专利名称：可还原聚(酰胺乙烯亚胺)的可切割修饰以增强核苷酸递送的制作方法
可还原聚(酰胺乙烯亚胺)的可切割修饰以增强核苷酸递
送
背景技术：
本发明涉及基因递送。更具体而言，本发明涉及非病毒基因递送载体。基因治疗在通过递送和应用基于治疗基因的药物治疗人遗传性和获得性疾病 中具有广泛潜力。安全、有效且可控制的基因载体的使用是临床基因治疗成功的必要条 件。R. C. Mulligan，The basic science ofgene therapy, 260 Science 926-932 (1993)； I. M. Verma & N. Somia, Gene therapy-promises，problems and prospects，389 Nature 239-242(1997)。尽管病毒载体在基因递送方面非常有效，但它们潜在的安全和免疫原 性问题增加其在临床应用中的危险。C. Baum等人，Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of genetransfer vectors,17 Hum. Gene Ther. 253-263(2006)。 作为病毒载体的备选方案，已合成阳离子聚合物例如聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(乙烯 亚胺)(poly (ethylenimine)，PEI)、聚(酰胺型胺类)树枝状聚合物(dendrimers) 以及阳离子脂质体作为基因递送载体。这些阳离子聚合物载体的优点包括安全、稳 定性、大DNA和RNA装载容量、以及易于且大规模生产。S.Li & L. Huang，Nonviral genetherapy :promises and challenges,7 Gene Ther. 31-34(2000) ；F.Liu 等 人’ Non-immunostimulatory nonviral vectors,18 Faseb J. 1779-1781(2004) ；T. Niidome & L.Huang, Gene therapy progressand prospects :nonviral vectors,9 Gene Ther. 1647-1652(2002)。阳离子聚合物可以通过静电相互作用使带负电的DNA浓缩到纳 米大小颗粒中，并且聚合物/pDNA聚合复合物(polyplexes)可以经由胞吞作用进入细 胞。Y. W. Cho 等人，Polycation gene delivery systems :escape from endosomes to cytosol, 55 J. Pharm. Pharmacol. 721-734(2003) ；L De Laporte等人，Design of modular non-viral gene therapy vectors,27 Biomaterials 947-954(2006) ；E· Piskin 等人， Gene delivery !intelligent but just at the beginning，15 J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1182-1202(2004)。因此，聚合物可以保护pDNA免受核酸酶降解，并且促进细胞摄取以 诱导高基因转染。0. Boussif 等人，Aversatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells inculture and in vivo :polyethylenimine，92 Proc. Nat ' 1 Acad. Sci. USA7297-7301 (1995) ；D. W. Pack ^ 入，Design and development ofpolymers for gene delivery,4 Nat. Rev. Drug. Discov. 581-593(2005)。然而，目前可用的阳离子聚合物具有显著的细胞毒性问题，主要是由于其在生理 条件下的弱生物相容性和不可降解性。因此，尽管现有非病毒基因递送载体是已知的并且一般适合于其有限目的，但它 们具有有损于其在基因治疗中的总体效用的特定的固有缺陷。考虑到前文，应当理解提供改良载体以增强核苷酸递送将是本领域的显著进步。发明概述本发明的一个举例说明性实施方案包括包含与聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]共价 键合的聚乙二醇的组合物。在本发明的举例说明性实施方案中，η是1、2或3。在本发明的某些举例说明性实施方案中，聚乙二醇是线性的，但在其他举例说明性实施方案中，聚乙二 醇是分支的。聚乙二醇一般具有约1，000至约50，000的分子量，并且更一般地具有约2，000 至约25，000的分子量。在本发明的一个举例说明性实施方案中，聚乙二醇具有约3，400的 分子量。聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA] —般具有约1，000至约25，000的分子量。然而，聚 [H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]和聚乙二醇的分子量仅受其作为载体的功能性限制。在本发明 的某些举例说明性实施方案中，组合物进一步包括与聚乙二醇共价键合的RGD肽。RGD肽的 举例说明性例子显示于SEQ ID NO :1中。本发明的另一个举例说明性实施方案包括包含与组合物离子键合的核酸的复合 物，所述组合物包括与聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]共价键合的聚乙二醇。举例说明性核酸 包括质粒、siRNAs和寡核苷酸。本发明的另外一个举例说明性实施方案包括用所选择的核酸转染细胞的方法，该 方法包括使细胞和包括与组合物离子键合的所选择核酸的复合物接触，从而使得复合物进 入细胞，所述组合物包括与聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]共价键合的聚乙二醇。本发明的一个再进一步的举例说明性实施方案包括用组合物包被的固体支持物， 所述组合物包括与聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]共价键合的聚乙二醇。聚乙二醇可以是线 性或分支的。在本发明的特定举例说明性实施方案中，η是1、2或3。此外，在另外的举例 说明性实施方案中，RGD肽可以与聚乙二醇键合。附图的几个视图的简述
图1显示了根据本发明用于合成聚[H2N-(CH2-CH2-N)n_H/CBA]的方案。图2显示了 MALDI-T0F分析的结果，显示在30°C或40°C下合成的聚(TETA/CBA) 的分支程度。图3显示了 MALDI-T0F分析的结果，显示在50°C下合成的聚(TETA/CBA)的分支程度。图4显示了聚合物构造对H9c2细胞中的转染效率的影响。从左到右，显示了关于 非载体对照(即仅报道质粒)、聚(TETA/CBA)和报道质粒的复合物的结果，其中聚(TETA/ CBA)在30°C下合成，并且载体与报道质粒的重量比是6 ( "30Deg w/w 6，，)、30Deg w/w 12、 30Dec w/w 24、40Deg w/w 6、40Deg w/w 12、40Deg w/w 24、50Degw/w 6、50Deg w/w 12、禾口 50Deg w/w 24。图5显示了聚合物构造对H9c2细胞中的细胞活力的影响。结果以与图4相同的 次序呈现。图6显示了关于聚(TETA/CBA)和聚(TETA/CBA) -g-PEG3400的一般合成方案。图7显示了质粒DNA保护免受在PBS中的20 % FBS中的血清核酸酶高达24小 时，聚(TETA/CBA)和相对应的 PEG 共聚物(5K-PEG3. 4K)具有 1，OOO(IK) ；5,000 (5K)；和 10, 000 (IOK)的截留分子量馏分。图8显示了与不含聚(TETA/CBA)的对照相比较，质粒DNA通过在30°C和50°C下 合成的聚(TETA/CBA)保护免受血清核酸酶。图9 显示了 由质粒 DNA 和聚(TETA/CBA(lk)) ( ■)、聚(TETA/CBA (5k)) (▲)、聚 (TETA/CBA(IOk)) ( T )、和聚(TETA/CBA(5k))-PEG3棚( )形成的聚合复合物的颗粒大
图10 显示了由质粒和 DNA 和聚(TETA/CBA (Ik)) ( ■)、聚(TETA/CBA (5k)) ( ▲)、 聚(TETA/CBA(IOk)) ( ▼)、和聚(TETA/CBA(5k))-PEG3400 ( )形成的聚合复合物的 ζ 电势(zeta potential)。图11显示了由质粒DNA和在40°C下合成的聚(TETA/CBA (Ik))形成的聚合复合物 通过动态光散射(DSL)测量的颗粒直径。图12显示了由质粒DNA和在40°C下合成的聚(TETA/CBA (5k))形成的聚合复合物 通过动态光散射(DSL)测量的颗粒直径。图13显示了由质粒DNA和在40°C下合成的聚(TETA/CBA(IOk))形成的聚合复合 物通过动态光散射(DSL)测量的颗粒直径。图14显示了由质粒DNA和在40°C下合成的聚(TETA/CBA(5k))-PEG34tltl形成的聚 合复合物通过动态光散射(DSL)测量的颗粒直径。图15显示了用于合成聚(TETA/CBA) -g-PEG-RGD的方案。图16显示了用于合成bPEG-g-聚(TETA/CBA)的方案。图17 显示了聚(TETA/CBA) ( )、聚(TETA/CBA)-PEG3棚(■)、和聚(TETA/ CBA) -PEG-RGD ( ▽)的颗粒大小。图18 显示了聚(TETA/CBA) ( ■)、聚(TETA/CBA)-PEG3彻(Δ )、和聚(TETA/ CBA)-PEG-RGD (▽)的 ζ 电势。 图19显示了与PEG-PEI和对照相比较，聚(TETA/CBA)和bPEG-聚(TETA/CBA)的 细胞毒性。图20显示了如通过萤光素酶表达测量的，与PEG-PEI和对照相比较，关于聚 (TETA/CBA)和 bPEG-聚(TETA/CBA)的转染。发明详述在公开且描述关于可还原聚(酰胺乙烯亚胺)(SS-PAEIs)的本文改善和方法前， 应当理解本发明并不限于本文公开的具体配置、处理步骤和材料，因为此类配制、处理步骤 和材料在某种程度上可以改变。还应当理解本文采用的术语仅用于描述具体实施方案的目 的，并且不意欲是限制性的，因为本发明的范围将仅受附加权利要求及其等价物的限制。本文提及用于描述本发明背景且提供关于其实践的另外细节的出版物和其他参 考文献材料通过引用在此合并。本文讨论的参考文献仅提供用于其在本申请提交日期前的 公开内容。本文任何部分都不应解释为承认本发明人未给予由于本发明先于此类公开内容 的权利。必须指出，如在本说明书和附加权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，单 数形式“一个”、“一种”和“某种”包括复数参考。除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有如由本发明所属领域普通技 术人员通常理解相同的含义。在描述且请求保护本发明中，下述术语将依照下文阐述的定义而使用。如本文所使用的，“包含”、“包括”、“含有”、“特征在于”及其语法等价物是包括在
内的或开放式术语，其不排除另外的未描述的元件或方法步骤。“包含”应解释为包括更限
制性的术语“由......组成”或“基本上由......组成”。如本文所使用的，“由......组
成”及其语法等价物排除权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分。如本文所使用的，“基本上由......组成”及其语法等价物使权利要求的范围限制于指定的材料或步骤和本质上
不影响请求保护的本发明的一种或多种基本和新鲜特征的那些。如本文所使用的，“SS-PAEI”意指含有可还原二硫键的聚(酰胺乙烯亚胺)； “TETA”意指三乙四胺；并且乂84”意指队& -胱胺双丙烯酰胺。可还原聚(酰胺乙烯亚胺)(SS_PAEIs)是用于递送核酸的一类非病毒载 体。L. V. Christensen 等 人，Reducible Poly(amido ethylenimine)s Designed for Triggered Intracellular Gene Delivery,17 Bioconiugate Chem. 1233-1240 (2006)。 使用聚胺单体和胱胺双丙烯酰胺(CBA)之间的迈克尔加成化学作用(Michael addition chemistry)合成这些类型的聚合物显示于图1中。已显示所得的聚合物介导治疗性质 粒 DNA 以及 siRNA 的有效转染效率。L. V. Christensen, C. W. Chang, J. W. Yockman,等人， Reducible poly (amido ethylendiamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery,118 J. Control. Rel. 254-261 (2007) J. Hoon Jeong, L. V. Christensen, J. W. Yockman, Z. Zhong, J. F. J. Engbersen, W. J. Kim, J. Fei jen, S. W. Kim, Reducible poly (amido ethylenimine) directed to enhance RNA interference, 28 Biomaterials 1912-1917 (2007)。这些聚合 物通过将目的核酸递送到细胞的细胞质区室内的触发释放机制利用细胞外和细胞内环境 之间的氧化还原电位。此类特征具有超过迄今为止用于非病毒基因递送的常规不可切割或 可水解聚合物的显著优点。用寡核苷酸(例如反义寡核苷酸和siRNA)的递送中可见明显的优点，其仅需要被 递送到细胞质用于证实其效应。由于其高静电相互作用，从胞内体区室中释放后，常规的不 可切割聚合物一般在细胞质内保持浓缩(condense)。治疗性核苷酸的这种浓缩阻止其在宿 主机制中用于转录或翻译抑制。然而，SS-PAEIs通过还原性蛋白质/酶，即谷胱甘肽-S-转 移酶(GSH)在细胞质内被还原，释放治疗性核苷酸并且显著增加用于转录或翻译抑制的可 用核苷酸的量。直到最近，这些聚合物已用于经由体内注射的直接递送。全身递送的缺点包括 与带负电的血浆蛋白质不希望的相互作用和在循环过程中的非特异性降解，已导致这样 的聚合系统的构建，其可以克服迄今为止由非病毒基因递送面临的主要问题。最重要 的是，聚合物和另外的聚合结构和/或靶向部分之间的反应性连接是关键的，以允许核 苷酸/聚合复合物在细胞质内的完全还原。已显示聚合结构的稳定连接可以减少在细 胞内的转染效率，无论是通过抑制核苷酸的释放还是阻碍进入核内的移动。MMeyer & E. Wagner, pH-Responsive shielding of non-viral gene vectors,3Expert Opin. Drug Deliv. 563-571 (2006)。因为SS-PAEIs的这种还原对于有效核苷酸递送是关键的，所以本 文公开了 SS-PAEIs的有效修饰，其保护免受体内的负面相互作用并且将核酸递送给所需 靶向区域。为了改善经由全身施用用于体内应用的聚(三乙四胺胱胺双丙烯酰胺)(聚 (TETA/CBA))聚合物，聚合物可以使用亲水PEG间隔物得到立体稳定，所述亲水PEG间隔 物可以包含或不包含伴随的组织特异性靶向部分，例如RGD。此外，先前的基因递送研究 已证实体内基因转移使用高分子量、分支聚合物是最高的。展示这些特征的共聚物的例 子是PEG34QQ-bPEI25k。因此，已合成高分子量、分支的聚(TETA/CBA) ( “bTETA/CBA”)， 并且已与PEG_和PEG34qq-RGD缀合，以衍生命名为聚(TETA/CBA) -PEG3400和聚(TETA/CBA) -PEG3400-RGD的所得到的共聚物。本发明的另一个举例说明性实施方案包括用组合物包被的固体支持物，所述组合 物包括与聚(TETA/CBA)共价键合的聚乙二醇。聚乙二醇可以是线性或分支的。此外，RGD 肽可以与聚乙二醇键合。举例说明性地，固体支持物可以是皿底部、多孔平板或连续表面。 固体支持物可以是玻璃、塑料(例如聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯 或聚丙烯)、硅、金属(例如金)、膜(例如硝酸纤维素、甲基纤维素、PTFE或纤维素)、纸、生 物材料(例如蛋白质、明胶或琼脂)、组织(例如皮肤、内皮组织、骨或软骨)、或矿物质(例 如羟磷灰石或石墨)、载玻片(例如玻璃或聚-L-赖氨酸包被的载玻片)或多孔平板或微 量滴定板的孔。一般的固体支持物材料包括聚苯乙烯树脂、环氧树脂或玻璃。包被量一般 是约0. 1至约lOOyg/cm2。组合物包被固体支持物的表面上。组合物可以与基质例如蛋白 质、肽、多糖或聚合物相混合。蛋白质可以是明胶、胶原、牛血清白蛋白或可以在使蛋白质与 表面附着中使用的任何其他蛋白质。聚合物可以是水凝胶、共聚物、不可降解或生物可降解 的聚合物、和生物相容性材料。多糖可以是可以形成膜且包被聚合物的任何化合物，例如壳 聚糖。试剂例如细胞毒性还原试剂、细胞粘合试剂、细胞生长试剂、细胞刺激试剂或细胞抑 制试剂和用于培养特定细胞的化合物，也可以连同组合物一起与固体表面附着(affix)。举例说明性地，包括在合适溶剂例如水中的组合物和明胶的明胶_组合物混合物 可以与固体表面附着。细胞培养试剂例如纤连蛋白、胶原、盐、糖、蛋白质或肽也可以存在于 明胶_组合物混合物中。使混合物在固体支持物例如载玻片或多孔平板的表面上均勻展 开。允许所得到的产物在合适条件下完全干燥，从而使得明胶_组合物混合物与固体支持 物附着。例如，所得到的产物可以在所选择的温度或湿度下或在真空干燥器中干燥。实施例1根据图1中举例说明和L. V. Christensen等人(如上文)中描述的方案在30°C、 40°C和 50°C下合成聚(TETA/CBA)。通过基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-T0F)质谱法表征根据这个实 施例制备的聚(TETA/CBA)的分支程度。结果显示聚(TETA/CBA)分支是约90%。在30°C 或40°C下的合成(图2)产生约90%的包含至少一条支链(臂)的聚(TETA/CBA)重复单 位，而其他10%是线性的。在这个群体内，约60%包含一个臂，并且约30%包含两个臂。在 50°C下的合成(图3)产生更致密的构造，其中约7%的共聚物是线性的，约40%包含一个 臂，约40%包含两个臂，并且约10%包含三个臂。实施例2使用质粒pBLuc作为报告子在H9c2细胞中评估用聚(TETA/CBA)共聚物的转染。 使细胞维持在包含10% FBS、链霉素(ΙΟΟμ g/mL)和青霉素(100单位/mL)的DMEM中在 37°C下在含5% CO2的湿润大气中。细胞在转染前24小时以4. OxlO4细胞/孔的起始密度 种植在24孔平板中。DNA以6、12和24的聚合物/pBLuc w/w比与聚(TETA/CBA)聚合物 复合。对照不包含聚(TETA/CBA)聚合物。复合物在HEPES缓冲液中进行制备，并且在使用 前温育30分钟。在转染时，每个孔中的培养基用新鲜的无血清培养基替换。使聚合复合物 (0. 5μ gDNA/孔)与细胞在37°C下温育4小时。培养基随后用500 μ L新鲜完全培养基替换， 并且使细胞温育另外44小时。细胞随后用预加温的PBS洗涤，用200 μ L细胞裂解缓冲液处 理，并且实施冻融循环。通过在14，OOOg下离心5分钟去除细胞碎片。使用萤光素酶测定试剂盒(100 μ L萤光素酶测定缓冲液)在光度计(Dynex Technologies Inc.，Chantilly， Virginia)上测量细胞裂解物(25 μ L)中的萤光素酶活性。萤光素酶表达的相对发光单位 (RLU)针对在细胞提取物中的蛋白质浓度进行标准化，所述蛋白质浓度通过BCA蛋白质测 定试剂盒(Pierce，Rockford，Illinois)进行测量。所有转染测定一式三份地进行。结果 显示于图4中。与分支较少的构造相比较，分支较多的构造减少转染效率。实施例3H9c2细胞以4. OxlO4细胞/孔的密度种植在24孔平板中，并且温育24小时。6、 12和24重量比(w/w)的聚(TETA/CBA)/pBLuc复合物和无聚合物(对照)与细胞在无血清 培养基中温育4小时，随后为在完全培养基中的20小时。随后加入MTT溶液(50 μ L，2mg/ mL)，并且使细胞进一步温育2小时。去除培养基，并且随后将300 μ L DMSO加入每个孔中。 使用微板阅读器(Model 680, Bio-RadLab, Hercules, California)测量在 570nm 处的吸光 度(absorption)。相对于对照(未经处理的)细胞测定相对细胞活力的百分比，所述对照 细胞未暴露于转染系统并且视为100%细胞活力。所有细胞毒性实验一式三份地进行。结 果显示于图5中。细胞毒性基本上是零。实施例4根据实施例1的操作制备的聚(TETA/CBA)共聚物使用截留分子量为10，000 ； 5,000 ；和1,000的超滤膜进行分馏。这些馏分分别称为聚(TETA/CBA(10k))、聚(TETA/ CBA (5k))和聚(TETA/CBA(lk))。使分子量为3，400的聚乙二醇(PEG3. 4k或PEG34J以等摩尔量与聚(TETA/ CBA (5k))缀合。将DPAS溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并且逐滴加入在DMSO中具有过量吡 啶的NH2-PEG-COOH中，并且反应过夜。接下来，将二硫苏糖醇(DTT)加入反应混合物中，并 且反应4小时。所得到的PEG产物随后通过超滤(1000MWC0)进行纯化。使HS-PEG-C00H 和过量二乙烯砜溶解于作为溶剂的DMSO中，并且反应过夜。所得到的产物再次通过超滤 (1000MWC0)进行纯化。随后将所得到的PEG产物溶解于碳酸钠缓冲液，pH 9.0中，并且逐 滴加入聚(TETA/CBA(5k))碳酸酯溶液中，并且反应16小时。对于视觉澄清度，聚(TETA/ CBA(5k))在图6中看起来是线性的，然而，应当指出聚(TETA/CBA(5k))是分支的。从该种 反应得到的产物命名为聚(TETA/CBA (5k)) -PEG34000通过凝胶渗透色谱法(GPC)分析聚(TETA/CBA (Ik))、聚(TETA/CBA (5k))、聚 (TETA/CBA (10k))、聚(TETA/CBA) 5k)) -PEG3400 和高分支的聚乙烯亚胺(bPEI25k ;MW = 25，000 ；Aldrich, St. Louis, Missouri)。表1显示源自GPC测量的数量平均分子量(Mn)、 重量平均分子量(Mw)和多分散性指数(Mw/Mn ；PDI)。通过使0. IM水性NaCl中的pH从7. 4 转变成5. 1所需的HCl摩尔来测定聚合物馏分缓冲容量滴定。通过使用TCEP和后续游离 硫氢基NEM保护还原每种聚合物馏分来测定分支的程度，如通过MALDI-T0F分析的。 实施例5测定聚(TETA/CBA(Ik))、聚(TETA/CBA (5k))、聚(TETA/CBA (IOk))和聚(TETA/ CBA (5k)) -PEG3400保护质粒DNA免受血清核酸酶的能力。如上所述制备聚合复合物，除使用聚(TETA/CBA (Ik))、聚(TETA/CBA (5k))、聚 (TETA/CBA (IOk))和聚(TETA/CBA (5k))-PEG3■代替未分馏的聚(TETA/CBA)外。随后使聚 合复合物和质粒DNA对照(未与聚(TETA/CBA)聚合物复合)暴露于血清核酸酶(20% FBS ； HyClone,Logan,Utah)共0、1、3、6、12、16或24小时。随后，对聚合复合物实施在TAE缓冲 液(40mMTris-HCl，l% (ν/ν)乙酸，ImM EDTA)中的凝胶电泳(150ng pDNA/泳道)。在溴化 乙啶染色后，用配备UV透射仪的图像分析仪(GelDoc，BiORad, Hercules, California)显 现图像。图7显示聚合物成功保护质粒DNA免受核酸酶降解共24小时。在另一个实验中，对照质粒DNA和用在30°C或50°C下合成的未经分馏的聚(TETA/ CBA)形成的聚合复合物暴露于在20%FBS中的血清核酸酶，如上所述。图8显示在50°C下 形成的更密集构造提供比在30°C下形成的构造更好的免受血清核酸酶的保护。实施例6在 Brookhaven Instruments Corp. (Holtsville, New York) ZetaPALS 上测定由 质粒 DNA 以及聚(TETA/CBA(lk))、聚(TETA/CBA(5k))、聚(TETA/CBA(IOk))和聚(TETA/ CBA (5k))-PEG3■在各种w/w比下形成的聚合复合物的颗粒大小和ζ电势。关于颗粒大小 的值是有效平均直径(n = 3SEM)。这些结果显示于图9和10中。使用聚(TETA/CBA(Ik))(图 11)、聚(TETA/CBA (5k))(图 12)、聚(TETA/CBA (IOk)) (图13)和聚(TETA/CBA(5k) )-PEG3. 4k(图14)测定动态光散射(DLS)测量。实施例7使用根据实施例1的操作而制备的聚(TETA/CBA)和商购可得的乙烯 砜-PEG-RGD (VS-PEG-RGD)来合成聚(TETA/CBA)-g-PEG-R⑶。反应方案在图15中举例说明。实施例8已显示分支的PEG产物例如bPEG2000_C0H增强蛋白质的保护，类似于高分子量 PEG产物的聚合物。这些缀合物已达到相似结果，同时维持低分子量。使分支PEG2000与聚 (TETA/CBA)缀合，以产生用于基因递送的改良共聚物系统。bPEG-g-TETA/CBA的合成显示 于图16中。实施例9在 Brookhaven Instruments Corp. (Holtsville, New York) ZetaPALS 上测定聚(TETA/CBA)、聚(TETA/CBA)-PEG34qq 和聚(TETA/CBA)-PEG-R⑶的颗粒大小和 ζ 电势。关于 颗粒大小的值是有效平均直径。结果显示于图17和18中。实施例10PC-3细胞以4. OxlO4细胞/孔的密度种植于24孔平板中，并且温育24小时。聚 (TETA/CBA)、聚(TETA/CBA)-PEG34qq以及对照PEG-PEI和无聚合物与细胞在无血清培养基 中温育4小时，随后为在完全培养基中的20小时。随后加入MTT溶液(50 μ L，2mg/mL)，并 且使细胞进一步温育2小时。去除培养基，并且随后将300 μ L DMSO加入每个孔中。使用 微板阅读器(Model 680, Bio-Rad Lab, Hercules, California)测量在 570nm 处的吸光度。 相对于对照(未经处理的)细胞测定相对细胞活力的百分比，所述对照细胞未暴露于转染 系统并且视为100%细胞活力。所有细胞毒性实验一式三份地进行。结果显示于图19中。实施例11使用质粒pCMV-Luc作为报告子在PC_3细胞上评估转染。使细胞维持在包含10% FBS、链霉素(100 μ g/mL)和青霉素(100单位/mL)的DMEM中在37°C下在含5% CO2的湿 润大气中。细胞在转染前24小时以4. OxlO4细胞/孔的起始密度种植在24孔平板中。使 DNA与聚(TETA/CBA)和PEG-聚(TETA/CBA)聚合物复合。对照是PEG-PEI和无聚合物。复 合物在HEPES缓冲液中进行制备，并且在使用前温育30分钟。在转染时，每个孔中的培养 基用新鲜的无血清培养基替换。使聚合复合物(0. 5 μ gDNA/孔)与细胞在37°C下温育4小 时。培养基随后用500 μ L新鲜完全培养基替换，并且使细胞温育另外44小时。细胞随后 用预加温的PBS洗涤，用200 μ L细胞裂解缓冲液处理，并且实施冻融循环。通过在14，OOOg 下离心5分钟去除细胞碎片。使用萤光素酶测定试剂盒(100 μ L萤光素酶测定缓冲液)在 光度计(Dynex Technologies Inc. , Chantilly, Virginia)上测量细胞裂解物(25 μ L)中 的萤光素酶活性。萤光素酶表达的相对发光单位(RLU)针对在细胞提取物中的蛋白质浓度 进行标准化，所述蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，Illinois)测 量。所有转染测定一式三份地进行。结果显示于图20中。
权利要求
组合物，其包括与聚[H2N (CH2 CH2 N)n H/CBA]共价键合的聚乙二醇。
2.权利要求1的组合物，其中η是1、2或3。
3.权利要求1的组合物，其中η是3。
4.权利要求1的组合物，其中所述聚乙二醇是线性的。
5.权利要求4的组合物，其中所述聚乙二醇具有约1，000至约50，000的分子量。
6.权利要求5的组合物，其中所述聚乙二醇具有约2，000至约25，000的分子量。
7.权利要求6的组合物，其中所述聚乙二醇具有约3，400的分子量。
8.权利要求4的组合物，其中所述聚[H2N-(CH2-CH2-N)n-H/CBA]具有约1，000至约 25，000的分子量。
9.权利要求4的组合物，其进一步包括与所述聚乙二醇共价键合的RGD肽。
10.权利要求9的组合物，其中所述RGD肽包括SEQID NO :1。
11.权利要求1的组合物，其中所述聚乙二醇是分支的。
12.包括与组合物离子键合的核酸的复合物，所述组合物包括与聚[H2N-(CH2-CH2-N) n-H/CBA]共价键合的聚乙二醇。
13.权利要求12的复合物，其中所述核酸包括质粒。
14.权利要求12的复合物，其中所述核酸包括siRNA。
15.权利要求12的复合物，其中所述核酸是寡核苷酸。
16.用所选择的核酸转染细胞的方法，该方法包括使所述细胞和包括与组合物离子键 合的所选择核酸的复合物接触，从而使得所述复合物进入所述细胞，所述组合物包括与聚 [H2N- (CH2-CH2-N)n-H/CBA]共价键合的聚乙二醇。
17.权利要求16的方法，其中η是1、2或3。
18.权利要求16的方法，其中所选择的核酸包括质粒。
19.权利要求16的方法，其中所选择的核酸包括siRNA。
20.权利要求16的方法，其中所选择的核酸包括寡核苷酸。
全文摘要
公开了用于基因递送的改良聚(酰胺乙烯亚胺)共聚物。一个举例说明性实施方案包括与分支的聚(三乙四胺/胱胺双丙烯酰胺)共聚物(聚(TETA/CBA))共价键合的聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇可以是线性或分支的。另一个举例说明性实施方案包括与聚(TETA/CBA))-PEG缀合物共价键合的RGD肽。另外一个举例说明性实施方案包括使用这些组合物与核酸用于转染细胞的方法。
文档编号A61K31/7105GK101918473SQ200880123854
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者J·W·尤克曼, J·布拉姆贝奇, L·V·克里斯坦森, 金城完 申请人:犹他大学研究基金会