供体特异性抗体文库的制作方法

专利名称：供体特异性抗体文库的制作方法
技术领域：
本发明涉及供体特异性抗体文库及其制造与使用方法。本发明亦涉及中和从上述 供体特异性抗体文库所得的抗体与使用所得抗体以预防和/或治疗各种人类疾病与状况 的方法
现有技术人类疾病的诊断、预防与治疗所用特殊药剂的产生和识别需要使用有用化合物的 大量集合。随着建立和筛选抗体文库多种技术的发明与快速发展，针对疾病靶的单克隆抗 体成为了一类主要的候选新药。因为对用于人，除了特异性与有效性外，安全是主要的考虑 因素，人类单克隆抗体文库越来越具有特殊的重要性。目前，基于人类抗体候选药物的发展通常表现为筛选包含人类抗体序列库 (repertoire)中随机搜集的人类抗体文库，所述抗体文库通常与其计划的应用无关。每个 从特定人类供体构建的抗体文库潜在性的包含针对源自或导致个人一生之中供体遭遇、激 发以及克服的所有挑战的所有组分，生理，以及代谢改变的抗体。因为使用现行方法制成的 通常人类抗体文库是在不了解供体健康历史的情况下构建的，无法了解所期待的所得的免 疫球蛋白库中何者值得期待。因此，建立从成功克服，或者正在克服其所遭遇特定疾病的个体来源的抗体文库 是非常令人感兴趣的，因为其所得的抗体库包括了供体用来特异性防御相关疾病的抗体。 同样重要的是提供有效筛选与处理所述文库的方法，包括移除或分离负面或正面要素的能 力，消除不受欢迎的部分以及产生具有优化性质的人类抗体。本发明通过提供构建、筛选和处理来自面临并克服或正在克服特定目标疾病个体 (encounter)的供体特异性抗体文库的方法与手段，处理了上述的需求。发明描述在一方面，本发明涉及载体集合(collection)，所述载体集包含编码抗体轻链或 重链或其片段的核酸分子集合(repertoire)，所述集合来自人类患者供体，所述供体已罹 患，或正在罹患激发针对靶抗原抗体生成的疾病，其中所述集合用独特的条形码识别。在一个实施方案中，载体集包含编码抗体轻链或其片段的核酸分子库，例如，抗体 lamda轻链，或抗体kappa轻链，或其片段。在另一个实施方案中，载体集包含编码抗体重链或其片段的核酸分子库。还在另一个实施方案中，所述条形码是连接或整合入集合中存在的载体的核苷酸 序列，和/或连接或整合入编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子，使得不干扰所述核 酸分子的表达。因此，所述条形码可为从1到约24个核苷酸连续的非编码核苷酸序列，其可能，例 如，连接到所述核酸分子的3’或5’非编码区域上。在进一步的实施方案中，所述条形码是核苷酸序列，所述序列是整合入编码抗体 轻链或重链或其片段的核酸分子的一个或更多沉默突变的编码序列。
在更进一步的实施方案中，所述条形码是非连续性的核苷酸序列。至少部分所述 非连续性的核苷酸序列可能连接或整合入所述集合中存在的载体中。或者，至少部分所述 非连续性(non-contiguous)核苷酸序列可能整合入编码抗体轻链或重链或其片段的核苷 酸序列中，使得不干扰所述核酸分子的表达。在另一个实施方案中，所述条形码(barcode)是肽或多肽序列。在一个另外的实施方案中，载体集合(collection)中存在的载体是噬菌粒载体， 其可能，例如，包含细菌噬菌体基因III以及在编码抗体轻链或重链或其片段的核苷酸序 列与所述细菌噬菌体III基因间的终止密码子，且其具有条形码，例如插入到所述终止密 码子之后非翻译区域的非连续性核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述发明涉及包括本发明所述载体集合的宿主细胞。所述 宿主细胞可能是真核或原核宿主细胞，例如，大肠杆菌细胞。在进一步的实施方案中，所述发明涉及供体特异性抗体文库，所述文库包括表达 针对目标抗原抗体或抗体片段的集合文库成员，其中所述抗体或抗体片段来自人类供体， 所述供体已罹患，或正在罹患激发针对所述目标抗原的抗体生成的疾病，其中实施抗体文 库通过至少一种独特的条形码识别。在一个实施方案中，所述抗体重链和轻链分别分开的通过对且来自其的人类供体 为独特的条形码识别。在另一个实施方案中，所述供体特异性抗体文库通过一种独特的条形码识别。还在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段包含载体中存在的核酸分子编码的 抗体重链与轻链或其片段。在进一步的实施方案中，所述条形码是连接或整合入所述文库中存在载体的核苷 酸序列，以及或者在连接或整合入编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子，使得不干扰 所述核酸分子的表达。在更进一步的实施方案中，所述条形码是1到约24个核苷酸的毗连(contiguous) 非编码核苷酸序列，其可能，例如连接到所述核酸分子的3’或5’非编码区域上。在一个另外的实施方案中，所述条形码是编码序列编码，所述序列是整合入编码 抗体轻链或重链或其片段的核酸分子的一个或更多沉默突变的编码序列。在另一个实施方案中，所述条形码由非连续性的核苷酸序列编码。在进一步的实施方案中，至少部分编码所述条形码的非连续性的核苷酸序列连接 或整合入所述文库中存在的载体中。在更进一步的实施方案中，至少部分编码所述条形码的非连续性核苷酸序列整合 入编码抗体轻链或重链或其片段的核苷酸序列中，使得不干扰所述核酸分子的表达。在一个另外的实施方案中，所述条形码是肽或多肽序列。在另一个实施方案中，所述载体是噬粒(phagemid)载体，可能，例如，包含细菌噬 菌体基因III以及在编码抗体轻链或重链或其片段的核苷酸序列与所述细菌噬菌体III基 因间的终止密码子还在另一个实施方案中，所述人类患者供体的医疗史显示所述供体已罹患，或正 在罹患所述疾病。在有些实施方案中，独立证实所述人类供体已罹患，或正在罹患所述疾 病。
在另一个的实施方案中，所述供体特异性抗体文库基本上缺乏与所述目标抗原不 同抗原特异性结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述目标抗原是甲型流感病毒，例如甲型流感病毒HI、H2、H3、 H5、H7或H9亚型的隔离群。在另一个实施方案中，所述文库表达至少一个抗体或抗体片段，所述抗体或抗体 片段与多于一种的甲型(A)流感病毒亚型特异地结合。还在另一个实施方案中，所述文库表达至少一个抗体或抗体片段，所述抗体或抗 体片段结合并中和甲型流感病毒H5m亚型。在进一步的实施方案中，人类供体已经罹患或正在罹患选自下面表1中所示疾病 组成组中的疾病。在另一个实施方案中，所述抗体文库表达与目标疾病相关抗原结合的至少一种抗 体或抗体片段。在另一个实施方案中，抗体文库表达至少一个抗体或抗体片段，所述抗体或抗体 片段结合并中和与目标疾病相关的抗原。所述供体特异性抗体文库可能，例如，是噬菌体文库，在实施方案中，其可能包含 编码多于106不同抗体或抗体片段成员，或多于109不同抗体或抗体片段成员的序列。在其他实施方案中，所述供体特异性抗体文库是孢子呈现文库(spore-display library)、核糖体呈现文库、mRNA呈现文库、微生物细胞呈现文库、酵母呈现文库或哺乳类 呈现文库，但不限于此。在实施方案中，编码文库中存在的抗体或抗体片段的核酸是从抽提自人类患者供 体淋巴细胞的mRNA逆转录所得，其中所述淋巴细胞可能，例如，来源于骨髓、血液、脾脏或 淋巴结。如果需要，可在抽提所述mRNA之前生成所述人类供体的血清学谱(profile)。或者，或进一步，在抽提所述mRNA之前或之后检查所述人类供体以及可选的，其 家族的医疗史。在另一方面，实施方面涉及一种制造抗体特异性文库的方法，所述文库表达针对 目标抗原的抗体或抗体片段集合，包括下述步骤a)从人类患者供体淋巴细胞中获取mRNA，所述供体已罹患，或正在罹患激发针对 所述目标抗原的抗体产生的疾病；b)通过所述所得mRNA的逆转录，生成包含所述患者免疫球蛋白库编码序列的核 酸集合；c)使用标记所述核酸的独特条形码识别所述抗体特异性文库。所述方法可能进一步包括在步骤a)之前或之后，生成所述患者的血清学谱和/或 检查所述患者的医疗史的步骤。所述方法可能进一步包括下述步骤d)将所述核酸插入表达载体；e)表达所述免 疫球蛋白库；以及f)在展示(display)系统中展示所述免疫球蛋白库。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括基于其中和或激活目标抗原能力筛选 文库成员的步骤。还在另一个实施方案中，所述方法产生至少一个中和抗体。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括构建一个或更多亚文库的步骤，所述 亚文库包括发现可中和或激活目标抗原的文库成员。还在另一个实施方案中，所述方法包括对至少一个识别的文库成员测序的步骤。在进一步的实施方案中，所述方面涉及治疗或预防与目标抗原相关疾病的方法， 所述目标抗原被上述方法选择的抗体中和或激活，所述方法包括对人类患者施与有效量的 所选抗体。所述抗体可能，例如，是中和抗体，例如中和至少一种甲型流感病毒亚型的抗体。在另一个实施方案中，所述疾病选自下述表1列出的疾病所构成的组。附图简述

图1示意说明构建本发明人类抗体文库通常方法的流程2说明增加针对两个不同目标A和B的反应强度的通常淘选(panning)富集方 案。每轮富集增加该池针对个别目标的反应强度。图3说明选择与目标A与B交叉反应的克隆选择策略，其中每一成功步骤增强了 所得池针对两个目标的反应强度。图4说明增加针对两个不同目标(目标A与B)反应强度的策略，通过重组平行发 现池以生成/增加交叉反应性。每轮选择重组抗体文库增加所得池针对两个目标的反应强度。图5说明增加针对目标B的交叉反应性同时保持针对目标A反应性的策略。首先， 选择与目标A反应的克隆，然后制备与目标A有反应性克隆的诱变文库，并根据所示进行选 择，生成一个或更多与两个目标A与B显示强反应性的抗体克隆。图6说明通过“目标性诱变”方法生成具有多样性的多功能抗体集合的代表性诱 变方法。图7显示15个已知血凝素(H)蛋白亚基的氨基酸序列。图8显示从六个土耳其H5W禽流感爆发人类幸存者所得血样的H5血凝素(HA) 血清学结果。该数据说明存在针对HA抗原的抗体。图9显示12个当地供体血清样测试H5抗原(A/越南/1203/2004)和Hmi (A/新 喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99)与H3N2 (A/巴拿马/2007/99)病毒所得的血清学结^ o图10说明构建抗体噬菌体文库中所用的独特条形码手段。图11显示结合来自不同甲型流感病毒亚型抗体的分析。图12在晶体结构显示Fab47e上H5血凝素结合组1所需及显性突变的位置。图13和14说明使用目标性诱变产生不同抗体重链与轻链文库，所述方法使用了 通过分析土耳其禽流感幸存者的血清和骨髓识别出的抗体重链与轻链序列发明详述A 定义除非另行定义，本文所用的技术与科学术语与本发明所属领域一般技术人员通 常理角军白勺意义一Singleton et al.，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.，J. ffiley&Sons (New York, NY 1994)为本领域一般技术人员提供以许多 本申请所用术语的通行指南。
本领域的一般技术人员将认识到许多与本文描述的类似或者等效的方法可用于 本发明的实施。事实上，本发明决非限定于所描述的方法与材料。考虑到本发明需要，下列 术语定义如下。术语“保守氨基酸残基”用于指这些氨基酸残基，在两个锅更多个氨基酸序列相互 排列比对时相同的氨基酸残基。术语“疾病”、“障碍”与“状况”可于本文中互换使用，指任何对正常身体机能的扰 乱，或显示任何类型的病状。导致扰乱正常生理的诱病因素(agent)可能为已知或未知。进 一步，虽然两位患者可能诊断为同样的障碍，这些个体所表现的特定症状可能一致也可能
不一致。“有效量”指足以导致有益或所期望的治疗(或预防)结果的量。有效量可于一次 或多次施与。本文中所用的“组合物”定义为包含活性成分，例如从本发明所得的中和抗体，以 及至少一种添加剂，例如药学上可接受的栽体，包括但不限定于，水、矿物质、蛋白质和/或 其它本领域技术人员已知的赋形剂。本文中所用的“进行治疗”或“治疗”意指指示疾病的临床症状的缓解。本文中所用的“进行预防”或“预防”意指预先防止指示疾病的临床症状。本文中所用的术语“实验对象”(受试者)或“患者”可互换使用，并且可指任何作 为检查、治疗、分析、测试或诊断对象的动物，优选为哺乳类动物。因此，实验对象或患者包 括人类、非人灵长类动物以及其它哺乳类，其可能患有或不患有疾病或其它病理学状况术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指本领域承认定义的氨基酸，例如选自下组的 氨基酸丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)； 谷氨酰胺(Gin)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(lie)；亮氨酸 (Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨 酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)与缬氨酸(Val)，虽然如果希望，也可使用修饰的、人 工的或稀有的氨基酸。因此，列于37CFR 1.822(b)(4)中的修饰的或罕见氨基酸符合该定 义，并清楚的以引用方式包含在本文中。氨基酸可细分为各种亚组。因此氨基酸可归类为 具有非极性侧链的(例如，Ala、Cys、lie、Leu、Met、Phe、Pro和Val)；带有阴性电荷侧链的 (例如，Asp与Glu)；带有阳性电荷侧链的(例如，Arg、His与Lys)或不带电荷极性侧链的 (例如，Asn、Cys、Gin、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp 与 Tyr)。氨基酸亦可归类为小氨 基酸(Gly与Ala)、亲核性氨基酸(Ser、His、Thr与Cys)、疏水氨基酸(Val、Leu、lie、Met 与Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp与Glu)，酰胺(Asp与Glu)与碱性氨基酸(Lys 与 Arg)。当提到多肽时，术语“变异体”指拥有与野生型多肽至少一个氨基酸突变或修饰 (亦即改变)的多肽。通过“氨基酸修饰”产生的变异体可由野生型氨基酸序列中，例如，替 换、缺失、插入和/或化学修饰至少一个氨基酸产生。“氨基酸修饰”指预先确定氨基酸序列中氨基酸序列的改变。作为例子的修饰包括 氨基酸替换、插入和/或缺失。特定位置“氨基酸修饰”指替换或缺失特定的残基，或在特定的残基邻近插入至少 一个氨基酸残基。在特定的残基“邻近”插入表示在距其一到两个残基以内插入。插入序列相对特定的残基可能是N-端或C-端。“氨基酸替换”(氨基酸取代)指在预先确定的氨基酸序列中用另一个不同的“替 换”氨基酸残基替换至少一个已经存在的氨基酸残基。替换后的残基或多个残基可为“自 然出现的氨基酸残基”(天然存在的氨基酸残基)(意即，由遗传密码编码的)且选择下组 丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺 (Gin)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(lie)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸 (Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨 酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)与缬氨酸(Val)。使用一个或更多非天然出现的氨基酸残基亦包括 在本文定义的氨基酸替换中。“非天然出现的氨基酸残基”指除了上述所列天然出现的氨基酸残基以外的残 基，其可在多肽链中与相邻氨基酸残基共价结合。非天然出现的氨基酸残基包括正亮氨 酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸以及其它氨基酸类似物，例如描述于Ellman et al. Meth. Enzym. 202 :301336 (1991)中的。为生成这样的非天然出现的氨基酸，可使用Noren et al. Science 244:182(1989)与Ellman etal.，同前，的过程。简言之，这些过程涉及用非天 然出现的氨基酸残基化学激活抑制性tRNA，继以该RNA体外转录与翻译。“氨基酸插入”指将至少一个氨基酸整合入预先确定的氨基酸序列。虽然一般所述 插入由一或两个氨基酸残基插入组成，本申请考虑更大的“肽插入”，例如，至少大约3到大 约5个或甚至直至大约10个氨基酸残基。插入的残基可能是天然出现的或上述披露非天 然出现的氨基酸。“氨基酸缺失”指从预先确定的氨基酸序列移除至少一个氨基酸残基。“多核苷酸”指诸如DNA分子与RNA分子及其类似物(例如，使用核苷酸类似物或 通过核酸化学产生的DNA或RNA)。根据需要，多核苷酸可以通过人工方法，例如使用本领域 公认的核酸化学，或通过酶，例如聚合酶，合成。而且，如果需要，所述多肽可经修饰。通常 修饰包括甲基化，生物素化以及其它本领域公知的修饰。另外，核酸分子可以是单链的或双 链的，而且，如果需要，与可供检测的部分相联。术语“诱变”指，除非另行说明，任何用于改变多核苷酸或多肽序列的公认技术。优 选的诱变种类包括易错PCR诱变、饱和诱变或其它定位诱变。“定位诱变”是本领域的技术标准方法，通过使用人工寡聚核苷酸引物进行，所述 寡聚核苷酸除少量代表所期望突变的错配外与要诱变的单链噬菌体DNA互补。简言之，所 述人工寡聚核苷酸被用作引物以指引与所述单链噬菌体DNA互补链的生成，且用所得双链 DNA转化支持噬菌体的宿主细菌。转化细菌的培养在顶层琼脂板中进行，允许来自含有噬菌 体的单独细胞的噬菌斑的形成。理论上，50%的新噬菌斑应含有携带单链形式突变态的噬 菌体，50%含有原来的序列。通过与带激酶的人工引物在允许严格匹配杂交但与原链的失 配足以阻止杂交的温度下杂交来选择所期望的噬菌斑。随即选择与探针杂交的噬菌斑，测 序并培养，回收DNA。术语“载体”用来表示在细胞中可自发复制的的rDNA分子，且可将DNA片段，例如 基因或多核苷酸，与其可操作的相联从而致使所附加片段的复制。可指引编码一个或多个 多肽的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。术语“对照序列”指在特定宿主生物中， 需用于表达可操纵的相联编码序列的DNA序列。例如，适用于原核生物的对照序列，包括启动子，视需要的操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷酸 化信号与增强子。当将核酸置于与其它核酸序列功能性的相关条件下时，该核酸为“可操纵的相联 的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA是与编码多肽的DNA可操纵的相联的，如果该序 列作为参与所述多肽分泌的前蛋白表达的话。启动子或增强子是可操纵的与编码序列相联 的，如果其影响了所述序列的转录的话。或者核糖体结合位点是可操作性的与编码序列相 联的，如果其被置于可促进翻译的位置上。一般而言，“可操纵的相联”表示所述相连DNA序 列是邻近的(毗连)，并且，对于分泌前导序列，是邻近并在阅读相内的。然而，增强子无需 毗连。连接可通过在方便的限制性位点相连达成。如果不存在这样的位点，可根据通行的 实践来使用合成寡聚核苷酸接头或连结子。氨基酸序列相同百分比可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul etal., Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 (1997))确定。所述 NCBI-BLAST2 序列比较程序可从 http://www. ncbi. nlm. nih. gov下载，或另夕卜从National Institute ofHealth,Bethesda, MD获取。NCBI-BLAST2使用数种搜索参数，其中所有那些搜索参数被设为缺省值，包括，例 如 unmask = yes, strand = all, expectedoccurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 以及 scoring matrix = BL0SUM62.本文使用“抗体依赖细胞介导细胞毒”与“ADCC”表示细胞介导反应，其中表达 FcRs的非特异性细胞毒细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞以及巨噬细胞) 识别靶细胞上相联的抗体，并随后导致靶细胞裂解。不同的免疫细胞表达不同的Fc受体 (FcRs)。因此，介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达Fc y RIII，而单核细胞表达Fc y RI、 Fc y RII 与 Fc yRIIL术语“甲型流感亚型”或“甲型流感病毒亚型”可互换使用，并指以血凝素(H)与 神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的不同组合为特征的甲型流感病毒变体，并因此通过H数字 与N数字的组合进行标记，例如Hmi与H3N2。该术语特定性的包括每一亚型内所有菌株 (包括绝灭菌株)，所述菌株通常来自变异且显示不同的致病分布(pathogenic profile)。 所述菌株亦可用病毒亚型的不同“隔离群”指代，包括所有过去的、现存的与将来的隔离群。 相应的，在此背景下，术语“菌株”与“隔离群”可互换使用。术语“流感”用于指由流感病毒引起的传染病。B 一般技术用于实行本发明方法的技术对本领域来说是众所周知的，并描述于标准实验教 禾斗书中，包括，例如 Ausubel et al.，Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)。Molecular Cloning :A Laboratory Manual，ThirdEdition， J. Sambrook and D. W. Russell, eds.，Cold Spring Harbor，New York，USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001o Brian et al., AnalyticalChemistry of Bacillus Thuringiensis,Hickle and Fitch，eds.，Am. Chem. Soc.，1990。Bacillus thuringiensis biology,ecology and safety, T. R. Glare and M. 0’ Callaghan，eds.，John Wiley,2000o Antibody Phage Display, Methods andProtocols， Humana Press，2001。与 Antibodies， G. Subramanian， ed. ，KluwerAcademic，2004。例如，可使用定位诱变(Kunkel et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA82 :488_492 (1985))来进行诱变。PCR扩增方法描述于美国 专利 4683192,4683202,4800159 与 4965188，以及数种教科书，包括“PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification",H. Erlich,ed. ,StocktonPress, New York(1989)与 PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, lnnis et al. , eds. , Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中。本发明方法并非限于任何特定用于展示抗体的技术。尽管本发明是通过提及噬菌 体展示说明的，亦可用其它展示或富集技术，例如核糖体或mRNA展示(Mattheakis et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91 =9022-9026(1994)。Hanesand Pluckthun, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94 :4937-4942(1997))、诸如细菌展示(Georgiou et al. , Nature Biotech. 15 29-34(1997))或酵母细胞展示(Kieke et al. , Protein Eng. 10 :1303-1310 (1997))的 微生物细胞展示、哺乳类细胞展示、孢子展示((Isticato et al. , J. Bacteriol. 183 6294-6301(2001)。Cheng et al. ,Appl. Environ. Microbiol. 71 3337-3341 (2005)以及共 同未决定的临时申请Serial No. 60/955，592，提交于2007年8月13日)、诸如逆转录病毒 展示(Urban et al.，Nucleic Acids Res. 33 :e35(2005))的病毒展示、基于蛋白质-DNA连 锁的展示(Odegrip et al. , Proc. Acad. Natl. Sci. USA 101:2806-2810(2004)。Reiersen etal.，Nucleic Acids Res. 33 :el0(2005))与微珠展示(印p et al.，FEBS Lett. 532 455-458(2002))来识别本发明的抗体。在核糖体展示中，所述抗体与编码的mRNA通过核糖体相联，所述核糖体被作成在 mRNA翻译结束时停止不释放所述多肽。选择是基于作为整体的三元复合物。 在mRNA展示文库中，抗体与编码mRNA之间的共价键通过嘌呤霉素建立，作为衔接 分子使用(Wilson et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA98 :3750_3755 (2001))。关于使用该技 术展示抗体，参见，例如 Lipovsek andPluckthun, J. Immunol. Methods. 290 51-67(2004)。微生物细胞展示技术包括在酵母上的表面展示，例如啤酒酵母(Boder andffittrup, Nat. Biotechnol. 15 :553_557 (1997))。因此，例如，抗体可通过与位于酵母细 胞壁的alpha-凝集素酵母粘连受体融合，在啤酒酵母表面展示。该方法提供了用流式细胞 计量术对库进行选择的可能。通过用荧光标记抗原与抗表位附着剂将细胞染色，可根据抗 原结合与细胞表面抗体表达水平分选酵母细胞。酵母细胞展示平台亦可与噬菌体组合(参 见，例如 Van den Beucken etal.，FEBS Lett. 546 :288_294 (2003))。关于选择与筛选抗体文库技术的综述，参见，例如Hoogenboom， NatureBiotechnol. 23(9) 1105—1116(2005)。C优选实施方案的具体描述I.制备供体特异性抗体文库本发明涉及来自成功克服或正在克服与特定疾病遭遇的个体的供体特异性抗体 文库。所得抗体库包括供体用以特异性的防御相关疾病的抗体，因此是，例如，发展用来预 防和/或治疗目标疾病的中和抗体的重要工具。虽本发明适用于任何在人类患者中激发抗体产生的目标疾病，上述疾病代表性的 非限定例子列于表1.表 1
13 本发明中一种构建供体特异性文库的方法在图1中示意说明。作为第一步，辨识 出潜在的供体。患者供体可能正在罹患目标疾病或自目标疾病恢复并幸存。因此，例如在 实施方案中说明的那样，本文中的供体特异性文库可从之前流感感染恢复期的骨髓构建， 所述流感感染包括季节性流感爆发、流行与大流行。当选择或辨识患者供体时，证实患者确实已罹患或正在罹患目标疾病是重要的。 证实的一部分是检查患者供体的医疗史。除了医疗史之外，不同的其它因素，例如患者家 族的医疗史、患者性别、体重、健康状况等，需加以考虑。如果该患者的历史无法获得或不可靠，或因为任何原因，例如作为进一步证实手段，可确定患者的血清学谱。血清学分析 在本领域是众所周知的，并可用各种形式进行，例如用各种ELISA分析的形式。因此，例 如针对流感病毒的抗体的存在可通过众所周知的血凝素抑制(HAI)分析(Kendal，A. P.， M. S. Pereira, and J. J. Skehel. 1982. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.U.S.Department of Health and HumanServices， Public Health Service, Centers for Disease Control， Atlanta， Georgia)，或 the microneutralization assay (Harmon et al.，J. Clin. Microbiol. 26 :333_337 (1988))检 测。如果所述血清样已证实含有流感的中和抗体，该步骤可能并非必要。为制备供体特异性人类抗体文库，可从已知正罹患目标疾病，例如表1所列至少 一种疾病，的个体搜集含有淋巴细胞的样品。例如，所述试样可来自骨髓、血液、脾脏、淋巴 结、扁桃体、胸腺以及等等。骨髓是本文中抗体文库的优选来源，这是因为其代表供体个体 成熟抗体库完整的“化石档案”。含有淋巴细胞的使用可于不同时点从患者供体搜集。在一个实施方案中，淋巴细 胞从患者搜集，所述患者自目标疾病恢复至少经历了 1、5、10、15、20、25天，至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年。在另一个实施方案中，淋巴细胞 从患者搜集，所述患者在搜集时点正罹患目标疾病，并在搜集前已诊断罹患所述疾病至少 1、5、10、15、20、25 天，或至少 1、2、3、4、5、6、7、8、10 个月，或 1、2、3、4 或 5 年。外周血试样，特别是来自地理上遥远来源的，可能需要在运输和使用之前稳定化。 为此目的的试剂盒是众所周知且为可市购的，例如BD Vacutainer CPT 细胞制备试管可 用于离心纯化淋巴细胞，而guanidiunuTrizol或RNAlater可用于稳定试样。从其它来源， 例如淋巴器官分离淋巴细胞的方法和试剂盒，亦是众所周知的，且为可市购的。当收到稳定化的淋巴细胞或全骨髓后，抽提RNA并进行RT-PCR以回收抗体重链与 轻链库，使用本领域公知的免疫球蛋白寡聚核苷酸引物。从骨髓淋巴细胞或任何其它来源的淋巴细胞中制备RNA的方法在本领域是众所 周知的。提取mRNA的一般方法披露于分子生物学的标准教科书，包括Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997)。 RNA t屯Hi式齐[J 盒可购自生产商，例如Qiagen，且可根据生产商的说明书使用。因为RNA无法作为PCR的模板，将其首先逆转录为cDNA，其可用于PCR扩增。最常 用的两种逆转录酶是鸟类(avilo)成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)与Moloney鼠 白血病病毒(MMLV-RT)。逆转录步骤通常使用特定引物、随机六聚体或寡dT引物引发，取决 于表达分布的情况和目标。例如，提取的RNA可根据生产商的说明书，用GeneAmp RNA PCR kit(PerkinElmer,CA,USA)逆转录。所得的cDNA可用作后续PCR反应的模板。为构建噬菌体展示文库，所述PCR库产物可与衔接子寡聚核苷酸合并以生成scFv 文库以直接在ml3 pill蛋白质阅读框中根据本领域公知的过程进行克隆。使用其它展示 技术的文库，例如上述讨论的，可通过本领域众所周知的方法制备。在通常的实验设计中，从新鲜或经RNAlater稳定化的组织通过Tri BD试剂 (Sigma)提取全RNA。随后，分离的供体全RNA进一步用Oligotexpurification (Qiagen)纯 化为mRNA。接下来，第一链cDNA合成，通过使用随机九聚体寡聚核苷酸和/或寡聚(dT) 18 弓 I 物，根据 AccuScript re verse transcriptase (Stratagene)白勺实验设计广生。简目 之，
15lOOng mRNA、0. 5mM dNTP 与 300ng 随机聚体和 / 或 500ng 寡聚(dT) 18 引物在 Accuscript RT buffer (Stratagene)中在65°C下温育5分钟，继以迅速冷却至4°C。然后，将lOOmMDTT、 Accuscript RT与RNAse Block添加到每个反应中并在42°C下温育1小时，并通过在70°C 加热15分钟使逆转录酶失活。所得cDNA可用作模板进行所述抗体重链与轻链V基因的 RT-PCR扩增，其随即可克隆入载体，或若意指展示文库，克隆入噬菌粒载体。该过程产生抗 体重链与轻链可变区域克隆作11与\文库)的库，其可单独保存或因筛选目的而合并。载 体，例如噬菌粒载体，可随即导入宿主细胞中，例如大肠杆菌宿主，以产生包含编码抗体轻 链或重链或其片段的核酸分子库的载体集合。在每种情况下，所述载体集合可包括单独或 多于一个的抗体轻链或重链亚型。因此，载体集合可能包括编码抗体kappa和/或lamda 轻链的序列。在本发明的方法中，通常抗体轻链与抗体重链首先分别克隆，如上所述，亦分离 kappa与lamda轻链文库。所述文库可归档，并在需要时，重链文库可与分开的kappa与 lamda轻链文库合并，且重链和轻链的配对，例如当进行噬菌体展示时，可通过淘选的方法 进行识别。使用不同文库或亚文库重复这些步骤若干次是可能的，取决于需要达成的目标。 本发明的方法提供了是否包含或排除文库，亚文库或克隆方面巨大的灵活性，如在淘选中 为最大化成功所必需的那样。具体而言，因为载体集合中存在的序列分开携带抗体重链与轻链(或片段)的编 码序列，所述序列可能被切出并插入到一个或更多表达抗体轻链或重链或其片段的表达载 体中。优选的，将抗体轻链或重链或其片段插入到为共同表达重链与轻链的同一载体中以 产生所述抗体或抗体片段的文库。本发明的表达载体包含可使载体在一个或更多所选的宿主细胞中表达的核酸序 列。所述序列对各种细菌、酵母和病毒是众所周知的。质粒PBR322的复制起点对于大部分 革兰氏阴性菌是适合的，质粒起点对酵母是合适的，而各种病毒起点(SV40、多瘤、腺病 毒、VSV或BPV)对在哺乳类细胞中克隆载体是有用的。表达载体通常包含选择性基因，亦称为选择性标记。通常选择性基因编码(a)提 供对抗生素或其它毒素抗性的蛋白质，例如氨苄西林、新霉素、氨甲喋呤或四环素，(b)弥补 营养缺陷型或(c)提供复合培养基不具有的关键营养，例如，为孢子杆菌编码D-丙氨酸消 旋酶的基因。合适的哺乳动物细胞选择性标记的例子是那些可使辨识有能力吸收编码抗体的 核酸的细胞成为可能的标记，例如DHFR或胸腺嘧啶激酶。当使用野生型DHFR时，合适的 宿主细胞可为缺乏DHFR活性的CH0细胞系，根据的Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 =4216(1980)描述制备并增殖。酵母中使用的合适选择性基因可为存在于酵母质
YRp7 中的 trpl (Stinchcomb et al. ， Nature, 282 39(1979) 。 Kingsman et al.， Gene，7 :141(1979)。Tschemper et al.，Gene，10 :157 (1980))。所述 trpl 基因提供了对 缺乏在色氨酸中生长的酵母变异株，例如ATCC No. 44076或PEP4-1 (Jones，Genetics, 85 12(1977))的选择性标记。表达与克隆载体通常包含可操纵的与编码抗体的核苷酸序列相联的启动子以指 引mRNA合成。多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适于用于原核宿主的启 动子包括beta-内酰胺酶与乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature, 275 :615(1978)。Goeddel et al.，Nature, 281 :544 (1979))、碱性磷酸酯酶、色氨酸启动子系统(Goeddel， Nucleic Acids Res.，8 4057 (1980)。EP36, 776)，以及杂交启动子，例如 tac 启动子(deBoer et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80 :21-25 (1983))。用于细菌系统的启动子亦包含 Shine-Dalgarno序列(S. D.)可操纵的与编码抗体的DNA相联合适的在酵母宿主中使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶启动子 (Hitzeman et al.，J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))或其它糖酵解酶(Hess etal. , J. Adv. Enzyme Reg.，7 149 (1968) oHolland, Biochemistry, 17 :4900 (1978))，例如烯醇化酶、磷酸 甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、 3_磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡萄糖激酶。其它酵母启动子为可诱导的启动子，具有额外的好处在于其转录由生长条件控 制，包括下列酶的启动子区域醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸磷酸酶、与氮代谢相关的降解 酶、金属硫蛋白、磷酸甘油醛-3-磷酸-脱氢酶与负责利用麦芽糖与半乳糖的酶。适合在酵 母表达中使用的载体与启动子进一步描述于EP73657。哺乳类宿主细胞中表达载体重链与轻链的转导是由，例如，从病毒基因组例如多 瘤病毒，禽痘病毒(UK2211504，公布于1989年7月5日)，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头 状病毒，鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及猿猴病毒40 (SV40)获得 的启动子，从异源哺乳类启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及热休克蛋 白启动子控制的，只要所述启动子与宿主细胞系统是相容的。高等真核生物编码抗体基因的DNA转录可通过将增强子序列插入载体而增加。增 强子是顺式作用DNA要素，通常大约为10到300bp，作用于启动子以增加其转录。许多增 强子序列由哺乳类基因得知(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、alpha-胎儿球蛋白与胰岛素)。 然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点晚期一侧的SV40增强子 (bpl00-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期一侧的多瘤增强子，以及腺 病毒增强子。增强子可剪接至载体上抗体编码序列5’或3’位置，但优选位于启动子5’的 位置。在真核宿主细胞中使用的表达载体(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其 它多细胞生物的有核细胞)亦包含对转录终止与稳定mRNA为必需的序列。上述序列通常 可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5’，有时是3’的非翻译区域获得。这些区域包含转录 为编码抗体重链与轻链的mRNA非翻译部分的多聚腺苷酸化片段。其它适用于为适应化以在重组脊椎动物细胞组织中合成多肽的方法、载体与细 于 Gething et al. ， Nature，293 :620_625 (1981) 。 Mantei et al. , Nature, 281
40-46(1979)。EP 117,060。与 EP 117,058。在特定的实施方案中，所述抗体文库以噬菌体文库的形式生成，其中抗体重链与 轻链或其片段的编码序列克隆入噬菌粒载体，例如包含细菌噬菌体基因III的载体。噬 菌粒载体是众所周知且为可市购的，包括，例如，pBluescriptvector SKII+(Stratagene， Genbank Accession X52328)与其它pBluscript载体。噬菌体展示技术使生成人类抗体的 大量库成为可能，且生物淘选过程允许选择具有任何所期望的特异性或其它性质的个别抗 体。例如，来自早年流行与大流行，例如1918年西班牙流感，的幸存者的外周淋巴细胞免疫球蛋白库可重新取回(retrieved)、稳定化、回收(rescued)并如上所述的方法进行 表达。对于额外的HI与H3文库，可从在适当时间接种疫苗的本地来源的供体回收其库。作 为额外的选项，可市购的骨髓全RNA或mRNA可从商业渠道购入以生成对HI与H3合适的文 库，且取决于供体的背景，对H2抗体筛选亦为合适的。一般而言，对于接种是可行的治疗选 择的目标疾病，抗体亦可由从接受免疫的人类供体所得的生物样品中分离。从获得识别特 定抗原的抗体效价的接受免疫的患者，搜集骨髓、血液、或其它来源的淋巴细胞，分离、扩增 并如上述方法表达产生的抗体。如上所述，对于每个供体，可分开克隆抗体轻链与重链文库。因此，对于每个供体， 不同的kappa与lamda轻链家族可分别储藏并以等摩尔量克隆。类似的，对每个供体，不同 的重链家族可储藏并以等摩尔量克隆。通过使基因家族特异性抗体回收成为可能，本发明 的方法产生更加全面代表供体抗体库的文库，所述抗体库包括并非多量(less abundant) 的抗体，以及，对于汇集(pooled)的抗体文库，保证来自任何及所有个体的免疫球蛋白贡 献。例如，如实施方案中实施方案1说明的那样为制备本文的流感重链与轻链文库，回收 (rescued) 了 6个kappa轻链家族，11个lamda轻链家族与4个重链家族。通常筛选产生零个、一个或多于一个靶特异性阳性克隆。如果特定的组合抗体文 库已完全的筛选且进一步的解决方法显得难以获得，这可能并非是因为重链与轻链库不具 有与靶结合的能力，而是因为所述集合可能无法集结必需的重链与轻链应与靶结合所需的 匹配。通常回收的来自任何个人的轻链库可能包含大约105到106之间的独特轻链与大约 106到108之间的独特重链。上述匹配的可能组合产物(product)布于1011到1014之间。上 述集合超过了多数展示系统，例如噬菌体展示的实用制限数个数量级。其结果，使用现有的 展示技术(例如噬菌体测定)，在任何单独的噬菌体抗体文库中，仅仅捕获与评价了组合可 能的一小部分。因此，将原先的重链组与原先的轻链集合重新克隆会产生全新的改组重链 与轻链组合，其中可能有针对特定靶的新抗体。发现上述新改组的集合将之前存在的表现 拙劣的供体特异性文库转变为高效的集合。具体而言，对于来自单一供体的集合，之前在三 轮选择之后与背景比较仅仅可获得0. 3x倍的富集。然而，当将该集合重新克隆并改组后， 在三轮淘洗之后可获得15倍的富集，结果从92个选择的克隆中获得55个新序列。如上所述，通常筛选可产生任意数量的靶特异性阳性克隆。本发明使通过其内含 的条形码识别任何克隆的起源成为可能。由于通常抗体筛选可能从许多供体特异性文库中 合并噬菌体抗体，可能部分文库与其组合的克隆并未作为携带噬菌体颗粒的抗体而未被充 分代表。在此情况下阳性克隆可能仅来自存在于被筛选的所述亚文库噬菌体菌群中所有可 能的克隆解决方案中的有限部分。在上述情况下，更加全面的盘查供体特异性噬菌体集合 是非常让人期望的。在此情况下，来自阳性克隆的条形码将人们指引到所述克隆相应的特 异性文库，并允许独占的且更加深入的筛选感兴趣的集合。当所期望的抗体必需具有超越其最初用来作为起始文库构建基础的能力，例如中 和或激活时，可前瞻性的概览个人供体血清寻找上述活性的迹象。如果在任何供体血清中 所期望的活性以合理效价存在，可选择其相应的文库被选择以筛查感兴趣靶的那些。在其 它情况下相关的选择标准可能与血清学无关，但与供体特征，例如年龄、性别或医疗史相 关。在任何情况下，供体谱对文库选择是合乎逻辑的指南，且仅在供体特异性和分离的抗体 文库中是可能的。
完成噬菌体淘洗筛选并发现免疫显性的克隆并不罕见。另外，通过反复的淘洗筛 选计划重新发现上述克隆亦不罕见。在显性克隆的情况下，当期望更多或不同的克隆时，避 免导致该克隆源(origin)的文库材料是重要的。通常噬菌体抗体文库中，无法将导致所述 克隆存在的特定文库与材料从集合中分离，然而在供体特异性文库中，重新筛选文库并简 单的忽略不受欢迎的供体亚文是可能的，从而将阳性选择从之前辨识出的显性克隆排除出 去。虽然，为简洁起见，文库被描述为重链或轻链文库，对那些本领域一般技术人员， 明显同样的描述适用于抗体片段文库、抗体重链和/或轻链片段文库与类抗体分子文库。在特定实施方案中，具有双重特异性的抗体，例如，对两种不同甲型流感病毒亚型 和/或对同一亚型的两个菌株(隔离群)，和/或对人或非人类隔离群表现反应性的，可通 过受控的交叉反应选择和/或定向组合和/或诱变工程来发现和优化。在通常的富集方案中，如图2说明的，对包含对两个靶，称为靶A和靶B，具有交叉 反应性的抗体的文库进行多轮富集。如果富集是基于与靶A的反应性，每轮富集将增加所 述池对靶A的反应强度。相似的，如果富集是基于与靶B的反应性，每轮富集将增加所述池 对靶B的反应强度。虽然图2提及淘洗，其为当筛选噬菌体展示文库(见下)时所用的选 择方法，该方法对任何上述讨论的文库，或在本领域为众所周知的，以及任何类型的展示技 术亦同样适用。靶A与B包括任何抗体结合的靶，包含但不仅限于流感病毒不同的隔离群、 型和亚型。如果目标是辨识具有多重特异性的中和抗体，可使用交叉反应性发现选择方案。 为简洁起见，在图3中说明该方案，显示选择具有双重特异性的抗体。在此情况下，任何包 含显示与两个靶，靶A与B有反应性抗体的抗体文库，首先针对与一个靶，例如，靶A的反应 性加以选择，继之针对与另一个靶，例如靶B的反应性加以选择。每次相继的选择增强了所 得池针对两个靶的反应强度。相应的，该方法对辨识具有双重特异性的抗体是特别有效的。 当然，通过包括额外轮次对额外靶的富集，该方法可扩展用于辨识针对进一步的靶显示反 应性的抗体。再者，如果所述筛选的文库是噬菌体展示文库，选择是通过交叉反应淘洗进行 的，但亦可使用其它文库与其它选择方法。上述两种方法的组合包括两轮分别对靶A与靶B反应性分开的富集，重新组合所 得的两个池以及如上所述随后的交叉反应性选择轮次。该方法在图4中说明。正如在纯交 叉反应性选择一样，每轮对重组文库的选择增加了所得池针对两个靶的反应强度。在进一步的实施方案中，如图5所示，首先显示与靶A强反应性，并具有与靶B可 检测出反应性的克隆。基于该克隆，制备诱变文库，然后对其在交替的轮次分别选择针对靶 B与靶A的反应性。该方案会得到保持与靶A强反应性并增加了与靶B反应性的抗体。正 如上述，如果所筛选的文库是噬菌体展示文库，选择是通过淘洗进行的，但亦可遵循同一策 略，使用其它文库，其它展示技术，以及其它选择方法。如上所述，例如，靶A和B可能是甲型流感病毒的两个不同亚型，相同甲型流感病 毒的两个不同菌株(隔离群)，两个不同物种的亚型与隔离群，其中一个物种优选为人类。 因此，例如，靶A可能为H5W病毒2004越南隔离群的隔离群，而靶B可能为H5W病毒1997 香港隔离群。应当强调这些例子仅仅是说明性的，且对任何两个或多个靶具有双重或多重 特异性的抗体可用类似的方法辨识、选择并优化。
—旦具有所期望特性的中和抗体被辨识出来，辨识优势表位或大部分上述抗体识 别的表位可能是令人期望的。表位映射的方法对于本领域是众所周知的，并披露于，例如， Morris,Glenn E. ,Epitope MappinR Protocols, Totowa, N. J. ed. ,Humana Press,1996 与 Epitope MappinR :A Practical Approach, ffestwoodand Hay, eds. , Oxford University Press，2001。II.用独特条形码法辨识供体特异性抗体文库根据本发明，在从cDNA，例如用如上所描述的方法制备的骨髓cDNA中扩增出抗体 重链与轻链库后，优选将抗体重链与轻链文库对每个患者供体分开克隆，其中个人的文库 可使用独特的条形码相互区别。优选选择所述条形码以使其得以与标记的克隆一起传播，同时不干扰期望的抗体 链及其片段的表达。在本发明的示例实施方案中，所述条形码插入所述表达载体的序列中， 优选为当使用噬粒时，位于末端pill终止密码子之后的3’未翻译区域。在克隆分离后，确 定载体的独特序列，并将其分配予单独的确定文库。所述确定文库不但可源自单独供体，亦 可来自离散的供体池，或人工合成的库，或半人工合成的集合。在另一个实施方案中，所述 条形码插入抗体重链和/或轻链及其片段的编码序列中，其插入位置或形式不干扰其相应 的链的表达。因此所述条形码可为非编码的DNA序列，其长度为大约1-24连续的非编码多核苷 酸，其可通过测序或特定PCR引物解码。通过该方法，核酸的集合，例如抗体库，可在克隆步 骤时连接。在本发明的示例实施方案中，所述条形码是3或5个碱基的随机产生的序列。在另一个实施方案中，所述条形码是沉默突变的编码序列。若所述文库利用了识 别中断的回文序列(palidromes)(如Sfi GGCCNNNNNGGCC)的限制性酶，不同的核苷酸可并 入那些N所在的位置以分辨不同克隆的集合，例如抗体文库。所述条形码编码方法具有下 述优点，即所述库在扩增步骤连接。在进一步的实施方案中，所述条形码是非连续性的核苷酸序列，其可存在于载体 序列和/或所期望抗体链的编码序列中。因此，具有非连续序列的条形码为鉴定不同单独 序列的起点以及监视对其随后的处理提供了灵活性。在不同的实施方案中，所述条形码是编码与噬菌体颗粒融合的免疫学上独特肽或 蛋白序列的编码序列。其示例包括，例如，融合于pill、pVIII、pVII或pix噬菌体的表位 (例如，Myc、HA和FLAG)。所述表位可单独或在不同组合中使用，且可以顺式(在编码文库 的质粒上)或反式(特别是修饰的辅助噬菌体)形式提供。其它可能的条形码示例包括，但不限于，噬菌体经化学和酶修饰(对噬菌体文库) 以半抗原或荧光生色团。上述标记优选用于单独一轮选择。所述来自单独供体的单独的重链与轻链文库，或其它条形码标记的克隆或集合， 可经集合，而不丧失分辨单独序列来源的能力。III.从供体特异性抗体文库中优化中和抗体若期望，具有双重或多重特异性的中和抗体的交叉反应性可进一步通过本领域 所知技术来改善，所述技术例如Look Through Mutagenesis (LTM)，如描述于US. Patent Application Publication No. 20050136428,published June 23，2005，其全部披露以参照 的方式清楚的包含于此。
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Look-through mutagenesis (LTM)是多方的诱变手段，其同时评价并优化所选氨 基酸的组合突变。所述过程致力于在一个或更多互补性决定区(CDR)域中准确的分布，并 开发氨基酸侧链化学的协同贡献。LTM在CDR内产生单独突变的位置系列，所述CDR中每个 野生型残基由许多所选氨基酸中的一个系统性的取代。组合突变的CDR以产生复杂性和大 小增加但不会变得对所有变体的定量展示有妨碍的组合型单链可变片段(scFv)文库。在 正选择后，将具有改善特性的克隆测序，并将那些有益突变定位。为鉴定具有改善结合特性 的协同突变，表达所有有益排列的组合文库(组合型有益突变，CBM)可通过混合DNA探针、 正选择并分析之以鉴定出一组经优化的scFv候选来产生。所述观察可以相似的方式用Fv 或其它抗体文库进行。诱变可通过步查诱变(walk-through mutagenesis (WTM))如上所述进行。另一种有意设计此处的抗体与多于一种甲型流感亚型和/或多于一种相同亚型 的分离群的交叉反应性的有用诱变方法，在此称为“目的性”诱变。目的性诱变可用于基于 一个或更多抗体克隆合理改变抗体集合，优选为不同反应性的。在本发明的背景下，目的性 诱变用于在相似序列上，例如在抗体的单独CDR中的，编码由同源位置定义的一个或多个 残基。在此情况下，这些集合使用寡聚简并来产生，以捕获见于比较性位置的残基范围。期 望在此集合内，在其亲本克隆间，甚至超越亲本克隆存在特异性的连续性。目的性诱变的目 标是在两个或更多离散实体或集合间，产生具有多样性的多功能抗体集合，或文库。为构建 目的性诱变文库，首先获得两个抗体的CDR序列并将其比对。接着所有的保守同一性位置 均用单独密码子固定于匹配的残基上。在有些情况下，所述简并密码子可仅编码该位置的 两个亲本残基。然而，在某些情况下，产生额外的共产物。共产物的产生水平可加以控制以 迫使共产物产生或消除此产生，依赖于大小限制与目标。因此，例如，若两个抗体各自的第一位置是苏氨酸和丙氨酸，所述具有A/G-C-的 简并密码子在其前两个位置应仅编码苏氨酸或丙氨酸，第三个位置的碱基无所谓。若，例 如，下一位置残基为赖氨酸和精氨酸，所述简并密码子A-A/G-A/G仅编码赖氨酸或精氨酸。 然而，若使用所述简并密码子A/C-A/G-A/G/C/T，则天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸共 产物均亦将产生。为方便起见，仅使用具有匹配CDR长度的抗体较为简单。一种强制如此的方法为， 基于所述CDR长度与起初发现的抗体给予的潜在的相同构架限制，对第二抗原筛选限制大 小的文库。然而，注意到使用相同长度的CDR仅为方便期间而非必需。易于发现，虽该方法 对创建大型功能多样性甲型流感病毒中和抗体文库为有用，其应用范围远较此广阔。所述 诱变技术可用于产生任何抗体的功能多样性文库或集合。因此，在此收入图6以说明使用 目的性诱变方法用TNF- a抗体与CDlla抗体的CDR作为亲本进行诱变。其它示例性的诱变手段包括饱和诱变与易错PCR。在饱和诱变(Hayashiet al.，Biotechniques 17 :310_315 (1994))技术中，在蛋 白质特定位置替换所有20种氨基酸，并对特定表型分析对应于每个变体的克隆。(亦参见 U. S. Patent Nos. 6，171，820。6，358，709 与 6，361，974)易 It PCR(Leung et al. ， Technique 1:11—15(1989)。 Cadwell and Joyce, PCRMethod Applic. 2 =28-33(1992))是经修饰的多聚酶链式反应(PCR)技术，在克隆基因 种导入随机点突变。所得PCR产物可经克隆产生随即突变文库或者，若在合适的PCR引物种并入了 T7启动子，直接进行转录。其它诱变技术亦为人熟知并详细描述。例如，在In Vitro MutaRenesisProtocols, J. Braman, Ed.，Humana Press, 2001 中。优化可基于单独形式或其任意组合的任何上述讨论的文库，或其它任何本领域所 知的文库。IV.中和抗体的产生一旦鉴定出具有所期望中和特性的抗体，该抗体，包括抗体片段，可通过本领域熟 知的方法产生，包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术。在杂交瘤方法中，将小鼠，或其它合适的宿主动物，如仓鼠，免疫化以激发产生 或能够产生将要特异性的与用来免疫化的蛋白结合的抗体的淋巴细胞。此外，淋巴细 胞可与体外免疫化。随即将淋巴细胞与骨髓瘤细胞使用合适的融合剂，例如聚乙二醇
(Goding, MonoclonalAntibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press，1986))。将因此制备的所述杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，所述培养基优选含 有一种或更多抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺 乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，所述培养基通常会包含次黄嘌呤， 氨基蝶呤与胸腺嘧啶(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。骨髓瘤细胞优选有效融合，支持所选抗体产生细胞产生稳定高水平抗体并对例 如HAT培养基的培养基敏感的。在其中，骨髓瘤细胞优选小鼠骨髓瘤细胞系，例如那些源 自可得自 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA 的 M0PC-21 与MPC-11 小鼠肿瘤的，或可得自 American TypeCulture Collection,Rockville, Maryland USA的SP_2或X63_Ag8_653细胞的。亦有描述用人类骨髓瘤以及小鼠_人类异 骨髓瘤细胞系山城人类单克隆抗体(Kozbor，J. Immunol. 133 =3001(1984)。and Brodeur et al. , Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc.，NewYork,1987))。对杂交瘤细胞所生长的培养基分析针对抗原的单克隆抗体的产生。由杂交瘤细 胞产生的单克隆抗体结合特异性优选通过免疫沉淀或体外结合分析，例如放射性免疫分析 (RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来确定。重组单克隆抗体可，例如，通过下述方法产生分离编码所需抗体链的DNA，并使 用众所周知的重组表达载体，将其与用于共表达的编码序列共转染重组宿主细胞。重组宿 主细胞可为如上所述的原核或真核细胞。用于制备人源化抗体的人类可变域的选择，无论是轻链还是重链，对降低抗原性 是非常重要的。根据所谓“最佳拟合”方法，针对已知人类可变域序列文库中筛选出啮齿 类抗体可变区序列。随即接受最接近啮齿类序列的人类序列为人源化抗体的人类构架 区域(Sims et al. , J. Immunol. 151 =2296(1993) Chothia et al. , J. Mol. Biol. 196 901(1987))。重要的是，人源化抗体应保留对抗原的高亲和度以及其它有利的生物学特性。 为达此目的，根据优选方法，通过使用亲本与人源化序列的三维模型分析亲本序列以及多 种概念性人员产物的过程，制备人源化抗体。另外，可遵循本领域已知方法产生人类抗体。举例而言，可制成能够在免疫化后，在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人类抗体全部库的转基因动物(例如，小鼠)。参 见，例如，Jakobovits et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :2551 (1993)。Jakobovits et al. , Nature 362:255-258(1993)。Bruggermann etal. ,Year in Immuno. 7 :33 (1993)。以 及 U. S. Patent Nos. 5，591，669，5，589，369 与 5，545，807。V.中和抗体的用途本发明所述中和抗体可用于预防和/或治疗目标疾病。为治疗用途，所述抗体 或其它分子，通过使用抗体或基于的抗体运输序列促进其给药，通常以医药组合物的形 式使用。其技术与配制方法一般可见于Remington' sPharmaceutical Sciences, 18th Edition,Mack Publishing Co. (Easton，Pa. 1990)and Hanson" Parenteral Formulations of Proteins and Peptides Stability and Stabilizers, " Journal of Parenteral Science and TechnoloRY, TechnicalReport No. 10, Supp. 42-2S(1988)。抗体通常以冻干粉配制物或水溶液的形式配制。可接受的载体、赋形剂或稳定 剂在所有使用的剂量与浓度下对受体无毒，并包括缓冲剂，例如磷酸、柠檬酸以及其它 有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸与甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯铵盐酸 盐(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、六甲季铵盐酸盐(hexamethonium chloride)、节铵盐酸盐(benzalkoniumchloride)、苯乙铵盐酸盐(benzethonium chloride)、苯酚(phenol)、丁醇或苯甲醇(butyl or benzyl alcohol)、烷基对羟基苯甲酸 酯(alkyl parabens)，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯(methyl or propyl paraben)、邻 苯二酚(catechol)、雷琐辛(resorcinol)、环己醇(cyclohexanol)、3_ 戊醇与 m_ 甲酚)； 低分子量(少于10残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水多聚体， 例如聚乙烯基吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸； 单糖、二糖与其它碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括例如EDTA ；糖例如 蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐逆离子，例如钠离子；金属复合物(例如，锌-蛋白复 合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN 、PLUR0NIC 或聚乙二醇(PEG)。所述抗体亦可包埋于微囊中，所述微囊可通过，例如，凝聚技术或界面缩聚法(例 如，分别对于羟甲基纤维素或明胶-微囊以及聚_(甲基异丙烯酸甲酯)微囊)制备。所述 抗体亦可包埋于胶质给药系统(例如，脂质体，白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒以及纳米 胶囊)或宏乳齐II (macroemulsion)中。上述技术披露于 Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences,见上。在此披露的中和抗体可作为免疫脂质体来配制。包含所述抗体的脂质体通过本领 域所知方法制备，例如描述于 Epstein et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 3688 (1985)。 Hwang et al.，Proc. Natl Acad. Sci. USA 77 =4030(1980)。U. S. Patent Nos. 4，485，045 与 4，544，545。与October 23，1997公布的W097/38731中的。具有增强循环时间的脂质体在 U. S. Patent No. 5，013，556 中披露。特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇与PEG衍生磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的液体组合物通过反向蒸发方法产生。通过限定孔大小的过滤器抽提脂质体 以产生所期望直径的脂质体。本发明所述抗体的fab’片段可与Martin et al. J. Biol. Chem. 257 =286-288(1982)中描述的脂质体通过二硫基交换反应相联。可选在所述脂质体 中包含化学治疗剂。参见 Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。
为预防或治疗疾病，抗体的合适剂量应取决于所治疗感染的类型、疾病的严重程 度和病程以及所述抗体的施用是为了预防还是治疗。抗体适于一次或在一系列的治疗中施 用于患者。取决于疾病的类型与严重度，大约lg/kg到大约15mg/kg抗体为通常的施与患 者的候选剂量，无论是，例如通过一次或更多分开施用，或者连续的灌注。本发明进一步的细节通过下列非限定性实施方案说明。实施例1来自在先(prior)禽流感爆发幸存者的抗体文库以及中和抗体的制备材料与骨髓实验方法以及血清制备通过标准静脉穿刺术获得血液，允许其凝结，并处理以回收血清。所述血清 在-20°C下储藏3-4日直至将其置于干冰上处理(ship)。供体通过注射局部麻醉剂麻醉， 并从每个H5W幸存者盆骨(pelvic)移取5ml骨髓。接着将所述5ml骨髓置入已消毒的含 有45ml RNAlater的50_ml试管中。将所得混合物轻柔的颠倒大约8_20次直至无可见的 块以及骨髓与RNAlater混勻为止。接着将所述样本冷藏于2-10°C过夜。在过夜冷藏后， 将所述样本在-20°C下储藏3-4日直至将其置于干冰上发运。接收后，所述含有RNAlater/ 骨髓以及血清的试管储存在-80°C直至处理。血清学HAELISA将ELISA板(Thermo，Immulon 4HBX 96W)通过在室温下过夜温育被以100 yl 100ng/mL H5 血凝素(Protein Sciences, A/Vietnam/1203/2004)的 1XELISA Plate Coating Solution (BioFX)。翌日用 300 yl PBS/0. 05% Tween-20 (PBST)将板漂洗三次。 漂洗后，添加 300 ii 1 封闭溶液(4% Non-Fat dry Milk inPBS/0. 05% Tween-20)并在室 温下温育1小时。在封闭步骤后，用300 ill PBS/0. 05% Tween-20将板漂洗三次。接着， 100 ill以1 20，000稀释于PBS/0. 05% Tween中的血清试样在室温下温育1_2小时并随 即用 300iil PBS/0. 05% Tween-20 漂洗三次。将以 1 5，000 稀释于 PBS/0. 05% Tween 中的抗人类Fc-HRP偶联物在室温下温育1-2小时，并随即用300 u 1 PBS/0. 05% Tween-20 漂洗三次。在此最后漂洗后，添加100 Pi生色底物溶液(TMB1 Substrate，BioFx)，并在充 足量的时间后通过添加100 ill STOP Solution (BioFx)终止反应。在板读数器(Molecular Devices Thermomax microplate reader with Softmax Prosoftware)上测定 450nm 处的 吸光度，记录数据，并随后用Excel (Microsoft)作图。骨髓提取RNA与mRNA纯化之前储存于_80°C的骨髓(20mlRNAlater中 2ml)通过离心去除RNAlater随即 在含有300 ill乙酸的11.25ml TRI BD reagent (Sigma)中重新悬浮的方法回收。随即剧 烈振荡沉淀。接着添加1. 5ml BCP (1-溴-3-氯丙烷，Sigma)，振荡混勻，在室温下温育5分 钟，并随即以12000xg在4°C下离心15分钟。不干扰界面的小心移除液相。来自液相的总 RNA随即通过添加20ml异丙醇沉淀，在室温下温育10分钟，并以12000xg在4°C下离心10 分钟。在添加异丙醇后，由于残留的RNAlater产生两相，导致沉淀的RNA位于界面。为消 除残留的RNAlater并允许RNA的最大回收，添加5ml份量(aliquots)的50%异丙醇水溶 液，直至无可见相分离，此时通过以2000Xg在4°C下离心10分钟沉淀RNA。所述RNA沉淀用 75% EtOH漂洗，转移至不含RNAse的1. 6ml微离心管中，并再次通过离心回收。最后将所 述RNA沉淀重新悬浮于100 u llmM Na-phosphate，pH8. 2中，并测定A26(1与A28(1以衡量RNA纯度。在逆转录前，从总RNA 中使用 Qiagen Oligotex mRNA purification kit 纯化 mRNA。简言之，将50-200 ii g用不含RNAse的水加至250iU，并与250 ylOBB缓冲液以及 Oligotex悬浮液混合，继以在70°C下温育3分钟。Oligotex颗粒中oligo dT30与mRNA多 聚A-tail间的杂交在室温下进行10分钟。所述杂交悬浮液随即转移至离心柱中，并离心1 分钟。所述离心柱用400 ill Buffer 0W2漂洗。通过用20 yl热的(70°C ) Buffer 0EB离 心将提纯的mRNA洗脱两次。通常产量为500ng到1. 5 y g总RNA。使用N9和Oligo dT对骨髓mRNA讲行逆转录逆转录(RT)反应通过下述方法进行将75-100ng mRNA与2 yl lOXAccuscript RT Buffer (Stratagene) >0. 8 u 1 lOOmM dNTPs 以及N9 (300ng)或oligo dT primer (lOOng) 之一混合，并随即用水加至终容积为17 yl。将所述混合物在65 °C下加热5分钟， 并随即允许其冷却至室温。接着向每个反应混合物添加DTT、0. 5iU RNase Block (Stratagene)与 0. 5 ii 1 AccuScript RT (Stratagene)。接着，将所述 N9 引发的反应 混合物在室温下温育10分钟，并将oligo-dT引发的反应混合物在冰上温育10分钟。最后， 将两个反应混合物在42°C下温育60分钟，继以70°C下温育15分钟以将酶灭活。源自骨髓的cDNA的PCR基本上使用之前描述的方法与简并引物(0，Brien, P.M.，Aitken R. Standard protocols for the construction of scFv Libraries. Antibody PhaRePisplay-Methods and Protocols, vol. 178，59-71，2001，Humana Press)基于人类种系 V与 J 区域从骨髓 cDNA 扩增抗体重链与轻链库。简言之，将使用Oligo dT引发的PCR反应所得的lambda轻链cDNA(来自75ng mRNA)与N9引发的cDNA (来自75ng kappa轻链mRNA，来自100ng重链mRNA) —同混以 5 ill 10X amplification buffer (Invitrogen) >1. 5 u 1 dNTPs (lOmM) >1 U 1 MgS04 (50mM) > 2. 5u 1 Vregion 弓 I物(lOuM)以及 2. 5iil Jregion 弓 I物(lOuM) _10uM 对 VH，0. 5 yl Platinum Pfx Polymerase (Invitrogen)，并用无菌水将总容积加至50 yl。PCR参数如下步骤1_95°C 5 分钟，步骤2-95°C 30秒，步骤3-58°C 30秒，步骤4_68°C 1分钟，步骤5-循环步骤2-440 次，步骤6-68°C 5分钟。使用Qiagen PCR Cleanup kit清除轻链PCR产物。使用Qiagen Gel Extraction Kit从1. 5 %琼脂糖胶凝胶纯化重链PCR产物，并将其重新扩增。重链 重扩增反应通过下述方法实施将 10 ii 1 10X amplification buffer (Invitrogen)、3 ii 1 dNTPs(lOmM)、2ii 1 MgS04 (50mM)、5 ii 1 每种 VH 引物(lOuM)与 JH 引物(lOuM)、5 ii 1 初次 (primary)重链PCR产物、lyl Platinum Pfx混合，并用水将容积调整为100 yl。循环参 数如下设置步骤1-95 °C 5分钟，步骤2-95 °C 30秒，步骤3_58°C 30秒，步骤4_68°C 1分钟， 步骤5-循环步骤2-420次，步骤6-68°C 5分钟。使用Qiagen Extraction Kit从1. 5%琼 脂糖-TAE胶提纯重扩增重链PCR产物。构建抗体噬菌体文库每个禽流感幸存者个体的分离抗体文库使用插入在丝状噬菌体pill基因终止密 码子之后非翻译区域的独特的鉴定用3-核苷酸条形码来构建。轻链克隆用NotI与BamHl对每个供体消化分别1 P g的集合的kappa轻链与集合的lambda轻链，并使用Qiagen Gel Extraction Kit从1. 5%琼脂糖-TAE胶进行凝胶纯化。用NotI 与BamHl对5 ii g的每个载体(pAMPFab)进行消化，并使用Qiagen Gel Extraction Kit从 1 %琼脂糖-TAE胶进行凝胶纯化。使用200ng凝胶纯化的kappa或lambda插入序列与1 y g 凝胶纯化的载体在室温下一小时或在14°C下过夜进行文库的连接。连接产物使用Edge BioSystem Perfroma离心柱脱盐。用所述文库通过在80 u 1份量的TG-1或XL-1 Blue中 五次电击进行转化，将每个转化体在lmlSOC中回收，集合，并在37°C下过生长1小时。在该 过生长后通过从每次转化中将一份量在板上培养的方法确定转化体的总量。剩余的电击产 物通过在37°C下于200ml 2YT+50 u g/ml氨苄西林+2%葡萄糖中生长过夜的方法来扩增。 所得的起来文库通过从该过夜培养液中使用Qiagen High Speed Maxiprep Kit进行质粒 提纯的方法来回收。重链克降用Sfil与Xhol以每y g DNA40过量单位对1. 5-2 u g每种供体特异性重链(VH1， VH2，5，6 池，VH3，与 VH4)用 Qiagen Gel Extraction Kit 从 1. 5%琼脂糖-TAE 胶进行凝胶纯 化。用Sfil与Xhol以每ii g DNA40单位对15 u g每种轻链文库用Qiagen Gel Extraction Kit从1 %琼脂糖-TAE胶进行凝胶纯化。通过将1. 2 y g经Sfil/XhoI消化并凝胶纯化的 重链供体集合与5 u g每种轻链文库(kappa与lambda)合并在14°C下过夜设定文库连接。 所述文库连接产物随即用Edge BioSystem Pefroma离心柱脱盐，并随即通过每文库20次 电击在80 ill TG-1份量中转化，每个在lmlSOC中回收，集合并在37°C下过生长1小时。同 样在该过生长后，每个份量用于确定转化体的总量，剩下的转移到1L 2YT+50ug/ml氨苄 西林+2%葡萄糖中，并于37°C下在剧烈通气的条件下生长至0D_为 0. 3。接着随即以 5 1的感染复数(M0I)添加M13K07辅助噬菌体并在无通气的条件下在37°C下温育1小 时。接着通过离心收获细胞并在1L 2YT+50 u g/ml氨苄西林+70 u g/ml卡那霉素中重新悬 浮，并在剧烈通气的条件下在37°C温育过夜以允许产生scFv噬菌粒。翌晨通过离心集合细 胞并集合含有噬菌粒的上清。所述噬菌粒通过添加0. 2体积20% PEG/5M NaCl溶液并于冰 上温育1小时的方法从上清中沉淀出来。所述噬菌粒文库库随即通过离心收获，并在20ml 灭菌PBS中重新悬浮。残余细菌通过额外的离心步骤移除，且将最终噬菌粒文库在_20°C下 储存于PBS+50%甘油中。噬菌粒淘洗与扩增将ELISA板(Immulon 4HBX 96W，Nunc)通过在室温下过夜温育被以100 yl 100ng/mL H5 血凝素蛋白(Protein Sciences, A/Vietnam/1203/2004)的 1XELISA Plate Coating Solution (BioFX)涂覆。翌日用 300 ii 1 PBS/0. 05% Tween-20 (PBST)将板漂洗三 次。漂洗后，添加 300 u 1 封闭溶液(4% Non-Fat dryMilk in PBS/0. 05% Tween-20)并 在冰上温育30分钟。在封闭步骤后，用300iilPBST将板漂洗三次。就在噬菌体淘洗前， 使用Amicon Ultra柱从冰冻的噬菌粒库中移除甘油并随即在4%脱脂奶粉溶液中封闭15 分钟。接着，将100 yl噬菌粒份量分别置于8个孔(总噬菌体量 1x1012CFU)中，并在 4°C下温育2小时，继以用300 ill PBST漂洗6-8次。在室温下放置10分钟后，在100 yl/ wellElution buffer (0. 2M 甘氨酸-HC1，pH 2. 2，lmg/ml BSA)中集合噬菌粒。随即将洗 脱液通过添加每ml洗脱液56. 25 ill 2M Tris碱来中和洗脱液。在中和后，用0. 5ml经中 和的抗体在37°C下在2-YT中无振荡的条件下感染5mlTGl细胞(0D6C1C1 0. 3)30分钟。在此步骤之后将部分细胞铺于LB AMP Glucose板上以确定总噬菌粒回收量。将剩余的接种 液置于10ml2-YTAG (终浓度为2%葡萄糖与50ug/ml氨苄西林)中，并在剧烈通气的条件 下在37°C下生长至0D_ 0. 3。接着用M13K07辅助噬菌体以5 1的感染复数感染培养 物，并在无振荡的条件下在37°C下温育30-60分钟。所述细胞通过离心集合，并重新悬浮 于25ml2-YTAK (氨苄西林50 u g/ml，卡那霉素70 u g/ml)中，转移至全新的培养品中，并在 37°C下振荡生长过夜。用类似的方法回收并扩增后继轮次。scFv ELISA由生物淘洗的噬菌体转化大肠杆菌HB2151的单独菌落在lml2YT+100 u g/ml AMP 中在37°C下生长过夜。翌晨通过离心收获细胞并重新悬浮于1. 5mi周质裂解缓冲液(1ml BBS (Teknova) +0. 5ml lOmg/ml溶解酶+EDTA至lOmM终浓度)中。所述细胞通过离心再次 沉淀，并集合含有scFv的周质细胞裂解液。将所述scFv裂解液与稀释缓冲液(PBS/0. 05% BSA)1 1组合，并取lOOyl添加到之前被以抗原并用稀释缓冲液封闭的孔中。所述试样在 室温下温育2小时并随即用PBS/0.05% Tween漂洗三次。接着将100 ill 1 2500抗生物素 蛋白链菌素HRP(SeroteC)添加到每个孔中，并在室温下温育1小时，并随即用PBS/0. 05% Tween漂洗三次。在该最后漂洗后，添加100 U 1生色底物溶液(TMB1 Substrate,BioFx)，并 于足量时间后通过添加100 ill STOPSolution (BioFx)终止反应。在板读数器(Molecular Devices Thermomaxmi crop late reader with Softmax Pro software)上测定 450nm 处的 吸光度，记录数据，并随后用Excel (Microsoft)作图。Mi￡为推出重链与轻链序列，生长单独的克隆并抽提其质粒DNA(Qiagen)。所述质粒 DNA用于标准DNA测序血凝素抑制(HAI)分析血凝素抑制基本上遵循Rogers et al.，VuroloRY 131 =394-408(1983)的方法在 圆底微滴定板(Corning)上使用4HAU(血凝单位)病毒或蛋白质/孔进行。为HAI确定， 将25 yl纯化单链可变片段(scfv)试样在每个微滴定孔中与25 yl含有4HAU测试病毒的 PBS混合。在室温下预温育15分钟后，添加25 u 10. 75%人类红细胞并混合。HAI抗体活性 通过60分钟室温温育后目测进行。具体而言，使用了下列实验方法抗体、蛋白与病毒从scfv或Fab之一通过将其编码序列亚克隆入基于pCKPromega)全长哺 乳类蛋白表达以产生IgA蛋白，并根据生产商的大纲将其转染入293Freestyle细胞 (Invitrogen)中。简言之，将20g轻链及10g重链编码质粒与1. 0ml293fectin组合并温育 60分钟。在该预温育后，将所述DNA混合物与3X107细胞合并于30ml培养基中，并根据生 产商的建议将所得细胞悬浮液生长7天。7天后分泌的免疫球蛋白从培养上清中使用蛋白 A色库(Calbiochem)纯化。所得的纯化抗体使用离心尺寸过滤(Centricon Plus-20)用缓 冲液交换入灭菌PBS中，并通过色度法BCA分析确定其蛋白浓度。交叉反应gG ELISA.将微滴定板以0. 1ml下述稀释于缓冲液的抗原涂覆，并于室温下温育 过夜100ng/ml H5NlVietnam 1203/04、250ng/ml H5N1 Turkey/65596/06、lg/
27ml H5N1 Indonesia/5/05,700ng/ml H1N1 New Caledonia/20/99、lg/mlHlNl North Carolina/1/18、与 lOOng/ml H3N2 Wisconsin/67/05。用 0. 3ml 封闭缓冲液(PBS/0. 05% Tween-20中4%脱脂奶粉)进行封闭。在封闭后，在2%脱脂奶粉封闭缓冲液中稀释至
0.5g/ml的抗体在4°C下温育2小时，漂洗并之后使用1 3000稀释于2%脱脂奶粉封闭 缓冲液中的过氧化物酶结合抗人类F。抗体(Jackson ImmunoResearch)与TMB substrate detection (BioFX)进行检测。读出450nm处的吸光度，记录数据并在此报告。病毒微中和使用人类密码子优化序列(DNA 2.0)人工组装印度尼西亚与土耳其血凝素基因， 并随即用于产生重组改变病毒。如前所述使用反向遗传学产生重组流感病毒(FodohE.et al.J Virol. 1999。73(11) :9679_82)。简言之，将10种质粒每种lg在转染入单层293T 细胞。每次转染除vRNA(pP0Ll类型)与A/Vietnam/1203/04HA与NA(pCAGGS表达质粒由 J. Miyazaki, OsakaUniversity, Osaka, Japan 友好提供)(Miyazaki, J. et al. Gene 1989。 79(2) 269-77)的蛋白表达质粒(pCAGGS类型)外包含A/Puerto Rico/8/34/PA、PBl、PB2、 NP、M与NS区段的双义质粒(为表达vRNA与mRNA两者)。在转染20小时后，将293T细胞 重新悬浮于细胞培养上清中，并用于接种10日龄含胚卵。用下述方法筛选具有针对病毒中和活性的抗体。将每个Mab的两倍系列序列稀 释与100TCID5Q病毒在PBS中在37°C下温育1小时。将24孔板上的Madin-Darby Canine Kidney单层细胞用PBS漂洗一次并用病毒-抗体混合物接种。在37°C下5% C02中温育1 小时后，移除接种液并再次用PBS漂洗单层细胞。添加附有0. 3% BSA的Opti-MEM与lug/ ml经TPCK处理的胰蛋白酶，并在37°C下温育72小时。细胞组织上清中病毒的存在通过HA 分析使用0. 5%鸡红细胞衡量。MM骨髓与血样从六个2006年1月发生于土耳其H5W禽流感爆发的幸存者在大约爆 发后4个月集合。对于所有六个幸存者最初禽流感的诊断是经土耳其卫生部批准，通过身 体检查、临床实验室测试以及分子诊断确定之后得出的。这些幸存者中的四人进一步通过 世界卫生组织(WHO)确证。使用上述血清学实验方法分析血清试样以确证存在针对H5血 凝素(A/Vietnam/1203/2004)的抗体。如图8所示，所有六名患者(分别指定为SLBH1-H6) 的血样说明了针对H5抗原抗体的存在。在此确证后，从这些个体的骨髓试样中提取RNA，并 将骨髓mRNA纯化并使用上述实验方法逆转录。抗体重链与轻链库随即从上述骨髓cDNA中 扩增，且对每个幸存者分别克隆了单独的抗体重链与轻链噬菌体文库，使用上述三核苷酸 条形码标记以分辨这些单独的文库。使用该载体与其编码系统，我们成功的从六个幸存者中的五个的骨髓中以单链 (scFv)与Fab噬菌粒形式克隆了库。来自单独幸存者的每个集合具有超过1.0x10s成员 的多样性。进一步，我们构建了额外的包括混合的幸存者轻链与重链具有最终多样性为
1.lxlO9的条形码编码文库。所述5个供体特异性集合以及从所有供体集合的文库作为 scFv集合一共具有1. OxlO9的总多样性，而作为Fab展示集合则为4. 2xl09(表4)。表2显示了 scFv与Fab两者形式的轻链和全(completed)文库总转化体。所有 的文库代表的总多样性为5. 6X109。MJl 亦从十二名在2006年因流感症状接受治疗的当地供体集合了骨髓与血样。如上 所述进行了血清学研究以确证分别针对HI、H3与H5血凝素的抗体存在。如图8所示，所 有的血清试样对针对HI和/或H3血凝素抗体的测试显示阳性，其中特定亚型的优势取决 于该特定供体在其一生中接触最多的甲型流感病毒亚型。有趣的是，亦存在其血清包含显 著水平的H5血凝素抗体的供体(图9中供体SLB1与SLB5)。从该确证出发，从供体骨髓 试样中提取RNA，且使用上述实验方法提纯骨髓mRNA并将其逆转录。随即如上所述从骨髓 cDNA扩增所述抗体重链与轻链库，并对每个供体分别克隆单独的抗体重链与轻链噬菌体文 库，使用上述三核苷酸条形码编码以分辨单独的文库。选择结合抗体针对含有Vietnam/1203/04病毒失活病毒HA与NA蛋白或重组纯化血凝素 (Barbas, C. et al. (2001)Phage Display, A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press))淘洗总结于表2的H5W幸存者文库。在进行了三到四轮噬菌体淘洗 后，通过针对H5W表达或纯化血凝素的ELISA分析来自富集噬菌体池的单独克隆，且对阳 性克隆测序以确定其重链与轻链序列并解读其幸存者条形码(D. W. Coomber，Methods Mol Biol 178,133 (2002) ) 0由此，我们从所有五个单独的幸存者文库中分离了特定的H5血凝 素结合克隆。总体而言，回收了超过300个不同的抗病毒抗体，其中146个特异性的与H5 血凝素蛋白结合。所选克隆的一般特征总体而言，单独的供体对重链和轻链两者使用不同的种系，说明单独的患者对同 样的潜在致死性免疫攻击找到了不同的解决方法。从这些克隆中观察到了组合抗体文库 的主要特征，即其既可用于保证所得库的质量，又可针对抗体结合和/或中和的化学基础 提供信息。这些克隆含有所有前述重复克隆(“累积赌注解法”)对抗原结合的特征，其见 于亲和度成熟化的自然进程以及选择的人工合成抗体文库。在这些大型集合中“累积赌 注”(Jackpot)的存在证实了所述筛选过程的作用，因为，除非所述噬菌体选择是基于活性 的，多次获取相同克隆的可能性是非常小的。另外，当在组内分析重链差异时，发现许多氨基酸替换在化学上和结构上都是保守的(表4)。如反复克隆一般，存在多个化学上合理的 氨基酸替换似不可能为随机事件。回收抗体的结合特异件从三个幸存者选择了六个克隆，其识别两个对转化为全IgGl蛋白为不同的表位。 这些抗体其中四个的结合匹配于所述血凝素蛋白的HA1亚基，而剩下两个则否。由于所述 HA1亚基与感染具有巨大的相关性，我们如下所述进一步分析这四种抗体的活性。这些研究的一个目标是回收那些稀有的，广谱中和相异(divergent)病毒菌株的 抗体。有迹象暗示我们的部分抗体可为广库反应性的，这是因为来自所述供体的血清具有 针对相异H5m病毒亚家族的高效价抗体，而所述病毒超越了患者所受感染病毒的范围。为 在单独抗体的水平确定相互反应性的程度，我们首先分析了我们的克隆对不同流感血凝素 抗原的结合(图11)。不足为奇，这些抗体识别来自相应感染的Turkey/65596/06菌株的血 凝素，且额外的识别来自用于选择的Vietnam/1203/04菌株的异源血凝素。另外，它们识别 抗原上相异的Indonesian/5/05H5血凝素。进一步，我们发现四种原型抗体结合来自近缘 的亚型Hmi当前参照菌株New Caledonia/20/99的血凝素。令人注目的是，属于幸存者5的 三种中和抗体亦与来自Hmi South Carolina/1/18分离群的血凝素结合，所述分离群是在 1918年西班牙流感大流行中出现的。相反，这四种抗体均不与当前H3N2WisConsin/67/05 参照菌株结合，表明尽管所述抗体展示在流感亚型之中与之间的广库结合能力，所述反应 性并不扩展于所有的流感亚型。图11显示来自两名幸存者的H5m抗体与来自Hmi病毒血 凝素的交叉反应性。(A)条为 H5N1 Vietnam 1203/04 (深棕)，H5mTurkey/65596/06 (白)， H5N1 Indonesia/5/05 (斜条)，H1N1 New Caledonia/20/99 (直条)，H1N1 South Carolina/1/18 (交叉条)，以及 H3N2 Wisconsin/67/05 (浅灰)。中和研究起初，分析所述抗体中和含有H5HA(Vietnam/1203/04)的流感病毒的能力。识别 共同表位(表位“A”)的一个来自幸存者2以及三个来自幸存者5的抗体均具有中和力，而 识别第二个表位(表位“B”)的两个来自幸存者1的抗体则否。基于针对H5W或Hmi血凝素之一分别分离自幸存者5的克隆序列惊人的相似 性，我们预测其交叉反应性应扩展超越单纯的结合，且它们应亦具有中和H5m与Him病毒 两者的非常罕见的特性。为测试所述IgG的交叉中和活性，我们在中和分析中测试了来自 H5N1筛选的代表性抗体以观察它们是否亦中和Hmi或H3N2表达(表3)。我们研究了携 带HI的病毒A/NewCal/20/99以及携带H3的病毒A/Hong Kong/68。亦测试了携带H5亚 型血凝素的病毒集合(A/Vn/1203/04。A/Indo/5/05。A/Turkey/65596/06。A/Egypt/06)。 所述病毒不显示针对H3亚型流感的活性。然而，三个中和含有H5病毒的单克隆抗体(1-3) 亦强烈中和亚型HI中所有携带HA的表达(表5)。表3
30 中和的免疫化学基础抗体文库的一个优势是当获得大量抗体时，可根据其相互关系对其归组。因此，当 观察到集合中给定抗体的功能时，可预测该抗体所属的该组其它成员将具有相似活性。表4显示了在H5W Vietnam淘洗后从幸存者5文库中发现的展示中和的免疫化 学基础的示例序列。61个独特的重链序列与来自114个独特的重链与轻链组合的其种系 可变区域比对。必要突变示于粗体下划线文字(列5-PI到GM与A到T。列6-KS到EL或 EM或XL)而优势突变示于斜体下划线文字(列2-A到T。列3-1S到VT。列5-G到A。列 8-K到Q或R)。在HmiNew Caledonia淘洗中亦发现的重链序列用加亮于灰色。抗体区域 以及Kabat计数范围列于每个序列列的顶部。重链/轻链配对于第一列如下所示*_与两 个独特轻链配对，-与三个独特轻链配对，i _与四个独特轻链配对，§ -与六个独特轻链 配对，以及.1 -与12个独特轻链配对。
含有针对来自幸存者 61个独特成员，其最近似于VH:的中和抗体集合的组成员示于表4。所述组包括 。有些重链与多于一种轻链配对。总体而言，这些
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u重链与kappa及lambda轻链两者有114独特的配对。将这些重链与高度近缘的VHle种系 比较，我们观察到三种类型的点替换。有些变化似为必需的，其它的为优势的，而有些残基 仅仅偶尔变化。必需变化发生在组中的所有克隆的⑶R2内位置52A(Pro > Gly)，53 (lie > Met)，与 57 (Ala > Thr)，以及在构架 3 区域位置 73 (Lys > Glu)和 74 (Ser > Leu 或 Met)， 所有这些均与种系侧链化学不同，暗示这些突变对抗原结合与中和至关重要。第二类的突 变是优势的，并见于多数克隆。第一个，在构架1位置24 (Ala > Thr)，代表显著的化学变 化。接下来三个是在CDR1位置34(Ile > Val)与35 (Ser > Thr)以及在CDR2位置50 (Gly >Ala)的保守变化。然而，所有这四种优势替换均为可有可无的，暗示虽然它们是有益的， 但并非不可或缺的。见于整个构架区域1、3与4，以及⑶R3的偶尔(sporadic)变化均为保 守的，并似为代表了次要的优化事件。图12显示了必需突变在抗体结构中的位置，叠合在称为47e(lrzi.pdb)的高 度相关的抗 HIV Fab 的晶体结构上(Huang, C. C. et al. (2004)Proc. Nat. Acad. Sci. 101， 2706-2711)。图12显示了在Fab 47e晶体结构上H5血凝素结合组1必需与优势突变的位 置。必需突变显示为 G52(52A(Pro > Gly)), M53(Ile > Met)，T57(Ala > Thr)，E73 (Lys > Glu)与 LM74(Ser > Leu or Met)。优势突变显示为 T24(Ala > Thr) ,V34(Ile > Val)， T35 (Ser > Thr)，与 A50 (Gly > Ala)。在 H5Vietnam/1203/2004 HA 生物淘洗中鉴定出的必 需与优势组1重链序列叠合在高度相关的抗HIV Fab47e晶体结构上。突变示于骨架(上 部)与空间填充(下部)模型两者。在CDR2内及其附近的四个必需突变形成了紧密簇。 必需突变 52A (Pro > Gly) ,53 (lie > Met), 73 (Lys > Glu)与 74 (Ser > Leu 或 Met)在重 链可变域暴露的表面上形成了非常紧密的簇，在此它们形成了明显从蛋白表面突出的脊 (ridge)(图12)。剩余的必需突变57 (Ala > Thr)部分埋于CDR2环的基部。在CDR2与构 架3中暴露变化的表面似在抗原结合中具有直接作用，而较少暴露的必需突变以及非不可 或缺的优势突变可能通过稳定和/或定位⑶R2环而具有间接作用。来自幸存者2的抗体包括两个独特的重链，最接近于VH4_4b展现重链(表5)。发 现第一个重链与五个独特的lambda轻链配对，其中四个来自不常用的lambda 6轻链家族， 而另一个与单独的kappa轻链配对。其中和模式更加限制的抗体4来自该组。
给定突变对抗体活性为重要的可能性作为其受单独选择的次数的函数而增加。为 确定所述必需突变是在体细胞突变中自独立克隆中选出，还是自单独克隆的后代并在后续的复制中进一步突变后选出，分析了优势突变的密码子使用(表6A-6B)。该数据揭示，尽管 使用不同的密码子，其结果仍为相同的氨基酸变化，说明这些突变独立的出现于不同克隆 中，并因此经历多次选择。这个独立选择事件的趋同性结果是这些优势突变在与病毒结合 和/或其中和中其至关重要作用的强力证据。如表6A-6B所示，单独克隆的密码子使用显示所选H5HA结合克隆的独立起源。DNA 比对并编码针对VHl-e种系的6个代表性组1抗体的氨基酸序列。对相同氨基酸使用不同 密码子说明每个独特序列来自独特起源。表6A对应CDR2而表6B对应构架3。种系密码 子示为粗体密码子。从种系(Germ)密码子变为相同氨基酸示为普通(plain)文字密码子。 从种系氨基酸的第一次变化示为粗体下划线密码子。从种系氨基酸第二次变化示为斜体下 划线密码子。从种系氨基酸的第三次变化示为下划线灰色高亮密码子。表 6A 实施例2力感染HIV的患者构建供体特牛抗体骨髓实验方法与血清制备通过标准静脉穿刺术获得血液，允许其凝结，并处理以回收血清。所述血清 在-20°C下储藏3-4日直至将其置于干冰上处理。供体通过注射局部麻醉剂麻醉，并 从每个患者供体盆骨移取5ml骨髓。接着将所述5ml骨髓置入已消毒的含有45ml RNAlater(Ambion)的50_ml试管中。将所得混合物轻柔的颠倒大约8_20次直至无可见的 块以及骨髓与RNAlater混勻为止。接着将所述样本冷藏于2-10°C过夜。在过夜冷藏后， 将所述样本在-20°C下储藏3-4日直至将其置于干冰上处理。接收后，所述含有RNAlater/ 骨髓以及血清的试管储存在-80°C直至处理。在选为供体之前，候选患者需先测试为HIV阳 性。 骨髓抽提与mRNA纯化、逆转录、PCR、抗体轻链与重链构建、噬菌粒淘洗与扩增、 ELISA与测序均基本如实施例1所述进行。尽管在前述描述中引用特定实施例说明本发明，但其并不受此限定。事实上，除那 些在此显示并描述之外，对本发明的多种修饰对于本领域的技术人员而言通过前述描述， 是显而易见的，并且包含于后附的权利要求的范围内。本说明书中所有引用的文献均清楚的以引用方式包含于本文之中。
权利要求
一种载体集合，其包括编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子库，源自己罹患，或正在罹患引发对目标抗原产生抗体的疾病的人类患者供体，其中所述集合通过独特条形码鉴定。
2.权利要求1所述的载体集合，包括编码抗体轻链或其片段的核酸分子库。
3.权利要求2所述的载体集合，其中所述抗体轻链为λ链。
4.权利要求2所述的载体集合，其中所述抗体轻链为κ链。
5.权利要求1所述的载体集合，其包括编码抗体重链或其片段的核酸分子的库。
6.权利要求1所述的载体集合，其中所述条形码是连接于或者掺入在所述集合中存在 的载体的核苷酸序列，和/或连接于或者掺入编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子， 使其不干扰所述核酸分子的表达。
7.权利要求6所述的载体集合，其中所述条形码是一到大约24核苷酸的连续的非编码 核苷酸序列。
8.权利要求7所述的载体集合，其中所述核苷酸序列连接于所述核酸分子的3’或5’ 非编码区域。
9.权利要求6所述的载体集合，其中所述核苷酸序列是掺入编码抗体轻链或重链或其 片段的核酸分子中的一个或多个沉默突变的编码序列。
10.权利要求6所述的载体集合，其中所述核苷酸序列为非连续的。
11.权利要求10所述的载体集合，其中至少部分所述非连续核苷酸序列连接于或者掺 入所述集合中存在的载体。
12.权利要求10所述的载体集合，其中至少部分所述非连续序列掺入编码抗体轻链或 重链或其片段的核酸分子，使其不干扰所述核酸分子的表达。
13.权利要求1所述的载体集合，其中所述条形码是肽或多肽序列。
14.权利要求1所述的载体集合，其中所述载体是噬菌粒载体。
15.权利要求14(15)所述的载体集合，其中所述噬菌粒载体包含噬菌体基因III以及 在编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子与该噬菌体基因III之间的终止密码子。
16.权利要求15所述的载体集合，其中所述条形码是插入在所述终止密码子之后非翻 译区域的非编码连续核苷酸序列。
17.包含权利要求1所述载体集合的宿主细胞。
18.权利要求16所述的宿主细胞，其为大肠杆菌宿主细胞。
19.供体特异性抗体文库，包括表达针对目标抗原的抗体或抗体片段集合的文库成员， 其中所述抗体或抗体片段源自己罹患，或正在罹患引发对目标抗原产生抗体的疾病的人类 供体，其中所述抗体文库通过至少一种独特条形码鉴定。
20.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述抗体重链与轻链各自分别通过 条形码鉴定，所述条形码对于其来源的人类供体是独特的。
21.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其通过一种独特条形码鉴定。
22.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述抗体或抗体片段由载体中存在 的核酸分子所编码的抗体重链与轻链或其片段组成。
23.权利要求22所述的供体特异性抗体文库，其中所述条形码是连接于或掺入所述文 库中存在的载体的核苷酸序列，和/或连接于或掺入编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子，使其不干扰所述核酸分子的表达。
24.权利要求23所述的供体特异性抗体文库，其中所述条形码是1到大约24个核苷酸 的连续的非编码核苷酸序列。
25.权利要求24所述的供体特异性抗体文库，其中所述核苷酸序列连接于所述核酸分 子的3’或5’非编码区域。
26.权利要求23所述的供体特异性抗体文库，其中所述核苷酸序列是掺入编码抗体轻 链或重链或其片段的核酸分子中的一个或多个沉默突变的编码序列。
27.权利要求23所述的供体特异性抗体文库，其中所述核苷酸序列是非连续的。
28.权利要求27所述的供体特异性抗体文库，其中至少部分所述非连续核苷酸序列连 接于或者掺入所述文库中存在的载体。
29.权利要求27所述的供体特异性抗体文库，其中至少部分所述非连续核苷酸序列掺 入编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子，使其不干扰所述核酸分子的表达。
30.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述条形码是肽或多肽序列。
31.权利要求22所述的供体特异性抗体文库，其中所述载体是噬菌粒载体。
32.权利要求31所述的供体特异性抗体文库，其中所述噬菌粒载体包含噬菌体基因 III以及在编码抗体轻链或重链或其片段的核酸分子与该噬菌体基因III之间的终止密码 子。
33.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其为表达抗体重链或其片段的集合。
34.权利要求33所述的供体特异性抗体文库，其包含多于一种抗体重链家族。
35.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述人类供体的医疗史显示该患者 已罹患，或正在罹患所述疾病。
36.权利要求35所述的供体特异性抗体文库，其中独立地确证了所述人类供体已罹 患，或正在罹患所述疾病。
37.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其基本上不含特异性地与异于所述目标 抗原的抗原结合的抗体与抗体片段。
38.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述目标抗原是甲型流感病毒。
39.权利要求38所述的供体特异性抗体文库，其中所述目标抗原是甲型流感病毒HI、 H2或H3亚型的分离群。
40.权利要求38所述的供体特异性抗体文库，其中所述目标抗原选自包含下述的组 H5、H7与H9甲型流感病毒亚型。
41.权利要求38所述的供体特异性抗体文库，其表达至少一种与多于一种甲型流感病 毒亚型特异性结合的抗体或抗体片段。
42.权利要求39所述的供体特异性抗体文库，其表达至少一种结合于并中和甲型流感 病毒H5W亚型的抗体或抗体片段。
43.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述人类供体已罹患，或正在罹患 选自列于表1中的疾病。
44.权利要求43所述的供体特异性抗体文库，其表达至少一种结合于与所述目标疾病 相关联的抗原的抗体或抗体片段。
45.权利要求43所述的供体特异性抗体文库，其表达至少一种结合于并中和与所述目标疾病相关联的抗原的抗体或抗体片段。
46.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其表达至少一种中和抗体。
47.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其中所述供体特异性抗体文库为噬菌体文库。
48.权利要求47所述的供体特异性抗体文库，其中所述集合包含编码超过106种不同 成员的抗体或抗体片段序列。
49.权利要求47所述的供体特异性抗体文库，其中所述集合包含编码超过109种不同 成员的抗体或抗体片段序列。
50.权利要求19所述的供体特异性抗体文库，其选自下组孢子展示文库、核糖体展示 文库、mRNA展示文库、微生物细胞展示文库、酵母展示文库与哺乳类展示文库。
51.权利要求50所述的供体特异性抗体文库，其中所述核酸逆转录自从所述人类供体 淋巴细胞提取的mRNA。
52.权利要求51所述的供体特异性抗体文库，其中所述淋巴细胞源自骨髓、血液、脾脏 或淋巴结。
53.权利要求52所述的供体特异性抗体文库，其中在提取所述mRNA前生成了所述人类 供体的血清学谱(profile)。
54.权利要求53所述的供体特异性抗体文库，其中在提取所述mRNA之前或之后检查所 述人类供体的医疗史。
55.一种构建表达针对目标抗原的抗体或抗体片段之集合的供体特异性文库的方法， 其特征为包括下列步骤a)从已罹患，或正在罹患引发对所述目标抗原产生抗体的疾病的人类患者供体的淋巴 细胞获取mRNA。b)通过对所述获得的mRNA进行逆转录产生核酸集合，所述核酸集合包含编码所述患 者免疫球蛋白库的序列；和c)用标记所述核酸的独特条形码鉴定所述供体特异性文库。
56.权利要求55所述的方法，其进一步在步骤a)之前或之后包括产生所述患者血清学 谱和/或检查所述患者医疗史的步骤。
57.权利要求56所述的方法，其进一步包括下列步骤d)将所述核酸插入表达载体；e)表达所述免疫球蛋白库；f)在展示系统中展示所述免疫球蛋白库。
58.权利要求57所述的方法，其中所述展示系统是噬菌粒。
59.权利要求58所述的方法，其进一步包括基于所属文库的成员中和或激活目标抗原 的能力对其进行选择的步骤。
60.权利要求59所述的方法，其产生至少一种中和抗体。
61.权利要求59所述的方法，其产生多于一种中和抗体。
62.权利要求61所述的方法，其进一步包括创建一种或多种亚文库的步骤，所述亚文 库包括被发现可中和或激活目标抗原的文库成员。
63.权利要求59所述的方法，其包括对至少一种鉴定出的文库成员进行测序的步骤。
64.一种治疗或预防与通过权利要求59所述的方法选出的抗体中和或激活的目标抗 原相关联的疾病的方法，其包括对有需要的所述人类患者施用有效量的所选抗体。
65.权利要求64所述的方法，其中所述抗体为中和抗体。
66.权利要求65所述的方法，其中所述疾病为甲型流感病毒感染。
67.权利要求64所述的方法，其中所述疾病选自由列于表1的疾病组成的组。
全文摘要
本发明涉及源自已罹患，或正在罹患一种或更多在此讨论的疾病的患者供体特异性抗体文库。本发明亦涉及产生与使用所述供体特异性抗体的方法。本发明进一步涉及自所述供体特异性抗体文库的中和抗体，以及使用这些抗体预防/治疗人类疾病的方法。
文档编号A61K39/395GK101854950SQ200880115462
公开日2010年10月6日 申请日期2008年9月11日 优先权日2007年9月11日
发明者劳伦斯·霍罗威茨, 拉梅什·巴特, 阿伦·K·卡什亚普 申请人:航道生物技术有限责任公司