载脂蛋白d类型的蛋白质的美容用途的制作方法

专利名称：载脂蛋白d类型的蛋白质的美容用途的制作方法
载脂蛋白D类型的蛋白质的美容用途 本发明的主题是载脂蛋白D、源自该蛋白质的多肽或其类似物、编码此类多肽的核 酸序列、或者调节此类多肽的活性或表达的试剂的用途，特别是美容和/或治疗用途，特别 是用于剌激终末上皮分化。 本发明还涉及载脂蛋白D、源自该蛋白质的多肽或其类似物、或者编码此类多肽的 核酸序列作为用于评价表皮状态的标志物的用途。 上皮是其细胞彼此拼接和整体联结并位于基底膜之上的组织。它们形成外部覆盖 层，例如在皮肤的表面上，也就是说表皮；或者内部覆盖层，在粘膜的表面上。它们还可以形 成腺体。 更精确地，这些上皮是这样的结构，所述结构的内环境稳定起因于受精细调控的 细胞内和细胞外信号集合的利用，所述细胞内和细胞外信号在下列的所有阶段中起作用 细胞增殖、迁移或分化，以及细胞外基质的各种组分的合成。这些信号可以特别地起因于由 角质形成细胞所产生的因子的作用。 维持上皮的良好生理学功能特别地牵涉终末上皮分化和/或蛋白聚糖的合成。
更特别地关于表皮，它是一种上皮，其常规地分为下列部分包含特别是皮肤干细 胞并构成表皮发生层的角质形成细胞基底层；由数层排列在基底层上的多角细胞组成的所 谓棘细胞层；包含一至三层含有明显细胞质内含物(角质透明蛋白颗粒)的所谓扁平细胞 的所谓颗粒层；和最后，称为角化层(或角质层)的全体顶层，所述角化层由在其分化的终 末阶段被称为角质细胞(corneocyte)的角质形成细胞构成。 角质层(其是提供在身体和环境之间的屏障功能的皮肤的最外面部分)和毛干 (其是构成毛发的毛囊的显现部分)二者均呈现了角质形成细胞的分化过程的结果。表皮 的分化跟随在成熟过程之后，在所述成熟过程中基底层的角质形成细胞进行分化并迁移， 从而导致形成完全角质化的死细胞即角质细胞。所述分化是极好地受协调的现象的结果， 其导致维持恒定的厚度并因此引起表皮的内环境稳定。 许多皮肤病症或病理学状况可以起因于表皮的内环境稳定的功能障碍，特别是角 质形成细胞的终末上皮分化和/或蛋白聚糖的合成的功能障碍。 因此，涉及表皮的主要改变是角质形成细胞的分化的减少，其引起角化细胞 (horny cell)的蛋白质基质的缺乏；金属蛋白酶(其为降解细胞外基质并参与皮肤衰老的 蛋白酶)的增加；和各种糖胺聚糖的合成的减少。 例如，在衰老的皮肤的情况下，所述功能障碍通常表现为出现皱纹(微起伏和深 皱纹)、丧失弹性、粗糙感和干燥。从组织学角度来看，观察到真皮-表皮连接变平以及真皮 和表皮的厚度减少。胶原和糖胺聚糖的含量降低。皮肤的屏障功能受损。所有这些现象通 过长期日光暴露而加剧。 同样地，在绝经期间，皮肤经历在其所有区室(即表皮和真皮区室)中的变化。涉 及真皮的主要变化是胶原的量和真皮的厚度的减少。这在更年期妇女中引起皮肤和/或粘 膜厚度的减少。然后，这些妇女感到"干燥的皮肤"或绷紧的皮肤的感觉，并且观察到表面 细小皱纹和细线的加重。皮肤展现出对于触摸而言粗糙的外观。最后，皮肤展现出减少的柔软度。 已经知晓，在角质形成细胞的分化的各个阶段期间，数个蛋白质家族开始起作用， 其中每个具有特定的功能。在这些之中，蛋白酶在脱屑中(也就是说在消除在表皮表面上 的角质细胞中)具有至关重要的作用，和转谷氨酰胺酶参与将形成皮肤的角质包层的蛋白 质的交联。 本发明特别地由于本发明人表征了载脂蛋白D(也称为ApoD)在人表皮的角质层 中的表达而产生。 ApoD是29KDa的糖蛋白，其在人中与HDL相联合地存在于血清中，并且它的功能还
不清楚。它的三维结构和它的脂笼蛋白家族的成员资格暗示，ApoD将会是小的疏水性分子
的转运蛋白，并且它将会特别地结合胆红素、胆固醇、孕酮、孕烯醇酮和花生四烯酸。 在人的数种疾病中观察到该蛋白质的大幅度增加。因此，ApoD在患有"巨囊液病
(Gross Cystic Fluid Disease)"(—种形式的良性乳腺癌症)这种疾病的妇女的乳腺的
囊液中高度积累。 此外，ApoD在神经再生过程中过表达。实际上，在外周神经损伤之后，观察到信使 RNA和蛋白质的大幅度增加，这暗示ApoD可能在外周神经系统的维持中起重要作用。
最后，以及更新近地，发现ApoD在患有阿尔茨海默病的受试者的脑脊液和海马中 积累。更详尽的分析证明，在数种其他人类神经变性疾病例如脑膜脑炎、心血管意外、运动 神经元疾病和痴呆中出现大幅度增加。这暗示，ApoD可能也在中枢神经系统的维持中起重 要作用。 另一个方面，就本发明人的知识而言，载脂蛋白D到目前为止尚未被鉴定为人角 质层的蛋白质。 实际上，与所有预期相反，载脂蛋白D也被证实是皮肤的生理学状态的潜在标志 物，特别是在衰老方面。因此，如从下面所呈现的测试中明显可见的，本发明人已出乎意料 地观察到，在一方面，这种糖蛋白在角质层中表达，和在另一方面，在表皮衰老过程中其表 达显著减少。 因此，根据一个方面，本发明的主题是有效量的至少一种源自载脂蛋白D的多肽、 至少一种编码此类多肽的核酸序列或者至少一种调节此类多肽的活性或表达的试剂作为 对于剌激终末上皮分化(特别是表皮类型)来说有用的试剂的美容或非治疗用途，所述多 肽所具有的氨基酸序列特别地由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其类似物或其片 段所呈现的核酸序列编码。 根据另一个方面，本发明的主题还是有效量的至少一种源自载脂蛋白D的多肽、 至少一种编码此类多肽的核酸序列或者至少一种调节此类多肽的活性或表达的试剂在制 备用于剌激上皮分化(特别是终末表皮分化)的组合物(特别是治疗组合物)中的用途， 所述多肽所具有的氨基酸序列特别地由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其类似物 或其片段所呈现的核酸序列编码。 特别地，根据本发明所考虑的组合物可用于剌激角质形成细胞的终末分化。
为了本发明的目的，"有效量"这一表述意指对于观察到所期望的效果，即美容效 果或治疗效果而言所必需的最小量，应当理解对于获得美容效果或治疗效果而言所必需的 有效量在合适时可以是相同的或不同的。
为了本发明的目的，"美容用途"这一表述意指主要用于获得美学效果和/或舒适 的用途。 为了本发明的目的，"治疗组合物"这一表述意指用于获得对于上皮(特别是表 皮)病症的预防性或治疗性效果的组合物，所述病症被认为是病理学状态的表现。
为了本发明的目的，"预防的"或"预防性的"这一表述意指减少现象例如病理学状 况突然出现的风险。 特别地，根据本发明的组合物可以用于预防和/或治疗上皮(特别是表皮)厚度
的减少，和/或上皮(特别是表皮)的紧实度(firmness)、弹性、密度和/或张度(tone)的
丧失，和/或皮肤衰老的征候(sign)例如铍纹和细线(fine line)的形成。"皮肤衰老征候"这一表述意指由于衰老(其为时序性的(chronobiological)和
/或光诱导的)所导致的皮肤外观的所有改变，例如皱纹和细线，干瘪的皮肤，皮肤弹性和/
或张度的缺乏，真皮厚度减少，和/或胶原纤维降解，其引起松弛和有皱纹的皮肤外表。该
术语还意指皮肤的并不系统地导致经改变的外观的所有内部改变，例如皮肤的所有内部降
解，特别是由于暴露于紫外线辐射而引起的弹性蛋白纤维或弹性纤维的降解。 根据另一个实施方案，根据本发明的组合物可以特别地用于预防和/或治疗皮肤
干燥征候，特别是用于预防和/或治疗上皮(特别是表皮)脱水。 根据本发明的组合物可以特别地用于预防和/或治疗上皮(特别是表皮)或嘴唇 或头皮的时序性衰老的效应。 根据另一个方面，本发明还涉及至少一种根据本发明的多肽作为用于筛选生物学 或化学化合物的工具的用途，所述化合物能够调节(特别是激活)所述多肽的表达和/或 生物学活性。 特别地，本发明涉及用于筛选抗衰老活性剂的方法，其至少包括下列步骤
a)在适宜于表现出根据本发明的多肽的表达的条件下，使至少一种能够表达根据 本发明的多肽即载脂蛋白D或其衍生物的细胞类型与至少一种待测试的化学或生物学化 合物相接触， b)测定所述多肽的含量。 根据本发明的另外一个方面，本发明还涉及至少一种根据本发明的多肽或者至少 一种编码所述多肽的核酸序列作为用于表征上皮(特别是表皮)状态的工具的用途。
更精确地，根据本发明的另一个方面，本发明涉及用于表征上皮(特别是表皮)的 表面状态的非侵入性的方法，特别是美容方法，所述方法至少包括定性或定量地表征根据 本发明的多肽即载脂蛋白D、其衍生物或片段的表达和/或生物学活性。
根据一个实施方案的变化形式，可以与参照数据项或值相比较地来评估所获得的 数据或值，所述参照数据项或值例如至少获自不同于所述表征受试物并且其状态已知的上 皮，特别是表皮。 根据本发明的另一个方面，本发明的目的还是用于表征美容或治疗处理的功效的 非侵入性的方法，特别是美容方法，所述美容或治疗处理旨在改善上皮(特别是表皮)的生 理学状态，和/或用于治疗上皮(特别是表皮)厚度的减少，和/或上皮(特别是表皮)的 紧实度、弹性、密度和/或张度的丧失，和/或皮肤衰老的征候例如皱纹或细线，所述方法至 少包括定性或定量地表征根据本发明的多肽即载脂蛋白D、其衍生物或片段的表达和/或
6生物学活性。 根据一个实施方案的变化形式，在表征结束时获得的数据也可以与参照值或数据
相比较地进行检查。该参照值或数据可以为在施行所述处理之前或者在相比于处理开始日
期而言较短的时序时间内从待经历处理的上皮(特别是表皮)获得的数据。 如从下面的描述中明显可见的，根据本发明的方法是特别有利的，因为它们的使
用不要求侵入性操作。 本发明的方法可以在体外、离体或在体内进行。 实际上，本发明人在角质层中定位了所述新型衰老生物标志物载脂蛋白D，这使得 仅通过局部样品收集就能够定量或定性地表征该糖蛋白的表达。样品收集方法可以是例如 剥离(stripping)型技术，其在于对于所考虑的上皮例如表皮施加一部分胶粘带。在去除 该胶粘带时，上皮的级分(例如表皮级分)被去除。然后，在提取后，这通过常规方法例如 免疫酶测定法或更特别地Western印迹分析来进行分析。
缝,2 根据一个实施方案，适合于本发明的多肽可以具有完全或部分地由SEQ ID NO 2 所示序列或其类似物或其片段所呈现的氨基酸序列。 为了本发明的目的，除非另外说明，"ApoD"这一表述通常意指在天冬酰胺残基第 45和178号上具有或不具有糖基化的蛋白质的序列(SEQ ID NO 2)，这导致分子量为19至 32kDa和pl为5. 6至7. 8的变体。"多肽的类似物"这一表述意指具有序列同源性(特别是相关于所述多肽的特征序
列)以及相同性质的生物学活性的任何多肽。 该化合物可以是肽模拟试剂(p印tidomimetic agent)。 同源性可以为至少85%，例如至少90%，和例如至少95%。同源性可以通过目视 比较或者借助于任何本领域中通常使用的计算机工具(例如在皿ncbi. nlm. nih. gov上
可获得的并且以默认配置参数来使用的BLAST程序)来确定。 序列的同源性可以由于在根据本发明的肽序列中源自突变或变异的修饰而产生， 所述突变或变异源自在根据本发明的多肽的特征序列中一个或多个氨基酸的缺失，或一个 或多个氨基酸的插入，或一个或多个氨基酸的置换。 为了本发明的目的，"多肽片段"这一表述意指根据本发明的多肽的任何部分，其 包含所述多肽的至少4个，至少6个，特别是至少8个和更特别地至少12个连续氨基酸，以 及实质上相似的生物学活性。"多肽的特征序列"这一表述，特别是就载脂蛋白D而言，意指由SEQ ID NO 2所呈 现的序列。 通常，多肽类似物可以包含相对于天然多肽的氨基酸序列而言保守的置换。
可以将几种这些修饰相组合。 作为在本发明中可以考虑的突变的例子，以非穷尽的方式，可以提及用具有相似 亲水值的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基而不因此明显地影响该多肽的生物学特 性，特别是其生物学活性，例如其剌激角质形成细胞的增殖和/或迁移和/或终末分化的活 性，或剌激上皮(特别是表皮)中蛋白聚糖合成的活性。 亲水值是根据其疏水性和其电荷而赋予氨基酸的值(Kyte等人，(1982) ， J. Mol.Biol. ，157 :105)。 本发明所涉及的多肽或类似物可以是经历一种或多种翻译后修饰的多肽。
"翻译后修饰"这一表述意在包括肽或蛋白质在细胞中合成之后可能经历的所有 修饰，例如一次或多次磷酸化、一次或多次糖基化、一次或多次脂质化(例如法呢基化或棕 榈酰化)、结构重排例如二硫键的形成和/或例如肽序列内部的切割。
此外，所述类似物具有与天然多肽基本上相同的生物学活性。 根据一个实施方案，适合于实施本发明的多肽还可以是天然或合成的多肽，在需 要时所述多肽能够在酶促或化学裂解载脂蛋白D后获得，或通过化学或生物合成而获得， 或通过从生物组织例如皮肤中提取而获得，所述生物组织天然地或在转染后表达该多肽以 及该多肽的各种翻译后形式；或者其序列全部或部分地(完全或部分地)包含前述氨基酸 序列的任何天然或合成的多肽，例如变体和类似物。 借助于基于重组DNA的方法，例如在手册《Molecular Cloning-A LaboratoryMa醒l》(第2版)，Sambrook等人，1989， Vol. 1-111， Coldspring HarborLaboratory，Coldspring Harbor Press,NY， (Sambrook)中所描述的那些方法，本令页 域技术人员可以获得根据本发明的多肽。 根据另一个实施方案，适合于实施本发明的多肽还可以是如前面所定义的多肽，
其中至少一个残基已被具有相似亲水值的氨基酸残基所替代，如前面所定义的。 根据另一个实施方案，适合于实施本发明的多肽还可以是如前面所定义的多肽，
其与另一个多肽，亲水或疏水性靶向试剂，生物转化的前体，发光、放射性或比色标记试剂
相融合。 以非限制性的方式，作为能够与根据本发明的多肽相偶联的化合物的例子，可提
及荧光蛋白例如"绿色荧光蛋白"，荧光化学化合物例如罗丹明、荧光素、德克萨斯红@，磷光
化合物，放射性元素例如3H、14C、35S、121I或1251，或者比色标记试剂例如对于半乳糖苷酶、过
氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或碱性磷酸酶的作用敏感的生色底物。 依照能够与根据本发明的多肽相偶联的化合物的性质，偶联可以通过化学方法，
特别是借助于反应性化学官能团，或者通过本领域技术人员已知的分子生物学方法来进行。 核酸序列的定义 根据一个实施方案，本发明还涉及编码本发明多肽的核酸序列以及其在根据本发 明的各种用途和方法中的应用。 因此，本发明还涉及核酸(特别是脱氧核糖核酸或核糖核酸)序列在制备根据本 发明的组合物中的用途，所述核酸序列编码根据本发明的多肽，特别是相应于至少一种SEQ ID N0:1所示核酸序列、其类似物或其片段的序列。 为了本发明的目的，"核酸序列的片段"这一表述意指编码根据本发明的多肽或其 类似物的全部或部分的核酸序列，特别是SEQ ID N0:1所示核酸序列或其类似物。
"核酸序列的类似物"这一表述意指任何这样的核酸序列，其任选地由于核酸密码 的简并性而产生，并且编码与由所述核酸序列所编码的多肽序列相同或类似的多肽序列。
所述核酸序列可以源自任何可能的来源，即动物来源(特别是哺乳动物，和更特 别是人)、植物来源、微生物来源(病毒、噬菌体、细菌等)或者真菌来源，但并不预先判断它们是否天然地存在或不存在于所述源生物体中。 在这种情况下，本发明还涉及编码根据本发明所考虑的多肽的经分离和纯化的核 酸片段的用途。 根据本发明的核酸序列可以包括有义、反义或干扰序列，其相应于编码根据本发 明的多肽的序列。 因此，本发明还涉及编码根据本发明的多肽的核酸(特别是脱氧核糖核酸或核糖 核酸)序列的用途。 根据本发明的核酸序列可以特别地用于制备相应的有义或反义核糖核酸序列。
本发明的主题还是任何多核苷酸的用途，所述多核苷酸具有包含有义或反义序列 的核糖核酸或脱氧核糖核酸序列(特别是"小干扰RNA")，所述序列至少相应于核酸序列 SEQ ID NO :1或其类似物。
调节试剂 根据另一个实施方案，本发明涉及调节根据本发明的多肽的表达、活性和/或释 放的试剂的用途。 特别地，本发明涉及激活本发明多肽的活性的调节试剂的用途。 为了本发明的目的，"调节"这一表述，就所给出的效应而言，意指剌激或抑制该效
应的作用。 为了本发明的目的，表述"调节试剂或者能够调节生物学活性和/或表达的化学 或生物学化合物"意指能够对于至少一种根据本发明的多肽或编码该多肽的核酸序列、或 者对于细胞内或细胞外信号传导途径或代谢途径(牵涉所述多肽)的组分、或者对于在调 控编码所述多肽的核酸序列的转录和/或翻译中所牵涉的组分直接或间接地起作用的任 何化合物。"生物学活性"这一表述，就载脂蛋白D而言，特别意指具有SEQ ID NO 2所示序 列的蛋白质的生物学活性、所述蛋白质的成熟形式的生物学活性以及在天冬酰胺残基第45 和178号上具有或不具有糖基化(这导致分子量从19至32kDa和pl从5. 6至7. 8的变 化)的蛋白质的生物学活性。 该调节试剂可以为激活本发明多肽的基因表达或蛋白质表达的试剂，或者抑制本 发明多肽的基因表达或蛋白质表达的试剂。 作为激活基因表达的试剂的举例说明而非限制，可以特别提及雄激素类(双氢睾 酮(DHT))、地塞米松(DEX)、反式-视黄酸、1， 25- 二羟维生素D3、氯氮平、a -白细胞介素1 和糖皮质激素。 作为抑制基因表达的试剂的举例说明而非限制，可以特别提及黄芩苷元、雌激素 类(雌二醇)和他莫昔芬。 更特别地，调节试剂可以是根据本发明的多肽的基因表达的激活剂。 本发明另外还涉及用于筛选能够调节根据本发明的多肽的生物学活性的生物学
或化学化合物或者物理化学因素的方法，所述方法至少包括下列步骤 a)在适宜于表现出根据本发明的多肽的所述生物学活性的条件下，使至少一种根 据本发明的多肽与至少一种待测试的化学或生物学化合物相接触，和/或对所述多肽施以 所述物理化学因素，禾口
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b)测定所述多肽的所述生物学活性。 在这样的方法中，所述多肽的生物学活性，特别是其上皮分化活性，尤其是表皮终 末分化活性(尤其是关于角质形成细胞而言)，可以例如通过本领域技术人员已知的任何 方法来测定。
例如并且非限制性地，可提及这样的方法进行细胞培养；随后对分化标志物例
如角蛋白10、聚丝蛋白，或增殖标志物例如KI67和PCNA进行表征。 根据一个实施方案，可以将所述多肽的生物学活性与参照值进行比较。 可以通过在不存在任何待测试的生物学或化学化合物或者物理化学因素的情况
下测量所述多肽的生物学活性来获得参照值。 假定参照值的该测量在使用待测试的生物学或化学化合物或者物理化学因素之
前进行，那么根据本发明的方法此外还可以，在需要时，允许评价所述化合物的潜在功效。 该生物学活性可以不受所述化合物的存在的影响，或者相反地被抑制或剌激。 假定观察到了剌激效应，那么该受试化合物能够用作例如抗衰老活性剂。 根据本发明的方法可以在分离的细胞样品上进行，所述细胞样品从皮肤活组织检
查或者从培养的细胞获得。 有利地，作为适合于本发明的细胞样品，可提及角质形成细胞样品。
有利地，在根据本发明的方法中使用的多肽可以是载脂蛋白D。 本发明还涉及用于筛选能够调节根据本发明的多肽的表达的生物学或化学化合 物的方法，所述方法至少包括下列步骤 a)在适宜于表现出编码根据本发明的所述多肽的核酸序列的表达的条件下，使至
少一种能够表达编码根据本发明的所述多肽的核酸序列的细胞类型与至少一种待测试的
化学或生物学化合物相接触，禾口 b)测定所述核酸序列的表达。 核酸序列的表达可以，例如借助于寡核苷酸探针，或者通过本领域技术人员已知 的任何实验方案来测定。 作为核酸序列的检测方法的例子，可提及聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶-聚合
酶链式反应(RT-PCR或Q-PCR) 、Northern印迹法、核糖核酸酶保护测定法、使用DNA芯片的
方法、使用转录物组学芯片的方法、使用寡核苷酸芯片的方法、原位杂交法。 作为适合于检测核酸序列，特别是mRNA序列的试剂的例子，可提及可以与所述序
列杂交的经标记的核酸探针。 这样的核酸探针可以通过本领域技术人员已知的任何方法容易地获得。 因此，根据本发明的核酸序列可以用于制备有义和/或反义寡核苷酸引物，所述
引物可以在高严紧条件下与序列SEQ ID N0:1或其类似物杂交。 可以将根据本发明的核酸序列的表达与参照值进行比较，所述参照值例如通过在 不存在受试化合物的情况下实施根据本发明的方法而获得。 核酸序列的表达还可以间接地通过测定由所述序列编码的多肽的表达来测定，其 中借助于本领域已知的任何技术，例如Western印迹法、ELISA、Bradford或Lowry法，或者 如下文所示的。 本发明还涉及用于筛选能够调节根据本发明的多肽的表达的生物学或化学化合物(甚至抗衰老活性剂)的方法，所述方法至少包括下列步骤 a)在适宜于表现出根据本发明的多肽的表达的条件下，使至少一种能够表达根据
本发明的多肽的细胞类型与至少一种待测试的化学或生物学化合物相接触， b)测定所述多肽的含量，禾口 c)将在步骤b)中测得的所述含量与在不存在待测试的化学或生物学化合物的情 况下测得的所述多肽的含量进行比较。 在步骤c)中进行的比较可以使得能够推断出关于所述受试化合物调节本发明多 肽表达的特性的信息。 本发明的方法可以在分离的细胞样品上进行。 根据本发明的多肽的含量的测定可以借助于本领域技术人员已知的任何方法来 进行。 作为多肽的检测方法，可以提及Western印迹法，狭线印迹法，斑点印迹法，单重 或多重类型的ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法，蛋白质组学或糖组学方法，用基于银的 染色剂、考马斯蓝或SYPRO在聚丙烯酰胺凝胶中对多肽进行染色的方法，免疫荧光方法，UV 吸收方法，使用常规显微术、电子显微术或共聚焦显微术的免疫组织化学方法，FRET(荧光 共振能量转移)方法，TR-FRET(时间分辨FRET)方法，FLIM(荧光寿命成像显微术)方法， FSPIM(荧光光谱成像显微术)方法，FRAP(荧光漂白恢复)方法，通过报告基因的方法， AFM(原子力显微术)方法，表面等离子共振方法，微量量热法，流式细胞术方法，生物传感 器方法，放射免疫测定法(RIA)，等电点聚焦方法，酶测试，使用肽芯片、糖芯片、抗体芯片的 方法，质谱法，SELDI-TOF型光谱方法(Ciphergen)。 根据本发明的方法可以在样品(例如分离自上皮，特别是表皮)上进行，所述样品 从皮肤活组织检查获得，或者从上皮(例如表皮)细胞模型获得，或者更有利地从角质层的 (特别是使用胶粘带("剥离带")的)非侵入性表面取样获得，或者通过简单洗涤获得。
表皮样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法来收集。
这些方法可通过所谓的剥离技术来进行。
这些剥离是施加到表皮表面上的粘性表面，例如3M的Blenderm 、
D' squam(CuDERM的商业胶粘剂)、氰基丙烯酸酯粘合胶或者涂料剥离(varnish stripping)法。通过使用这些剥离，可以收集得到粘附性角质细胞和其细胞间隙的内容物， 并随后使其经历提取，这使得能够评估蛋白质的含量。 适合于所述方法的样品的收集还可以更直接地通过"洗涤"皮肤表面来进行，其中 借助于例如叶轮(vane turbine)类型的附件、螺旋室(spiral cell)类型的附件(如专利 FR 2 667 778中所描述的)(其与流体回路(fluid circuit)相组合)，或者简单地通过在 皮肤表面上添加/移去缓冲液滴。 作为对适合于实施本发明的其他样品收集方法的引导，可提及基于借助双刀片 (twin blade)系统刮削角质层顶部的方法。该技术使得能够收集鳞屑，所述鳞屑然后可以 通过各种技术直接进行分析，以测定矿物质、氨基酸或脂质水平。 应当理解，根据本发明所考虑的所有美容或治疗组合物采用生理学上可接受的介 质。 为了本发明的目的，"生理学上可接受的介质"这一表述意指这样的介质，其适合于将组合物应用在上皮或角蛋白材料(例如，皮肤，头皮，嘴唇，粘膜，以及角蛋白纤维例如 头发、指(趾)甲和体毛)上，或在需要时通过口服或肠胃外途径。 为了本发明的目的，"治疗的"这一表述意指可以在上皮(特别是表皮)状态的预 防性和/或治疗性处理的范围内，或者在上皮(特别是表皮)状态的评价方法的范围内使 用的组合物。 根据另一个实施方案，根据本发明的美容或治疗组合物另外还可以包含至少一种 美容和/或治疗活性剂。 作为在本发明范围内可使用的活性剂的例子，可提及美容用油，例如硅油或甘油 三酯类型的植物油，烃油例如parleam油以及脂肪酸和脂肪醇的酯。 还可以使用其他使得能够改善皮肤状况的活性剂，例如水化活性剂或润湿活性 剂，或使得能够改善天然脂质屏障的活性剂，例如神经酰胺、硫酸胆固醇和/或脂肪酸以及 它们的混合物。 还可以使用对皮肤具有活性的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、葡糖苷酶、酰胺酶、脑苷酶 和/或melanases以及它们的混合物。 作为适用于实施本发明的活性剂的其他例子，可以提及止痛活性剂、抗酵母活性 剂、抗细菌活性剂、抗寄生虫活性剂、抗真菌活性剂、抗病毒活性剂、类固醇抗炎活性剂、麻 醉活性剂、止痒活性剂、角质层分离活性剂、抗自由基活性剂、抗皮脂溢活性剂、去头屑活性 剂、抗痤疮活性剂、旨在防止皮肤衰老和/或改善其状况的活性剂、抗皮炎活性剂、抗剌激 物活性剂、免疫调节活性剂、用于治疗干燥的皮肤的活性剂、抗出汗活性剂、抗银屑病活性 剂、针对UV的保护性活性剂、抗组胺活性剂、瘢痕形成活性剂、自晒黑活性剂、抗氧化剂例 如绿茶或其活性级分、甘油、l即onite、咖啡因、芳香精油、着色剂、去色素活性剂、脂调节 剂、柔软化活性剂、提神活性剂、祛臭活性剂、脱敏活性剂、漂白活性剂、和营养活性剂、减少 皮肤的分化和/或增殖和/或色素沉着的活性剂以及它们的混合物。 —般地，可以将本发明的任何组合物应用于皮肤(身体的任何皮肤区域)上或者 粘膜(颊的、颧的、牙龈的、生殖器的、结膜的粘膜等等)上。 正如已经知道的，美容组合物还可以含有美容学领域中通常使用的辅助剂，例如 亲水或亲脂的凝胶剂、亲水或亲脂的添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、防晒剂、 气味吸收剂和着色物质。 根据本发明的组合物的各种组分的量为在所考虑的领域中常规使用的量。
在根据本发明的组合物中所包含的化学或生物学化合物或者根据本发明的多肽、 核酸序列或调节试剂的量(也称为"有效量")，当然取决于所述化合物的性质和所寻求的 效应，并因此可以在大的范围内变动。 为了给出大概的数量级，组合物所包含的根据本发明的调节试剂或多肽的量可以 为所述组合物总重量的0. 00001 %至50 % ，特别地0. 001 %至10 % ，和更特别地0. 1 %至1%。 更特别地，根据本发明的组合物旨在用于减少和/或治疗可能使上皮(特别是表 皮)状态变坏的疾患。 本发明所涉及的上皮状态可以是与下列相关的状态终末上皮(特别是表皮的， 尤其是角质形成细胞的)分化的功能障碍。
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这样的状态可以是时序起因的(即与时间流逝相关的，例如皮肤衰老)，和/或为 与例如光衰老相关的皮肤病症的指示。 因此，根据本发明的组合物(特别是美容组合物)可以特别是用于预防和/或治 疗表皮厚度的减少，和/或表皮的紧实度、弹性、密度和/或张度的丧失，和/或皱纹和细线 的形成。 根据另一个实施方案，根据本发明的组合物(特别是美容组合物)可以特别是用 于预防和/或治疗皮肤干燥征候，特别是预防和/或治疗表皮脱水。 本发明的组合物还可以用于预防和/或治疗上皮(特别是表皮)屏障功能的紊 乱。 根据另一个实施方案，根据本发明的组合物(特别是美容组合物)可以用于预防 和/或治疗表皮衰老的征候。 更特别地，根据本发明的组合物(特别是治疗组合物)可以用于治疗皮肤病症，例 如皮肤水化紊乱，例如干燥病，角化不全，角化过度，鱼鳞病，银屑病，特应性皮炎，湿疹，酒 渣鼻，苔癣(lichen)，瘙痒症，具有炎性组分或者由于免疫应答的改变而引起的皮肤病理学 状态，脱屑，黑素生成或皮脂生成(sebogenesis)的失常，脱发，多毛症，瘢痕形成紊乱，或 者牵涉分泌现象和细胞侵入过程的皮肤病症，特别是在恶性或良性瘤形成的范围内。
根据另一个方面，本发明还涉及至少一种根据本发明的多肽或至少一种编码所述 多肽的核酸序列作为用于表征上皮(特别是表皮)状态的工具的用途。
作为例子，根据本发明可以表征上皮状态，所述上皮状态选自脱屑、鱼鳞病、角化 过度、表皮干燥、衰老或光衰老。 因此，如上所说明的，根据本发明的另一个方面，本发明涉及用于表征非病理性表 皮的表面状态或者美容或治疗处理的功效的非侵入性方法，其旨在定性或定量地表征载脂 蛋白D、其衍生物或片段的表达。 这些方法是特别有利的，因为它们的应用并不必定要求诉诸外科手术技术来实施 此类表征。因此，表皮提取物可以通过简单的剥离而获得，并且直接通过常规的分析技术来 进行分析，特别是如上面所描述的。 根据一个实施方案，用于表征上皮(例如表皮)状态的方法至少包括下列步骤
a)测定在所述上皮的样品中根据本发明的多肽或编码所述多肽的核酸序列的含 量，禾口 b)将在步骤a)中测得的所述含量与参照值进行比较。
有利地，本发明的方法是非侵入性的。
有利地，本发明的方法在分离的样品上进行。 根据一个实施方案，根据本发明的方法可以在收集自个体的上皮(特别是表皮) 样品上进行。 根据本发明的方法还可以在上皮(特别是表皮)样品上进行，所述样品收集自上 皮(特别是表皮)细胞模型或者重构的分离的皮肤，以便对其状态进行定性。
上皮样品的收集可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。
根据本发明的方法可以在体内、在体外或离体进行。 参照值可以是例如在表皮样品上所测得的多肽或核酸序列的含量，所述表皮样品收集自上皮，特别是正常皮肤，即在生理学方面符合例如年轻皮肤的形象。 参照值的测量可以与测定多肽或核酸序列的所述含量平行地或顺次地进行。 所测得的含量与参照值的比较可以使得能够评价相对于该值的偏差。 分析该偏差的程度和/或性质(负的或正的)可以提供关于表皮状态的信息。 表皮状态的表征可以为可能的皮肤病症的指示，所述皮肤病症可以通过使用能够
调节根据本发明的多肽的表达的化合物来修正。 根据一个实施方案，根据本发明的方法可以在个体中在推测的上皮(特别是表 皮)病症的体内、体外或离体诊断方法中施行。 例如，待评价的上皮状态可以选自脱屑、鱼鳞病、角化过度、表皮干燥、衰老或光衰老。 有利地，适合于施行根据本发明的方法的多肽可以是载脂蛋白D。 可以通过本领域技术人员已知的任何实验方案来测定表皮样品中根据本发明的
多肽或根据本发明的核酸的含量。 作为多肽检测的方法，可提及前面已列举的那些。 因此，可以设想，借助于抗体，在需要时以经标记的形式，来检测根据本发明的多 肽的存在。 能够用作用于评价表皮状态的工具的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何 方法来获得，例如在"Antibodies :A Laboratory Manual ，，， Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)中所描述的方法。有利地，所使用的抗体可以是 重组抗体，例如由Antibodies-by-design公司所开发出的那些抗体。 有利地，适合于施行根据本发明的方法的核酸序列可以是编码ApoD的核酸序列， 例如mRNA类型的核酸序列。 作为根据本发明的核酸的检测方法的例子，可以提及前面已列举的方法。 本发明还涉及非治疗方法，其用于证明在个体中能够引起上皮病症(特别是皮肤
或头皮病症)消退的处理的效果，所述方法至少包括下列步骤 a)在所述处理之前，在收集自所述个体的第一上皮样品中进行至少一次根据本发 明的多肽的生物学活性和/或表达或者编码所述多肽的核酸序列的表达的第一测定，
b)在所述处理之后，在收集自所述个体的第二上皮样品中进行至少一次在步骤 a)中所测定的所述多肽的所述生物学活性和/或所述表达或者所述核酸序列的所述表达 的第二测定，禾口 c)将所述第一和第二测定进行比较，特别是以便从中推断出至少关于所述处理的 效果的信息。 此类处理可以特别地为美容处理。 特别地，其效果待评价的处理可以是用于缓解或减少与角质形成细胞的增殖和/
或分化的功能障碍相关的皮肤或头皮病症的处理。 可以如上所示来测定多肽的生物学活性和表达。 根据另一个方面，本发明涉及用于皮肤病症的美容处理的方法，其至少包括下列 步骤将至少一种根据本发明的美容组合物应用在皮肤、粘膜和/或角蛋白纤维的至少一 部分上。 根据另一个方面，本发明涉及有效量的至少一种根据本发明的多肽或者至少一种调节所述多肽的表达的试剂用于制备和/或改善多层细胞模型(特别是表皮或粘膜类型 的)，特别是重构的皮肤模型的用途。 为了本发明的目的，"重构的皮肤模型"这一表述意指这样的模型，在所述模型中 组合了各种细胞类型，例如特别是皮肤的天然组成成分，例如角质形成细胞、成纤维细胞、 朗格汉斯细胞和黑素细胞。 成纤维细胞类型的细胞可以是经照射的或相反。
这样的模型及其制备是本领域技术人员已知的。 为了本发明的目的，"a"应当理解为指"至少一 (种、个)"的意思。
下面给出的实施例是为了举例说明而非限制本发明的目的而呈现的。
实施例1 通过在个体的不同皮肤区域上进行涂料剥离而收集的样品的分析 通过使用在腿上进行的涂料剥离来施行所述分析。 将适合于该研究的受试者分成4个组。 AS组相应于组1 :干燥的更年期个体，n = 15。 AN组相应于组2 :正常的更年期个体，n = 13。 JS组相应于组3 :干燥的年轻个体，n = 16。 JN组相应于组4 :正常的年轻个体，n = 14。
1 :丙酮制粉的制备 将两个10cm2的涂料剥离物(B. Mehul等人，J Biol Chem 2000，Apr 28 ;275(17): 12841-7)置于20ml丙酮中。角质细胞发生脱附。将该混合物在40 y m尼龙膜上进行过滤。 用相同体积的丙酮进行3次连续的漂洗。最后，在真空泵上使该悬浮液进行过滤。以干燥
形式获得角质层的丙酮制粉。
2 :样品的提取 在变性条件下进行提取。为此，每mg丙酮制粉，添加100 iU体积的PBS缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水)+0. 1% Triton XIOO，以进行预洗涤。在Potter中研磨该混合物，并进行 离心。回收角质细胞粒状沉淀。用相同体积(100iil/mg)的包含O. 0625mM Tris pH 6.8， 200mM DTT，2% SDS， 10%甘油的Laemmli缓冲液进行提取。将该混合物在沸腾温度下加热 10分钟，随后进行研磨并以10000g离心10分钟。回收上清液。使用Bradford试剂，按照 Bradford技术来进行蛋白质测定法(Bio-Rad蛋白质测定法)。将样品调整至lmg/ml。
3 :通过Western印迹法来分析所述蛋白质 通过SDS-PAGE电泳来分离开所述蛋白质。在根据标准实验方案半干燥地转移 到PVDF膜(Immobilon-P Milipore)上之后，将所述蛋白质与抗_载脂蛋白D抗体Medcla 457 (36c6) (Accurate Chemical) —起在4。C下温育过夜。接下来，用针对一抗的二抗(在 该情况下，为小鼠抗体(山羊抗小鼠IgG HRP缀合物)(Bio-Rad))来进行第二次温育，所述 温育在室温下进行1小时30分钟。在免疫检测后，用酰胺黑对在转移后在膜上存在的总蛋 白质进行染色。将ECL Plus试剂盒(Amersham)用于可视化。用FluorSmax(Biorad)来获 取图像，并且借助于Quantity-one软件(Biorad)对条带进行定量。
4 :结果 将结果表示为目标蛋白的A cnt*mm2/总蛋白质的A cnt*mm2。
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方法 皮肤的年龄和类型的双因素方差分析(考虑了这两个因素的相互作用)+单因素 方差分析(组)和Turkey' s多重比较检验。由于正态性和同方差性条件未经验证，因此 在对数变换后进行所述分析。 用软件包SAS版本8. 2和SPSS版本12进行统计学分析。 以5%双侧阈值来进行所有的检验。
下表显示了平均值结果以及其平均值的标准误差(sem)。

组载脂蛋白Dsem apoD
AS19262
AN20676
738245
了N728201注意到在皮肤衰老过程中载脂蛋白D的表达显著减少(p=0. 005)。序列表SEQID NO 11gctgattctgcatctgg^actgccttcat皿gctccaggtcccttctcc61agccacccagccccaagatggtgatgctgctgctgctgctttccgcactggctggcctct121tcggtgcggcgcatttcatcttggg皿gtgccccaatcctccggtgcagg181ag朋ttttgacgtg皿teagtetctcggaagatggtecga241cctttgagaatggacgctgcatccaggccaactectcactgg^agatca301朋gtgtte朋cc郷agttg卿gctgatgg皿ctgtg皿ggtg皿gcca361ccccagtteacctcacagagcctgccaagctgg皿gtteagttttcctggtttetgccat421cggcaccgtectggatcctggccaccgactatgag皿ctetgccctcgtgtettcctgte481cctgcatcatccaactttttcacgtggattttgcttggatcttggc皿gaaacccteatc541tccctccaga皿C3gtgg3Catetcctgacttcteateacattgatgtca601ggtC3C3g3Ccaggtg皿ctgccccaagctctcgteaccaggttctecag661ggaggctgcacccactccatgttecttctgcttcgctttccccteccccacccccccccc721ate朋gac朋C3Cg3C皿3gg皿gttgacctg皿catgteaccatgccct781accctgtteccttgctegctcttgttgctgacctgc皿皿841a a a a a a a a a ￡SEQID NO 21匪LLLLLSALAGLFGMEGQAFHLGKCPNPPVQENFDVNKYLGRWYEIEKIPTTFENGR61CIQANYSLME NGKIKVLNQELRADGT濯EGEATPVNLTEPAKLEVKFSWFMPSAPYWI121LATDYENYAL VYSCTCIIQLF誦FAWILARNPNLPPETVDSL認ILTSNNIDVKKMTVT181DQVNCPKLS
1权利要求
有效量的至少一种多肽、至少一种编码此类多肽的核酸序列或者至少一种调节此类多肽的活性或表达的试剂作为对于刺激终末上皮分化来说有用的试剂的美容用途，所述多肽所具有的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO 1所示序列、其类似物或其片段所呈现的核酸序列编码。
2. 有效量的至少一种多肽、至少一种编码此类多肽的核酸序列或者至少一种调节此类 多肽的活性或表达的试剂在制备用于剌激终末上皮分化的治疗组合物中的用途，所述多肽 所具有的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其类似物或其片段所呈现 的核酸序列编码。
3. 根据权利要求1或2的用途，其中所述多肽具有完全或部分地由SEQ ID N02所示序 列、其类似物或其片段所呈现的氨基酸序列。
4. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述调节试剂是所述多肽的基因表达的激 活剂。
5. 根据前一项权利要求的用途，其中所述激活剂选自双氢睾酮(DHT)、地塞米松 (DEX)、反式-视黄酸、1，25- 二羟维生素D、氯氮平和糖皮质激素。
6. 根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述组合物用于预防和/或治疗表皮厚度 的减少，和/或表皮的紧实度、弹性、密度和/或张度的丧失，和/或皱纹和细线的形成。
7. 根据权利要求2、3、4或5的用途，其中所述组合物用于预防和/或治疗皮肤干燥征 候，特别是预防和/或治疗表皮脱水。
8. 根据权利要求2、3、4或5的用途，其中所述组合物用于预防和/或治疗表皮屏障功 能的素乱。
9. 至少一种依照权利要求1或3所定义的多肽作为用于筛选生物学或化学化合物的工 具的用途，所述化合物能够调节所述多肽的表达和/或生物学活性。
10. 至少一种依照权利要求1至3所定义的多肽或者至少一种编码所述多肽的核酸序 列作为用于表征上皮状态的工具的用途。
11. 根据前一项权利要求的用途，其中所述上皮状态选自脱屑、鱼鳞病、角化过度、表皮 干燥、衰老或光衰老。
12. 用于表征上皮状态的方法，其至少包括下列步骤a) 测定在所述上皮的样品中依照权利要求1至3所定义的多肽或编码所述多肽的核酸 序列的含量，禾口b) 将在步骤a)中测得的所述含量与参照值进行比较。
13. 根据前一项权利要求的方法，其特征在于，它是非侵入性的。
14. 用于筛选抗衰老活性剂的方法，其至少包括下列步骤a) 在适宜于表现出权利要求1至3中所定义的多肽的表达的条件下，使至少一种能够 表达权利要求1至3中所定义的多肽的细胞类型与至少一种待测试的化学或生物学化合物 相接触，b) 测定所述多肽的含量。
15. 用于表征美容或治疗处理的功效的美容方法，所述美容或治疗处理旨在改善上皮 的生理学状态，和/或用于治疗上皮厚度的减少，和/或上皮的紧实度、弹性、密度和/或张 度的丧失，和/或皮肤衰老的征候例如皱纹和细线，所述方法至少包括定性或定量地表征权利要求1至3中所定义的多肽的表达和/或生物学活性。
16.有效量的至少一种依照权利要求1至3中任一项所定义的多肽或者至少一种调 节所述多肽的表达的试剂用于制备和/或改善多层细胞模型，特别是重构的皮肤模型的用 途。
全文摘要
本发明的主题是载脂蛋白D、源自该蛋白质的多肽或其类似物、编码此类多肽的核酸序列、或者调节此类多肽的活性或表达的试剂的用途，特别是美容和/或治疗用途，特别是用于刺激终末上皮分化。本发明还涉及载脂蛋白D、源自该蛋白质的多肽或其类似物、或者编码此类多肽的核酸序列作为用于评价表皮状态的标志物的用途。
文档编号A61P17/00GK101796417SQ200880021314
公开日2010年8月4日 申请日期2008年6月20日 优先权日2007年6月22日
发明者D·贝尔纳, I·卡斯蒂埃尔, L·西莫内蒂 申请人:欧莱雅公司