保健食品组合物及其使用方法

专利名称：保健食品组合物及其使用方法
技术领域：
本发明大体上涉及保健食品组合物以及将它们给药用于治疗炎症或者与炎症有 关的疾病的方法。本发明还涉及提取自能够治疗炎症或者与炎症有关的疾病的植物的保健食品组 合物。
背景技术：
在本说明书中，当提到或者讨论知识文献、法案或者条目时，这些参考和讨论并不 是认可知识文献、法案和条目或者它们的任一组合在优先权日之前部分属于公知常识，或 已知与试图解决本说明书中所关注的任何问题的相关知识。用于镇痛、抗炎、解热的非甾类抗炎药(NSAID)诸如阿司匹林和布洛芬是公知的。 来自所述药物的不良反应分布广泛并且日益流行，导致在2001年在美国超过100，000人住 院治疗。一些更新的NSAID’ s已经被证明使患者心肌梗死的风险增加了 80%。此外，存在许多增加的药物不良反应(ADR)，特别是当NSAID与C0X-2抑制剂结合 时。观察到的一些常见的胃肠ADR’s包括恶心、呕吐、消化不良、胃溃疡以及腹泻，还 观察到的其他更严重的ADR’ s包括高血压、间质性肾炎、急性肾衰竭和光敏性。NSAID’ s主要作为C0X抑制剂起作用，并且某些NSAID’ s被开发成专门的C0X-1 或者C0X-2抑制剂。2004年，基于观察到的服药患者中心血管事件的发生呈现增长的趋势，美国FDA 发布了有关选择性C0X-2抑制剂Vioxx 的安全性的公共健康忠告。2005年，基于观察到的服药患者中心血管事件的发生呈现增长的趋势，美国FDA 再次向从业者发布了有关NSAID Celebrex 的安全性的警告。由于上述原因，在许多情况下医生通常不愿开具已知的NSAID’ s处方，或者开具 减少剂量的处方以试图减轻目前已经发现的不良副作用。NSAID’ s已经长期用于关节炎的治疗以起到镇痛作用。在免疫介导的关节炎实验模型中，鲨鱼软骨提供了关节健康的明显改善 (Pivnenko等人，2005)，并可提高硫酸盐摄入到新的蛋白多糖分子中。类似地，有临床证据证明，翡翠贻贝(perna mussel)用于治疗狗的退行性关节病 的治疗是有效的(Pollard等人，2006 ；Bui和Bierer 2003)。同样地，鲍鱼在缓解和治疗关 节疾病中具有潜在优势。其具有高浓度的n-3多不饱和脂肪酸(Su和Antonas 2004)，已知 该脂肪酸能减少炎症类花生酸的形成(Mesa Garcia等人，2006)，并且至少部分地抑制一氧 化氮的产生(Pearson等人，2007)，后者与软骨保护(chondroprotective)以及镇痛性质有 关(Pearson 等人，2007)。发明目的本发明的目的在于提供用于治疗炎症或者与炎症有关的疾病的保健食品组合物。
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本发明的目的在于克服或者至少实质上改善现有技术的不足和缺点。通过下列结合附图的描述，本发明的其他目的和优点将更加清楚，其中，通过说明 和实例，公开了本发明的具体实施方式
。发明概述在本发明的第一方面，但这不应当被视为以任何方式对本发明的限制，提供了在 有机体中调节炎症的方法，该方法包括将含有来自植物侧柏的治疗剂量的提取物的组合物 给药到有机体。在典型方法中，将含有治疗剂量的来自植物侧柏的组合物给药到有机体减少有机 体的炎症。在一种实施方式中，用于调节炎症的组合物包括如本文中描述的侧柏 (B. orientalis)提取物，还包括其他附加提取物，诸如贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨 鱼软骨粉或者它们的组合。在一种实施方式中，侧柏提取物可通过模拟胃肠功能/处理的模拟消化来制备。本发明的另一方面，提供了一种抑制有机体中cox表达的方法，该方法包括将来 自植物侧柏的治疗剂量或者预防剂量的提取物给药到有机体。优选地，cox 为 cox 1。优选地，cox 为 cox 2。优选地，cox表达被抑制了 70%以上“(例如75、80、85、90、95% )”。本发明的又一方面在于提供了一种在有机体中抑制IL-1诱导的iNOS表达的方 法，该方法包括将来自植物侧柏的治疗剂量或者预防剂量的提取物给药到有机体。在本发明的另一种形式中，提供了一种治疗组合物，其包括来自植物侧柏的提取 物与鲨鱼软骨、翡翠贻贝提取物或粉末和鲍鱼提取物或粉末中的一种或多种的协同组合。在进一步的实施方式中，组合物包括浓度为5_30wt%的来自植物侧柏的提取物、 浓度为10_30wt%的鲨鱼软骨、浓度为10-30衬％的鲍鱼提取物和浓度为40-60wt%的贻贝 提取物。在本发明的又一种形式中，使用包括选自下组的至少一种化合物的组合物生产用 于抗炎病症的治疗和/或预防性治疗的药物，该组包括(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八 烷-9，11，15-三烯酸、顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酸(ALA)、顺，顺，顺-6，9，12-十八碳 三烯酸(GLA)、顺，顺-9，12-十八碳二烯酸和9-十八碳烯酸。优选地，药物包括另外的提取物，诸如翡翠贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼 软骨粉或者它们的组合。本发明的还一种形式在于提供一种用于哺乳动物抗炎病症治疗的方法，其包括将 治疗上有效量的多不饱和脂肪酸给药到哺乳动物。优选地，多不饱和脂肪酸选自下组Q-3，Q-6, Q _9和结合脂肪酸或者它们的混 合物。优选地优选地，Q _3脂肪酸选自下组顺，顺，顺-7，10,13-十六碳三烯酸；顺，顺， 顺-9，12，15-十八碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-6,9,12，15-十八碳四烯酸；顺，顺，顺-11,14， 17- 二十碳三烯酸；顺，顺，顺，顺_8，11，14，17- 二十碳四烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-5,8,11， 14，17- 二十碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-7，10，13，16，19- 二十二碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸；顺，顺，顺，顺-9，12，15，18，21- 二十四碳五烯 酸；和顺，顺，顺，顺，顺，顺_6，9，12，15，18，21-二十四碳六烯酸或它们的混合物。优选地优选地，Q-6脂肪酸选自下组顺，顺_9，12-十八碳二烯酸；顺，顺，顺_6， 9，12-十八碳三烯酸；顺，顺-11，14- 二十碳二烯酸；顺，顺，顺_8，11，14- 二十碳三烯酸； 顺，顺，顺，顺-5，8，11，14- 二十碳四烯酸；顺，顺-13，16- 二十二碳二烯酸；顺，顺，顺， 顺-7，10，13，16- 二十二碳四烯酸；和顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16- 二十二碳_五烯酸 或它们的混合物。优选地，Q-9脂肪酸选自下组，包括顺-9-十八碳烯酸；顺-11-二十碳烯酸；顺， 顺，顺_5，8，11-二十碳三烯酸；顺-13-二十二碳烯酸；以及顺-15-二十四碳烯酸或者它们 的混合物。优选地，结合脂肪酸选自下组，包括9Z，1 IE-十八碳_9，11- 二烯酸；10E, 12Z-十八碳-9，11- 二烯酸；8E, 10E, 12Z-十八碳三烯酸；8E, 10E, 12E-十八碳三烯酸；8E, 10Z，12E-十八碳三烯酸；9E, 11E，13Z-十八碳-9,11,13-三烯酸；9E, 11E，13E-十八碳_9， 11，13-三烯酸；9Z, 11Z，13E-十八碳-9，11，13-三烯酸；9Z, 11E，13Z-十八碳-9,11,13-三 烯酸；9E, 11Z，15E-十八碳-9，11，15-三烯酸；9E, 11Z，13Z，15E-十八碳-9,11,13，15-三 烯酸；反，反，反，反-十八碳_9，11，13，15-三烯酸；(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八碳_9， 11，15-三烯酸；和5Z，8Z，10E, 12E，14Z- 二十酸或它们的混合物。优选地，脂肪酸以盐的形式存在。本发明的另一种形式在于提供一种用于哺乳动物抗炎病症治疗的药物制剂，其包 括治疗上有效量的多不饱和脂肪酸。


通过实施例，此后将参照附图更全面地描述本发明的实施方式，其中图1 :IL_1刺激(A)和未刺激⑶的软骨外植体中cox 1 RNA的相对表达。图2 :IL-1刺激(A)和未刺激⑶的软骨外植体中cox 2 RNA的相对表达。图3 :IL-1刺激(A)和未刺激⑶的软骨外植体中iNOS RNA的相对表达。图4 :IL-1刺激(A)和未刺激⑶的软骨外植体中聚集蛋白聚糖RNA的相对表达。图5 通过IL-1刺激(A)和未刺激⑶的软骨外植体的前列腺素(PGE2)的产生。
~_代表明显不同于刺激(A)或者未刺激(B)对照的治疗。刺激的外植体与刺激对照比 较，Indosim, SEQsim (两种剂量)和B0sim(0. 18mg/mL)导致产生更少的PGE2。与未刺激对照相 比，Indosim和SEQsim在未刺激外植体中降低产生的PGE2。图6 注射和样品收集时间轴；样品收集包括通过关节穿刺术提取的左右腕骨关 节滑液和颈静脉血)。饮食增加从第0天开始并持续在整个实验过程中。图7 来自在CON (A)和SEQ(B)马中注射了 IL-1 (注射_1为10ng，注射_2 为lOOng)或者生理盐水的对照马的腕骨间关节的滑液[PGE2]。健康马用含有安慰剂 (C0N)或者Sasha’ s EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关 节内IL-l(500iiL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水 (500 uL)向对侧关节进行注射。在其后24小时，将IL-l(500iiL无菌生理盐水中含有 100ng)或者生理盐水(500 yL)的第二次关节内注射在相同的关节内进行注射(注射_2)。注射之前)、注射-2-2 (第二次IL-1注射之后8 小时)之前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1. 5mL 滑液。*表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理中生理盐水与IL-1之间有显 著差异。当0.05时变化是显著的。图8 将来自在CON(A)和SEQ(B)马中注射了 IL-1 (注射_1为10ng，注射_2为 lOOng)或者生理盐水的腕骨间关节的滑液[GAG]。健康的马用含有安慰剂(CON)或者 Sasha's EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充(注射_1)开始14天之后，将关节内IL-1 (500 u L 无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500 yL)向对侧关节 注射。在其后24小时，将IL-1 (500 iiL无菌生理盐水中含有lOOng)或者生理盐水(500 y L) 的第二次关节内注射进行相同关节的注射(注射_2)。在(补充开始之前)、注射-1和注 射_2 (注射之前)、注射-2-2 (第二次IL-1注射之后8小时)之前那天以及第二次IL-1注 射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在处理中注射_1的显 著变化。字母表示在处理中生理盐水与IL-1之间有显著差异。SEQ马具有比C0N马显著更 多的滑液[GAG]。当p < 0. 05时差异是显著的。图9 来自在CON(A)和SEQ(B)马中注射了 IL-1 (注射_1为10ng，注射_2为 100ng)或者生理盐水的对照马的腕骨间关节的滑液[蛋白质]。健康的马含有安慰剂 (C0N)或者Sasha’ s EQ(SEQ)食物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关 节内IL-l(500iiL无菌生理盐水中含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水 (500 u L)向对侧关节注射。在其后24小时，将IL-1 (500 u L无菌生理盐水中含有lOOng) 或者生理盐水(500 yL)的第二次关节内注射进行相同关节的注射(注射_2)。在(补充 开始之前)、注射-1和注射_2 (注射之前)、注射-2-2 (第二次IL-1注射之后8小时)之 前那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕骨间关节抽取大约1. 5mL滑液。* 表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理中生理盐水与IL-1之间有显著差异。 SEQ马具有比C0N马显著更多的滑液[GAG]。当p彡0. 05差异是显著的。图10 注射了 IL-1 (10ng注射-1，lOOng on注射_2)或者生理盐水的C0N(A)和 SEQ(B)马的腕骨间关节的周长。健康的马用含有安慰剂(C0N)或者Sasha’ s EQ(SEQ)食 物喂养28天。在补充开始14天之后(注射-1)，将关节内IL-l(500iiL无菌生理盐水中 含有10ng)注射到腕骨间关节，并使用无菌生理盐水(500 yL)向对侧关节注射。在其后 24小时，将IL-1 (500 u L无菌生理盐水中含有lOOng)或者生理盐水(500 u L)进行相同关 节的注射(注射_2)。在(补充开始之前)、注射-1和注射_2 (注射之前)、注射-2-2 (第 二次IL-1注射之后8小时)之前的那天以及第二次IL-1注射后的第1、3、7和14天从腕 骨间关节抽取大约1.5mL滑液。*表示在处理中注射-1的显著变化。字母表示在处理中 生理盐水与IL-1之间有显著差异。SEQ马中IL-1注射关节的关节周长明显小于C0N马(p <0.001)。当p < 0.05时，差异是显著的。图11 表1示出了用于聚集蛋白聚糖和肌动蛋白的引物。图12 表2示出了制备的Sasha’ s EQ粉末的成分，其由鲍鱼(AB)，新西兰绿唇贻 贝(NZGLM)，鲨鱼软骨(SC)和 B0(lnterpath Pty Ltd, Australia)混合制成。图13 表3示出了用于喂马的SEQ的养分组成。图14 侧柏油提取物的色谱分析波谱。
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图15 示出了细胞培养测定中每个分离馏分的NO浓度。图16 示出了分离的馏分Frl和FI诱导PGE2的水平。图17 示出了分离的馏分FV和Vi诱导PGE2的水平。图18 示出了 IL-1 3诱导的PGF2a水平占馏分Frl和Fri比例的降低。图19 示出了 IL-1 3诱导的PGF2a水平占馏分FrV和FrVi比例的降低。
具体实施例方式为了便于理解本发明，使用的各种术语和缩写定义如下“SEQ”是指新西兰绿唇贻贝、鲍鱼、鲨鱼软骨粉和侧柏油的混合物。“B0”是指从植物侧柏种子中提取的“侧柏油”。“NZGLM”是指新西兰绿唇贻贝。“sim”是指模拟消化或者模拟的消化。“ C0X ”或者“ cox，，是指环氧合酶。“iNOS”是指可诱导的一氧化氮(NO)合成酶。侧柏是来自中国西部和北朝鲜的本土草药，并且已知其具有许多别名，诸如Thuja orientalis, Platycladus stricta L^i,^. Platycladus orientalis。早期的报道表明，鲨鱼软骨、NZGLM和鲍鱼的模拟消化在关节炎的软骨外植体模型 中通过减少PGE2、GAG和/或一氧化氮而具有抗炎效果(Pearson等人，2007)。下面的数据报道了与使用所有四种成分(SEQ ；SEQsiffl)结合的模拟消化调节软骨 外植体有关的基因表达的改变，并描述了它们对IL-1-诱导的PGE2、GAG、NO、细胞活力和 cox Ucox 2、iNOS以及聚集蛋白聚糖的基因表达的影响的特征。方法外植体培养从本地屠宰场获得市售猪(5-7个月大，200-250磅)的前腿。将腿在碎冰上冷冻 直到解剖。使用无菌技术，切开腕骨间关节并使软骨表面暴露。将4mm长的皮肤活检穿刺 针用于从腕骨间关节的两个关节运动表面的承重区获取健康软骨的外植体(厚度约0. 5mm 厚；ll_15mg/外植体)。将软骨片用添加了 NaHC03的DMEM营养液中洗涤三次。将两个软 骨片置于24孔组织培养板的每个孔中，其中含有添加了氨基酸、亚硒酸钠、硫酸锰、NaHC03 和抗坏血酸(TCM-组织培养基)的DMEM营养液。将培养板在潮湿环境下在37°C，7% C02 中培养144小时。每24小时将培养液完全抽吸到lmL的微量离心管中，并在将其返回到培 养箱中之前立即替换成对照、条件培养基和/或刺激培养基(见下述)。将收集的培养液储 存在-80°C下直到分析。在每次实验结束时收集软骨，并以每孔一个外植体进行细胞毒性染 色，并将剩余软骨立即在-80°C条件下冷冻保存。模拟消化和超滤作用进行模拟消化过程是模仿胃肠道对摄入膳食补充品的处理过程。该类型的方法 先前已经被用于提高假定保健食品的生物评估的准确性(Rininger等人，2000 ；Pearson等 人，2007)。使用SEQ (0. 85g)、B0 [2. 5mL (0. 85g)]和 indo (0. 074g-阳性抗炎对照)来制备模 拟消化液。将每种测试物质单独悬浮在35mL的模拟胃液(37mM NaCl,0. 03N HCl，3.2mg/mL胃蛋白酶)中，并在37°C下摇动2小时(Rininger等人，2000)。此后，向酸性溶液中加 入等当量体积的2. 2N NaOH(l. 15mL)进行中和。将36. 15mL的模拟肠液(Rininger等人， 2000-30mM K2HPO4,160mM NaH2PO4 ；20mg/mL胰酶；pH调节至7. 4)加入到其中并且将得到的 混合物在37°C培养箱中继续摇动2小时。使用相同方法处理但不包括任何测试物质来制备 “空白”。分离出近似于人类胃中的合适体积的胃液和肠液(Marciani等人，2005)。当完成4小时的培养之后，SEQ(SEQsim)BO(BOsim)和消炎痛(indosim)的模拟消化液 在4°C下以3，000 Xg离心25分钟。弃去上清，并在4°C下以3，000 Xg第二次离心15分钟。 将得到的上清液加热至室温并过滤(0. 22 μ m)除去微粒。将该滤液使用50kDa分子量的超 滤离心装置进行进一步的分离(AmiconUltra，Millipore, Mississauga ON)，以 3，OOOXg 的速度旋转25分钟(室温下)。将滤出的模拟消化液储存在4°C下直到使用，最长贮存7 天。SEQsim和BOsim对IL-1-诱导的炎症的作用按照上面的介绍制备SEQsim。按照上述方法制备来自12头猪的外植体，并在最初 的24小时内将外植体保持在非条件(unconditioned)培养基中。在培养24小时之后，将 SEQsim, BOsim(0,0. 06 或者 0. 18mg/mL)或者 indosim(0. 02mg/mL)添加到 TCM(条件培养基) 中。在实验期间每24小时更换一次条件培养基。培养72小时后，此后的每24小时，使用 IL-I (0 或者 10ng/mL ；Medicorp, Montreal, Quebec ；Cat. #PHC0813)刺激外植体。将来自 每个动物的外植体在每种处理中进行两次重复。外植体总共培养120小时。分析培养基的 [PGE2]、[GAG]、[NO]。每种处理的一个外植体收集于无菌磷酸缓冲液(PBS)中并立即染色 以便观察细胞活力(见下)。第二个外植体在-80°C冻存用于RNA提取(见下)。PGE2 分析使用市售PGE2ELISa试剂盒(该试剂盒与PGE1有7 %的交叉反应)(Amershan， Baie D' Urfe, Quebec)测定TCM的PGE2浓度。使用吸光度设为405nm的Victor 3酶标 仪(Perkin Elmer,Woodbridge ON)对培养板进行读取。对每个板绘出PGE2标准曲线，其中 将具有R2 ^ 0. 99的最佳适配三阶多项式方程用于计算每板样品和标准品的PGE2的浓度。NO 分析通过格里斯反应测定组织培养基的NO浓度(Shen等人，2005)。使用吸光度设 为530nm的Victor 3酶标仪对培养板进行阅读。对每个板绘出硝酸钠标准曲线，将具有 R2 ^ 0. 99的最佳适配线性回归方程用于计算NO的浓度，并将其与硝酸标准进行比较。总RNA的分离和cDNA的合成使用改良的TRIzoI程序从软骨外植体中提取总RNA (Chan等人，2005)。将来自每 个动物的冻存软骨根据条件和刺激情况进行集中(pool)，并在Tri-Reagent (IOOmg组织/ mL;Sigma, Mississauga ON)中均化。加入氯仿以提取RNA，接着在室温下剧烈震荡并培养 2分钟。然后将样品离心(12，000Xg，15分钟)并使用等体积的70%乙醇(DEPC)使RNA 沉淀。将RNA沉淀物上RNeasy微型柱(Qiagen，Valencia CA, USA)并根据生产商的说明进 行RNA纯化。对于每种集中的样品，根据生产商的说明使用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转 录酶(Invitrogen，Burlington ON)将1 μ g总RNA转化成单链cDNA。通过UV分光光度计 对单链cDNA定量并使用DEPC-H2O稀释至终浓度为IOng/ μ L。
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实时定量RT-PCR制备用于猪的iNOS (Granja 等人，2006)、Coxl/2 (Blitek 等人，2006)、聚集蛋白 聚糖(Fehrenbacher等人，2003)和β-肌动蛋白(持家基因；Nishimoto等人，2005)(表 1)的引物(实验室服务中心，圭尔夫大学)，并储存在-20°C直至使用。对来自SEQsim和 BOsiffl的软骨样品与前面在相同条件下以其他3种SEQ成分进行软骨培养一起进行基因表 达改变的评估(见Pearson等人，2007，详细培养条件)。使用ABIPrism 7000序列测定 系统(Perkin-Elmer)检测25微升PCR反应液，重复三次。使用SYBR-Rox(Invitrogen, Burlington ON)对每种cDNA样品的50ng扩增物进行测定并将其与含有来自每个样品的等 量cDNA的聚合cDNA的标准曲线进行比较。用1. 5%琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物。将每 个样品中每个感兴趣的基因(G)的表达与肌动蛋白(β)的扩增进行比较，并定标为未 刺激的对照外植体(即对于校准器的倍数变化=1)。倍数变化的表达(AG/Δ β)在任意 单元中呈现。细胞毒性染色使用市售细胞活力染色试剂盒(Invitrogen ；Burlington ON) (Pearson等人， 2007)对细胞活力进行测定。简言之，将外植体在500uLPBS中洗涤三次并将其置于96-孔微 孔板(每孔一个外植体)中，并在200uL染色母液(stock stain) (4 μ M C-AM ；8 μ M EthD-1) 中室温下培养1小时。使用10个水平步骤、3个垂直步骤和0. Imm的位移对板从每个孔的 底部进行读取。分别使用485/530nm和530/685nm的激发/发射过滤器获得存活和死亡的 外植体的C-AM和EthD-I荧光。数据分析将来自组织培养基和细胞活力的分析数据以平均士标准误差的方式表示。使用 将每次处理与未处理的对照和消炎痛处理的对照相比较的变化的双向重复测定分析对来 自每次处理/动物的复本的平均值进行分析。使用史蒂特氏t检验(Student’ s t-test) 将刺激对照与所有其他处理单独进行比较分析细胞活力数据。当得到显著的F-比例时，采 用Holm-Sidakpost-hoc检验用于确定处理和/或时间之间的显著性差异。如果ρ < 0. 05 则显著性是可接受的。由于软骨外植体的细胞构成密度(cellularity)低，需要将暴露在相同条件和刺 激下的外植体的RNA集中以便提取足够的RNA用于逆转录反应。因此，在本文中PCR数据 以相对于测定变化的肌动蛋白士系数的基因表达(相对于对照校准)的平均变化来 表示。校准的倍数表达变化(calibrated fold expression change)彡2时，则被认为是 生物学上相关的(Yang等人，2002 ；Schena等人，1995)，并且在本文中作为显著性差异进行 讨论。结果PCRCox 1 (图1，A和B)与未刺激的对照相比，对照外植体的IL-I刺激导致cox 1表 达增加了 35%。通过暴露在indosim下，未刺激和刺激的外植体中Cox 1表达分别降低了 98%禾口 91. 5%。在未刺激的外植体中所有SEQ中的成分均降低了 cox 1的表达(范围76_95%抑 制)。重要的是，观察到BOsim (0.06mg/mL)是最有效的cox 1抑制剂，使未刺激和刺激的外植体中cox 1的表达都降低了 95%。另外，观察到在未刺激的外植体中，SEQsim(0. 06和0. 18mg/mL)使cox 1的表达 分别降低了 90%和80%。在IL-I刺激的外植体中，SEQsim(0. 06和0. 18mg/mL)分别将 cox 1的表达抑制了 57%和76%。在IL-I刺激的外植体中效果最差的cox 1抑制剂为 NZGLM (0. 18mg/mL)，其将 cox 1 的表达增加了 62%。对于所有样品在cox 1中的倍数变化都大于2，因此不能认为是显著的。Cox 2 (图2，A和B)对照外植体的刺激导致cox 2表达增加4. 3倍。在未刺激 和刺激的外植体中Indosim将cox 2的表达分别降低了 44%和47%。对于indosim处理的 IL-I刺激的外植体cox 2表达的倍数增加是显著的(2. 3)。在未刺激的外植体中，鲍鱼(0. 18mg/mL)显著增加了 cox 2的表达，显示与IL-I 对COX 2(3. 7倍)的相同作用。在未刺激的外植体中所有其他成分均降低了 Cox 2的表达 (范围56% -90% )。在使用indosim处理的那些外植体中，IL-I刺激导致COX 2表达显著增加 (2. 3-倍)，SEQsim (0. 06mg/mL ；2. O 倍)，NZGLMsim (0. 18mg/mL ；28. 2 倍)以及 ABsim (0. 18mg/ mL ；41. 5倍)。所有其他成分均防止了 IL-I诱导的cox 2表达的显著增加；最有效的抑制 剂为BOsim(0. 06mg/mL)，其将cox 2的表达抑制了 92%.iN0S(图3，A和B)对照外植体通过IL-1刺激导致iNOS表达增加了 287倍。 Indosim调节在未刺激外植体中对iNOS没有影响。在IL-I刺激的外植体中，indosim调节增 加了 IL-I对iNOS表达的影响(增加725倍)。SEQ和所有其单独的成分均显著增加了未刺激外植体中iNOS的表达(范围 39-2486倍增加)。IL-I刺激导致所有处理的外植体中iNOS表达显著增加。但是，与IL-I刺 激的对照相比，两种剂量的SEQsim(对于0. 06mg/mL和0. 18mg/mL分别抑制了 60%和89% ) 以剂量依赖的方式显著抑制了 iNOS表达。BOsim(0.06mg/mL)和ABsim(0. 18mg/mL)还分别显 著使IL-I-诱导的iNOS表达抑制了 55%和12%.聚集蛋白聚糖(图4，A和B)使用IL-I刺激的对照外植体导致聚集蛋白聚糖表 达有轻微的，不明显的下降。未使用indosim刺激的外植体的处理导致聚集蛋白聚糖表达增 加了 58倍。这种增加通过使用IL-I刺激indosim处理的外植体被完全消除。在未刺激外植体中SEQ及其所有成分都显著增加了聚集蛋白聚糖的表达。在未 刺激外植体中，SEQsim以剂量依赖的方式增加了聚集蛋白聚糖的表达(对于0.06mg/mL和 0. 18mg/mL分别增加42. 8倍和215. 7倍)。在SEQ及其所有成分中使用IL-I刺激的处理的外植体导致聚集蛋白聚糖的表达 增加，但SCsim除外(0. 18mg/mL ；增加1. 4倍)。组织培养实验PGE2 (图5，A和B)在48小时的刺激时间段使用IL_1 (10ng/mL)刺激的对照外植 体，导致培养基中[PGE2]显著增加，导致刺激和未刺激对照之间的显著差异(ρ = 0. 03)。与 刺激和未刺激对照相比，在IL-I刺激和未刺激外植体中Indosim(0. 02mg/mL)分别显著降低 了 [PGE2]。在使用indosim处理的外植体中培养基[PGE2]没有IL-I诱导的显著增加。使用IL-I刺激经SEQsim处理的外植体(0. 06mg/mL和0. 18mg/mL)没有增加培养 基中的[PGE2]。与刺激和未刺激对照外植体相比培养基中的[PGE2]显著低于这些外植体(图5，A)。在使用SEQsim(0. 06mg/mL和0. 18mg/mL)处理的的外植体中，在未刺激的外植 体中培养基中的[PGE2]比未刺激的对照更低(图5，B)。在IL-I刺激和未刺激外植体中， SEQsim(0. 06mg/mL和0. 18mg/mL)与indosim之间的培养基中的[PGE2]没有显著变化。在使用BOsim(0.06和0. 18mg/mL)处理的外植体中IL-I暴露之后培养基中的 [PGE2]没有明显增加(图5，A)。使用BOsim(0. 18mg/mL)处理的IL-I刺激的外植体的调节 导致比刺激的对照中更低的培养基[PGE2]。BOsim对未刺激的外植体没有显著影响(图5， B)。NO 在未刺激的对照外植体中培养基中的[NO]没有明显变化。将对照外植体暴露 于 IL-I (10ng/mL)导致在 24 小时(1. 21 士0. 1 μ g/mL)和 48 小时(1. 06士0. 1 μ g/mL)时培 养基中[NO]的明显升高。在刺激或者未刺激外植体中indosim对[NO]没有明显影响(图 7)。讨论这些实验有助于描述SEQ的模拟消化对cox Ucox 2、iNOS和聚集蛋白聚糖基因 表达的影响。这些基因表达数据可被用于进行有关SEQ的作用机制的预测。在IL-I刺激的对照外植体中观察到的基因表达改变显示了与炎症应答一致的模 式。IL-I刺激导致小的不明显的与cox 2表达明显增加相耦合的cox 1表达增加，如同由 其他作者报道的那样(Kydd等人，2007)。如图所示的那样，indosim显示了 cox 1 cox 2抑制分布(profile)大约为2 1， 这与其作为cox 1/2类抑制剂的分类相一致(Gerstenfeld等人，2003)。我们已经证实了 indosim不抑制IL-I诱导的iNOS表达，这与其他作者的报道相一致(Palmer等人，1993)。 其不影响IL-I刺激的外植体中IL-I介导的聚集蛋白聚糖表达，即一种已经在机械应力软 骨外植体中报道的效果(Iimoto等人，2005)。这些数据描述了消炎痛通过对cox抑制作为主要的有效的消炎药物的特征。其不 能降低IL-I介导的聚集蛋白聚糖的表达，并且其增加了对IL-I介导的iNOS表达的影响。 然而，其表明暴露于消炎痛的软骨将通过在基质形成中减少而继续退化，并可忍受增加的 一氧化氮介导的细胞凋亡。事实上，这些副作用已经在使用预防性消炎痛的患有关节炎的 狗中报道过(Himgin和Kean 2001)，并且消炎痛与人类关节炎中的一些生理指标的恶化有 关(Rashad等人，1989 ；Huakinsson等人，1995)。在目前的研究中当将indosim施加到软骨 外植体上时，IL-I介导的NO产生增加，但这与细胞活力下降无关。在两种剂量下SEQsim对cox 1 cox 2表达的相对抑制分布大约都是1 1。在 本文描述的实验中，低剂量的SEQsim与作为cox 2抑制剂的indosim是类似的，而高剂量的 SEQsim是比indosim更为有效的cox 2抑制剂。因此可以预测，SEQsim将通过IL-I刺激的外 植体有效抑制PGE2的产生。在组织培养外植体实验中观察到这种抑制。IL-I介导的PGE2产生通过SEQsim处 理的软骨外植体的抑制在两种剂量下都是显著的，并且与通过indosim的PGE2的抑制没有 统计学上的差异。这提供了对于SEQ在观察到的减轻关节炎患者的痛苦的临床益处的解释 (Rukwied 等人，2007 ；Zhao 等人，2007)。更早的出版物已经报道，SCsim和NZGLMsim通过IL-I刺激的软骨外植体抑制了 PGE2 的产生(Pearson等人，2007)，本申请中的数据显示BOsim也具有这种作用。但是，其意义在
12于，除SCsim以外(0. 18mg/mL)，最有效剂量的SEQsim对cox 2的抑制比任何单一成分单独抑 制都更强。这指明了这些成分之间的协同关系。假定有效的PGE2抑制，以及相关的SEQsim的cox抑制性质，研究了 SEQsim对iNOS 的影响。使用标准‘NSAID-样’机制，预测了 SEQ还可以增加IL-I刺激的外植体中iNOS的 表达。事实上，真实的情况是相反的，并且发现SEQsim明显并强烈地抑制了 iNOS的表达。IL-I对iNOS和cox 2的细胞表达的影响通过至少2种丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK)的活化而受到差异调节(LaPointe和Isenovi 1999)。iNOS和cox 2的净表达(Net expression)至少部分依赖于细胞周围的NO和PGE2的相对量(Shin等人，2007)。因此，增 加细胞周围的NO可有效地降低cox 2的表达，反之亦然(Shin等人，2007 ；Kim等人，2005)。 这提供了有关为什么SEQsim显示了对iNOS的明显抑制效果而同时许多单个成分包括鲨鱼 软骨、鲍鱼和NZGLMsim(0. 18mg/mL)实际上增加了 iNOS的表达的一些解释。结论SEQ能够有效下调iNOS和cox 2的RNA。其对iNOS和cox 2的影响似乎是由于 其四种成分之间的协同作用，但也可能与NO产生的翻译后抑制有关(Pearson等人，2007)。马的软骨炎症模型被广泛报道，包括关节内激发(challenge)诸如脂多糖 (Jacobsen等人，2006)、弗式完全佐剂(Toutain和Cester 2004)或者碘乙酸钠(Welch等 人，1991)；或者外科破裂，包括骨软骨碎片的形成(Frisbie等人，2007)、局灶性挫伤冲击 伤害(focal contusion impact injuries, Bolam 等人，2006)以及韦刃带横断(Simmons 等 人，1999)。虽然这些模型能够使得软骨以及相关的软骨下骨和软组织内复杂的炎症机制最 大活化，但它们代表了主要的创伤性炎症应答。它们几乎不代表初始或者亚急性关节炎的 更细微的生物化学、功能和生理途径变化，这些变化描述了赛马跛行的大多数情况的特征 (Steel 等人，2006)。虽然非甾类消炎药(NSAID)和皮质类甾醇仍然是用于明显的临床跛行的重要治 疗来源，对于患有低级别、亚急性关节损伤的马和患有进行性关节问题的那些来说，保健食 品正在作为治疗和预防目的而广泛使用(Trumble 2005 ;Neil等人，2005)。大部分的研究 报道了使用体外模型时，这些产品在关节炎中的效力和/或安全性(Pearson等人，2007 ； Chan等人，2006)，或者非马物种的外伤性损伤或临床体内研究(McCarthy等人，2006 ；Cho 等人，2003)。虽然作为筛选工具是有用的，但体外模型不能说明可影响关节内的结果的食 品的综合作用。该部分的目标是a)在马中关于PGE2和NO的产生以及来自软骨的GAG释放来生 产IL-I诱导的关节内炎症的可逆亚临床模型并描述其特征；和b)将该模型应用于哺乳动 物尤其是马中SEQ的评估。方法食物根据表2中提供的组成，通过将鲍鱼(AB)、新西兰绿唇贻贝(NZGLM)、鲨鱼软 骨(SC)和侧柏油(Interpath Pty Ltd, Australia)混合在一起制备SEQ粉末。混合的SEQ 定量通过将 SEQ粉末(10g/kg)、糖蜜(20g/kg)和调味料(Essential Sweet Horse Essence D 2344. Essentials Inc. Abbotsford, BC.) (lg/kg)与甜饲料马定量(表 2)来制备，并以 5kg为一批在食物搅拌器中搅拌直至完全混合。对照定量(CON)使用与糖蜜( 20g/kg) 和调味料(lg/kg)混合的相同的甜饲料食物来制备。
马将11匹健康没有关节炎征兆的马(3匹纯种马，8匹标准竞赛用马，年龄为 5-12岁；10匹阉割的公马，1匹母马)随机分配到A组(SEQ ； 1.5kg/天；η = 6)或者B组 (CON ；1. 5kg/天；η = 5)。28天的实验包括两个阶段-阶段1 预处理(14天)；阶段2 处理(14天)。在第0天开始补充营养直到实验结束(图6)。在第0 (前)、14 (注射-1)、 15 (2个样品注射-2-在注射之前立即收集；注射-2-2-注射后8小时小时收集)、16 (第1 天)、18(第3天)、21(第7天)和28天(第14天)进行收集样品；在这些天从颈静脉收集 血液，并通过无菌关节穿刺术从两个腕骨间关节获取滑液样品(见下述)。在第14天(注 射-1 ； IOng溶入500 μ L无菌生理盐水中)和第15天(注射_2 ；IOOng溶入500 μ L无菌生 理盐水中)将炎症激发(inflammatory challenge)-重组白细胞间介素-1 β (IL-I)-注射 到左右腕骨间关节内。将等体积的无菌生理盐水注射到对侧腕骨间关节内。作为关节积液 指示物的关节周长在每次关节液取样时使用带尺测定。在白天内将所有马关在小牧场里并在夜间关在马厩内。它们躺在木屑上休息并随 意提供干草、水和矿物盐。根据加拿大动物管理理事会的指南，所有过程被圭尔夫大学动物 管理委员会认可。关节穿刺术刮削左右腿的两个膝盖，并使用洗必太(4% )准备进行无菌消毒，使 用70%异丙醇冲洗。将无菌的22规格的1.5"针插入到左腕骨间关节的侧面。然后连接 一个3cc的无菌注射器，并抽取大约1. 5-2mL滑液并立即注入无菌K2-肝素真空采血管。然 后对右侧腕骨间关节重复该过程。在第14天(注射-1)和第15天(注射-2)，在抽取滑液 之后除去针头借口之前将IL-I (500 μ L)注射到右侧或左侧对侧的任一个中(将500 μ L生 理盐水注射到对侧关节内)。将大约1. 5mL滑液从真空采血管中移去并置于微量离心管中 并以11，OOOXg旋转10分钟以除去细胞杂质。将上清液置于含有10 μ g消炎痛的另一微 量离心管中，并在-80°C下冻存直到用于PGE2、GAG和NO分析。在已经收集到滑液之后将消 炎痛加入到滑液中，以便防止样品储存期间PGE2的进一步形成。将剩余 0. 5mL滑液送到 动物健康实验室(圭尔夫大学)用于细胞学分析。滑液的细胞学从真空采血管吸去1. 0-1. 5mL液体用于PGE2、N0和GAG分析(见下)，并且在动物 健康实验室中，用大约0. 5mL的液体去分析其总的有核细胞数(Coulter Z2计数器Beckman Coulter Canada Inc. MississaugaON)，蛋白质(折射计)和细胞分化(对100个有核细胞 进行)。滑液[PGE2]将滑液解冻到室温，然后使用20 μ L透明质酸酶(lOmg/mL)在试管摇床上37°C 下培养30分钟以便消化透明质酸。然后将样品使用蚁酸(0.1%)按照1 2稀释并 在12，000Xg下离心10分钟。弃去上清，并通过市售ELISA试剂盒(GE Amersham, Baie D' Urf6，Qu6bec)分析PGE2。使用提供的裂解试剂将PGE2从样品中提取从而使PGE2从可 溶性膜受体和结合蛋白中分离出来，然后根据试剂盒的使用说明进行定量。使用Victor 3 酶标仪(Perkin Elmer, Woodbridge ON)将吸收度设定为450nm对板进行阅读。对每个板 绘出最佳适配的3阶多项标准曲线(R2 ^ 0. 99)，并将这些方程用于计算来自每个板的样品 的PGE2浓度。滑液[GAG]
按照上面的描述使用透明质酸酶将滑液样品中的透明质酸消化。滑液的GAG浓度 使用由Chandrasekhar等人(1987)描述的1，9-DMB分光光度测定法来测定。使用稀释缓 冲液将样品以1 3稀释并置于96-孔微孔板中。将每个孔中加入盐酸胍(275g/L)，然后 立即加入150 μ L DMB试剂。将板在黑暗条件下培养10分钟，并在530nm下使用Victor 3 酶标仪读取吸收度。将样品的吸收度与牛硫酸软骨素标准品(Sigma，OakviIleON)的吸收 度进行比较。对于每个板绘出最佳适配线性标准曲线(R2 ^ 0. 99)，并且将这些方程用于计 算对于每个板中样品的GAG浓度。滑液[NO]亚硝酸盐(NO2J，NO的稳定氧化产物通过格里斯反应(Fenton等人，2002)进行分 析。将未稀释的TCM样品加入到96孔板中。将溶解在磷酸(0. 085g/L)中的磺胺(0. 01g/mL) 和N-I-萘基乙二胺盐酸盐(lmg/mL)加入到所有孔中，并在5分钟内在530nm处在Victor 3酶标仪上读取吸收度。将样品吸收度与亚硝酸钠标准品进行比较。数据分析和陈述将双因素重复测量(RM)方差分析(ANOVA)用于测定处理之间的差异。当得到显著 的F-比例时，将Holm Sidak post-hoc检测用于识别处理之间的差异。将单因素RM ANOVA 用于测定以时间为参照的处理之间的差异。对于血液和滑液数据，数据的单因素比较可分 别针对注射前和注射-1数据来进行，如同对于食物和IL-I注射的每个所表示的基线那样。 数据以平均值士SEM来表示。除非另有说明，生物化学和血液学的数据的图示按照生理学 参数间隔的比例绘制。参考间隔是由圭尔夫大学的动物健康实验室公布的那些(http:// www. labservices. uoguelph. ca/units/ahl/files/AHL-userguide. pdf)。结果滑液PGE2 CON马在任何时候，注射了生理盐水的关节中滑液的[PGE2]没有显著变化(图 7，A)。相对于注射前的浓度，在IL-I注射的关节中，[PGE2]在注射-2-2中显著增加 (321.3±161.8pg/mL;p = 0.04)，此时注射了 IL-I的关节中滑液[PGE2]明显比注射生理 盐水的关节中高(P < 0. 001)。SEQ马数据表示η = 5，一个含有非正常值的马被从分析中除去。PGE2在SEQ马 注射了生理盐水的关节中没有发生变化。与CON马类似，在SEQ马的IL-I注射的关节中 [PGE2]的增加在注射-2-2处被阻止(175. 4士89. 2pg/mL)(图7，B)。但是，当与注射前浓 度相比，这种增加并不显著。与CON马相比对生理盐水注射产生应答的PGE2在SEQ马中没 有差别。与注射了生理盐水的SEQ马相比，对IL-I注射产生应答的PGE2没有显著差异。虽然在SEQ马中在注射-2-2处平均[PGE2]大约是CON马的55%，平均值的变化 没有导致食物之间的明显差别。GAG CON 马在注射-1(18. 3 士 6. 8μ g/mL)和第 1 天(48. 1 士 9. 6μ g/mL)之间 注射了生理盐水的关节中滑液[GAG]增加(图8，A)。IL-I的注射(IOng)引起了注 射-1 (24. 5 士 7. 3 μ g/mL)与注射-2 (77. 6 士 4. 4 μ g/mL)之间的滑液[GAG]明显增加。与注 射前浓度相比，在注射-2-2 (66.0 士9. 6 μ g/mL)和第1天(53. 3 士 11. 4 μ g/mL)，在注射了IL-I的关节中滑液[GAG]保持显著地提高。注射IL-I的关节中滑液[GAG]增加的数量明 显高于注射生理盐水的关节(P = 0. 003)。SEQ 马在注射前(生理盐水29. 3士5. 9μ g/mL ;IL-1 :27. 0士 10. 8μ g/mL)与注 射-1(生理盐水85. 5士28. 0 μ g/mL ；IL-I 83. 2士27. 9 μ g/mL)之间，注射生理盐水和注 射IL-I的关节中滑液[GAG]都趋于增加(ρ = 0. 09)，这表明饮食对滑液[GAG]的影响(图 8，B)。在整个实验过程中，注射了生理盐水或者注射了 IL-I的关节中滑液[GAG]没有明显 变化。注射IL-I和注射了生理盐水的关节中滑液[GAG]没有显著差异。在SEQ马中，注射IL-I和注射了生理盐水的关节中滑液[GAG]明显高于CON马(ρ <0.001)。这种差异主要是由于食物的作用，而不是IL-I的作用，事实证明，在任何注射 IL-I之前GAG浓度已经增加。NO:CON马注射了生理盐水和注射了 IL-I的关节中滑液[NO]低，并且在实验过程中 是变化的。在CON马中在该时间内无论是注射生理盐水还是注射IL-I对NO水平都没有显 著影响(数据未示出)。滑液[NO]的量值在注射IL-I与注射生理盐水的关节中是相同的。SEQ马在实验过程中的任何时刻，注射了 IL-I或者注射生理盐水的关节中滑液 的[NO]没有变化。在任何时刻，IL-I或者生理盐水之间没有显著差异。食物对IL-I注射或者生理盐水注射的关节中滑液[NO]没有明显影响。滑液的细胞学CON马注射前通过在注射-2(40. 17士 16. IX 109/L)给予外源IL-1 (IOng)，总 细胞数(0.61±0.1X107L)显著升高。在第二次注射IL-I(IOOng)之后细胞数没有进 一步增加，但在第1天内，细胞数保持轻微上升(但不显著)。注射了生理盐水的关节中 (0.6±0.2X109/L)注射-1细胞数适度增加，在第一天达到最大值(6.0士2.6\109/1)，但 这种增加也是不显著的。注射了生理盐水和IL-I的关节中总细胞数在注射_2[即在第一 次IL-I注射(IOng)之后24小时]时有明显差异。细胞数的增加主要是由于嗜中性粒细 胞相对百分含量的增加。在第一次注射之后嗜中性粒细胞的百分比在注射了生理盐水和注 射了 IL-I的关节中都明显增加。在第一天到第三天之间在没有进一步增加实验的剩余物 的情况下，嗜中性粒细胞计数在注射了生理盐水和注射了 IL-I的关节中都明显降低。注射 了生理盐水和注射了 IL-I的关节中的嗜中性粒细胞百分比没有差异(数据未示出)。SEQ马注射前通过在注射-2(27.5±8.7X109/L)给予外源IL_1 (IOng)，总细胞 数(0.4士0.03X107L)明显升高。细胞数没有在注射-2-2后进一步增加，但在注射的第 1天内保持明显上升。注射了生理盐水的关节中(0.4±0.1X107L)注射-1总细胞数适 度增加，在注射-2-2达到最大值(4.0士2.6X107L)，但这种增加也是不显著的。注射了 生理盐水和IL-I的关节中总细胞数在注射_2 (即在第一次IL-I注射IOng之后8小时)、 注射-2-2 (即在第二次IL-I注射IOOng之后8小时)以及第一天(即在第二次IL-I注射 IOOng之后24小时)时有明显差异。在第一次注射之后在注射了 IL-I和注射了生理盐水 的关节中嗜中性粒细胞的百分比都明显增加。注射了生理盐水的关节的嗜中性粒细胞浓度 的增加归因于由注射创伤引起的较小炎症。随着在第7天的第二次显著阻止，在第一天到 第三天之间嗜中性粒细胞计数(％ )在注射了生理盐水和注射了 IL-I的关节中都显著降 低。注射了生理盐水和注射了 IL-I的关节中的嗜中性粒细胞百分比没有差异。
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注射了 IL-I和注射了生理盐水的关节中SEQ和CON食物对总细胞计数或者嗜中 性粒细胞百分比没有显著影响。CON 马通过注射 IOng IL-1 (20士0. Og/L 到 39. 4士4. Og/L)，滑液[蛋白质]明显 增加(图9，A)。在注射IOOng IL-I后，[蛋白质]不再进一步增加，并且在注射IOOng 24 小时之后明显下降。生理盐水的注射还导致在第一次注射之后[蛋白质]立即明显增加， 然后回到第一天的基线浓度(25.5±1.5g/L)。在整个实验过程中，注射了 IL-I的关节中 [蛋白质]增加量值明显高于注射了生理盐水的关节(P = 0.01)。SEQ 马与注射-1(20士Og/L)相比，注射 IOng IL-1 导致在注射 _2 (38. 7士4. 9g/ L)、注射-2-2(36.2±4.4g/L)以及第一天(27. 8士3. 8g/L)滑液蛋白质的明显增加(图9， B)。第二次注射IOOng的IL-I注射不再对[蛋白]产生影响。与注射_1 (20. 6士0. 6g/L) 相比，在注射-2-am(27. 5士3. Og/L)和注射-2_pm(25. 8士2. 5g/L)的情况下注射生理盐水 也导致[蛋白质]的明显增加。注射了 IL-I的关节中[蛋白质]增加量值明显高于注射 了生理盐水的关节(P = 0. 003)。注射了 IL-I或者生理盐水的关节SEQ和CON食物对滑液[蛋白质]的影响没有 显著差异。关节周长CON马随着时间的变化在注射了 IL-I或者生理盐水的关节的周长中没有显著变 化，并且在注射了 IL-I与生理盐水的关节的周长之间没有显著差异(图10，A)。SEQ 马在 SEQ 马中在注射-1(31. 1 士0. 2cm)与注射-2(31. 9士0. 5cm)之间 注射了 IL-I的关节的周长存在明显增加(图10，B)。在下降到注射前水平之前，在注 射-2-2(31. 7士0.4cm)时关节周长保持显著增加。准确地说，注射了生理盐水的SEQ马中 出现了同样的情况。SEQ马中注射了 IL-I的关节的周长明显低于CON马(ρ < 0. 001)。讨论该数据显示了早期关节炎的微创的可逆模型，其可以被用于评估假定的抗炎保健食品。在第二次注射之后的8小时，双倍IL-I注射方案导致在统计上PGE2的明显增 加。在实验过程中，任何时候都没有CON马在行走或者简单小跑时出现明显地跛足现象， 尽管平均峰值滑液[PGE2] (498pg/mL)与马的跛行状况相关联(488pg/mL ;de Grauw等人， 2006)。PGE2W上升并不伴随NO的上升。这给马不出现跛足的现象提供了一种解释，可能 是因为伤害性疼痛的传递和感受主要是由于升高的PGE2和NO的联合作用。CON马已经可 证明适度训练可使他们出现轻度的跛足，但由于训练对滑液[PGE2]的混淆影响而不能进行 (van den Boom等人，2005)。在CON马中观察到的滑液[PGE2]的增加提供了对于关节内轻 度IL-I诱导的炎症的很好证据。我们假设这种增加会被有效的消炎保健食品饮食方案所 降低。炎症细胞的运输(trafficking)以及粘多糖释放到滑液中对IL-I的刺激比产生 PGE2更为敏感，因为在初始IOng IL-I注射之后24小时观察到滑液[GAG]和[嗜中性粒 细胞]的增加。滑液[蛋白质]也在第一次IL-I注射之后立即升高。而进行更高的IL-I 的激发后，这些参数没有进一步的增加。这些应答与‘关节炎前(pre-arthritic) ’炎症状
17态相一致(Adarichev等人，2006)。在关节炎早期阶段表达的基因主要是与趋化因子、细胞 因子(尤其是IL-1)以及金属蛋白酶，尤其是MMP-13和MMP-9的转录相关的那些。趋化因 子是炎症细胞迁移到滑膜空间的强有力的信号。由于滑膜膜上的的滑膜细胞和内皮细胞被 活化以表达细胞粘附分子并产生趋化因子，使渗入到关节间隙中的嗜中性粒细胞极大地增 加，如同在本文中描述的研究中所观察到的滑液[嗜中性粒细胞]急剧增加一样。滑膜的细 胞也变得对血清蛋白的可渗透性增加(Middleton等人，2004)，导致观察到滑液[蛋白质] 的快速增加。MMP-13 (Yammani等人，2006)和MMP-9 (Soder等人，2006)在关节软骨中是关 键的降解酶，在目前的研究中表明在IL-I诱导的滑液[GAG]观察到的情况支持这些酶在早 期关节炎中编码基因的增量调节中起重要作用(Adarichev等人，2006 ；Kydd等人，2007)。 PG-刺激的小鼠中关节炎前软骨的微阵列分析表明，编码磷脂酶C2 (催化来自核膜花生四烯 酸释放的酶)的基因没有升高(Adarichev等人，2006)。这至少可部分解释为什么在IL-I 刺激之后PGE2的增加需要的时间比细胞迁移和GAG的增加更长的原因。使用IL-I的关节内激发没有导致滑液内一氧化氮的持续上升。IL-I诱导的一氧 化氮已经在软骨外植体模型(Pearson等人，2007 ；Petrov等人2005)，从急性关节炎动物模 型中获取的细胞(Kumar等人，2006)以及关节炎的临床案例(Karatay等人，2005)中频繁 地被报道。这些数据提供了用于证明编码可诱导一氧化氮合成酶在早期关节炎中没有增加 的证据的支持(Kydd等人，2007)，其延迟了 IL-I诱导的一氧化氮形成。SEQ提供了对IL-I刺激的关节的保护，原因如下1)滑液[PGE2]没有明显增加； 2)在IL-I激发之前滑液中[GAG]增加，然后防止了 IL-I诱导的GAG增加；以及3)在IL-I 激发之后有限的积液渗入到关节间隙中。作为在关节内IL-I激发之前2周的饮食的一部分，SEQ防止了 IL-1诱导的PGE2 的明显增加。与CON马类似，PGE2对SEQ马中的IL-I产生响应峰值出现在第二次IL-I注 射之后的8小时，但该峰值很低，并且随着时间的变化不导致统计学意义上的明显变化或 者IL-I与生理盐水注射之间的明显差异。这显示了 SEQ减少了在患有早期关节炎的马中 与升高的PGE2有关的炎症与疼痛，并且表明在关节损伤之前使用SEQ饲养马可阻止疾病发 展到更高级的阶段。在注射前和注射-1之间，即炎症激发前SEQ马在注射生理盐水和IL-I两者的关 节中观察到的滑液[GAG]的增加提供了滑液空间内食物GAG的吸收后积累的证据。SEQ依赖四种组分的协同作用，预防关节炎早期的生化指标而起作用。已经出版的文献报道了在提供了食物NZGLM的狗种关节炎症状的明显改善 (Pollard等人，2006)，以及软骨外植体中的葡糖胺和软骨素-SC的主要生物活性成分-对 由IL-I降解的明显保护(Dechant等人，2005)。但是，每克产品的SEQ的体外PGE2抑制效 果远大于其四种组分单独的抑制效果(Pearson等人，未出版)，表明各组分之间具有协同 作用。侧柏油的分馏色谱法使用装配了二极管阵列探测器和自动分馏收集器的Agilent 1200Preparative HPLC对来自侧柏种子的油进行分馏。所用的色谱柱为Agilent Prep C18， 10 μ m(30 X 250mm)，流速20mL/分钟，注射900 μ L的组分4。使用以下的梯度0_5分钟，80%为水，20%乙脲。5-7分钟梯度变化为10%的水、90%的乙脲。7_25分钟时用10%的 水和90%的乙脲。在254nm处实现馏分测定。质谱测定法在Agilent 6210MSD飞行时间质谱仪上以阳离子和阴离子两种模式进行质谱测 定。使用下列电喷雾离子化条件，干燥气体氮气(7mL分钟-1，350°C)；雾化气体氮气 (15psi)毛细电压4. OkV ；蒸发温度350°C以及锥孔电压:60V图14示出了油的色谱分析图谱，如图所示收集了各种馏分并编号。(B)来自侧柏油馏分的消炎潜能为了研究消炎活性，测定Fr UFr i、Fr V和Fr Vi被选择并在浓度彡64 μ g/ml进 行测定。进行测定1) 一氧化氮(NO)水平，2)前列腺素PGE2水平，3)前列腺素PGF2a水平。 第3通道(passage)的NHAC细胞首先用促炎症细胞因子IL-1 β以预定浓度lOng/ml刺激 过夜，然后在IL-I β 10ng/ml存在下将NHAC细胞使用馏分处理24小时，并收集细胞培养上 清液以测定NO、PGE2*PGF2a水平。用测定亚硝酸盐的格里斯试剂盒(Molecular Probes, Invitrogen)根据试剂盒说明进行测定。为了评估PG，使用了高灵敏性PGE2和PGF2aEIA试 剂盒(Assay Designs Inc.)。如图15所示，馏分1 (Fr 1)、FrI和Fr V以剂量依赖的方式(高度显著)降低了 NO的水平。发现Frl是所有四种馏分中最有效的，并且Fr Vi是效果最差的，但仍有一些效^ ο作为阳性对照的非甾类消炎药物消炎痛显著降低了 IL-I β诱导的PGE2水平。所 有四种馏分在任何测试浓度下对这些水平都没有影响(图16和17)。消炎痛显著降低了 IL-I β诱导的PGF2a水平。Fr 1显示了对PGF2a水平完全没 有影响，而Fr i、Fr V和Fr Vi以剂量依赖的方式降低了这些水平(64-32 μ g/mL)(图18 和 19)。迄今为止尚不清楚侧柏油提取物馏分的功效。Fl. 1-1. 4化合物的单独或者作为与 其他组分的一种或多种混合使用都使得病症诸如骨关节炎的治疗显著改善。在本发明的部分或者全部方法步骤和系统组成可进行任何改进。本文中引用的所 有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用结合入本文。除非特别声明，本文中使 用的任何和所有实施例或者举例性的语言(例如“诸如”)都用于解释本发明，而不造成对 本发明的范围的限制。本文中各有关本发明的本质或者优点或者优选实施方式的任何陈述 都不是为了限制本发明，并且所附的权利要求书也不应当被认为受到这些陈述的限制。更 通常地说，本发明的说明书的任何语言均不能被当成未声明的部分，成为本发明实施的基 础。只要适用法律许可，本发明包括叙述主题的所有修改和等同物。此外，除非在本文中 特别指明或者与上下文明显矛盾，本发明包含上面描述的成分及其所有可能变化的任意组
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2权利要求
一种调节有机体中炎症的方法，该方法包括将组合物给药到有机体的步骤，其中该组合物包含来自植物侧柏的治疗剂量的提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步的特征在于所述组合物包括其他提取物，诸 如贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼软骨粉或者它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步的特征在于侧柏提取物可通过模拟胃肠功能 /处理的模拟消化来制备。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步的特征在于所述方法包括抑制有机体中cox 的表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步的特征在于cox为cox1。
6.根据权利要求4所述的方法，其进一步的特征在于cox为cox2。
7.根据权利要求4所述的方法，其进一步的特征在于cox表达的抑制大于70%。
8.根据权利要求2所述的方法，其进一步的特征在于所述组合物为协同组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步的特征在于所述组合物包括浓度为5-30wt% 的来自植物侧柏的提取物，浓度为10-30衬％的鲨鱼软骨，和浓度为40-60wt%的贻贝提取 物。
10.使用选自下组的至少一种化合物生产用于抗炎病症的治疗和/或预防性治疗 的药物，其包括(9Z，13S，15Z)-12，13-环氧十八烷-9,11,15-三烯酸、顺，顺，顺_9，12， 15-十八碳三烯酸(ALA)、顺，顺，顺-6,9,12-十八碳三烯酸(GLA)、顺，顺-9，12-十八碳二 烯酸和9-十八碳烯酸。
11.根据权利要求10所述的用途，其进一步的特征在于所述药物包括其他提取物，诸 如翡翠贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼软骨粉或者它们的组合。
12.—种治疗哺乳动物中抗炎病症的方法，其包括将治疗上有效量的多不饱和脂肪酸 给药到哺乳动物。
13.根据权利要求12的方法，其进一步的特征在于Ω-3脂肪酸选自下组顺，顺， 顺-7，10，13-十六碳三烯酸；顺，顺，顺-9，12，15-十八碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-6,9,12，15-十八碳四烯酸；顺，顺，顺-11，14，17-二十碳三烯酸；顺，顺，顺，顺_8，11，14，17- 二十 碳四烯酸；顺，顺，顺，顺，顺_5，8，11，14，17-二十碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-7，10，13，16， 19- 二十二碳五烯酸；顺，顺，顺，顺，顺，顺-4，7，10，13，16，19- 二十二碳六烯酸；顺，顺，顺， 顺-9，12，15，18，21-二十四碳五烯酸；和顺，顺，顺，顺，顺，顺_6，9，12，15，18，21-二十四碳 六烯酸或它们的混合物。
14.根据权利要求12的方法，其进一步的特征在于Ω-6脂肪酸选自下组顺，顺-9， 12-十八碳二烯酸；顺，顺，顺-6,9,12-十八碳三烯酸；顺，顺-11，14- 二十碳二烯酸；顺， 顺，顺-8，11，14- 二十碳三烯酸；顺，顺，顺，顺-5,8,11，14— 二十碳四烯酸；顺，顺-13,16-二十二碳二烯酸；顺，顺，顺，顺_7，10，13，16- 二十二碳四烯酸；顺，顺，顺，顺，顺-4，7， 10，13，16- 二十二碳-五烯酸或它们的混合物。
15.根据权利要求12的方法，其进一步的特征在于Ω-9脂肪酸选自下组，包括 顺-9-十八碳烯酸；顺-11-二十碳烯酸；顺，顺，顺_5，8，11-二十碳三烯酸；顺-13-二十二 碳烯酸；以及顺-15-二十四碳烯酸或者它们的混合物。
16.根据权利要求12所述的方法，其进一步的特征在于结合脂肪酸选自9Ζ，11Ε-十八碳-9，11- 二烯酸；10E, 12Z-十八碳-9，11- 二烯酸；8E, 10E, 12Z-十八碳三烯酸；8E, 10E， 12E-十八碳三烯酸；8E, 10Z, 12E-十八碳三烯酸；9E, 11E，13Z-十八碳-9，11，13-三烯 酸；9E, 11E，13E-十八碳-9，11，13-三烯酸；9Z, 11Z，13E-十八碳 _9，11，13-三烯酸；9Z, 11E，13Z-十八碳-9，11，13-三烯酸；9E, 11Z，15E-十八碳-9,11,15-三烯酸；9E, 11Z，13Z， 15E-十八碳-9，11，13，15-三烯酸；反，反，反，反-十八碳-9,11,13，15-三烯酸；(9Z，13S， 15Z)-12，13-环氧十八碳-9，11，15-三烯酸；和5Z，8Z，10E, 12E，14Z-二十酸或它们的混合 物。
17.根据权利要求12-16任一项所述的方法，其进一步的特征在于脂肪酸为盐的形式。
18.一种治疗哺乳动物中抗炎症状的药物制剂，其包括治疗上有效量的来自侧柏植物 的提取物。
19.根据权利要求18的药物制剂，其进一步的特征在于所述制剂包括其他提取物，诸 如贻贝提取物、鲍鱼提取物或粉末、鲨鱼软骨粉或者它们的组合。
20.一种用于哺乳动物中抗炎症状的治疗的药物制剂，其包括治疗上有效剂量的多不 饱和脂肪酸。
21.根据权利要求20的药物制剂，其进一步的特征在于所述多不饱和脂肪酸选自下 组，包括(9Z，13S，15Z) -12，13-环氧十八碳-9，11，15-三烯酸，顺，顺，顺-9,12,15-十八 碳三烯酸(ALA)，顺，顺，顺-6,9,12-十八碳三烯酸(GLA)，顺，顺-9，12-十八碳二烯酸、 9-油酸、十一酸、花生四烯酸或者它们的混合物。
全文摘要
一种调节有机体中炎症的方法，该方法包括将组合物给药到有机体的步骤，其中该组合物包含来自植物侧柏的治疗剂量的提取物。侧柏提取物中的一些关键成分已经被鉴定，其已经显示了显著降低炎症应答的效果。
文档编号A61K36/14GK101945662SQ200880126619
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者丹·布莱特 申请人:达西科技有限公司