活性材料或这
些材料的组合制成。基底例如包括但不限于硅晶片；CaC03微粒或三聚氰胺甲醛微粒等带电胶体粒子；蛋白质晶体；核苷酸晶体；红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞等生物细胞；聚苯乙烯或苯乙烯共聚物等有机聚合物点阵结构体(polymer lattice);脂质体；细胞器和病毒。在-一实施例中，基底是人工起搏器、人工耳蜗或支架等医疗器械。如果在膜形成期间或形成之后，将基底分离，或用其它方式去除，这时候将基底称为"模板"(用于膜的形成)。模板粒子可以用合适的溶剂溶解或加热去除。举例来说，如果使用部分交联的三聚氰胺甲醛模板粒子，可以用较为温和的化学方法，如使用DMSO或改变pH值来溶解模板。模板粒子溶解后，留下由聚电解质层交替构成的中空多层外壳。"微胶囊"是指中空外壳形式或包覆核心的涂层形式的聚电解质膜。所述核心含有各种不同的胶囊填充剂，如液体形式或结晶形式的蛋白质、药物或其组合。"生物活性分子"是指有生物学效应的分子、大分子或大分子组装体。利用合适的试验，并经每单位重量或每分子标准化后，可以测出生物活性分子的具体生物学效应。可以将生物活性分子装入胶囊、固定在后面或者置于聚电解质膜内。生物活性分子例如包括但不限于药物、药物晶体、蛋白质、蛋白质功能片段、复合蛋白、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖。本文所述的"生物活性分子"进一步包括有生物活性的结构组成，如功能性膜
11碎片、膜结构组成、病毒、病原体、细胞、细胞团和细胞器。能被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面的蛋白质例如有血红球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲酶和溶菌酶等酶；纤维连接蛋白、层粘蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白等胞外基质蛋白；以及抗体。能被封装在胶囊内或固定在多肽膜后面的细胞例如包括移植胰岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。治疗剂是生物活性分子的子集。"治疗剂"是指单独给患者使用或与另外的化合物、元素或混合物联合使用，直接或间接对患者产生生理效果的一类化合物、元素或混合物。间接生理效果可通过代谢或其它间接机制发生。当所述活性剂是一种化合物时，则盐、该游离化合物或盐的溶剂化物(包括水合物)、该化合物的晶形、非晶形和任意多晶型物均涵盖于此。合适的治疗剂为抗炎物、冠状血管扩张剂、脑血管扩张剂、外周血管扩张剂、抗感染剂、精神药物、抗躁狂药、兴奋剂、抗组胺药、胃肠道镇静剂、抗腹泻制剂、抗心绞痛药、血管扩张药、抗心律失常剂、抗高血压药、血管收縮剂、偏头痛治疗药物、抗凝血剂和抗栓药、镇痛药、解热药、安眠药、镇静剂、止呕剂、止恶心药、抗惊厥药、神经肌肉药、降糖药、甲状腺制剂和抗甲状腺制剂、利尿剂、解痉药、矿物质和营养添加剂、抗肥胖药、合成代谢药、红细胞生成药、平喘药、祛痰药、化痰剂、抗尿酸药、其它药物，以及前述一种或多种治疗剂的组合。"生物相容性"是指经口服、局部给药、透皮给药、皮下注射、肌内注射、吸入、植入或静脉内注射后不会对健康产生实质性的不良影响。例如，生物相容性膜包括那些与免疫系统(如人的免疫系统)接触后不会引起实质性免疫应答的膜。"免疫应答"是指细胞或体液免疫系统对体内任何部位出现的物质所产生的反应。免疫应答可以表现为很多方式，如血流中识别某种抗原的抗体数量增加。抗体是由B细胞分泌的蛋白质，而抗原是诱导产生免疫应答的物体。人体通过增加血流或其它部位的抗体数量来抵抗感染和抑制再感染。"表位"是指被抗体识别的蛋白质的结构或序列。表位通常位于蛋白质表面。"连续表位"是指表位中包括的若干氨基酸残基相互连接、而不是在折叠蛋白中碰巧接触或处于有限的空间区域内。本发明涉及含有第一多肽层的多肽多层膜，其中，所述第一多肽层含有与其可逆连接的生物活性分子。其它层含有设计多肽或其它聚阳离子或聚阴离子。适于静电层叠沉积工艺用的多肽的设计原理在美国专利(公
开号2005/0069950)有所记载，该文通过引用并入本文。简单说来，
设计时首先要考虑多肽的长度和电荷。静电是多肽设计时需要考虑的最
重要因素，因为它是ELBL的基础。如果一个多肽的电荷特性不合适，那么它在pH4-10时基本上不溶于水溶液，所以不能很容易地通过ELBL工艺制备多层膜。其他考虑因素包括多肽的物理结构、由多肽形成的膜的物理稳定性，以及膜与组成该膜的多肽之间的生物相容性和生物活性。如上所述，设计多肽是指包含一个或多个氨基酸序列基元的多肽，其中，所述多肽有至少15个氨基酸残基长，pH7.0时，多肽中每个残基的净电荷数量大于或等于0.4。"氨基酸序列基元"是指含n个氨基酸残基的连续氨基酸序列，其中n是5-15。 pH7.0时，天然存在的正电荷氨基酸(碱性)是Arg、 His和Lys，天然存在的负电荷氨基酸(酸性)是Glu和Asp。使用的氨基酸基元中可以包含带相反电荷的混合氨基酸残基，只要整个电荷比例满足以上规定的标准即可。在一实施例中，设计多肽不是同聚体。在一典型实施例中，氨基酸序列基元含7个氨基酸残基。对长7个氨基酸残基的基元来说，含4个带电氨基酸是较为合适的最低限度，因为少于4个电荷，肽的可溶性和对ELBL工艺的控制能力会降低。
13而且，关于生物相容性，基因组数据中述及的各氨基酸序列基元都比7个氨基酸长，足以构成连续表位，但并没有长到基本上与蛋白质表面和其内部的残基相对应。所以，氮基酸序列基元的电荷和长度有助于确保基因组数据中提到的序列基元可能出现在该序列基元所来源的折叠蛋白表面上。相反，非常短的序列基元在机体看来有可能是随机序列，或者是非特定"自体"的随机序列，从而会诱导免疫应答。某些情况下，设计氨基酸序列基元和设计多肽时，需要考虑
形成二级结构尤其是a-螺旋或(3-折叠的倾向度(propensity)。某些实施例中，最好能控制水介质中设计多肽形成二级结构的可能性，如最大程度降低这种可能性，以便尽可能地控制薄膜层形成工艺。首先，序列基元最好比较短，约5-15个氨基酸残基，因为长基元在溶液中更有可能形成稳定的三维结构。第二，设计多肽中共价连接相邻氨基酸序列基元的接头，如甘氨酸或脯氨酸残基，会降低多肽在水溶液中形成二级结构的倾向。例如，甘氨酸的a-螺旋和(3-折叠倾向度很低，非常不利于甘氨酸和其相邻氨基酸在水溶液中形成规则的二级结构。第三，选择(X-螺旋总倾向度小于7.5、 P-折叠总倾向度小于8的氨基酸序列基元，可将设计多肽本身的a-螺旋和P-折叠倾向度降到最低。"总"倾向度是指基元中所有氨基酸的a-螺旋或(3-折叠的倾向度总和。a-螺旋和/或P-折叠的总倾向度稍高的氨基酸序列基元适用于ELBL工艺，尤其是由Gly或Pro等接头连接时更是如此。某些应用中，如果作为薄膜制备中的特定设计特征，多肽形成二级结构的倾向度可以较高。用Chou和Fasman法(参见P. Chou and G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974)，其整体通过引用并入本文)可以计算出所有20种天然存在的氨基酸的二级结构倾向度。另一考虑因素是多肽ELBL膜的稳定性控制。离子键、氢键、范德华力和憎水作用都有助于多层膜的稳定性。另外，同一层内或相邻层中多肽的含巯基氨基酸之间形成的共价二硫键可以增加结构强度。含巯基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往(3-氨基酸中
14加入巯基，如D,L-卩-氨基-P-环己基丙酸、D,L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫 代)-3-氨基戊酸。使用含巯基的氨基酸，通过改变氧化电位，可以将多 肽多层膜各层"锁住"(结合在一起)和"解锁"。另外，设计多肽中序 列基元中加入含巯基的氨基酸后，由于分子内形成二硫键，所以可以在 薄膜制备中使用较短的肽。可以使用下面叙述的方法从基元文库中选取 包括含巯基氨基酸的氨基酸序列基元，或者可以从头设计。在一实施例中，将无论是化学合成还是宿主体内产生的含巯 基的设计多肽，在含有用于防止二硫键过早形成的还原剂条件下，采用 ELBL法进行组装。然后除去还原剂，再加入氧化剂。氧化剂使巯基之 间形成二硫键，将各层内多肽"锁"在一起，而且存在硫醇基团时还会 将各层之间的多肽"锁"在一起。合适的还原剂包括二硫苏糖醇 ("DTT")、 2-巯基乙醇(2-ME)、还原谷胱甘肽、三(2-甲酰乙基)膦 盐酸盐(TCEP)和前述一种以上化学物质的组合。合适的氧化剂包括 氧化谷胱甘肽、叔丁基过氧化氢(t-BHP)、硫柳汞、肼、5,5'-二硫代-双-(2-硝基-安息香酸)(DTNB)、 4,4'-二硫代二吡啶、溴酸钠、过氧化氢、 连四硫酸钠、卟啉啶(porphyrindin)、邻碘苯甲酸钠，及前述一种以上 化学物质的组合。生物相容性是生物药学应用中所考虑的一个因素。这类应用 中，首先利用作为多聚体设计基础的基因组或蛋白质信息，得到我们需 要的"免疫惰性"多肽。如果生产出的或外覆涂层的物体要与循环血接 触，则这一方法特别有用。由于氨基酸序列基元的极性较高，所以它们 通常位于其来源蛋白质天然折叠结构的表面。"表面"是指折叠蛋白质 中与溶剂接触或因水的微粒性而难以单独靠近溶剂的那一部分。已鉴定 出的血液蛋白氨基酸序列基元在血液中总是能与细胞有效接触。所以， 来源于血液折叠蛋白质的多肽有免疫原性的可能性低于随机选择的序 列。设计多肽一般都有生物相容性，但免疫应答或其它任何类型的生物 应答所达到的程度可能完全取决于序列基元的具体细节。
可以用很多方法使膜、涂层或微胶囊具备生物活性。例如， 含设计多肽的膜可以含有功能域。或者，具有多肽薄膜涂层或装在多肽 薄膜胶囊内的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一实施例中，所 述模板包含蛋白晶体等生物活性分子。这里提到的功能域是指蛋白质中一段有特定生物功能(如结 合磷酸化酪氨酸)的独立耐热区域。多结构域蛋白质中可能存在多功能 域，例如，张力蛋白中就包含磷酸酪氨酸结合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。 多层膜内加入的设计多肽中包含功能域，可以使膜具有与特异性配体结 合、体内靶定、生物感应和生物催化等所需功能。生物活性分子可以是蛋白质，蛋白质功能片段，非设计多肽 构成部分的蛋白质功能片段、复合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 体、活性治疗剂、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜结构组成、 病毒、病原体、细胞、细胞团、细胞器、脂、碳水化合物、药物或抗菌 剂。生物活性分子可以是规则排列的结晶型或无定形。所述蛋白质可以 是酶或抗体。所述基底可以包含这类生物活性分子。在一实施例中，在 带相反电荷的各多肽层沉积前，基底表面含有生物活性分子。在另一实 施例中，基底是含生物活性分子的晶体。在一实施例中，氨基酸序列基元采用从头设计。在另一实施 例中，氨基酸序列基元选自特定生物的基因组或蛋白质组信息，如人的
基因组。例如，可以利用补体C3 (gi|68766)或乳转铁蛋白(gi|4505043) 的一级结构，从人血液蛋白中检索氨基酸序列基元。鉴定多肽内第一个氨基酸序列基元的方法包含选择多肽的 起始氨基酸残基；检査多肽内含该起始氨基酸残基和后面n - 1个(即 n减l)氨基酸残基的氨基酸序列中存在的正电荷和负电荷，其中n是 5-15;如果pH7.0时，这5-15个氨基酸残基侧链的净电荷大于或等于 0.4xn，则将这些氨基酸残基确定为氨基酸序列基元；或者，如果pH7.0 时，这5-15个氨基酸残基侧链的净电荷小于0.4xn，则舍弃该序列。
下面叙述在一实施例中从氨基酸序列数据中检索含n个氨 基酸、仅包含中性或负电荷氨基酸的负电荷氨基酸序列基元的方法。第 一步，从蛋白质序列中选择起始氨基酸残基。第二步，检查起始氨基酸 残基和后面n - 1个氨基酸残基中是否含有精氨酸、组氨酸或赖氨酸(中
性pH时，这三种天然存在的氨基酸可能带正电荷)，其中n是5-15。 第三步，如果发现这n个氨基酸残基中有一个或多个精氨酸、组氨酸或 赖氨酸，则从第二个氨基酸残基重新开始上述步骤。但如果这n个氨基 酸中不含精氨酸、组氨酸或赖氨酸，则检查并确定n个氨基酸残基中谷 氨酸(Glu)和/或天冬氨酸(Asp)(中性pH时这两个氨基酸带负电荷) 出现的数量。第四步，如果这n个残基中有至少0.4xn个Glu禾n/或Asp， 则将该序列归类为负电荷氨基酸序列基元。但如果发现负电荷氨基酸数 量少于0.4xn个，则舍弃从第一个氨基酸残基开始的序列，然后再重新 开始以上步骤，例如，立即从与第一个氨基酸残基相邻的第二个氨基酸 残基开始以上步骤。将基元归好类后，再从第二个氨基酸残基开始，重 复以上步骤。鉴定正电荷序列基元的方法大致是从蛋白序列数据中检索 仅含中性或正电荷氨基酸、n个氨基酸长而且中性pH时这些氨基酸残 基侧链的净电荷数量大于或等于0.4xn的氨基酸序列。鉴定含n个氨基酸、允许同时存在正电荷和负电荷氨基酸残 基的负电荷氨基酸序列基元或正电荷氨基酸序列基元的方法也差不多 类似。例如，鉴定含n个氨基酸的正电荷氨基酸序列基元的步骤也是从 多肽中选择起始氨基酸残基。然后，检查该氨基酸残基和后面n - 1个 氨基酸残基中是否有pH7时带正电荷或负电荷的残基。确定这n个氨 基酸残基侧链的净电荷数。如果净电荷的绝对值小于0.4xn，则舍弃该 序列，从另一个氨基酸重新开始检索。但如果净电荷的绝对值大于或等 于0.4xn，则该序列为一个氨基酸序列基元。若净电荷大于0，该基元 为正电荷基元，若小于0，该基元为负电荷基元。
17
本文述及的氨基酸序列基元的从头设计方法与上面的原理 大体相同，不同在于设计用的序列并不限于天然发现的序列。首先， 选择基元长度n和所需的净电荷符号和数量。然后，选定n个能作为氨 基酸序列基元而得到所需电荷符号和数量的氨基酸，这n个氨基酸的净 电荷绝对值大于或等于0.4xn。从头设计氨基酸序列基元的潜在优点是， 操作者可以从所有氨基酸(20种天然存在的和所有非天然的氨基酸) 中挑选以获取所需的净电荷，而不仅限于特定己知氨基酸序列中发现的 那些氨基酸。与从基因组序列中鉴定氨基酸基元相比，大型氨基酸池扩 大了基元序列设计时可供选择的物理、化学和/或生物学特征的潜在范 围。本文述及的氨基酸序列基元的从头设计方法与上面的原理 大体相同，不同在于设计用的序列并不限于天然发现的序列。首先，
选择基元长度n和所需的净电荷符号和数量。然后，选定n个能作为氨 基酸序列基元而得到所需电荷符号和数量的氨基酸，这n个氨基酸的净 电荷绝对值大于或等于0.4xn。从头设计氨基酸序列基元的潜在优点是， 操作者可以从所有氨基酸(20种天然存在的和所有非天然的氨基酸) 中挑选以获取所需的净电荷，而不仅限于特定已知氨基酸序列中发现的 那些氨基酸。与从基因组序列中鉴定氨基酸基元相比，大型氨基酸池扩 大了基元序列设计时可供选择的物理、化学和/或生物学特征的潜在范 围。本文所述的设计多肽包含一个或多个氨基酸序列基元。设计 用于ELBL工艺的多肽时，可以重复同一基元，或者将不同基元连在一 起。在一实施例中，氨基酸序列基元之间共价连接，无插入序列。在另 一实施例中，设计多肽包含两个或两个以上由接头共价连接的氨基酸序 列基元。该接头可以是氨基酸型接头，如一个或多个氨基酸残基，如赖 氨酸或脯氨酸，或者可以是适于共价连接两个氨基酸序列基元的其它任 何化合物。在一实施例中，接头包含l-4个氨基酸，如1-4个赖氨酸和/或脯氨酸残基。该接头包含合适的长度或组成，使设计多肽中每个残基 的净电荷数量大于或等于0.4。在一实施例中，设计多肽的长度大于或等于15个氨基酸残
基。在其它实施例中，设计多肽的长度大于18、 20、 25、 30、 32或35 个氨基酸。实际使用的多肽长度上限为1，000个残基。氨基酸序列基元被选出或从头设计后，即可利用本领域熟知 的方法，如固相合成和F-moc化学合成法，或者通过基因克隆、转化及 细菌异源表达的方法，合成带有氨基酸型接头的设计多肽。可以委托肽 合成公司如Global Peptide公司(Ft Collins, Colorado),在实验室内用 肽合成器合成，或者采用重组DNA的方法合成。任何新型开发的肽合 成法可能会增加肽的产量，但对本文所述的肽设计方法应该不会有实质 性改变。合成后，第一多肽层与治疗剂可逆结合。可逆结合既包括共 价结合，也包括非共价结合，只要治疗剂在暴露于合适的刺激物中之后 能脱离第一多肽层就行。所述治疗剂可与多肽的N-端、C-端或侧链连 接，这些多肽或者是在自然界中发现的，或者是通过化学修饰以利于结 合和释放的多肽。例如，可使药物与第一多肽层上的游离巯基、游离氨 基和游离羧基之间形成可逆的共价键。可逆的非共价键例如包括离子键 和疏水作用。在一实施例中，所述治疗剂中的醇、胺或羧酸基团与所述多 肽的N-端、C-端或侧链共价连接。连接位置与选择的官能团有关。例 如，如果治疗剂是羧酸类物质(如阿司匹林)，则多肽的N-端是合适的 连接点。如果治疗剂是胺类物质(如氨苄青霉素)，则C-端是合适的获 得稳定的肽-活性剂的连接点。在所述的C-和N-端实施例中， 一个形成 新肽键的单体单元实质上是在多肽末端加了一个分子。如果所述治疗剂是胺类物质，可选用的另一种将胺类物质与 肽的C-端连接的方法是让该胺类物质启动连接。如果所述治疗剂是醇
19类物质，则C-端或N-端均是可获得稳定组分的连接点。例如，所述治 疗剂是醇类物质时，可将该醇转变成含有碳酰氯或二(三氯甲基)碳酸酯 的垸基氯代甲酸酯。然后将该中间产物与肽的N-端反应，生成通过氨 基甲酸酯连接的治疗剂-肽组分。然后在肠道的肽酶、酰胺酶或酯酶的 作用下氨基甲酸酯-治疗剂从多肽中释放出来。或者，可以将醇类治疗剂有选择的与谷氨酸Y位羧酸酯结 合，然后将该结合物与肽的C-端共价结合。因为可以将谷氨酸-治疗剂 结合物看成二聚体，该产物在肽的C-端加了两个单体单元，其中谷氨 酸部分充当肽和治疗剂之间的联接基团。主要肽键经肠道酶水解后使谷 氨酸-药物部分从肽载体上脱离。然后，新形成的游离的含谷氨酸残基 的胺将发生分子内转氨反应，从而释放治疗剂，同时形成焦谷氨酸。如果治疗剂是酮或醛类物质，则治疗剂与具有适于和多肽的 C-端、N-端或其侧链连接的侧基的接头形成縮酮。例如，如葡萄糖与甲 基纳曲酮反应的例子所示，甲基呋喃核糖苷或葡萄糖与甲基纳曲酮反应 生成縮酮。该糖部分的其余游离羟基则可以当作一种能与多肽的C-端 或合适的侧链连接的醇。在一实施例中，所述治疗剂与所述多肽的N-端连接。用于 连接的合适的氨基酸例如包括谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和赖氨酸。用
于N-端连接的合适的药物通常具有连接用的羧酸基团或无机官能团，
这类药物例如有布洛芬、呋塞米、吉非罗齐和萘普生。在一实施例中，所述治疗剂与所述多肽的C-端连接。治疗
剂与多肽的c-端连接可通过多个活性剂官能团完成。该官能团包括胺
基及其等同物和醇基及其等同物。虽然可以使用任意氨基酸来连接所述
活性剂与所述c-端，但尤以谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和赖氨酸最为
合适。用于c-端连接的合适的活性剂是指具有醇基和氨基官能团的活
性剂，例如阿替洛尔、美托洛尔(metropolol)、心得安、哌甲酯和舍曲 林。
在一实施例中，所述治疗剂与多肽的侧链共价连接。含有羧 酸的活性剂可以与多肽侧链的胺基或醇基连接，分别形成酰胺或酯。含 有胺的活性剂可以与多肽侧链的羧酸酯、尿素或鸟嘌呤基团连接，形成 酰胺基团或新的鸟嘌呤基团。另外，接头可以选自几乎能与多肽的任何 侧链发生连接的所有化合物。在另一实施例中，治疗剂与多肽之间的连接通过在它们之间 加入接头来完成。该接头应该具有官能侧基，如羧酸酯基、醇基、硫醇 基、肟基、腙基、酰肼基或胺基以与多肽共价连接。在一实施例中，治 疗剂是醇，该醇通过接头与多肽的N-端共价连接。在另一实施例中， 治疗剂是酮或甲醛，它与接头连接，分别形成縮酮或乙縮醛，所述基团 具有与多肽连接的侧基。仍在另一实施例中，治疗剂是酰胺、亚胺、咪 唑或尿素，其中的N原子与接头连接，该接头的侧基与多肽连接。在一实施例中，第一多肽层和治疗剂均含有游离的硫醇基。 天然的含有游离硫醇基的合适治疗剂例如包括半胱胺、二巯丙醇、2-巯 基乙烷磺酸钠、乙酰半胱氨酸、奥马曲拉、卡托普利等。另外，己知的 不含游离巯基的治疗剂可通过化学方法修饰，使其含有游离的巯基。制备聚电解质多层膜的方法包含将多个带相反电荷的聚电 解质层沉积到基底上。依次沉积的聚电解质的净电荷相反。在本情况下，
至少沉积得到与治疗剂可逆连接的第一聚电解质层。图1是ELBL沉积
过程的示意图。在一实施例中，聚电解质如设计多肽的沉积过程包括将 基底暴露在水溶液中，水溶液中含有设计多肽(或其它聚电解质)，其
pH值使设计多肽带有适于进行ELBL工艺的净电荷。在另一实施例中， 将设计多肽或其它聚电解质沉积到基底上的方法是将带有相反电荷的 聚电解质溶液先后喷涂到基底上。在其它实施例中，沉积到基底上的方 法是将带有相反电荷的聚电解质同时喷涂到基底上。在形成多层膜的ELBL方法中，相邻层的相反电荷能驱动组 装发生。其关键因素不是相对层中聚电解质的净线性电荷密度相同，而 是相对层带有相反电荷。 一种用于沉积的标准膜组装程序包括在能使聚电解质以离子形式存在的pH值条件下(即pH4-10)，形成聚电解质
水溶液，然后选用带有表面电荷的基底，最后将基底交替浸入带电荷的 聚电解质溶液内。视情况可以在各层交替沉积步骤之间洗涤基底。本领域普通技术人员可以很容易地确定适于聚电解质沉积
的聚电解质浓度。典型的浓度为0.1-10mg/mL。 一般来说，制出的层厚 基本上不受沉积过程中所述范围内聚电解质溶液浓度的影响。对于典型 的非多肽聚电解质如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺盐酸盐)，层厚通常约 3-5A，具体视溶液离子强度而定。较短的聚电解质通常比较长的电解质 形成的层薄。聚电解质膜的厚度与湿度、层数和膜组成有关。例如，50nm 厚的PLL/PLGA膜经氮气干燥后收縮到1.6nm。 一般来说，可以形成 l-100nm或更厚的膜，具体取决于膜的水合状态和组装体中所用聚电解 质的分子量。另外，形成稳定聚电解质多层膜所需的层数取决于膜内的聚 电解质。对仅含有低分子量多肽层的膜来说，通常要有4个或4个以上 带相反电荷的多肽双层。而对于含高分子量聚电解质如聚(丙烯酸)和 聚(烯丙胺盐酸盐)的膜来说，含一个带相反电荷聚电解质的双层就可 以保持稳定。在另一实施例中，从多肽多层膜中释放治疗剂的方法包括提
供本文所述的多肽多层i莫，该多肽多层膜含有第一多肽层，该多肽层上
具有与其可逆连接的治疗剂；将所述膜与适于刺激所述治疗剂从所述可 逆连接物中释放出来继而从所述膜中释放出的刺激物接触。在一实施例中，所述治疗剂释放的目标是进入总的体循环。 血流和/或消化道中的pH环境能提供适于所述治疗剂释放的合适剌激。 在另一实施例中，血流中多肽-治疗剂结合物受到酶的作用，或者消化 道内多肽-治疗剂结合物受到酶的作用，然后按常规进入路线通过肠道 或胃吸收，从而刺激治疗剂从多肽中释放出来。
在一实施例中，所述治疗剂通过多肽中的谷氨酸残基进行连 接。所述复合物先经多肽水解从多肽中释放出来，然后通过同时发生的 分子内转氨反应，治疗剂与谷氨酸脱离。在另一实施例中，所述谷氨酸 由天冬氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸 替代，其中，治疗剂与氨基酸侧链连接形成酰胺、硫酯、酯、醚、硫醚、 碳酸酯、酸酐、原酸酯、羟肟酸、腙、磺酰胺、磺酸酯、硫的其他衍生 物、或氨酸甲酸酯。仍在另一实施例中，所述谷氨酸由带有例如含胺官 能团、醇官能团、巯基、酰胺官能团、尿素官能团或酸官能团的侧基的 合成氨基酸替代。当所述可逆连接是通过离子键连接时，合适的刺激物为浓盐 溶液，如1MNaCl。当所述可逆连接是通过疏水作用连接时，合适的刺
激物为表面活性剂溶液，如2%SDS。当所述可逆连接是通过二硫键连 接时，充当治疗剂释放刺激物的合适还原剂包括二硫苏糖醇("DTT")、 2-巯基乙醇(2-ME)、还原谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)， 以及上述化学物质中一种以上的组合。现通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例 材料与方法材料中性pH时，由于赖氨酸(K)的质子化和谷氨酸(E)
的去质子化而使得多肽(KVKGKCKV)3KVKGKCKY ( " Pl ")和 (EVEGECEV)3EVEGECEY ("N1")(美国Genscript公司)带相反电荷。 其他氨基酸残基是缬氨酸(V)、甘氨酸(G)和半胱氨酸(C)。 4-15kDa 聚(L-赖氨酸)("PLL")、 13kDa聚(L-谷氨酸)("PLGA")和DTNB 来自Sigma公司(USA)。 DL-二硫苏糖醇(DTT)、还原剂来自Gold Biotechnology公司(USA)。其他所有试剂来自Sigma公司。Pl、 Nl、 PLL和PLGA溶解在TA缓冲液(10mM三(羟甲基)氨基甲烷、10mM 醋酸钠、20mMNaCl、 0.1%NaN3、 pH7.4)中，浓度为lmg/mL。
23
用DTNB标记Nl:多肽Pl和Nl含有Cys残基。多肽上的 游离巯基在氧化条件下将与DTNB反应(图2)。在这一反应过程中， TNB分子形成带有Cys侧链的混合二硫化物，同时TNB分子被释放到 周围环境中。游离TNB的水溶液呈黄色，在弱碱性pH、 412nm时出现 吸收峰。TNB的消光系数为n，400-14，150M"cm"，具体视条件而定。制备用于负载的冻干N1:将多肽溶解在"TA还原缓冲液中" (TA缓冲液、10mM DTT、 pH8.1)中，环境温度下温育24小时。将 2mLNl溶液引入l,OOOMWCO透析袋内(美国Spectrum Laboratories公 司，SpectroPor 7，)对200mL "DTNB溶液"(TA缓冲液、10mM DTNB、 pH8.1)进行透析，同时不断搅拌。经1、 2、 4禾n 17小时后该DTNB 发生变化。然后将含有被标记的Nl (LN1)的透析袋浸没到pH7.4的 TA缓冲液中，除去过量的DTNB，将pH从8.1变到7.4。 TA缓冲液在 1、 2、 4和17小时后发生变化。LN1的终浓度被pH7.4的TA缓冲液调 到lmg/mL。 LN1在DTT处理前后的UV吸光谱如图6所示。多肽多层纳米涂层的组装将基质清洁后，在石英显微玻片 (美国Electron Microscopy Sciences)上进行多肽多层涂层的的组装。 将基质反复的浸入带正电荷的多肽溶液(PI或PLU和带负电荷的多 肽溶液(N1、 LN1或PLGA)中，每一多肽吸附步骤持续15分钟。每 一多肽吸附步骤结束后，将带有涂层的玻片置于几个去离子水浴中分别 漂洗2分钟、1分钟和1分钟。按这一方法组装30个多肽层。某些情 况下，如下所述，在30个P1/LN1涂层顶部再组装两个封顶的PI和Nl 双层，该双层用(P1/N1) 2表示。 TNB从多肽多层纳米涂层中释放用去离子水将pH7.4的 LN1溶液稀释4倍，然后加入DTT，终浓度达到2mM (图3)。 TNB释 放过程中在震荡台上轻微摇动该混合物。用Shimadzu UV mini 1240UV-Vis分光光度计(日本)记录溶液的吸光谱。每种情况下涂层 覆盖大约2cm2的基质。将10个单独的石英台上的P1/LN1涂层浸没在 3mL释放介质(pH7.4 TA缓冲液用去离子水稀释4倍；含0、 0.1或]mMDTT)中使TNB的吸收峰处于可测范围。用扫描分光光度计在限定的时间点记录释放介质的吸光度。每个涂层先浸没5分钟进行第一次吸光度测定，然后再隔15分钟进行随后的测定。整个释放过程中缓慢地晃动装膜样品和释放介质的烧杯。
例1:将TNB负载在N1上 DTT在还原状态下能完全保持为单硫醇形式，并能定量的还原二硫化物。用DTT处理多肽N1，使分子内和分子间可能存在的二硫键断裂，同时保护Cys残基侧链的游离巯基。得到的每个N1分子含有几个游离的巯基，在弱碱性溶液中用它们进行TNB负载(图2)。由于TNB和硫醇混合的二硫化物缘故，图3中328nm的吸收峰显示，TNB成功地负载到Nl分子上。275nm的酪氨酸吸光度是TNB接近UV处时吸光度的IO倍之多。
例2:多肽多层的组装采用LBL法将30层的P1/N1、 P1/LN1、 P1/PLGA、 PLL/N1和PLL/PLGA涂层组装到石英玻片上。图3显示，膜厚度随吸收歩骤数目增加而增加。P1/N1显示其沉积的材料量最多。P1/N1和PLL/PLGA的光质谱差异暗示了多层膜层叠中线性电荷密度、氨基酸序列和聚合程度的重要性，这与前期的研究吻合。强库仑力将既吸引带相反电荷的物质又排斥带相同电荷的物质，这限制了膜厚度的增加。P1/LN1的组装与PLL/N1和P1/PLGA的组装类似。这些实验中，每个"负载"的TNB分子使多肽的疏水性增加并加入了一个负电荷。静电作用和疏水作用同时影响多肽的组装行为和膜的稳定性。P1/LN1和P1/N1的组装行为间的差异间接证明了 Nl上负载有TNB，这与图3中的数据吻合。设计多肽在本文所述的药物负载和释放过程中扮演重要角色。TNB分子可负载到Pl和母鸡蛋白溶菌酶(HEWL)上，在加有DTT的溶液中该TNB可与被标记的分子脱离(数据未显示)。但经证明，无
25论是标记了的Pl还是标记了的HEWL均不利于用LBL法组装多层膜(数据未显示)。Pl和HEWL在pH7.4时带正电荷，而TNB基团带负电荷。 一个分子内不同符号的电荷组合会减小线性电荷的平均密度和用于静电LBL法的适用性。HEWL中的电荷分布比较复杂，所含大量疏水基团中的一部分基团在完整的天然酶中形成"疏水核"。相比之下，LN1有利于用静电LBL法制作多层膜。
例3: TNB的控释与TNB在溶液中的行为类似(图3)，浸没在水性还原环境中时TNB从多层涂层中的LN1上释放出来(图5)。 421nm处的吸收峰(图6)显示0.1mMDTT溶液中的TNB浓度与涂层温育时间的函数关系。图7中对含和不含(P1/N1) 2 "封顶"层时TNB从涂层中释放的动力学进行了比较。O.lmMDTT对应的第一级时间常数为8分钟。DTT浓度越高，DTT与涂层中的TNB在给定时间内碰撞的可能性越高，TNB从涂层中释放的越快。在弱氧化条件下(0mMDTT) TNB的释放量没有达到可检测的水平。1小时后O.lmM DTT溶液中TNB的浓度为2.2pM。含LN1的涂层中加入封顶双层减小了 TNB的释放率。封顶膜的时间常数是19分钟，约为无封顶膜的两倍。封顶层不含TNB，它们可能阻挡DTT向内扩散并阻挡TNB向外扩散，游离巯基可能结合TNB和DTT (图8)。将TNB "负载"到带负电荷、含Cys的32mer设计多肽上，采用LBL法将该标记了的多肽用于组装多层涂层，然后改变氧化还原电位刺激TNB从涂层中释放出来。该方法与先制备涂层然后将小分子负载到涂层上的方法有很大的不同。与控制扩散的负载相比，本文概述的方法是更有效的捕获小分子的方法，它能在特定条件下通过环境剌激释放发生。本文中"第一"和"第二"等词不表示任何特定顺序，而仅便于表示例如多个层。除非另外说明，"包含"、"具有"、"包括"和"含有"等词均应理解为开放式用语(即意指"包括但不限于")。文中表示 数值范围的方式仅仅是作为单独谈及落在该范围内的每个分散数值的 简略表示法，除非本文另外指明，而且每个分散值就好比文中以一一叙 述的方式被引入本说明书。所有范围的端点包含在该范围内，而且可独 立组合。文中所述所有方法均按合适的顺序操作，除非文中另外指明或 上下文清楚地出现不同说法。任一和所有实施例或典型用语(如"例如 /如")仅仅是为了更好地阐述本发明，而非对本发明范围予以限制，除 非另外要求。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求权利保护的 特征作为实施本文所述发明的必要特征。虽然参照典型实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人 员应当明白，在本发明范围内可以进行各种改动而且可以将本发明的特 征用等同特征替代。另外，根据本发明的教导有可能在本发明的范围内 进行多种改进以适应特定情况或材料，所以，本发明并非要局限于本文 公开的作为实施本发明最佳模式的特定实施例，而是要包括权利要求范 围内的所有实施例。本发明涵盖上述特征所有可能变化形式的任一组 合，除非本文另外指明或有清楚的相反叙述。
2权利要求
1.一种多层膜，该膜含有两个或多个聚电解质层，其中，相邻层含有带相反电荷的聚电解质；第一聚电解质层包括含有一个或多个第一氨基酸序列基元的第一多肽层；所述一个或多个第一氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成，每个氨基酸残基的静电荷为0.4；所述第一多肽层有至少15个氨基酸残基长，pH7时其电荷差约大于或等于所述第一多肽层总长度的一半；所述第一多肽层含有与其可逆连接的治疗剂；以及第二层包括含有分子量大于1,000且每个分子带至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料的第二聚电解质层，其中，所述第二层不含多肽。
2. 根据权利要求1所述的多层膜，其中，所述治疗剂与所述多肽 的N-端、C-端或侧链可逆连接。
3. 根据权利要求1所述的多层膜，其中，所述多肽和治疗剂均含 有巯基，所述可逆连接是通过二硫键连接。
4. 根据权利要求1所述的多层膜，其中，所述治疗剂的醇基、胺 基或羧酸基与所述多肽的N-端、C-端或侧链共价结合。
5. 根据权利要求1所述的多层膜，其中，所述治疗剂与所述多肽 之间的连接通过在它们之间加入接头来完成，所述接头含有官能侧基。
6. 根据权利要求6所述的多层膜，其中，所述官能侧基包括羧酸 酯基、醇基、硫醇基、肟基、腙基、酰肼基或胺基。
7. 根据权利要求1所述的多层膜，其中，所述膜是微胶囊形式。
8. 根据权利要求l所述的多层膜，其中，所述膜在基底上形成。
9. 根据权利要求8所述的多层膜，其中，所述基底包括医疗器械。
10. —种从多肽多层膜中控释治疗剂的方法，其包括 提供权利要求1所述的多肽多层膜，以及将所述膜与适于刺激治疗剂从所述可逆连接物中释放出来的刺激 物接触。
11. 根据权利要求IO所述的方法，其中，所述可逆连接物通过二硫 键连接，所述剌激物是还原剂。
12. 根据权利要求IO所述的方法，其中，所述可逆连接物是酰胺、硫酯、酯、醚、硫醚、碳酸酯、酸酐、原酸酯、羟肟酸、腙、磺酰胺、磺酸酯或氨酸甲酸酯，所述刺激物是血流和/或消化道的pH环境。
13. 根据权利要求IO所述的方法，其中，所述刺激物是作用于所述 多肽-治疗剂连接物的酶。
14. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述膜是微胶囊形式。
15. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述膜在基底上形成。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述基底包括医疗器械。
17. —种组装多肽多层膜的方法，其包括将第二聚电解质层置于基底上，其中，所述第二聚电解质层含有分 子量大于l，OOO且每个分子带至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子 材料，所述第二层不含多肽；将第一多肽层置于所述第二聚电解质层上，其中，所述第一多肽层 含有一个或多个第一氨基酸序列基元，所述一个或多个第一氨基酸序列基元由5-15个氨基酸残基组成， 每个氨基酸残基的静电荷为0.4，所述第一多肽层有至少15个氨基酸残基长，pH7时其电荷差约大于或等于所述第一多肽层总长度的一半；以及 所述第一多肽层含有与其可逆连接的治疗剂。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述治疗剂与所述多肽的 N-端、C-端或侧链可逆连接。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述多肽和治疗剂均含有 巯基，所述可逆连接是通过二硫键连接。
20. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述基底包括医疗器械。
全文摘要
本申请公开的是多肽多层膜，其中，治疗剂与第一多肽层共价连接。这种连接的优点在于所连接的治疗剂能在加入合适刺激物条件下从所述多层膜中可控地释放到膜的环境中。本申请公开的膜和方法的优点是能在特定条件下通过环境刺激进行释放。
文档编号A61K9/50GK101641086SQ200880006185
公开日2010年2月3日 申请日期2008年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者唐纳德·坦普尔顿·海尼 申请人:人工细胞技术公司