Gas57突变型抗原和gas57抗体的制作方法

专利名称：Gas57突变型抗原和gas57抗体的制作方法
技术领域：
本发明设计免疫学和疫苗学领域。具体说，本发明涉及衍生自酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)的抗原及它们在免疫接种中的应用。
背景技术：
大肠杆菌表达和从其提纯的酿脓链球菌(A群链球菌；GAS)抗原GAS57重组蛋白 在小鼠中诱导了抗酿脓链球菌致死性攻击的保护活性。然而，GAS57是一种蛋白酶，能切割 和灭活人趋化因子如白介素-8 (IL-8) (Edwards 等.，J infectious Diseases. 192,783-90, 2005 ；hidalgo-Grass 等·，EMBO J. 25，4628-37，2006)。GAS57 的这种性能由于可能产生副 作用而妨碍了其在疫苗组合物中的应用。因此，本领域需要不能切割人趋化因子但仍保留 了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的GAS57抗原。本领域也需要能特异性结合GAS57抗原从 而削弱GAS57切割IL-8和其它物质能力的抗体。附图简述

图1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示了野生型GAS57可切割IL_8。图2.野生型GAS57 (查询序列SEQ ID NO :1)与C5a肽酶丝氨酸蛋白酶(对象序 列SEQ ID NO 9)的BLAST算法比对。图3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示GAS57点突变体D151A丧失了切割 IL-8的能力。图4.此图所示的ELISA试验结果表明GAS57点突变体D151A丧失了切割IL-8的 能力。图5A-B SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示GAS57单突变体D151A和S617A 及双突变体D151A+S617A丧失了 GAS57的蛋白酶水解活性。图6.此图所示的ELISA试验结果表明单突变体D151A和S617A及GAS57双突变 体D151A+S617A丧失了 GAS57的蛋白酶水解活性。图7. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示野生型GAS57翻译后被修饰成 150. 5kDa和23. 4kDa的两个多肽片段。图8. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示与野生型(黑色箭头)相比，GAS57 突变体D151A、S617A及D151A+S617A翻译后未被修饰成为150. 5kDa和23. 4kDa的两个多 肽片段。对应于未经加工蛋白的一个主要174kDa条带存在于对应于灭活突变株蛋白(灰 色箭头)的泳道中。图9A-B.ELISA试验结果表明，在二种不同实验条件下，抗GAS57多克隆抗血清以 剂量依赖方式抑制GAS57介导的IL-8切割。图9A，培育8小时，0. 1 μ g/ml GAS57。图9B， 培育 24 小时，0. 05μ g/ml GAS57。图10A-GG.不同菌株/M型的GAS57抗原比对。粗黑体字为催化三联体(D、H和 S)。图10A，各图上部为氨基酸1-50 (氨基酸编号，10A-GG为GAS57M1_SF370的氨基酸序列， SEQ ID NO :1)；图 10B，氨基酸 51-100 ；图 10C，氨基酸 101-150 ；图 10D，氨基酸 151-200 ； 图10E，氨基酸201-250 ；图10F，氨基酸251-300 ；图10G，氨基酸301-350 ；图10H，氨基酸351-400 ；图 101，氨基酸 401-450 ；图 10J，氨基酸 451-500 ；图 10K，氨基酸 501-550 ；图 10L, 氨基酸551-600 ；图10M，氨基酸601-650 ；图10N，氨基酸651-700 ；图100，氨基酸701-750 ； 图10P，氨基酸751-800 ；图10Q，氨基酸801-850 ；图10R，氨基酸851-900 ；图10S，氨基酸 901-950 ；图 10T,氨基酸 951-1000 ；图 10U,氨基酸 1001-1050 ；图 10V,氨基酸 1051-1100 ； 图 10W，氨基酸 1101-1150 ；图 10X，氨基酸 1151-1200 ；图 10Y，氨基酸 1201-1250 ；图 10Z, 氨基酸 1251-1300 ；图 10AA，氨基酸 1301-1350 ；图 10BB，氨基酸 1351-1400 ；图 10CC，氨 基酸 1401-1450 ；图 10DD，氨基酸 1451-1500 ；图 10EE，氨基酸 1501-1550 ；图 IOFF 氨基酸 ~ 1551-1600 ；图 10GG，氨基酸 1601-1650。Gas57Ml_SF370, SEQ ID NO 1 ；gas57Ml_31075, SEQ ID NO 10 ；gas57Ml_31237, SEQ ID NO 11 ；gas57Ml_3348, SEQ ID NO 12 ； gas57M2_34585, SEQ ID NO 13 ;gas57M3，1_21398，SEQ ID NO :14 ;gas57M44_61_20839， SEQ ID NO :15 ;gas57M6，31_20022，SEQ ID NO 16 ;gas57Ml 1_20648，SEQ ID NO 17 ； gas57M23_2071, SEQ ID NO 18 ;gas57M18，3_40128，SEQ ID NO 19 ；gas47M4_10092, SEQ ID NO 20 ；gas57M4_30968, SEQ ID NO 21 ；gas57M6，31_22692，SEQ ID NO 22 ；gas57M68, 5_22814，SEQ ID NO 23 ；gas57M68_23623, SEQ ID NO 24 ；gas57M2_10064, SEQ ID NO 25 ；gas57M2_10065, SEQ ID NO 26 ；gas57M77_10251, SEQ ID NO 27 ；gas57M77_10527, SEQ ID NO 28 ；gas57M77_20696, SEQ ID NO 29 ；gas57M89_21915, SEQ ID NO 30 ； gas57M89_23717, SEQ ID NO 31 ；gas57M94_10134, SEQ ID NO 32 ；gas57M28_10164, SEQ ID NO 33 ；gas57M28_10218, SEQ ID NO 34 ；gas57M29_10266, SEQ ID NO 35 ； gas57M28_10299, SEQ ID NO 36 ；gas57M28_30176, SEQ ID NO 37 ；gas57M28_30574, SEQ ID NO :38 ;gas57M6，9_21802，SEQ ID NO 39 ；gas57M75_20671, SEQ ID NO 40 ； gas57M75_30603, SEQ ID NO 41 ；gas57M75_30207, SEQ ID NO 42 ；gas57M22_20641, SEQ ID NO 43 ；gas57M22_23465, SEQ ID NO :44 ;gas57M3，1_30610，SEQ ID NO 45 ；gas57M3, 1_40603，SEQ ID NO :46 ;gas57M3，28_24214，SEQ ID NO :47 ;gas57M3，34_10307，SEQ ID NO 48 ；gas57M4_40427, SEQ ID NO 49 ；gas57M3_2721, SEQ ID NO 50 ；gas57M12_10296, SEQ ID NO 51 ；gas57M12_10035, SEQ ID NO 52 ；gas57M12_20069, SEQ ID NO 53 ； gas57M12_22432，SEQ ID NO 54 ；gas57M4_40499,SEQ ID NO 55 ；和 gas57M6，1_21259，SEQ ID NO 56 ；gas57M75_20671, SEQ ID NO :80。图11.人趋化因子的比对。GAS57在二个粗体显示氨基酸与下划线显示氨基酸之 间切断 CXCL8(IL-8) (SEQ ID NO :81)。CXCL4，SEQ ID NO 57 ；CXCL7/NAP-2，SEQ ID NO 58 ； CXCLl/GRO α，SEQ ID NO 59 ；CXCL2/GR0 3，SEQ ID NO 60 ；CXCL3/GR0y , SEQ ID NO 61 ； CXCL6/GCP-2 γ，SEQ ID NO 62 ；CXCL12/SDF-1 α，SEQ ID NO 63 ；CXCL12/SDF-1 γ，SEQ ID NO 64 ；CXCL12/SDFl-3，SEQ ID NO 65 ；CXCL9/MIG, SEQ ID NO 66 ；CXCL10/IP10, SEQ ID NO 67 和 CXCLl 1，SEQID NO :68。图12. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显微照片，显示GAS57切割CXC趋化因子。发明详述本发明提供不能切割人趋化因子如IL-8但仍保留了诱导抵御酿脓链球菌保护能 力的Spy0416或GAS57突变体(本文称为“GAS57突变抗原”、“GAS57突变体”、“突变型GAS57 抗原”)。本发明的GAS57突变体可用于疫苗组合物以诱导抵御酿脓链球菌的保护力。本 发明也提供特异性结合野生型GAS57蛋白从而能抑制GAS57切割IL-8和类似物质的抗体。设想该抗体可用作预防和/或治疗酿脓链球菌感染的治疗药物。突变型GAS57抗原“GAS57” 也称为 “Spy0416”(Ml)、“SpyM3_0298”(M3)、“SpyM18_0464”(M18) 和“prtS”。GAS57的鉴定也曾推测为是一种细胞外膜蛋白酶。参见WO 02/34771和UA 2006/0258849。根据疾病控制中心现知有17种不同M类型(1、2、3、4、6、11、12、18、22、23、 28、44/61、68、76、77、89、94)的49种GAS57序列，在美国这17种不同M类型占咽炎病例的 95%以上和侵入性GAS分离物的约68%。野生型GAS57抗原的序列见SEQ ID NO 1,10-56 和80。野生型GAS57包含二条非共价结合的肽(参见实施例5和图7)。本发明的突变型GAS57抗原对白介素8(IL_8)有蛋白水解活性，经SDS-PAGE或 ELISA 检测此活性比野生型 GAS57 至少低 50% (如低 50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 96、98、99或100% )，参见实施例2和3 ；但有免疫原性，例如能赋予小鼠模型抵御GAS致 死性攻击的保护力(实施例4)。优选的本发明突变型GAS57也不切割人的其它细胞因子， 如 CXCLl/GRO α (如 SEQ ID NO 59)、CXCL2/GR0 β (如 SEQ ID NO 60)、CXCL3/GR0 γ (如 SEQ ID NO 61)、CXCL4(如 SEQ ID NO 57)、CXCL12/SDF-1 α (如 SEQ ID NO 63)、CXCL12/ SDF-I β (如 SEQ ID NO 65) ,CXCL12/SDF-1 γ (如 SEQ ID NO :64)、CXCL5/ENA78 (如 SEQ ID NO :82)、CXCL6/GCP-2(如 SEQ ID NO :62)、CXCL7/NAP_2 (如 SEQ ID NO :58)、CXCL9/MIG (如 SEQ ID NO :66)、CXCL10/IP10 (如 SEQ ID NO :67)、CXCL11 (如 SEQ ID NO :68)、CXCL13 (如 SEQ ID NO 83)、CXCL14(如 SEQID NO 84)和 CXCL16(如 SEQ ID NO 85)。出乎意料的是 本发明的GAS57突变体是单一多肽，而野生型GAS57则相反经翻译后加工(成熟)形成二 条非共价结合的肽(实施例5和6)。能够获得这种单一肽形式的抗原有利于疫苗重组蛋白 的生产。本发明的GAS57突变体包括在SEQ ID NO :1所示野生型GAS57序列编号的D151、 H279或S617氨基酸中一个或多个处具有氨基酸改变(即取代、缺失或插入)的那些，参见 图10。本发明的GAS57突变体包括在D151、H279和/或S617位置的一个、二个或三个氨 基酸改变(“单突变体”、“双突变体”、“三突变体”)。因此，GAS57突变蛋白可包括以下i.D151A(SEQ ID NO :2)、D151R、D151N、D151C、D151Q、D151E、D151G、D151H、D151I、 015比、01511(、0151]\1、015明、0151卩、01515、01511\01511、0151￥或0151￥ ；ii. H279A、H279R、H279N、H279D、H279C、H279Q、H279E、H279G、H279I、H279L、H279K、 H279M、H279F、H279P、H279S、H279T、H279W、H279Y 或 H279V ；iii. S617A(SEQ ID NO 3)、S617R、S617N、S617D、S617C、S617Q、S617E、S617G、 S617H、S617I、S617L、S617K、S617M、S617F、S617P、S617T、S617W、S617Y 或 S617V ；iv. AD151 ；或 ΔΗ279 ；或 AS617 ；和它们的组合，如D151A+S617A(SEQ ID NO :4)。本发明的GAS57突变抗原也包括含上述GAS57突变抗原和另一种GAS57抗 原的融合多肽。例如WO 02/34771公开的GAS57抗原包括但不限于GAS25 (SpyO 167 ； gi13621460)、 GAS39 (Spy0266 ； gi13621542)、 GAS40 (Spy0269 ； gi13621545)、 GAS42 (Spy0287 ；gi 13621559)、GAS45 (M5005_Spy0249 ；gi71910063)、GAS58 (Spy0430 ； gil3621663)、GAS84 (Spyl274 ；13622398)、GAS95 (Spyl733 ；13622787)、GAS117 (Spy0488 ；gi13621679)、 GAS130(Spy0591 ；gi13621794)、 GAS137 (Spy0652 ；gi13621842)、 GAS159(Spyl105 ；gi13622244) 、 GAS193(Spy2025 ；gi3623029)、 GAS202 (Spy 1309 ； gi13622431) 、 GAS217(Spy0925 ；gi1362208)、 GAS236 (Spyl126 ；gi13622264)、 GAS253 (Spyl524 ；gil3622611) 、 GAS277 (Spyl939 ；gil3622962) 、 GAS294 (Spy 1173 ； gi 13622306)、 GAS309 (Spy0124 ；gi13621426)、 GAS366 (Spy 1525 ；gi13622612)、 GAS372 (Spyl625 ；gil3622698) 、 GAS384 (Spy 1874 ；gil3622908) 、 GAS389 (Spy 1981 ； gi 13622996)、 GAS504 (Spy 1751 ；gi13622806)、 GAS509 (Spy 1618 ；gi 13622692)、 GAS290(Spyl959 ；gil3622978)、 GAS511(Spy 1743 ；gil3622798)、 GAS527 (Spyl204 ； gi3622332)、GAS529(Spyl280 ;gi3622403)和 GAS533 (Spyl877 ;gil3622912)。GAS 抗原 还包括:GAS68(Spy0163 ；gi 13621456)、GAS84 (Spyl274 ；gi 13622398)、GAS88 (Spy 1361 ； gi13622470)、 GAS89(Spy 1390 ；gi13622493)、 GAS98(Spy 1882 ；gil3622916), GAS99(Spy 1979 ；gi13622993)、 GAS102(Spy2016 ；gi13623025)、 GAS146(Spy0763 ； gi13621942)、 GAS 195(Spy2043 ；gi13623043)、 GAS561(Spy 1134 ；gi13622269)、 GAS179(Spyl718 ；gil3622773)和 GAS681(Spyll52 ；gil362228)。本发明还包括经SDS-PAGE或ELISA测定不能切割IL_8，但具有免疫原性能赋予 小鼠模型抵御GAS致死性攻击保护力的GAS57突变体单一多肽的等同物。这种等同物包括 在D151、H279或S617以外的位置含有氨基酸缺失、插入和/或取代的突变型GAS57抗原， 包括N或C末端缺失最多约40个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个氨 基酸)。因此，这种等同物包括除了在上述氨基酸D151、H279或S617和S617中一个或多 个处具有氨基酸改变外，在D151、H279或S617位以外的一些位置含有缺失、插入和/或取 代的GAS57突变体。核酸分子本发明包括编码突变型GAS57抗原的核酸分子。本发明也包括所含核苷酸序列 与这种分子至少有50%序列相同性的核酸分子。取决于具体的序列，所述序列相同性程度 优选大于 50% (如 60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更高)。核苷酸序列之间的相同性优选用Smith-Waterman同源性检索算 法测定，以MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))进行，所用仿射空位检索的 参数是空位开放罚分=12，空位延伸罚分=1。本发明也提供能与上述这些分子杂交的核酸分子。可在不同“严谨性”条件下 进行杂交反应。提高杂交反应严谨性的条件是本领域广为所知和已发表的。参见例如 Sambrook 等“分子克隆实验室手册(Molecular Cloning :A Laboratory Manual) ” 1989， 第7. 52页。有关条件的例子包括(为提高严谨性)251、371、501、551和681的培育 温度；10X SSC、6X SSCUX SSC 禾口 0. IX SSC(SSC 是 0. 15M NaCI 禾口 15mM 柠檬酸缓冲液)的 缓冲液浓度和与其等同的采用其它缓冲液的系统；0%、25%、50%和75%的甲酰胺浓度； 5分钟至24小时的培育时间；1、2或更多次的洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤培育时间； 6X SSCUX SSC、0. IX SSC或去离子水的洗涤液。杂交技术及其优化是本领域熟知的，可参 见例如，Sambrook，1989 ;Ausubel等编著的“分子生物学简短方案(Short Protocols in MolecularBiology)，，第4版，1999 ；美国专利5，707，829 ；Ausubel等编著“分子生物学当前方案(Current Protocols in Molecular Biology) ”，增刊 30，1987。在某些实施方式中，本发明的核酸分子能在低严谨条件下与靶分子杂交；在其它 实施方式中，本发明的核酸分子能在中等严谨条件下杂交；在优选的实施方式中，本发明的 核酸分子能在高严谨条件下杂交。低严谨性杂交条件的一个例子是50°C和IOX SSC0中 等严谨性杂交条件的一个例子是55°C和IX SSC0高严谨性杂交条件的一个例子是68°C和 0.IX SSCo制备突变型GAS57抗原重组制备基因密码子的冗余度是众所周知的。因此，可利用编码野生型GAS57蛋白或编 码本发明GAS57突变蛋白的任何核酸分子(多核苷酸)来产生重组蛋白质。编码野生型 GAS57、GAS57突变体D151A、GAS57突变体S617A和GAS突变体D151A+S617A的核苷酸序列 分别见SEQ ID N0:5、6、7和8。也可采用标准的核酸纯化技术从合适的酿脓链球菌分离编 码野生型GAS57的核酸分子，或采用扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)或用自动化合成 仪合成该核酸分子。参见 Caruthers 等.，Nucl Acids Res SympSer. 215, 223,1980 ；Horn 等.，Nucl Acids Res Symp Ser. 225，232，1980 ;Hunkapiller 等·，Nature 310,105-11, 1984 ；Grantham 等，Nucl Acids Res. 9，r43_r74，1981。可用标准分子生物学技术，以mRNA为模板制备cDNA分子。然后可用本领域熟知的 分子生物学技术复制该cDNA分子。可利用基因组DNA或cDNA作模板，以扩增技术，如PCR 获得更多拷贝的本发明多核苷酸。如果需要，可用本领域众所周知的方法工程改造多核苷酸以改变抗原编码序列， 包括但不限于导致克隆、加工和/或多肽或mRNA产物表达的修饰等的改变。可采用基因片 段和合成寡核苷酸的随机片段化PCR重装配改组DNA，从而工程改造核苷酸序列。例如，可 利用定点诱变插入新的限制性酶位点，改变糖基化模式，改变密码子偏爱，产生剪接变体， 引入突变等等。可利用序列修饰，例如加入纯化标签序列或优化密码子来促进表达。例如，用编码 标签蛋白如聚组氨酸(“HIS”)或谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)的序列替代N-末端前导 序列。可利用这种标签蛋白促进表达蛋白的纯化、检测和稳定性。可选择具体的原核或真 核宿主偏爱的密码子来提高蛋白表达率，或制备具有所需性能，如半寿期比天然序列产生 的转录物更长的RNA转录物。这些方法是本领域熟知的，在WO 05/032582中也有描述。表达载体可将编码突变型GAS57抗原的核酸分子插入表达载体中，该表达载体含有转录和 翻译插入的编码序列所需的元件。可采用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码序列和 合适转录和翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内 基因重组技术。宿主细胞能产生突变型GAS57抗原的宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的宿主细 胞是大肠杆菌，其它合适的宿主包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌乳 脂亚种(lactococus cremoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、乳酉先胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌 (Mycobacteria)(如结核分枝杆菌(M. tuberculosis))、酵母菌、杆状病毒、哺乳动物细胞寸寸。

可选择能以所需方式调节插入序列的表达或加工所表达多肽的宿主细胞株。多 肽的这种修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。也可利用切 害IJ “前蛋白”形式多肽的翻译后加工来帮助正确插入、折叠和/或行施功能。可从美国模 式培养物保藏中心(ATCC ;10801，大学大道，玛娜丝，弗吉尼亚州(University Boulevard, Manassas, VA) 20110-2209)获得具有翻译后活化特异性细胞机制和特征机理的不同宿主细 胞，并作选择以确保外源蛋白的正确修饰和加工。参见WO 01/98340。可采用已良好建立的技术将表达构建物引入宿主细胞，包括但不限于转铁蛋 白-聚阳离子介导的DNA转移，用裸核酸或包裹的核酸转染，脂质体介导的细胞融合，包裹 DNA的胶乳珠的胞内转运，病毒感染，电穿孔，“基因枪”方法，和DEAE-或磷酸钙介导的转
^fe ο将表达载体转化的宿主细胞培养在适合从细胞培养表达蛋白和回收的条件下。转 化细胞产生的蛋白可能分泌出来或包含在细胞内，这取决于核苷酸的序列和/或所用的表 达载体。本领域技术人员知道可以设计含有信号序列的表达载体，其能引导可溶性抗原穿 过原核或真核细胞膜而分泌。纯化可在重组产生的突变型GAS57抗原中包含信号输出序列，以便用已知方法纯化细 胞培养液中的抗原。或者，可用本领域熟知的方法，从工程改造的宿主细胞中分离本发明重 组产生的突变型GAS57抗原，使其与宿主细胞的其它组分，如蛋白质、糖或脂质分开。这类 方法包括但不限于分子大小排阻层析、硫酸铵分级、离子交换层析、亲和层析和制备型凝 胶电泳。纯化的突变型GAS57抗原制品至少80 %纯，优选该制品为90 %、95 %或99 %纯。 可用本领域已知的任何方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估制品的纯度。可用适当 的试剂，如脲素来促进突变型GAS57抗原的溶解。化学合成突变型GAS57抗原的合成，例如可采用固相技术。参见，如Merrif ield，J Am Chem Soc. 85,2149-54，1963 ;Roberge 等·，Science 269，202-04，1995。可采用手工技术或自 动化技术进行蛋白质合成。实施自动化合成，例如可采用泊金艾尔默公司的应用生物系统 431A肽合成仪(Applied Biosystems431A Peptide Synthesizer,Perkin Elmer)。可任选 分别合成突变型GAS57抗原的各片段，再用化学方法组合产生全长分子。GAS57 抗体本发明也提供能特异性结合野生型GAS57从而实质性减弱或消除GAS57切割IL_8 能力的抗体。本发明的某些抗体也能特异性结合上述突变型GAS57。优选的抗体还能减弱 或消除 GAS57 切割其它物质，如 IL-8 同类物(如 CXCL1/GR0 α、CXCL2/GR0 β、CXCL3/GR0 γ、 CXCL4、CXCL12/SDF-1 α、CXCL12/SDF-1 β、CXCL12/SDF-1 γ、CXCL5/ENA78、CXCL6/GCP-2、 CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCL11、CXCL13、CXCL14 和 CXCL16)的能力。任何 用于免疫化学试验的抗体提供的检测信号比用非-GAS57蛋白提供的检测信号至少高5_、 10"或20-倍，即为能“特异性结合”野生型或突变型GAS57的抗体。能特异性结合野生型或突变型GAS57的抗体优选在免疫 化学试验中不能检测非GAS57蛋白，可用其免疫沉淀溶 液中的野生型GAS57。用SDS-PAGE或ELISA检测，本发明的抗体可减弱GAS57对白介素 8(IL-8)的蛋白水解活性，与野生型相比至少减弱50% (如50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、96、97、98、99 或 100% )。在优选的实施方式中，本发明的抗体能阻断免疫接种野生型或突变型GAS57重组 抗原并受GAS攻击的动物坏死病灶的发展。本文所用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子，以及其能特异性结合野生型 GAS57的，某些情况下能特异性结合突变型GAS57抗原的片段。这些抗体片段包括杂交 (嵌合)抗体分子(如 Winter 等，Nature349，293-99，1991 ；美国专利 4，816，567) ；F(ab，)2 和F(ab)片段及Fv分子；非共价连接的异质二聚体(如Inbar等，Proc Natl AcadSci. USA. 69,2659-62,1972 ；Ehrlich 等.，Biochem. 19，4091-96，1980)；单链 Fv 分子(sFv)(如 Huston 等.，Proc Natl Acad Sci. USA. 85，5897-83，1988) ；二聚或三聚抗体片段构建物； 微小抗体(如 Pack 等·，Biochem. 31，1579-84，1992 ；Cumber 等·，J Immunology. 149B, 120-26,1992)；人源化抗体分子(如 Riechmann 等·，Nature. 332，323-27，1988 ；Verhoeyan 等·，Scence. 239，1534-36，1988 和公开的英国专利号 GB2, 276，169，1994/9/21 公开)；获 自这些分子的任何功能性片段及通过非常规方法，如噬菌体展示技术获得的抗体。制备GAS57抗体可利用突变型或野生型GAS57抗原免疫哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴 子或人来产生多克隆抗体。如果需要，可将GAS57抗原偶联于载体蛋白，如牛血清白蛋白、 甲状腺球蛋白或匙孔贼血兰蛋白。根据宿主种类，可采用不同的佐剂来增强免疫应答。这 类佐剂包括但不限于弗氏佐剂、无机胶体(如氢氧化铝)和表面活性剂(如溶血卵磷脂、 普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔贼血兰蛋白和二硝基苯酚)。人用佐剂中，特 别采用BCG(卡介苗)和短棒杆菌。可采用通过连续培养细胞系产生抗体分子的任何技术来制备能特异性结合野生 型或突变型GAS57抗原的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交 瘤技术和 EBV 杂交瘤技术(Kohler 等.，Nature. 256，495-97，1985 ；Kozbor 等.，J Immunol Methods. 81，31-42，1985 ;Cote 等·，Proc Natl Acad Sci.USA.80,2026-30,1983 ；Cole 等·，Mol CellBiol. 62，109-20，1984)。此外，可采用为产生“嵌合抗体”而开发的技术，该技术将小鼠抗体基因剪接于 人抗体基因获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等.，Proc Natl Acad Sci. USA. 81，6851-55，1984 ；Neuberger 等.，Nature. 312，604-08，1984 ；Takeda 等.， Nature. 314,452-54,1985)。也可“人源化”单克隆抗体和其它抗体以防止病人对所用治疗 抗体产生免疫反应。这类抗体的序列与直接用于治疗的人抗体应充分相似或可能需要改变 几个关键残基。可通过定点诱变单个残基或移植整个互补决定区，用人抗体序列取代与鼠 抗体序列中不同的残基以最大程度减少啮齿类抗体与人序列之间的序列差异。或者，可用以下所述重组方法产生人源化抗体。如美国专利5，565，332所述，特异 性结合特定抗原的抗体可包含部分或完全人源化的抗原结合位点。可如Simmons等.，PLoS Medicine 4 (5)，928-36，2007所述体外制备人单克隆抗体。或者，可采取所述的产生单链抗体的技术，用本领域已知方法来产生特异性结合特定抗原的单链抗体。可从免疫球蛋白随机组合库的链改组来产生具有相关特异性但独特 性组成不同的抗体(Burton 等·，Proc Natl AcadSci. USA. 88，11120-23，1991)。也可用DNA扩增方法，如PCR，用杂交瘤cDNA作模板构建单链抗体(Thirion 等.，Eur J Cancer Prev. 5，507-11，1996)。单链抗体可以是单-或双-特异性，可以是 二价或四价抗体。构建四价双特异性单链抗体可参见，例如Coloma and Morrison. , Nat Biotechnol. 15，159-63，1997中所述。构建二价双特异性单链抗体可参见Mallender和 Voss.，J Biol Chem. 269，199-206，1994 中所述。可用手工或自动化核苷酸合成构建编码单链抗体的核苷酸序列，如下所述，用标 准重组DNA方法将其克隆入表达构建物中，再引入细胞而表达该编码序列。或者，可采 用丝状噬菌体技术直接产生单链抗体(Verhaar等.，Int J Cancer. 61，497-501，1995 ； Nicholls 等·，J ImmunolMeth. 165，81-91，1993)。也可通过体内诱导淋巴细胞群产生，或通过筛选文献所述的免疫球蛋白库或一些 高特异性结合物质(Orlandi 等.，Proc Natl AcadSci. USA. 86，3833-37，1989 ；Winter 等.， Nature 349，293-99，1991)来制备能特异性结合GAS57抗原的抗体。可按WO 93/03151所述构建嵌合抗体。也可制备免疫球蛋白衍生的多价多特异性 结合蛋白，如WO 94/13804所述的“二抗体”。可用本领域熟知方法纯化抗体。例如，可通过结合有相关抗原的层析柱来亲和纯 化抗体。然后可用高盐浓度缓冲液洗脱结合的抗体。药物组合物本发明也提供用作药物的组合物(如免疫原性组合物或疫苗)。可用本发明的组 合物预防和/或治疗酿脓链球菌感染所引起的疾病，该组合物包含至少一种活性成分，可 以是多肽、核酸分子或抗体。所述疾病，例如可以是菌血症、脑膜炎、产褥期猩红热、猩红热、 丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克综合征。本发明的药物组合物可用于预防或治疗，但通常用于预防。因此，本发明包括治疗 或预防性治疗酿脓链球菌感染的方法。动物优选哺乳动物，最优选人。该方法包括给予动 物治疗或预防量的本发明免疫原性组合物。本发明也提供本发明的免疫原性组合物以供治 疗或预防性治疗动物的酿脓链球菌感染。包含突变型GAS57抗原或编码突变型GAS57抗原核酸分子的组合物优选为免疫原 性组合物，更优选为疫苗组合物。这种组合物的PH宜在6-8之间，优选约7。可用缓冲剂维 持此PH。该组合物可以无菌和/或无热原。该组合物可与人体组织(如血液)等渗。本发明的某些组合物包含本文所述的一种或多种突变型GAS57抗原。本发明的其 它组合物包含编码突变型GAS57抗原的一种或多种核酸分子及任选的可包含在此组合物 中的其它抗原(见下文)。参见例如 Robinson 禾口 Torres (1997) Seminars in Immunology 9 271-283 ；Donnelly φ . , (1997) AnnRev Immunol 15 617-648 ；Scott-Taylor & Dalgleish(2000)Expert OpinInvestig Drugs 9 471~80 ；Apostolopoulos & plebanski(2000)Curr Opin MolTher 2 ；441-47 ；Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1 116-20 ；Dubensky φ . ， (2000)Mol Med 6 723-32 ；Robinson & Pertmer(2000)Adv Virus Res 55 :1-74 ;Donnelly 等·，(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt2) :S190_193 ； Davis (1999)Mt Sinai J Med 66:84-90。所述核酸分子通常是DNA分子，如质粒形式。
本发明的其它组合物包含至少一种特异性结合上述野生型GAS57抗原的抗体，或 编码这种抗体的核酸分子。在某些实施方式中，本发明的组合物可包含一种类型以上的活性剂(如多肽抗原 和核酸分子；多肽抗原和抗体；核酸分子和抗体；多肽抗原、核酸分子和抗体)。在某些实施方式中，本发明的组合物可包含一种或多种其它活性剂。这种活性剂 包括但不限于(a)本发明的另一种突变型GAS57抗原，(b)用于儿童疫苗的多肽抗原，(c) 用于老年人或免疫力低下个体的疫苗的多肽抗原，(d)编码(a)-(c)的核酸分子和特异性 结合(a)-(c)的抗体。其它抗原本发明的组合物可与用于本发明治疗或预防方法的一种或多种抗原一起给予。优 选的抗原包括以下所列的那些。此外，可用本发明的组合物治疗或预防以下所列任何一种 病原体引起的感染。除与以下所述抗原联用外，本发明组合物也可与本文所述佐剂联用。可与本发明联用的抗原包括但不限于一种或多种以下抗原，或衍生自一种或多种 以下病原体的抗原A.细菌抗原适合用于本发明的细菌抗原包括可从细菌分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多 糖及外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解液和灭活的细菌制剂。可重组表达产生细 菌抗原。细菌抗原优选包含在细菌生命周期至少某阶段暴露在细菌表面的表位。细菌抗原 优选多种血清型之间的保守性抗原。细菌抗原包括衍生自以下的一种或多种细菌及以下鉴 定的特异性示范抗原中的抗原。奈瑟脑膜炎球菌(N.meningitides)脑膜炎球菌抗原可包括自奈瑟氏脑膜炎球 菌血清群如A、C、W135、Y和/或B纯化的或衍生的蛋白质(如参考文献1-7所鉴定的那 些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(参考文献8、9、10、11)。可从粘附蛋白、 自身转运蛋白(autotransporter)、毒素、Fe获取蛋白和膜缔合蛋白(优选外膜整合蛋白) 中选择脑膜炎球菌的蛋白抗原。肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌 的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。可选用血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的糖抗原。可选用 WO 98/18931、WO 98/18930、美国专利号6，800，744,WO 97/43303和WO 97/37026所鉴定蛋白质的蛋白抗原。 可从聚组氨酸Triad家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX 截短物、CbpX-LytX截短嵌合蛋白、肺炎球菌溶酶(Ply)、PspA, PsaA, Spl28、SplOl、Spl30、 Spl25或Spl33蛋白选择肺炎链球菌蛋白。酿脓链球菌(A群链球菌)A群链球菌抗原可包括WO 02/34771或W02005/032582 鉴定的蛋白质(包括GAS40)、融合的GAS M蛋白片段(包括TO 02/094851和Dale， Vaccine (1999) 17 ； 193-2000 及 Dale Vaccinel4(10) :944_948 中描述的那些)、纤连蛋白 结合蛋白(Sfbl)、链球菌亚铁血红素缔合蛋白(Shp)和链球菌溶血素S(SagA)。其它的A 群链球菌抗原包括但不限于:GAS25(Spy0167 ；gi 13621460) GAS39 (Spy0266 ；gi 13621542)， GAS40(Spy0269 ；gi13621545)，GAS42(Spy0287 ；gil3621559)，GAS45(M5005_Spy0249 ； gi71910063), GAS58 (Spy0430 ；gi 13621663)，GAS84 (SPyl274 ； 13622398)，GAS95 (SPyl733 ；13622787) , GAS117(Spy0448 ；gil3621679) , GAS130 (Spy0591 ； gi13621794)， GAS137(Spy0652 ；gil3621842)， GAS159 (Spyll05 ；gil3622244)， GAS193 (Spy2025 ； gi3623029)， GAS202 (Spy 1309 ；gi13622431)， GAS217 (Spy0925, gi1362208)， GAS236 (Spyll26 ；gil3622264)， GAS253 (Spyl524 ；gil3622611)， GAS277 (Spyl939 ； gi13622962)， GAS294 (Spyl 173 ；gi13622306)， GAS309 (SpyO 124 ；gi13621426)， GAS366(Spyl525 ；gil3622612) ， GAS372 (Spyl625 ；gil3622698)， GAS384(Spy 1874 ； gil3622908) , GAS389 (Spyl981 ；gi13622996)， GAS504 (Spyl751 ；gi13622806)， GAS509(Spyl618 ；gil3622692) ， GAS290(SPy1959 ；gil3622978) ， GAS511(Spyl743 ； gi 13622798)， GAS527 (Spy 1204 ；gi3622332)， GAS529 (Spy 1280 ；gi3622403)， and GAS533 (Spyl877 ；gil3622912) ， GAS68 (Spy0163 ；gil3621456)， GAS84 (Spy 1274 ； gil3622398), GAS88 (Spyl361 ； gi13622470)， GAS89 (Spyl390 ；gi13622493)， GAS98 (Spy 1882 ；gi13622916) ， GAS99(Spy 1979 ；gi13622993) ， GAS102(Spy2016, gi13623025)， GAS146(Spy0763 ；gi13621942)， GAS195 (Spy2043 ；gi13623043)， GAS561(Spyll34 ；gil3622269), GAS179 (Spyl718, gil3622773)和 GAS681(spyl152 ； gil362228)。粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhal is)粘膜炎莫拉菌抗原包括W002/18595和 WO 99/58562鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)百日咳菌抗原包括百日咳全毒素 (PT)和丝状血凝素(FHA)，任选也与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3 联用。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)金黄色葡萄球菌抗原包括任选与无 毒重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A偶联的5型和8型金黄色葡萄 球菌荚膜多糖，例如StaphVAX ，或衍生自表面蛋白质的抗原，侵染素(杀白细胞素、激酶、 透明质酸酶)，抑制吞噬细胞吞噬作用的表面因子(荚膜，A蛋白)，类胡萝卜素，过氧化氢 酶产物，A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核细胞膜的膜破坏性毒素(任选脱毒的) (溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)表皮葡萄球菌抗原包括粘质结合抗 原(SAA)。破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)破伤风菌抗原包括破伤风类毒素 (TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白质。白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)(白喉)白喉抗原包括白喉毒 素，优选脱毒的，如CRM197。此外考虑将能调节、抑制ADP核糖基化或与之结合的抗原与本 发明组合物联用/共同给药/偶联，所述白喉类毒素可用作运载体蛋白。流感嗜血杆菌B (Haemophilus influenzaeB) (Hib) =Hib 抗原包括 Hib 糖抗原。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)铜绿假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz 蛋白、铜绿假单胞菌LPS，更具体说是分离自PAOl (05血清型)的LPS和/或外膜蛋白，包括 外膜蛋白 F (OprF) (Infect Immun. 2001，May ；69 (5) :3510_15)。嗜肺军团病杆菌( pneumophila)可以是衍生自嗜肺军团杆菌病杆菌 的细菌抗原。
无乳链球菌(Sti^ptococcus agalactiae) (B群链球菌)B群链球菌抗原包括WO 02/3477UW0 03/093306,WO 04/041157 或 WO 2005/002619 鉴定的蛋白或糖抗原(包括蛋 白 GBS80、GBS104、GBS276 和 GBS322 以及包括血清型 la、lb、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII 和VIII产生的糖抗原)。淋病奈瑟菌(Neiserria gonorrhoeae)淋病奈瑟菌抗原包括Por (或膜通道蛋 白)蛋白，如PorB(参见Zhu等.，Vaccine (2004) 22 :660_69)、转移结合蛋白如TbpA和 TbpB (参见 Price 等·，Infection and immunity (2004) 71 (1) :277_283)、混浊蛋白(如 Opa)、还原可修饰蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(参见Plante等.，J Infectious Disease (2000) 182 :848-55)，也参见例如 WO 99/24578、WO 99/36544、WO 99/57280、WO 02/0792430。砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)砂眼衣原体抗原包括血清型A、B、Ba和 C产生的抗原(砂眼致病因子，导致失明)、血清型Li、L2和L3产生的抗原(与性病性淋 巴肉芽肿(Lymphogranuloma venereum)有关)和血清型D-K产生的抗原。砂眼衣原体 抗原还可包括 WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811 或 WO 05/002619 鉴定的抗原， 包括 P印A(CT045)、LcrE (CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK (CT396)、CT398、OmpH-样(CT242)、 L7/L 12(CT316)、0mcA(CT444)、AtosA (CT467)、CT547、Eno (CT587)、HrtA(CT823)禾口 MurG (CT761)。苍白密螺旋体(Tr印onema pallidum)(梅毒)苍白密螺旋体抗原包括TmpA抗原。杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(导致软性下疳)软性下疳抗原包括外 膜蛋白(DsrA)。獎肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)抗原 包括三糖重复序列或美国专利号6，756，361提供的其它肠球菌衍生抗原。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)幽门螺杆菌抗原包括 Cag、Vac、Nap、HopX, HopY和/或脲酶抗原。腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)抗原包括160kDa腐生葡萄 球菌血凝素。小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括 LPS (InfectImmun. 2002，Augst ；70 (8) 4414)。大肠杆菌(E. coli)大肠杆菌抗原可以是肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大 肠杆菌(EAggEC)、弥散性附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠溶血性 大肠杆菌(EHEC)产生的抗原。炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)炭疽杆菌抗原任选是脱毒的，可选自 A-组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF) )，二者具有称为保护性抗原(PA)的共同B-组分。鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)鼠疫抗原包括Fl荚膜抗原(Infect Immun.，2003 年 1 月；71(1) :374_383)，LPS (Infect Immun. 1999 年 10 月；67(10) 5395)， 鼠疫耶尔森菌 V 抗原(Infect Immun. 1997 年 11 月；65(11) =4476-4482) 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)结核菌抗原包括脂蛋白、LPS、BCG 抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任选配制在阳离子脂质载体中(Infect Immun. 2004年10月；72 (10) :6148)，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(ProcNatl Acad Sci USA. 2004 年 8 月 24 日；101 (34) 12652)，禾口 / 或 MPT51 抗原(Infect Immun. 2004 年 7 月；72 (7) 3829)。立克次体(Rickettsia)抗原包括外膜蛋白A 和 / 或 B (OmpB) (BiochimBiophys Acta. 2004 年 11 月 1 日；1702 (2) 145)，LPS 和表面蛋白抗原(SPA) (J Autoimmun. 1989 年 6月；2增刊81)。单核细胞增多症李斯特菌(Listeria monocytogenes)细菌抗原可衍生自单核细 胞增多性利斯特菌。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原包括WO 02/02606鉴定的那些抗原。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)抗原包括蛋白酶抗原、LPS、特别是霍乱弧菌II的 脂多糖、01 Inaba 0_特异性多糖、霍乱弧菌0139、IEM108疫苗的抗原(Infect Immun. 2003 年10月；71 (10) =5498-504)和/或紧密连接毒素(Zot)。伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒热)抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi， 即 vax-TyVi)。博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)(莱姆病)抗原包括脂蛋 白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相关蛋白(Erps)、核心蛋白多 糖结合蛋白(如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13结合的蛋白(一种膜 内在蛋白，Infect Immun. 2001 年 5 月；69 (5) :3323_34)、VLsE 抗原可变异蛋白(J Clin Microbiol. 1999 年 12 月；37 (12) 3997)。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原包括其牙龈卟啉单孢菌外膜 蛋白(OMP)。克雷伯菌(Klebsiella)抗原包括0ΜΡ，包括0ΜΡΑ，或任选与破伤风类毒素偶联的多糖。本发明的其它细菌抗原可以是任何上述的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白抗原。其它 细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、减毒的和/或纯化的任何上 述细菌。本发明的抗原可以衍生自革兰-阴性菌或革兰-阳性菌。本发明的抗原可以衍生 自需氧菌或厌氧菌。此外，可将上述细菌产生的任何一种糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)与其它物质 或抗原，如运载体蛋白(如CRM197)偶联。这种偶联可以是通过还原胺化糖上的羰基部 分而实现与蛋白质上的氨基直接偶联，参见美国专利号5，360，897和Can.，J Biochem Cell Biol. 1984May ；62 (5) :270_5。或者，糖可以经接头，例如琥珀酰胺或Bioconjugate Techniques (生物偶联技术)，1996 和 CRC, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(蛋白质偶联和交联化学)，1993中提供的其它连接键偶联。。B.病毒抗原适合本发明用的病毒抗原包括灭活(或杀伤)病毒、减毒病毒、裂解病毒制剂、纯 化亚单位制剂、从病毒和病毒样颗粒(VLP)分离、纯化或衍生的病毒蛋白质。病毒抗原可以 是在培养细胞或其它基质上增殖病毒产生的抗原。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原 优选包含在其生命周期至少某阶段暴露在病毒表面的表位。病毒抗原优选在多种血清型或 分离物中为保守的抗原。病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒及以下鉴定的特异性抗 原例子的抗原。
正粘病毒(Orthomyxovirus)病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙 型流感(病毒)。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质，包括血凝素(HA)、神经氨 酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(Ml)、膜蛋白(M2)；一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和 PA)。优选的抗原包括HA和NA。流感病毒抗原可以可衍生自流行病爆发间的(年度)流感毒株。或者，流感病毒 抗原可以衍生自可能导致流行病爆发的毒株(即，与目前的流行毒株相比，具有新血凝素 的流感毒株，或者在禽类对象中致病并可能平行转移至人群的流感毒株，或对人致病的流 感毒株)。副粘病毒科病毒病毒抗原可以衍生自副粘病毒科病毒，如肺病毒属(RSV)、副粘 病毒属(PIV)和麻疹病毒属(麻疹)。肺病毒属病毒抗原可以衍生自肺病毒属，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合 胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒产生的病毒抗原。优选的肺病毒是RSV。肺病毒 抗原可选自以下一种或多种蛋白，包括表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)、 基质蛋白Ml和M2、核衣壳蛋白N、P和L及非结构蛋白NSl和NS2。优选的肺病毒抗原包括 F、G*M。参见J Gen Virol. 2004年11月；85 (部分11) :3229。肺病毒属抗原还可配制 成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。副粘病毒属病毒抗原可衍生自副粘病毒属，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎 病毒、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病 毒。副粘病毒抗原可以选自以下一种或多种蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白Fl 和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。优选的副粘病毒属蛋白包括 HN、F1和F2。副粘病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒 可同时包含RSV和PIV的组分。可商品化购得的腮腺炎病毒疫苗包括单价形式或与麻疹和 风疹疫苗联用(MMR)的减毒活腮腺炎病毒。麻疹病毒属病毒抗原可以衍生自麻疹病毒属如麻疹病毒。麻疹病毒属抗原可选 自以下一种或多种蛋白血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、 聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。可商品化购得的麻疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和风疹病 毒组成联合减毒活疫苗(MMR)。微小RNA病毒病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒 (Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。优选衍生自肠病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。肠道病毒病毒抗原衍生自肠病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型 柯萨奇A病毒、B1-6型柯萨奇病毒、1-9型、11-27型和29-34型艾柯病毒(ECHO)，及68-71 型肠病毒。优选的肠病毒是脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原宜选自以下VPl、VP2、VP3和VP4衣 壳蛋白的一种或多种。可商品化购得的脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV) 和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。嗜肝RNA病毒病毒抗原可衍生自可以是嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。可商 品化购得的HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。披膜病毒病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选 衍生自风疹病毒属，如风疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自El、E2、E3、C、NSP-l、NAP0-2、 NSP-3或NSP-4。优选的披膜病毒抗原是E1、E2或E3。可商品化购得的风疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和麻疹疫苗联用的冷适应的活病毒(MMR)。黄病毒属病毒抗原可衍生自黄病毒属，如蜱传脑炎(病毒)(TBE)、登革热(病 毒)(1、2、3或4型)、黄热病(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼洛河脑炎(病毒)、圣露易斯 脑炎(病毒)、俄罗斯春夏型脑炎(病毒)、波瓦桑脑炎病毒。黄病毒属抗原可选自PrM、M、 C、E、NS-l、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和 NS5。优选的黄病毒属抗原是 PrM、M 和 E。可商 品化购得的TBE疫苗包括病毒灭活疫苗。鼠疫病毒病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、经典猪瘟 病毒(CSFV)或边界病病毒(BDV)。嗜肝DNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原 选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可商品化购得的HBV疫苗包括含表面抗 原S蛋白的亚单位疫苗。丙型肝炎病毒病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自El、E2、El/ E2、NS345糖蛋白、NS345-核心多蛋白和/或非结构区肽中的一种或多种(Houghton等.， Hepatology(1991)14 381)。杆状病毒病毒抗原可衍生自杆状病毒，如如莱萨病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒 (VSV)。杆状病毒抗原可选自糖蛋白(G)、核蛋白(NP)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可 商品化购得的狂犬病毒疫苗包含在人二倍体细胞或恒河猴胎肺细胞上培养的杀伤病毒。杯状病毒科病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺瓦克病毒，和诺瓦克样病毒如夏 威夷病毒和雪山病毒。冠状病毒病毒抗原可衍生自冠状病毒，SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气 管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选 自突刺(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和血凝素-脂酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原 优选衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原参见WO 04/92360中的描述。逆转录病毒病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿 瘤病毒抗原可衍生自HTLV-I、HTLV-2和HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-I或HIV-2。逆 转录病毒抗原选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef > vif > vpu 禾口 vpr。HIV 抗原选 自:gag(p24gag 禾口 p55gag)、env (gpl60 禾口 gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白(优选 p55gag 和 gpl40v 缺失)。HIV 抗原可衍生自以下病毒株HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、 HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1U54。呼肠孤病毒病毒抗原可衍生自呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病 毒或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自结构蛋白λ 1、λ 2、λ 3、 μ 1、μ 2、σ 1、ο 2或σ 3或非结构蛋白σ NS、μ NS或σ Is。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生 自轮状病毒。轮状病毒抗原选自^卩1、￥ 2、￥ 3、￥ 4(或切割产物￥ 5和￥ 8)、赂？1、￥卩6、 NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)及 VP7。细小病毒病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原选自 VP-1、VP-2、NS-1和NS-2。优选的细小病毒抗原是衣壳蛋白VP-2。δ-肝炎病毒(HDV)病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ -抗原(参见 例如美国专利号5，378,814)。
戊肝病毒(HEV)病毒抗原可衍生自HEV。庚肝病毒(HGV)病毒抗原可衍生自HGV。人疱疹病毒病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带 状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6 (HHV6)、人疱疹病毒 7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白 (β )和晚期蛋白(Y )。HSV抗原可衍生自HSV-I或HSV-2毒株。HSV抗原选自糖蛋白gb、 gC、gD和gH、融合蛋白(gB)或免疫逃避蛋白(gC、gE或gl)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、 外被膜或包膜蛋白。可商品化购得VZV减毒活疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、 病毒衣壳抗原(VCA)和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMA抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如 gB和gH)和外被膜蛋白。乳多空病毒抗原可衍生自乳多空病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包 括 HPV 血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 和 65。HPV 抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原选自衣壳蛋白(Li)和(L2)或E1-E7或 其融合蛋白。优选将HPV抗原配制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。 多瘤病毒抗原选自VP1、VP2或VP3。《疫苗》(Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物》 (Medical Microbiology)，第四版，(Murray 等编，2002)；《病毒学》(Virology)，第三版， (W. K. Joklik 编，1988)；《基础病毒学》(FundamentalVirology)，第二版，(B. N. Fields 和 D. M. Knipe编，1991)也描述其它抗原、组合物、方法和微生物，本发明的组合物涵盖了这些 抗原。C.真菌抗原可用于本发明的真菌抗原是以下一种或多种真菌产生的抗原。真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括絮状表皮癣菌(Epidermophytonf loccusum)、 头癣小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌、扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)、马小孢子菌(Microsporum equinum)、石膏样小孢子菌、矮小孢子菌 (Microsporum nanum)、同心发癣菌(Trichophytonconcentricum)、马发癣菌、鸡发癣 lif (Trichophyton gal 1 inae)、石膏样发;Jlf 菌(Trichophyton gypseum)、麦格发;Jlf 菌 (Trichophyton megnini)、须发癣菌、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色 "R'MM (Trichophyton rubrum)(Trichophyton schoenleini) > Ht^^S' (Trichophyton tonsurans)、抚状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、抚状发癣菌 album $禾中(var. album)、discoides$禾中(var. discoides)、ochraceum$禾中(var. ochraceum)、jj 色发癣菌(Trichophyton violaceum)禾口 / 或蜜块状发癣菌(Trichophyton faviforme)。。真菌病原体可衍生自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)> 黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、 土 曲 霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi) > 黄麥i 菌(Aspergillus flavatus)(Aspergillus glaucus) >(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带 念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)(Candidaparapsilosis) ^MJ^^-^fM (Candida stellatoidea)、克鲁斯念珠菌、(Cmdidaparakwsei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusiteniae)、假热带念 (Candidapseudotropicalis)、^ M M^M M (Candida guilliermondi)、^■里· 分支抱子菌(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、皮炎 芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉 (Geotrichum clavatum)、夹膜组织胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、月市炎克雷伯杆 菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏月市囊 虫(Pneumocystis carinii)、腐霉菌(Pythiumninsidiosum)、瓶形酵母(Pityrosporum ovale)、酉良酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉第酵母菌(Saccharomyces boulardii)、 粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申 克(氏)孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、 鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、马尼弗(氏)青霉菌(Penicillium marneffei)、鳞斑霉 属(Malassezia spp·)、产色芽生菌属(Fonsecaea spp·)、万吉拉菌属(Wangiella spp.)、 抱子丝菌属(Sporothrix spp·)、担子菌团属(Basidiobolusspp·)、耳霉属(Conidiobolus spp·)、根霉菌属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucorspp)、犁头霉属(Absidia spp)、被孢霉属 (Mortierella spp)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)、瓶霉属(Saksenaea spp)、链格 抱属(Alternaria spp)、弯抱霉属(Curvularia spp)、长螺抱属(Helminthosporium spp)、 德抱菌属(Fusarium spp)、曲霉菌属(Aspergillus spp)、青霉菌属(Penicillium spp)、褐 腐病菌属(Monolinia spp)、丝核菌属(Rhizoctonia spp)、拟青霉属(Paecilomyces spp)、 皮司霉属(Pithomyces spp)禾口分支抱子菌属(Cladosporium spp)。制备真菌抗原的方法是本领域熟知的(参见美国专利号6，333，164)。在一优选 方法中，提取溶解组分，将其与真菌细胞的不可溶组分分开，其中基本上除去或至少部分除 去了细胞壁，该方法的特征在于包括获得活的真菌细胞；获得基本上除去或至少部分除去 细胞壁的真菌细胞；使基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞破裂；获得不可溶组 分；和提取溶解的组分并将其与不可溶组分分开。D. STD 抗原本发明的组合物可包含衍生自性传播疾病(STD)的一种或多种抗原。这种抗原可 供预防或治疗STD，如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如丙肝)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软 下疳(参见WO 00/152550)。抗原可以衍生自一种或多种病毒或细菌STD。用于于本发明 的病毒STD抗原可衍生自，例如，HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV) 和肝炎(HCV)病毒。用于于本发明的细菌STD抗原可衍生自，例如，淋病奈瑟球菌、肺炎衣 原体(Chlamydia pneumoniae)、砂沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜克雷嗜血杆菌、大肠杆菌 和无乳链球菌。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。E.呼吸道抗原本发明的组合物可包含一种或多种衍生自引起呼吸道疾病的病原体的抗原。例 如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、 麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起 呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特菌、结核分支杆菌、肺炎支 原体、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例 子。
F.儿科疫苗抗原本发明的组合物可包含适合用于儿科对象的一种或多种抗原。儿科对象一般年龄 小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿科抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间 中多次给予。儿科抗原可衍生自靶向儿科群体的病毒和/或儿科群体易受感染的病毒。儿 科病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒的抗原正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘 病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、 冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。儿科细菌抗原衍生自以下 一种或多种细菌的抗原肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎 莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、 流感嗜血杆菌B (Hib)、铜绿假单胞菌、无乳链球菌(B群链球菌)和大肠杆菌。上文描述了 这些病原体产生的特定抗原的例子。G.适合用于老年人和免疫力低下个体的抗原本发明的组合物可包含适合用于老年人和免疫力低下个体的一种或多种抗原。所 述个体可能需要更经常接种疫苗，用较高剂量或含佐剂的制剂以增强对靶抗原的免疫反 应。用于老年人和免疫力低下个体的抗原包括衍生自以下一种或多种病原体的抗原脑膜 炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄 色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌 B(Hib)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团病杆菌、无乳链球菌(B群链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆 菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻 疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病 毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例 子。H.适合用于青少年疫苗的抗原本发明的组合物可包含合用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要以 前给予的儿科抗原的加强免疫。上文描述了适合用于青少年的儿科抗原。此外，青少年可 能需要接受衍生自STD病原体的抗原以在开始性活动前确保具有保护性或治疗性免疫力。 上文描述了适合用于青少年的STD抗原。I.抗原制剂本发明的其它方面，提供了吸附抗原微粒的生产方法。该方法包括(a)将含有 以下成分的混合物分散来提供乳液(i)水，(ii)洗涤剂，(iii)有机溶剂和(iv)生物可 降解的聚合物，所述聚合物选自聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚 酐和聚氰基丙烯酸酯。与有机溶剂相比，混合物中存在的所述聚合物浓度通常约-约 30%，而根据洗涤剂-聚合物的重量比，混合物中存在的洗涤剂通常约为0.00001 1-约 0.1 1(更常见是约 0. 0001 1-约 0. 1 1，约 0.001 1-约 0. 1 1，或约 0.005 1-约 0. 1 1) ； (b)除去乳液中的有机溶剂；和(C)将抗原吸附到微粒表面。在一些实施方式中， 与有机溶剂相比，所述生物可降解聚合物的存在浓度是约3% -约10%。可以用可灭菌、无毒和生物可降解的材料制备本文所用的微粒。这些材料包括但 不限于聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。 本发明所用的微粒优选源自聚(α-羟酸)，特别是聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)或D， L-丙交酯和己内酯的共聚物。微粒可源自分子量不同的任何聚合起始材料，以共聚物，例 如PLG为例，各种丙交酯乙交酯的比例(其选择在很大程度上是个选择问题)部分取决 于共同给予的大分子。下文将更详细地讨论这些参数。其它抗原还包括外膜囊泡(OMV)制品。其它配制方法和抗原(特别是肿瘤抗原)参见美国专利序列号09/581，772。J.抗原参考文献以下参考文献包含可与本发明组合物联合使用的抗原1国际专利申请W099/245782国际专利申请W099/36544.3国际专利申请W099/57280.4国际专利申请W000/22430.5Tettelin 等(2000) Science 287:1809-1815.6国际专利申请W096/29412.7Pizza 等(2000) Science 287:1816-1820.8PCT WO 01/52885.9Bjune 等(1991) Lancet 338(8775).IOFuskasawa 等(1999) Vaccine 17:2951-2958.IlRosenqist 等(1998)Dev. Biol. Strand 92 :323_333·12Constantino 等(1992) Vaccine 10:691-698.13Constantino 等(1999) Vaccine 17:1251-1263.14ffatson(2000)Pediatr Infect Dis J 19:331-332.15Rubin(20000)Pediatr Clin North Am 47 :269_285，v.16Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65:187—207.172001年7月3日递交的国际专利申请，要求GB-0016363. 4 ；W002/02606 ； PCTIB/01/00166 的优先权18Kalman 等(1999)Nature Genetics 21 :385_389·19Read 等(2000)Nucleic Acids Res 28 :1397-406.20Shirai 等(2000) J. Infect. Dis 181(增刊 3) :S524_S527.21 国际专利申请 W099/27105.22 国际专利申请 W000/27994.23 国际专利申请 W000/37494.24 国际专利申请 W099/28475.25Bell (2000)Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.26Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.27Gerlich 等(1990) Vaccine 8 增刊:S63_68&79-80.28Hsu 等(1999)Clin Liver Dis 3:901-915.29Gastofsson 等(1996) N. Engl. J. Med. 334- :349_355.30Rappuoli 等(1991)TIBTECH 9 :232_238.
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Microbiol. 47 :663_567.52 欧洲专利 0477508.53 美国专利号 5，306，492.54 国际专利申请 W098/42721.55Con jugate Vaccines (偶联物疫苗)(Cruse 等编)ISBN 3805549326，特卷 10 48-114.56Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques (生物偶联技术)ISBN 012323368 和 012342335X.57欧洲专利申请0372501.58欧洲专利申请0378881.59欧洲专利申请0427347.60 国际专利申请 W093/17712.61 国际专利申请 W098/58668.62欧洲专利申请0471177.63 国际专利申请 W000/56360.64 国际专利申请 W000/67161.以上引用的所有专利、专利申请和杂志论文的内容通过引用全文纳入本文。当采用糖或碳水化合物抗原时，优选将其与载体蛋白偶联以增强免疫原性。 参见Ramsay 等(2001)Lancet 357(9251) 195-196 ；Lindberg(1999)Vaccine 17 增干Ij 2 :S28-36 ；Buttery 禾口 Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond34 163-168 ；Ahmad 和 Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Aml3 113-133, vii ；Goldblatt(1998) J. Med. Microbiol. 47 :563_567 ；欧洲专利 0477508 ；美国专利 5，306，492 ；W098/42721 ； Conjugate Vaccines (偶联物疫苗)(Cruse 等编)ISBN 3805549326，具体是 10 :48_114 ； Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)ISBN 0123423368 或 012342335X。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。特别优选 CRM197白喉类毒素。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽 (EP-A-0378881 和 EP-A 0427347)、热激蛋白(W0 93/17712 和 W094/03208)、百日咳蛋 白(W0 98/58668和EP A 0471177)、流感嗜血杆菌蛋白D(W0 00/56360)、细胞因子(W0 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素A或B(W0 00/61761)、铁摄取蛋白(W0 01/72337)等等。当混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，优选MenA糖MenC糖的比例 (w/w)大于1(如2 1、3 1、4 1、5 UlO 1或更高)。可将不同糖与相同或不同 类型的载体蛋白偶联。需要时可采用任何适合的偶联反应，和任何适合的接头。如需要可脱毒有毒性的蛋白抗原，如用化学和/或遗传方法脱毒百日咳毒素。药学上可接受的运载体本发明的组合物除了上述组分外，通常包含一种或多种“药学上可接受的运载 体”。包含的这些运载体本身不会诱导产生对接受此组合物个体有害的抗体，合适的运载体 通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共 聚物和脂质聚集物(如油滴或脂质体)。这类运载体是本领域技术人员熟知的。所述组合 物也可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助剂，如湿润或乳化剂、PH缓冲剂 等。可从 Gennaro (2000) “Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿 药物科学与实践)”第20版ISBN =0683306472 一书中获得关于药学上可接受组分的全面论 述。免疫调节剂佐剂本发明的疫苗可与其它免疫调节剂联合给予。具体说，该组合物通常包含佐剂。本 发明可用的佐剂包括但不限于以下的一种或多种A.含矿物质的组分适合用作本发明佐剂的含矿物质组分包括矿物盐，如铝盐和钙盐。本发明包括矿 物盐，如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐，正磷酸盐)、硫酸盐等(例 如参见Powell和Newman主编的“疫苗设计(VaccineDesign. ·.) ”，第8禾口 9章，ISBN 030644867X普莱纳姆出版社(Plenum.))或不同矿物质化合物的混合物(如磷酸盐与氢 氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶 体、无定形等)，这些盐优选(具有)吸附性。也可将含矿物质的组合物配制成金属盐颗粒 (W000/23105)。本发明疫苗中可包含铝盐，Al3+的剂量在0. 2-1. Omg/剂之间。在一实施方式中，本发明所用的铝盐佐剂是明矾(硫酸钾铝AlK(SO4)2),或者，例 如通过在磷酸缓冲液中混合抗原与铝盐，再用碱如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀原位形成的明矾衍生物本发明疫苗制剂可用的另一种铝佐剂是氢氧化铝(Al (OH)3)或结晶碱式氢氧化铝 (A100H)，这是一种极佳吸附剂，表面积约500m2/g。或者，可用含有磷酸基团替代了氢氧化 铝佐剂中的一些或全部羟基的磷酸铝佐剂(AlPO4)或羟基磷酸铝。本文提供的优选磷酸铝 佐剂是无定形的并可溶于酸性、碱性和中性介质。在另一实施方式中，本发明的佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝。在一更具体的实施方 式中，此佐剂的磷酸铝含量高于氢氧化铝，例如以重量计，磷酸铝与氢氧化铝之比为2 1、 3 ；1,4 1,5 ；1,6 1、7 1、8 1、9 1或高于9 1。更具体说，该疫苗所含的铝盐 为每疫苗剂量0. 4-1. Omg、或每疫苗剂量0. 4-0. 8mg、或每疫苗剂量0. 5-0. 7mg或每疫苗剂 量约0. 6mg。—般通过优化分子间的静电吸引使抗原在所需pH时携带与佐剂相反的电荷，从 而能选择优选的铝佐剂或多种铝佐剂，例如磷酸铝与氢氧化铝之比。例如，PH 7. 4时磷酸 铝佐剂(iep = 4)吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶标，则应选择氢氧化铝佐 剂(iep 11. 4)。或者，用磷酸预处理氢氧化铝可降低其等电点，使其成为碱性更高的抗原的 优选佐剂。B.油-乳剂适合用作本发明佐剂的油-乳剂包括角鲨烯-水乳剂，如MF59 (5%角鲨烯、0. 5% 吐温 80和0. 5%司盘85，用微流化器制成亚微米颗粒)。参见W090/14837。也参见Podda， Vaccine (2001) 19 2673-2680 ；Frey 等，Vaccine (2003) 21 :4234_4237。MF59 已用作 FLUAD 流感病毒三价亚单位疫苗中的佐剂。本发明组合物中所用的特别优选佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚 微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5% w/v角 鲨烯、0. 25-1. 0 % w/v吐温80 (聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0. 25-1. 0%司 盘85 (失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺 基-L-丙氨酸-2-(1 ‘ -2' - 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE) 的亚微米水包油乳剂，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(国际公布号W090/14837 ；美 国专利号6，299，884和6，451，325 ；和Ott等，"MF59-人用疫苗的一种安全而强效佐剂的 ^CTf^Wiii"(MF59__Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines)()，刊于《疫苗设计亚单位和佐剂方法》(Vaccine Design =The Subunit and Adjuvant Approach) (Powell, Μ. F.禾口 Newman，Μ· J.编)，普莱纳姆出版社(Plenum Press), 纽约，1995，第 277-296 页)。MF59 含有 4-5% w/v 角鲨烯(如 4. 3% )、0· 25-0. 5% w/v 吐 温80 和0. 5%司盘85 ，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化 仪(微射流公司(Microfluidics)，牛顿市，马萨诸塞州)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE 的含量可以是约0-500 μ g/剂，更优选0-250 μ g/剂，最优选0-100 μ g/剂。本文所用的术 语“MF59-0”指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语“MF59-MTP”表示含有MTP-PE 的制剂。例如，“MF59-100”含有IOOyg MTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微 米水包油乳剂，其含有4. 3% w/v角鲨烯、0. 25% w/v吐温80 和0. 75% w/v司盘85 和任 选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10%角鲨烯、0. 4% 吐温80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400 μ g MTP-PE/剂国际公布号W090/14837 ；美国专利号6，299，884和美国专利6，451，325详细描述 了用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂，例如胞壁酰肽。弗氏完全(CFA)和不完全佐剂(IFA)也可用作本发明的佐剂。C.皂苷制剂皂苷制剂也适用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至 花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化购自丽花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata) (婚纱花(brides veil))禾口月巴阜草(Saponariaofficianalis)(阜根(soap root))。阜昔 佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISC0M。已利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。 已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A, QH-B和QH-C。 皂苷优选QS21。美国专利号5，057，540披露了 QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇， 例如胆固醇(参见W096/33739)。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM — 般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM 优选含有 QuilA、QHA 和 QHC 中的一种或多种。EP0109942、W096/11711 和 W096/33739 进一 步描述了 ISC0M。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见W000/07621。开发皂苷佐剂的综述可参见Barr等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32 :247-271。 也可参见 Sjolander 等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32 :321_338。D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或 多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常无致病性、不能复制，通常不 含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP 中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白质流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如 核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病 毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV, RNA-噬菌体、Q^-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬 菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (例如逆转录转座子Ty蛋白pi)。W003/024480、 W003/024481 ；Niikura 等，(2002)，ViroloRy293 273~280 ；Lenz 等，(2001)，J. Immunol 166 (9) 5246-5355 ；Pinto 等，(2003)，J. Infect. Dis.迴:327_338 ；和 Gerber 等，(2001)， J.Virol. 75(10) :4752_4760 进一步讨论了 VLP。例如，Gluck 等，(2002)，Vaccine 20 B10-B16 进一步讨论了病毒体。鼻内三价 INFLEXAL 产品(Mischler 和 Metcalfe，(2002) Vaccine 20，增刊5 :B17_B23)和INFLUVAC PLUS 产品中使用免疫增强型重建流感病毒体 (IRIV)作为亚单位抗原递送系统。E.细菌和微生物衍生物适合用于本发明的佐剂包括细菌和微生物衍生物，如(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰基脂质A (MPL)和3-0-脱酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是含有 4、5或6条酰化链的3脱-0-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP 0689454公开了 3脱-0-酰 化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0. 22 μ m 膜无菌过滤(参见EP 0 689454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例 如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 :2273_2278。(2)脂质A衍生物 脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，例如0M-174。 0M-174 描述于，例如Meraldi 等(2003) Vaccine 21 :2485_2491 ；和 Pajak等(2003) Vaccine 21 :836-842。(3)免疫刺激寡核苷酸适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键 与随后的鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的 细菌双链RNA或寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单 链。可任选用类似物，例如2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代可参 见 Kandimalla 等，(2003)，Nucleic Acids Research. 31(9) 2393-2400 ；W002/26757 禾口 W099/62923。 Krieg， (2003) , Nat. Med. 9 (7) 831-835 ；McCluskie 等，(2002)， FEMS Immunology and Medical Microbiology. 32 179-185 ；W098/40100 ；美国专利号 6，207，646 ；美国专利号6，239，116和美国专利号6，429，199进一步讨论了 CpG寡核苷酸作 为佐剂的作用。CpG 序列可涉及 TLR9，例如基序 GTCGTT 或 TTCGTT。参见 Kandimalla 等(2003) Biochemical Society Transactions. 31 (部分 3) :654_658。CpG 序列，例如 CpG-A ODN 可 特异性诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-BODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等 (2003)J. Immunol. 170(8) :4061_4068 ；Krieg (2002)TRENDS in Immunol. 23(2) :64_65 ；禾口 WO 01/95935 讨论了 CpG-A 和 CpG-B 0DN。CpG 优选 CpG-A 0DN。优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序 列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如Kandimalla等(2003) BBRC 306 948-953 ；Kandimalla ^ (2003)Biochemical Society Transactions. 31
3) 664-658 ；Bhagat 等(2003) BBRC 300 :853_861 ；和 W003/035836。(4) ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自 大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(弧菌)(“CT”)或百日咳(杆菌) (“PT”)。W095/17211描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，W098/42375 描述了其作为胃肠外佐剂的应用。佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和 LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用 见以下参考文献Beignon 等，Infection and Immunity (2002) 70 (6) 3012-3019 ；Pizza 等，Vaccine (2001) 19 :2534-2541 ;Pizza 等，Int. J. Med. Microbiol (2000) 290 (4-5) 455-461 ；Scharton-Kersten φ, Infection and Immunity(2000)68(9) 5306-5313 ；Ryan等，Infection and Immunity (1999) 67 (12) 6270-6280 ；Partidos 等，Immunol. Lett. (1999)67(3) 209-216 ；Peppoloni 等，Vaccines (2003) 2 (2) :285_293 和 Pine 等，(2002) J. Control Release (2002) 85 (1-3) :263_270。氨基酸取代的数字基准优选以 Domenighini 等，Mol. Microbiol (1995)15(6) :1165_1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列 对比为基础。F.生物粘附剂和 粘膜粘附剂。生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的 佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001) J. Cont. Release. 70 267-276)，或者粘膜粘合剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维 素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。参见W099/27960。G.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟 酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成 微粒(即，直径约IOOnm到150 μ m,优选约200nm到约30 μ m,最优选约500nm到约10 μ m 的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用 阳离子洗涤剂，如CTAB)。H.脂质体适合用作本发明佐剂的脂质体制剂例子描述于美国专利6，090，406;美国专利 5，916，588 和 EP O 626 169。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(参见，例如W099/52549)。 这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(W001/21207)以及联 用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂 (W001/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯_9_硬脂 酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯_8_硬脂酰基醚、聚氧乙烯_4_月桂基醚、聚氧乙烯_35_月桂 基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷腈(PCPP)PCPP 制剂描述于，例如 Andrianov 等，"Preparation of hydrogelmicrospheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions ( ffl过 疑聚聚M月青水备 水凝胶微球)”，Biomaterials (1998) 19(1-3) :109_115 和 Payne 等，‘‘Protein Release from Polyphosphazene Matrices (胃 M 月青■ M 的胃白 M # 方文)”，Adv. Drug. Delivery Review (1998)31(3) :185_196。K.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基_胞壁酰-L-苏氨酰 基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl) -L-丙氨酰基-D-异 谷氨酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨 酸-2- (1 ’ -2' - 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。L.咪唑并喹啉化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特(Imiquimod)及 其类似物，其描述参见 Stanley，Clin Exp Dermatol (2002) 27 (7) 571-577 Jones, Curr Opin Investig Drugs (2003) 4 (2) :214_218和美国专利 4，689，338、5，389，640、5，268，376、 4，929，624,5，266，575,5，352，784,5，494，916,5，482，936,5，346，905,5，395，937, 5，238，944 和 5，525，612。M.缩氨基硫脲化合物 所有适合用作本发明佐剂的缩氨基硫脲化合物的例子以及配制、制备和筛选这种 化合物的方法包括WO 04/60308所述的。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞 因子，例如TNF-中特别有效。N.色胺酮化合物所有适合用作本发明佐剂的色胺酮化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合 物的方法包括WO 04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因 子，例如TNF-α中特别有效。本发明还包括以上鉴定和一种或多种佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于 本发明(1)皂苷和水包油乳剂(W0"/ll241)；(2)皂苷(例如QS21) +无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见W094/00153)；(3)皂苷(例如QS21) +无毒的LPS衍生物(例如3dMPL) +胆固醇；(4)皂苷(例如 QS21) +3dMPL+IL_12 (任选 + 固醇)(W098/57659)；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见欧洲专利申请0 835 318 ；0 735 898 和 0 761 231)；(6)含有10%角鲨烯、0. 4%吐温80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr_MDP的 SAF，微流化成亚微米乳剂或旋振(vortex)产生粒度较大的乳剂；(7) RIBI 佐剂系统(RAS)，(Ribi 免疫化学公司(Ribi Immunochem))，其含有 2 % 角鲨烯、0. 2%吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和 细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS (Detox )组成的细菌细胞壁组分；和(8) 一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)；(9) 一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 寡核苷酸序列)。0.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-Y )、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤 坏死因子。 可注射的流感疫苗采用的优选佐剂是铝盐和MF59。粘膜递送疫苗采用的优选佐剂 是细菌毒素和生物粘附剂。以上引用的所有专利、专利申请和杂志论文的内容通过引用全文纳入本文。治疗方法本发明提供的上述组合物可用于治疗。本发明提供的上述组合物可诱导或增强对 酿脓链球菌的免疫反应。本发明提供用上述组合物诱导或增强对酿脓链球菌的免疫反应的方法。免疫反应优选为保护性，包括抗体和/或细胞介导免疫力(包括全身和粘膜免疫 力)。免疫反应包括增强反应。青少年和儿童，包括学步儿童和婴儿可接受预防用疫苗，而治疗疫苗通常给予青 少年和成人。儿童疫苗也可给予成人，例如评估其安全性、剂量、免疫原性等。可按照本发明预防或治疗酿脓 链球菌引起的疾病，包括但不限于咽炎(如链球 菌扁桃体炎)、猩红热、小脓疱疹、丹毒、蜂窝组织炎、败血症、中毒性休克综合征、坏死性筋 膜炎和后遗症，如风湿热和急性肾小球肾炎。该组合物对其它链球菌，如GBS也有效。检测免疫反应效果的试验一种评估治疗性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后监测GSA感染。一种评 估预防性治疗效果的方法涉及在给予本发明组合物后监测对该组合物中突变型GAS57抗 原的免疫反应。另一种评估本发明免疫原性组合物中组分蛋白的免疫原性的方法是用重组的突 变型GAS57抗原作免疫印染筛检病人血清或粘膜分泌物。该蛋白与患者血清之间发生阳性 反应表明该患者已对所述蛋白产生了免疫反应，即所述蛋白为免疫原。也可用此法鉴定免 疫优势蛋白和/或抗原表位。另一种核查治疗性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后监测GSA感染。一种 核查预防性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后全身性(如监测IgGl和IgG2a的产 生水平)和粘膜性(如监测IgA的产生水平)监测抗GAS57的免疫反应。通常检测免疫后 但攻击前的血清特异性抗体反应，而粘膜特异性抗体反应在免疫后和攻击后检测。可在给予宿主，如人前用体外和体内动物模型评价本发明疫苗组合物。特别有用 的小鼠模型包括先腹膜内免疫小鼠，然后腹膜内攻击或经鼻攻击的那些。本发明免疫原性组合物的效力也可用GAS体内攻击经该免疫原性组合物免疫的 模型动物，如豚鼠或小鼠来测定。免疫原性组合物可以衍生自或不衍生自与攻击血清型相 同的血清型。体内效力模型包括但不限于(i)采用人GAS血清型的小鼠感染模型；(ii)采用 粘膜适应GAS菌株，如在小鼠中特别有毒性的M23菌株的小鼠患病模型；(iii)采用人GAS 分离株的灵长动物模型。免疫应答可以是Thl免疫反应和Th2应答之一或二者。免疫反应可能是改善的或 增强的或改变的免疫反应。免疫反应可以是全身和粘膜免疫反应之一或二者。优选的免疫 反应是增强的全身和/或粘膜反应。增强的全身和/或粘膜反应为增强的Thl和/或Th2免疫反应。增强的反应优选 包括IgGl和/或IgG2a和/或IgA产生增多。粘膜免疫反应优选Th2免疫反应，粘膜免疫反应优选包括IgA产生增多。活化的Th2细胞增强抗体产生，因此有利于对胞外感染的反应。活化的Th2细胞 能分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。Th2免疫反应可导致产生IgGl、IgE, IgA和记忆B细胞以提供进一步保护力。Th2免疫反应包括与Th2免疫反应相关的一种或多种细胞因子(如IL-4、IL_5、 IL-6和IL-10)的升高，或IgGl、IgE、IgA和记忆B细胞产生的增多。增强的Th2免疫反应 优选包括IgGl产生增加。
Thl免疫反应包括CTL的增加，与Thl免疫反应相关的一种或多种细胞因子(如 IL-2.IFNY和TNFi3)的升高、活化巨噬细胞增多、NK细胞活性增强，或IgG2a产生增加中 的一种或多种。增强的Thl免疫反应优选包括IgG2a产生增加。本发明的免疫原性组合物，具体说，含本发明一种或多种突变型GAS57抗原的免 疫原性组合物可单独使用或与其它GAS抗原联用，任选与能引发Thl和/或Th2反应的免 疫调节剂联用。本发明还包括含有一种或多种免疫调节剂，如矿物盐(如铝盐)和含CpG基序的 寡核苷酸的免疫原性组合物。最优选，该免疫原性组合物同时包含铝盐和含CpG基序的寡 核苷酸。或者，该免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素(如脱毒的ADP核糖基化毒素) 和含CpG基序的寡核苷酸。优选的一种或多种免疫调节剂包括佐剂。佐剂可选用Thl佐剂 和Th2佐剂中的一种或多种。本发明的组合物优选能引发细胞介导免疫反应和体液免 疫反应二者，以有效应对 GAS感染。这种免疫应答宜诱导产生长效(如中和性)抗体和在接触一种或多种GAS抗原 后能快速应答的细胞介导免疫力。在一特别优选的实施方式中，该免疫原性组合物包含能引发中和抗体反应的一种 或多种突变型GAS57抗原，和能引发细胞介导免疫反应的一种或多种突变型GAS57抗原。以 此方法，中和抗体能防止或抑制最初的GAS感染，而细胞介导免疫反应能引发增强的Thl细 胞反应以防止GAS感染进一步扩散。通常将本发明的组合物直接给予患者。可通过各种不同途径单独或作为组合物的 一部分给予本发明组合物。某些途径对某些组合物可能更有利益，因为可产生更有效的免 疫反应，优选CMI反应，或较少可能诱导副作用，或较容易给药。递送方法包括胃肠外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)和 经直肠、口服(如药片、喷雾)、经阴道、局部、经皮(如参见WO 99/27961)、透皮(如参见 W002/074244和W002/064162)、鼻内(如参见WO 03/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜
途径给予。例如，本发明的组合物可通过全身途径或粘膜途径或经皮途径给予，或可直接给 予特定组织。本文所用的术语“全身给予”包括但不限于任何胃肠外途径给药。具体说，胃 肠道外给药包括但不限于皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸骨内注射，静脉内、动 脉内或肾透析灌注技术。优选的全身性、胃肠外给药是肌肉内注射。本文所用的术语“粘膜 给予”包括但不限于口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠和眼部给药。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。初次免疫方案和/或加强免疫方案可 采用多剂量。在多剂量方案中，通过相同或不同途径给予不同剂量，例如胃肠外初免和粘膜 加强，粘膜初免和胃肠外加强，等等。可将本发明组合物制成各种剂型。例如，可将组合物制成可注射的液体溶液或悬 浮液。还可以制备适合在注射前用液体运载体配制成溶液或悬浮液的固体剂型(如冻干的 组合物)。可制备口服给药的组合物，如片剂或胶囊、喷雾剂，或糖浆(任选加入调味剂)。 可制备肺部给药的组合物，如吸入剂，采用细粉或喷雾剂。可将组合物制备成栓剂或阴道 栓。可制备鼻部、耳部或眼部给药的组合物，例如滴剂。组合物可以是试剂试剂盒形式，如 此设计使得在给予患者之前可重建成合并的组合物。这种试剂试剂盒装有液体形式的一种或多种突变型GAS57和其它抗原及一种或多种冻干抗原。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的突变型GAS57或其它抗原(或编码 该抗原的核酸分子)，以及需要的其它组分，如抗生素。“免疫有效量”是以单剂量或一系列 剂量的一部分给予个体时能增强可测定的免疫反应或防止或减少临床症状的用量。本发明的免疫原性组合物可与抗生素治疗方案组合给予。在一实施方式中，给予 抗生素然后给予本发明的抗原，或包含本发明的一种或多种突变型GAS57抗原的组合物。在另一实施方式中，先给予本发明的突变型GAS57抗原然后给予抗生素。适合用 于治疗GAS感染的抗生素包括但不限于青霉素或其衍生物，或克林霉素、先锋霉素、糖肽 类(如万古霉素)和环丝氨酸。然而，该组合物中活性药物的含量可以不同，取决于所治疗个体的健康和生理状 况、年龄、所治疗个体的物种分类(如非人灵长动物，灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗 体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、治疗医师对医学状况的评估和其它相关的因素。此 用量落在可通过常规试验确定的较广泛范围内。试齐[J本发明还提供装有本发明组合物的一个或多个容器的试剂盒。组合物可以是液体 形式或冻干形式，可以是各个抗原。组合物的合适容器包括，例如瓶子，小药瓶，针筒和试 管。可用各种材料，包括玻璃或塑料制备容器。容器可配备无菌的入口(例如，容器可以是 装有皮下注射针头可刺破塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。该试剂盒也可装有包含药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐水、林格液或葡萄 糖液的第二容器。也可装有终末用户所用的其它物质，包括其它缓冲液、稀释液、过滤器、针 头和针筒。该试剂盒还可装有含另一活性药物，如抗生素的第二或第三容器。该试剂盒也可装有书面的包装插页，说明诱导抗酿脓链球菌免疫力或治疗酿脓链 球菌感染的方法。该包装说明书可以是未经批准的草稿插页或可以是经食品药物管理局 (FDA)或其它管理当局批准的包装插页。本文引用的所有专利、专利申请和参考文献专门通过引用纳入本文。以上公开内 容已总体上描述了本发明。参考以下具体实施例可获得更全面的理解，提供实施例的目的 只是说明而非限制本发明的范围。实施例1.纯化的野生型GAS57能切割IL_8和其它CXC细胞因子大肠杆菌表达并纯化的野生型GAS57为有His-尾或无His-尾的蛋白质。表达的 所有变体蛋白没有N-末端前导序列，没有C-末端跨膜区(参见SEQ ID N0:78和79)。详 细说，用以下引物扩增M1_SF370基因组中的gag57基因57F, GTGCGTCATATGGCAGATGAGCTAAGCA(SEQ ID NO 69)57R, GCGTCTCGAGGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT(SEQ ID NO 70)57 终止 R，GCGTCTCGAGTTAGGCTTTTGCTGTTGCTGAGGT (SEQID NO 71)采用引物57F和57R获得了含His尾的形式，而用引物57F和57终止F获得了无 尾的形式。用NdeI-XhoI消化PCR产物，再分别与用相同酶切断的pET21b+和pet24b+连 接。用连接反应转化大肠杆菌BL21 (DE3)电感受态细胞。用集落PCR鉴定携带正确插
32入物(pET21_57his和pET24_57)质粒的卡那霉素抗性菌落，测定一个阳性克隆的GAS57基 因序列。25°C搅拌下用液体培养基培养表达GAS57的阳性克隆菌，在培养物中加入ImM IPTG获得重组蛋白的表达。用金属离子亲和层析(IMAC)纯化含His尾GAS57蛋白。用三 步层析离子交换层析(Q琼脂糖HP)、羟基磷灰石层析和凝胶过滤层析纯化无尾GAS57蛋 白。图7和8显示纯化的野生型蛋白的SDS-PAGE分析。为了检测GAS57的蛋白酶水解活性，将IL-8与二种不同浓度的纯化GAS57长时间 温育后在SDS-聚丙烯凝胶上进行电泳，显示原先SkDa的IL-8蛋白转变成被切断的无活性 6kDa蛋白。结果见图1。图12显示类似实验的结果，该实验中，37°C将各种趋化因子(10 μ g/ml)与或不与 GAS57(1 μ g/ml) 一起温育24小时。样品在18% SDS-聚丙烯酰胺上进行电泳。实施例2.制备GAS57突变体 通过与C5a蛋白酶的比较(图2)，在GAS57中鉴定有3个氨基酸可能构成了该蛋白 酶的催化位点D151、H279和S617。为了获得灭活形式的酶，用重叠延伸PCR法(SOE-PCR) 剪接在GAS57编码序列中引入核苷酸取代导致D151A和/或S617A的氨基酸改变。D151A 取代进行了三次PCR反应
权利要求
一种纯化的突变型GAS57抗原，其在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个氨基酸位置包含氨基酸改变，其中所述氨基酸的位置按SEQ IDNO1编号，通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8(IL 8)的蛋白酶水解活性比野生型GAS57降低至少50％。
2.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原包含选自D151A 或S617A的至少一个氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原包含SEQID NO 2[D151A]、SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4。
4.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原是含有第二种 GAS抗原的融合蛋白。
5.如权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，该抗原偶联于载体蛋白。
6.如权利要求5所述的纯化的突变型GAS57抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自细 菌毒素、细菌类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、热激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血杆菌蛋白 D、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B和铁摄取蛋白。
7.编码权利要求1所述的纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子。
8.如权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，该分子编码选自SEQIDNO :2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
9.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含选自SEQIDNO :6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示编码序列的核苷酸序列。
10.一种特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8的能力的抗体制剂。
11.如权利要求10所述的抗体制剂，其特征在于，该抗体还抑制野生型GAS57切割人 趋化因子的能力，所述人趋化因子选自CXCLl/GR0a、CXCL2/GR0 β、CXCL3/GR0 γ , CXCL4、 CXCL12/SDF-1a、CXCL12/SDF-1β、CXCL12/SDF-1γ、CXCL5/ENA 78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/ ΝΑΡ-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP10、CXCLl 1、CXCL13、CXCL14 和 CXCL16。
12.如权利要求10所述的抗体制剂，其特征在于，该抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、 人源化抗体、嵌合型抗体、F(ab' )2片段、F(ab)自体、Fv分子、非共价异质二聚体、单链Fv 分子(sFv)、二聚抗体片段构建物、三聚抗体片段构建物、微小抗体或它们的混合物。
13.—种组合物，其特征在于，该组合物包含(a)选自以下的活性药剂(i)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低了至少50% ；( )编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂；和(b)药学上可接受的运载体。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含儿童疫苗所用的活性 药剂。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述活性药剂选自(a)选自以下的多肽抗原脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、百日咳博德特菌、粘膜炎莫 拉菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病 毒、风疹病毒和轮状病毒多肽抗原；和(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。
16.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物还包含用于老年人或免疫力 低下个体疫苗的第二种活性药剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述第二种活性药剂选自(a)选自以下的多肽抗原粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 嗜肺军团病杆菌、单核细胞增多症李斯特菌、流感病毒和副流感病毒多肽抗原；和(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。
18.一种抑制野生型GAS57蛋白酶水解活性的方法，包括使野生型GAS57与权利要求 10所述的抗体制剂接触。
19.一种治疗或预防酿脓链球菌感染的方法，包括给予有此需要的个体有效量的组合 物，该组合物包含(a)选自以下的活性药剂(i)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂；和(b)药学上可接受的运载体。
20.—种试剂盒，其包括(a)装有选自以下活性药物的容器(i)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂；和(b)用所述组合物治疗或预防酿脓链球菌感染的说明书。
21.一种制备预防或治疗酿脓链球菌感染的组合物的方法，，包括混合 (a)选自以下的活性药剂(i)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；( )编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(iii)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂；和 (b)药学上可接受的运载体。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述活性药剂是突变型GAS57抗原或抗 体，所述突变型GAS57抗原或抗体通过以下方法制备，该方法包括(a)培养含编码所述突变型GAS57抗原或抗体的表达构建物的宿主细胞；和(b)回收所述突变型GAS57抗原或抗体。
23.活性药剂在制造治疗或预防酿脓链球菌感染的药物中的应用，所述活性药剂选自(a)纯化的突变型GAS57抗原，该抗原在选自氨基酸D151、H279或S617的一个或多个 氨基酸位置包含氨基酸突变，所述氨基酸的位置按SEQ ID NO :1编号，通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳或ELISA试验检测，该纯化的突变型GAS57抗原对白介素8 (IL-8)的蛋白酶水 解活性比野生型GAS57降低至少50% ；(b)编码所述纯化的突变型GAS57抗原的核酸分子，和(c)特异性结合野生型GAS57并抑制野生型GAS57切割IL-8能力的抗体制剂。
24.如权利要求1-6中任一项所述的纯化的突变型GAS57抗原，权利要求7-9中任一项 所述的核酸分子，权利要求10-12中任一项所述的抗体制剂，或权利要求13-17中任一项所 述的组合物在治疗中的应用。如权利要求1-6中任一项所述的纯化的突变型GAS57抗原，权利要求7-9中任一项所 述的核酸分子，权利要求10-12中任一项所述的抗体制剂，或权利要求13-17中任一项所述 的组合物用于治疗或预防酿脓链球菌感染。
全文摘要
本发明提供不能切割IL-8和类似物质但仍保留了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的GAS57的突变体。本发明也提供特异性结合GAS57从而抑制其切割IL-8和类似物质的抗体。所述突变体等可用于疫苗组合物中诱导抗酿脓链球菌的保护力。所述抗体可用于，例如用作药物治疗酿脓链球菌感染。
文档编号A61K39/09GK101969992SQ200880115439
公开日2011年2月9日 申请日期2008年9月12日 优先权日2007年9月12日
发明者C·津加瑞蒂, G·格兰迪, I·马格里蒂若斯 申请人:诺华有限公司