专利名称：：活减毒志贺氏菌疫苗株基因缺失组合的制作方法活减毒志贺氏菌疫苗株基因缺失组合
背景技术：
：发明领域本发明一般地涉及志贺氏菌(Shigella)疫苗、菌株、它们在疫苗中的用途和治疗痢疾的方法。相关技术志贺氏菌种是细菌性痢疾的病原体。结肠和直肠末端是志贺氏菌病(shigellosis)期间最常影响的胃肠(GIT)道区域，其显示出强烈的和急性粘膜肿胀。10-100个细菌的非常低的接种物足以引起疾病，其然后通过粪口途径或苍蝇污染食物和水轻易地且常常直接地传播。使用合适的抗生素，例如有效对抗革兰氏阴性细菌的抗生素对抗志贺氏菌感染；然而，正如对大多数细菌性病原体一样，抗生素抗性的增加极大地强调对安全和有效疫苗的需要。近来的志贺氏菌疫苗候选株包括从致病性(virulent)培养物(例如Inv即lex疫苗)纯化的亚细胞复合物，其包括与载体蛋白缀合的解毒脂多糖(LPS)和活减毒疫苗株。利用以高剂量和多剂量给药的全细胞失活生物体的尝试遭受了差的免疫原性和保护性功效。活疫苗看来似乎提供了更好的方法，因为它们模拟自然感染，同时颠覆了临床结果。US5762941阐述了一个活疫苗方法并且包括弗氏志贺氏菌(S.flexneri)2a、宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)和痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)1中的virG(icsA)基因缺失。产生了疫苗株SC602、WRSS1和WRSdl，其中SC602和WRSS1在人志愿者中的第一期试验中测试，且发现在从103至104CFU的口服剂量范围内是安全的。然而，施用了SC602或WRSS1的志愿者有15-25%表现出轻微腹泻和发热的症状。美国专利US5589380和US5468639阐述了另一个方法，其中利用了两种候选基因setAB(shETl)和senAshET2(shET2)，因为以前表明它们编码肠毒素活性。setAB(shETl)主要存在于弗氏志贺氏菌2a菌株的染色体上，而senA(shET2)基因位于所有志贺氏菌菌株的大致病性(virulence)质粒上。JournalofInfectiousDisease(传染病杂志)2004，190:1745-54中的文章阐述了获得活志贺氏菌疫苗的又一个方法。对弗氏志贺氏菌2a疫苗候选株CVD1204的guaBA突变体观察到的腹泻和发热症状在施用CVD1208时得到改善，其包含guaBA突变和setAB和senA(shET2)基因缺失的组合。值得注意的是，senB(shET2_2)构成推定的肠毒素基因，其在氨基酸水平上与senA(shET2-l)共享>60X的同源性并可能是senA(shET2)的功能类似物。尽管被高度减毒，但是CVD1208以非常高的剂量(109)施用，这可诱发10%的受试者发热。美国专利US6759241涉及活疫苗开发中一个包括msbB2基因的方法。msbB2基因编码脂酰转移酶，该酶将脂肪酸残基添加到细菌性LPS分子的脂质A部分。脂质A部分构成内毒素，内毒素是造成细菌性LPS的有效炎症活性和发热性能的原因。在大肠杆菌(E.coli)背景中，msbB基因的突变产生较低毒性的LPS，但是与大肠杆菌不同，志贺氏菌具有两个msbB基因，第一个(msbBl)在染色体上和第二个(msbB2)在致病性质粒上。弗氏志贺氏菌2a背景中缺失任一个msbB基因在兔回肠环模型中引起减轻的志贺氏菌感染组织病理损害，且两个msbB基因都缺失甚至进一步减轻病理损害。在2006年Gordon会议上提出的来自我们实验室的数据表明在弗氏志贺氏菌2a背景中msbBl和msbB2基因都缺失影响该细菌的生长和侵入性能。然而，与野生型志贺氏菌菌株感染相比，单独缺失msbBl或msbB2基因不危害生长、侵入性、免疫原性或志贺氏菌感染动物模型中产生的保护。此外，任一个msbB基因的缺失引起鼻内感染该细菌的小鼠的肺清洗物(lungwashes)中的较低水平促炎细胞因子(例如IL_lb和MCP-1)。ExpertReviewVaccines(疫苗专业综述)2006，5:5中的一篇综述中讨论了若干活减毒志贺氏菌疫苗，该疫苗在特定基因中具有明确限定的突变。在这些研究中，将使用每种疫苗株得到的免疫反应与由使用野生型志贺氏菌菌株的攻击试验获得的数据进行比较。来自这些试验的数据表明活减毒疫苗株引发了与野生型志贺氏菌菌株攻击的个体相似的免疫反应。因此，预计该基因缺失组合消除反应原性，同时诱导保护性免疫反应。Vaccine(疫苗)2007，25:2269-2278中发表的文章描述了弗氏志贺氏菌2a疫苗候选株WRSf2Gll，其具有virG(icsA)、set和sen基因中的缺失。这个菌株是使用A红重组酶系统构建的，并证明了缺少肠毒素基因的基于virG的志贺氏菌疫苗株显示出较低水平的反应原性，没有妨碍坚实(robust)的免疫反应。发明概述本发明涉及所有4种主要血清型的志贺氏菌疫苗候选株，它们的主要减毒特征是virG(icsA)基因的缺失，和setAB(shETl)、senA(shET2)、senB(shET2-2)、stxAB禾口msbB2基因中的两个或更多个的另外缺失。因此，疫苗株将在确定的基因中有三个或更多缺失，并应该更安全，当在人类志愿者中测试时不存在或减少发热和腹泻。已经构建了下列疫苗株WRSS3(AsenA，AsenB，AvirG，AmsbB2)，WRSf2G15(AvirG，AsetAB，AsenA，AsenB，AmsbB2)禾口WRSd5(AvirG，AstxAB，AsenA，AsenB，AmsbB2)。本发明的菌株被设计用来防止由弗氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)引起的痢疾和腹泻。此外，本发明的菌株可以在活减毒多价疫苗的混合物中使用，所述混合物包含两种或更多血清型的志贺氏菌(例如弗氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌)。本发明的菌株还可以与对抗肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的活减毒疫苗组合使用，以提供针对由这些细菌引起的痢疾和腹泻的保护。显而易见地，使用这些菌株的多价疫苗可以防止志贺氏菌和ETEC的常见血清组(serogroup)。抗原接触(prime)-加强，最初用活疫苗免疫后用亚单位疫苗免疫，将提供针对由志贺氏菌引起的痢疾和腹泻的保护。本发明的志贺氏菌疫苗株可以用作来自其他痢疾病原体例如弯曲杆菌(Campylobacter)的抗原的载体(carrier)，其他原核抗原的粘膜递送载体(vector)，真核抗原的载体(vector)和免疫调节剂例如细胞因子的载体(carrier)。本发明的志贺氏菌疫苗株可以以低至104至106CFU的剂量使用。尽管已经在人类中测试了基于virG(icsA)的疫苗并且显示出是适度安全的，但是15-25%的志愿者表现出不能接受的反应原性症状。virG(icsA)基因的缺失和与肠毒素活性相关的基因，推定的肠毒素，和/或与LPS毒性相关的基因的缺失的组合将产生更安全的口服志贺氏菌疫苗。志贺氏菌疫苗株的特征在于具有virG(icsA)基因缺失/失活，和setAB(shETl)、senA(shET2)、senB(shET2-2)、stxAB和msbB2基因中的两个或更多缺失的组合。志贺氏菌疫苗是4种血清组，即弗氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌的无致病性菌株。志贺氏菌疫苗株的特征在于一个或多个下列特性上皮细胞中的侵入性、上皮细胞单层中缺少斑、豚鼠眼睛中缺少角膜结膜炎诱导、诱导豚鼠避免攻击的保护性免疫反应，和胃内接种1(TCFU后从猴子有效排出。志贺氏菌疫苗株可以配制为免疫原性组合物，其中该菌株与药用载体混合并在一次或多次给药后以诱导保护性免疫反应的量存在。多菌株疫苗组合物可以配制为实现保护性免疫反应的单剂量。精确量可以通过经验确定且将根据动物类型、重量、情况和年龄而变化。本发明的组合物和菌株可以包装成试剂盒以便于操作和提供最佳保护。该试剂盒可以包括一个或多个容器，每个容器装有特定的志贺氏菌疫苗株或菌株混合物。菌株的量或类型可以作为方案或应用的一部分来选择。本发明的志贺氏菌疫苗株可以与书面说明一起并以保持该菌株生存力的方式包装。当以单剂量或系列剂量给予受试者时，本发明的志贺氏菌疫苗株诱导粘膜(口服或鼻内)免疫反应。该疫苗制剂的一个优点是与多剂量的活的非侵入性疫苗或失活全细胞疫苗株的备选方案相比，保护性反应可以以含相对较少菌落形成单位(1(^至10SCFU)的单口服剂量获得。下面参照附图详细描述本发明的更多特征和优点，以及其各种实施方案的构成和操作。附图简述本发明的上述特征和优点通过以下本发明优选实施方案的更具体描述将很明显，如附图中阐明地，其中类似的参考号通常表示相同的、功能类似的和/或结构类似的成分。相应参考号中最左侧的数字表示其中首次出现成分的附图。图1显示了特定志贺氏菌疫苗株即WRSS1、WRSS2和WRSS3的构建。图2显示了通过HeLa细胞免疫测定(2A)、菌落免疫印迹(2B)和斑测定(2C)表征WRSS1、WRSS2和WRSS3疫苗株。图3显示了WRSS1、WRSS2和WRSS3的豚鼠免疫方案。图4显示了眼(occularly)免疫豚鼠的血清抗体滴度(4A)和粘膜抗体滴度(4B)。图5显示了野生型菌株攻击后WRSS1、WRSS2和WRSS3的保护性功效。图6显示了猴胃内免疫方案。图7显示了猴子免疫方案中WRSS1、WRSS2和WRSS3的疫苗排泄结果。图8显示了通过弗氏志贺氏菌菌株2457T构建志贺氏菌疫苗株WRSf2G12和WRSf2G15。5图9显示了通过菌落免疫印迹(A)和HeLa细胞侵入测定(B)表征WRSf2G12和WRSf2G15。图10显示了豚鼠眼(0C)免疫方案。图11显示了眼免疫豚鼠的血清抗体滴度(A)和粘膜(B)抗体滴度。图12显示了用野生型弗氏志贺氏菌菌株2457T攻击后，SC602、WRSf2G12和WRSf2G15的保护性功效。本发明示例实施方案的详细说明下面详细论述了本发明的优选实施方案；然而，尽管论述了特殊示例的实施方案，但是应该理解这仅仅是为了例证目的而进行的。相关领域的技术人员应该公认在不背离本发明的精神和范围的条件下可以使用其他成分和结构。WRSS1、SC602和WRSdl，即三种基于virG(icsA)基因缺失的志贺氏菌疫苗候选株，最近已经在健康成人的第一期临床试验中进行了测试，表明全部这三种疫苗在以103至104CFU的剂量范围口服给药时，是安全的。此外，接种疫苗SC602的志愿者，在用同源野生型弗氏志贺氏菌2a菌株攻击后，受到保护以避免严重的痢疾。然而，扩展第一期临床试验揭示不能接受数量的给药了SC602或WRSS1的志愿者具有轻微腹泻和发热症状。由疫苗开发中心(CenterforVaccineDevelopment,CVD)的研究人员进行的近期临床试验表明这些症状中的大部分可以通过除去ShETl(set)和ShET2-l(senA)肠毒素而改善。进一步减毒活志贺氏菌疫苗的另外目标包括修饰脂质A，即LPS的生物活性中心。通过缺失晚期酰基转移酶(msbB)，脂质A的正则结构的变更已表明显著降低该分子的内毒性。构建了新的第二代基于virG(icsA)的宋内氏志贺氏菌疫苗候选株(WRSS2和WRSS3)，其在两个质粒_承载肠毒素和脂质A修饰基因中具有另外的缺失，这将降低与WRSS1相关的反应原性症状。WRSS2(由virG(icsA)、ShET2-l(senA)、和ShET2-2(senB)的缺失组成)和WRSS3(由诸如在质粒-承载msbB2基因中具有另外缺失的WRSS2的缺失组成)在培养的上皮细胞中具有侵入性，但在斑测定中是阴性的。用WRSS1、WRSS2或WRSS3眼免疫，并且然后用野生型宋内氏志贺氏菌菌株53G攻击的豚鼠显示出相似水平的免疫原性和保护性功效。因此，senA、senB和质粒-承载msbB2基因的缺失不改变用携带单一virG(icsA)突变的疫苗株诱导的保护性免疫反应。此外，对猕猴胃内施用这三种疫苗候选株表明这三个菌株全部被排泄至相同程度，这提示改变脂质A酰基饱和度水平的遗传修饰没有降低肠建群模型中的生存力。使用致病性表现型稳定的宋内氏志贺氏菌菌株Mosely构建志贺氏菌疫苗株WRSS1、WRSS2和WRSS3(图1)。第一代疫苗株(WRSS1)利用自杀载体构建，如HartmanAB等1998中所述。WRSS2和WRSS3利用的A红重组工程通过一系列缺失突变构建，如Ranallo等2007所述。完成WRSS2构建的另外修饰包括使用镰孢菌酸失去四环素抗性。为产生WRSS3，从WRSS2删除msbB2基因并用基因组PCR分析来验证所有的基因缺失。接着通过HeLa细胞侵入测定、菌落免疫印迹和斑测定表征该菌株，如图2所示。每组十只的四组豚鼠眼内接种4X108CFUWRSS1、WRSS2、WRSS3或作为天然(na'ive)对照的正常盐水(参见图3)。值得注意的是，另外的实验也表明接种剂量在没有有害作用的条件下可以是5X1Q9(参见图10)。在第14天重复免疫，并在首次免疫后6四周时，用野生型宋内氏志贺氏菌53G眼攻击(Sereny测试)每只豚鼠。收集血液和粘膜分泌物作为来自用WRSS1、WRSS2和WRSS3免疫的豚鼠的血清抗体反应(图4A)和粘膜抗体反应(图4B)。通过ELISA测定测量抗宋内氏志贺氏菌LPS和宋内氏志贺氏菌侵袭素(invasin)-LPS复合物(Inv即lex)的血清IgG特异性、血清IgA特异性、和粘膜IgA特异性免疫反应。测定第0天(D0)、第14天(D14)和第28天(D28)以及攻击(CLG)后两周时的IgG和IgA抗体反应。用误差线指示的95%可信区间计算每组的几何平均滴度(GMT)。由单向(one-way)AN0VA测试没有检测到WRSS1、WRSS2和WRSS3免疫反应之间的显著差异。最后的免疫之后26天时，用1X1()8CFU/眼睛的野生型宋内氏志贺氏菌菌株53G攻击全部豚鼠(参见图5)。豚鼠(每组十只)在结膜囊接种并测试角膜结膜炎7天。反应评分如下0、无炎症或轻微疾病；1、轻微角膜结膜炎；2、角膜结膜炎，没有化脓；和3、严重的角膜结膜炎并伴有化脓。用不同疫苗株(WRSS1、WRSS2和WRSS3)免疫的全部豚鼠被保护免于角膜结膜炎。三组五只猴子胃内接种4X101QCFU的WRSS1、WRSS2和WRSS3，并然后每天检查临床症状(参见图6)。如所示，收集或进行大便样品、血液采集、直肠灌洗和直肠镜检。通过将大便样品涂布在Hektoen肠琼脂平板上检测猴子中的疫苗排泄(参见图7)。用宋内氏志贺氏菌抗血清(D组)检测菌落的凝集并通过用抗IpaB抗体的菌落免疫印迹进一步鉴定。(+)符号代表培养阳性大便和(_)符号代表阴性培养物或没有收集样品(参见图7)。直到免疫后大约5至7天，从猴子大便中回收WRSS1、WRSS2和WRSS3。没有在三组之间观察到疫苗排泄的显著差异。表l.接种宋内氏志贺氏菌疫苗株后，猴子中的血清IgA&IgG免疫反应<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.接种宋内氏志贺氏菌疫苗株后，猴子中的总粘膜免疫反应<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用弗氏志贺氏菌2a菌株2457T构建减毒志贺氏菌菌株，如图8中所示。第一代疫苗株SC602(未显示)类似于WRSf2G，但是在以大于104菌落形成单位的剂量给药于人类志愿者时，反应原性太强。使用A红重组工程，通过一系列缺失突变构建更多减毒菌株(WRSf2G10-15)。使用基因组PCR分析验证全部基因缺失。然后通过HeLa细胞侵入测定和菌落免疫印迹表征该菌株(参见图9)。由^^一只组成的四组豚鼠眼接种5X108CFU的SC602、WRSf2G12、WRSf2G15或作为天然(naive)对照的正常盐水(参见图IO)。在第14天重复免疫，并在首次免疫后四周时，用野生型弗氏志贺氏菌菌株2457T眼攻击(Sereny测试)每只豚鼠。收集血液和粘膜分泌物作为来自用SC602、WRSf2G12、WRSf2G15或正常盐水免疫的豚鼠的血清抗体反应(图11A)和粘膜抗体反应(图IIB)。通过ELISA测定测量抗弗氏志贺氏菌LPS和弗氏志贺氏菌侵袭素-LPS复合物(Inv即lex)的峰(第28天)IgG特异性、血清IgA特异性、和粘膜IgA特异性免疫反应。用误差线指示的95%可信区间计算每组的几何平均滴度(GMT)。当与对照组相比时，在所有接种的动物的血清中检测到同样显著的抗LPS和抗Inv即lexIgG和IgA反应。当与对照组相比时，在所有接种的动物中检测到同样显著的抗LPS粘膜IgA反应。当与SC602和WRSf2G12二者相比时，WRSf2G15产生显著更高的抗Invaplex反应，如图11B中星号所示。最后的免疫之后27天时，用1X1Q8CFU/眼睛的野生型弗氏志贺氏菌菌株2457T攻击每只豚鼠(参见图12)。豚鼠在结膜囊接种并评价角膜结膜炎4天。反应评分如下0、无炎症或轻微疾病；1、轻微角膜结膜炎；2、角膜结膜炎，没有化脓；和3、严重的角膜结膜炎并伴有化脓。用不同疫苗株(SC602、WRSf2G12和WRSf2G15)免疫的全部豚鼠被保护免于角膜结膜炎。对两个不同血清型的活志贺氏菌疫苗的二价混合物进行评价。两种新的弗氏志贺氏菌2a疫苗候选株WRSf2G12和WRSf2G15单独地或与宋内氏志贺氏菌疫苗候选株WRSs3组合口服施用于猕猴组。初步的排泄数据似乎表明WRSf2G12和WRSf2G15中缺失setAB基因不影响肠道建群，WRSf2G15中缺失msbB2基因不影响肠道建群，且宋内氏志贺氏菌疫苗和具有基因缺失组合的弗氏志贺氏菌2a疫苗的二价混合物不影响任一菌株的建群。由于肠道建群是产生保护性免疫反应的关键，所以这些结果表明本专利申请中描述的通过基因缺失组合而减毒的不同血清型疫苗候选者的多价混合物可以施用于志愿者并且预期是安全的并引发针对每种血清型的保护性免疫反应。将这些菌株组合到可以一次给药且仍以相当低的剂量(在104至106cfu的范围内)给药的多价混合物中的可能性为本专利申请提升了价值。虽然上面已经描述了本发明的各种实施方案，但是应该理解它们仅仅是为举例而存在，而并非限制性的。因此，本发明的广度和范围不应受上述任何示例实施方案的限制，反而应该仅根据以下权利要求和它们的等同物来限定。权利要求一种志贺氏菌(Shigella)疫苗株，其特征在于具有下列基因缺失或基因失活virG(icsA)与setAB(shET1)、senA(shET2)、senB(shET2-2)、stxAB和msbB2基因中的一个或更多个的组合。2.志贺氏菌疫苗是选自弗氏志贺氏菌(S.flexneri)、宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和鲍氏志贺氏菌(S.boydii)的4种血清组的致病性菌株。3.权利要求2的志贺氏菌疫苗株是弗氏志贺氏菌2a。4.权利要求2的志贺氏菌疫苗株是痢疾志贺氏菌1。5.志贺氏菌疫苗株，其特征进一步在于选自以下各项中的一种或更多种特性上皮细胞中的侵入性、上皮细胞单层中缺少斑形成、豚鼠眼睛中不存在角膜结膜炎、诱导豚鼠避免攻击的保护性免疫反应，或胃内接种101QCFU后从猴子有效排出。6.志贺氏菌疫苗株，其选自由下列各项组成的组WRSS3(AsenA，AsenB，AvirG，AmsbB2)，WRSf2G15(AvirG，AsetAB，AsenA，AsenB，AmsbB2)，和WRSd5(AvirG，AstxAB，AsenA，AsenB，AmsbB2)。7.权利要求6的志贺氏菌疫苗株，其中senA(shET2)、senB(shET2-2)和msbB2基因存在于大致病性质粒上。8.志贺氏菌疫苗株，其选自由下列各项组成的组WRSf2G15(AvirG，AsetAB，AsenA，AsenB，AmsbB2)禾口WRSf2G12(AvirG，AsenA，AsetAB，AsenB)。9.一种免疫原性组合物，其包含一种或更多种权利要求1-8中任一项的志贺氏菌疫苗株和药用载体。10.—种疫苗，其包含一种或更多种权利要求1-8中任一项的志贺氏菌疫苗株和药用载体。11.权利要求10的疫苗，其中该疫苗是活的和侵入性的。12.—种用于通过诱导免疫保护反应治疗受试者的试剂盒，其包括装有一种或更多种权利要求1-8中任一项的志贺氏菌疫苗株的一个或多个容器。13.权利要求12的试剂盒，其中每个容器分别包括单独的志贺氏菌疫苗株。14.一种方法，包括施用有效量的一种或更多种权利要求1-8中任一项的志贺氏菌疫苗株。15.权利要求14的方法，其中所述有效量足以诱导保护性免疫反应。16.权利要求14的方法，其中一种或更多种志贺氏菌菌株以口服施用。17.权利要求16的方法，其中一种或更多种志贺氏菌菌株以单剂量口服施用，所述单剂量与多剂量的活的非侵入性疫苗或失活全细胞疫苗的备选方案相比，包含相对少量的菌落形成单位(CFU)。18.权利要求14的方法，其中所述有效量是104至106CFU的剂量。全文摘要志贺氏菌疫苗株，其主要的减毒特征是缺失virG(icsA)基因，和在setAB(shET1)、senA(shET2)、senB(shET2-2)、stxAB和msbB2基因中的另外两个或更多缺失。因此，该疫苗株应该在确定的基因中具有三个或更多缺失，应该更安全，并应该减轻或消除人的发热和腹泻症状。已经构建了下列特异性疫苗株WRSS3(ΔsenA，ΔsenB，ΔvirG，ΔmsbB2)，WRSf2G15(ΔvirG，ΔsetAB，ΔsenA，ΔsenB，ΔmsbB2)和WRSd5(ΔvirG，ΔstxAB，ΔsenA，ΔsenB，ΔmsbB2)。文档编号A61K39/02GK101720229SQ200880019647公开日2010年6月2日申请日期2008年4月25日优先权日2007年4月25日发明者瑞安·T·拉纳洛,肖莎娜·巴尔诺,马拉比·M·文卡特桑申请人:以沃尔特里德军事研究所的名义,由美国陆军部部长为代表的美国政府