专利名称：重组失活病毒载体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗疾病，尤其禽类疾病的技术，更具体地，涉及含失活病毒载体和可药用媒介物、佐剂或赋形剂的重组疫苗，所述载体具有插入的编码蛋白的外源核苷酸序列，所述蛋白具有疾病的抗原活性。
背景技术：
众所周知，抗病毒性病原体的疫苗都是从相应病毒配制的，所述相应病毒被分离出来，用于产生疫苗，通过多样化的配制剂给动物或人施用。一方面，有些疫苗制品采用在野生环境显示低致病性的完整活病毒制成，或者采用经实验室减毒后致病性减弱的病毒制成，它们被给药后，引起的抗原反应足以提供抗高致病性的相同种病毒株的保护作用。例如，新城疫(ENC)就是由病毒引起的，传染性很强，而且可能致死。该病感染家禽和野生禽类，引起高发病率和死亡率。ENC由副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus)的病毒引起。这些毒株根据其致病性和毒力强弱划分为轻毒型 (lentog6nicas)，中等毒力型(mesogenicas)和强毒型(velog6nicas)，分别是低、中、高致病性(Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p.576-589)。ENC病毒有多种传播来源。例如，经由肝脏或死禽以及它们的产物或副产物 (subproductos)直接传播，或者经由诸如受感染的昆虫或其它动物、包括人类等载体进行间接传播。引起高死亡率的强毒型ENC病毒(VVENC)的潜伏时间约为21天，显示呼吸道症状和/或神经症状，如呼吸困难(jadeo)，打喷嚏(estornudo)以及共济失调 (incoordinacion) ,MM^jt (alas erizadas) ,ΙΙ Ι δ (arrastre de las patas), ^5] 曲(cabeza, cuello torcidos)，抽搐(tics)，中心移位(desplazamientos en circulos)， 抑郁(cbpresi0n)，无欲(inapetencia)，以及彻底瘫痪(parcilisis completa)。此外，卵的生成被部分地或彻底地中断，形成不成形的卵或有薄薄的粗糙卵壳，内有含水清蛋白。控制和预防ENC的策略之一是应用活病毒(virus activos)疫苗，通常由轻毒株制得。抗ENC的活疫苗诱导出呼吸道粘膜处的保护作用，并已产业化超过50年。这些活病毒疫苗主要是基于应用来自Hitchner Bl和LaSota株的轻毒型病毒，后者是最常用的疫苗 (Op. Cit. , Office International desEpizooties(2008)Newcastle)。然而，因活病毒可被乳液中的一些成分灭活，乳化后的活疫苗的稳定性是有限的。 故而，它们常常用在其它类型的配制剂中，或者，它们通过原位混合来递送，这导致它们在大规模养禽场很难予以应用。活病毒的主要问题在于，它们具有较高的遗传变异能力，与其它活病毒重组，或者可能改变它们的致病特性，如流感病毒，因此它们并不总是能够用作疫苗。流感是能感染哺乳动物和鸟类的呼吸道疾病。流感病毒株在特定人群中的出现可能导致个体(包括家禽、 人类、或其它哺乳动物)的严重后果。当该病毒感染家养的母鸡和哺乳动物时，它们快速发生变化以使得自己适应这个新的群体，在该适应性进化过程中，可能在同一病毒内引起重大的生物学改变，导致宿主和动物或人群的致命后果。具体地，禽流感(IA)是一种强传染性病毒流行病，由正粘病毒科的甲型病毒引起。大多数IA病毒(VIA)都已从野生禽类中分离得到，尤其是水禽，它们起到携带并蓄积低致病性IA病毒(VIABP)的作用。当这些病毒感染非天然宿主，如家禽，主要是鹑鸡类(gallinaceaeM即，母鸡，火鸡，和鹌鹑等)时，它们在适应过程中突变为高致病形式 (VIAAP)。VAI可根据两种病毒外膜蛋白进行分类。第一种是血凝素，是最重要的蛋白，因为它在被感染或被接种的禽体内负责与中和抗体反应，已报道了 16种不同的亚型或血清型。 第二种蛋白是神经氨酸酶，已报道了 9种不同亚型。具体地，对于禽类来说，最重要的病毒是那些具有血凝素血清型H5和H7的病毒，当它们突变为高致病性时，能引起接近100%的
死亡率。同样地，禽类中的IA疾病有两种临床形式第一种是低致病性禽流感(IABP)，它引起轻微的疾病，有时表现出羽毛损坏，产卵量降低。但是，IA对于禽类的重要性占主导地位的，因为该病毒具有较高的突变能力，总是引起第二种临床形式，变为高致病性禽流感 (IAAP)，引发接近100%的死亡率。具体地，IA临床症状是多样化的，受所涉病毒的亚型、致病性、免疫状态以及被感染的禽物种的影响。VIAAP潜伏期为21天，有多种临床症状结膜炎(conjuntivitis)， 以羽毛直立为特征的升温，抑郁，虚脱(postratWn)和死亡。最常提及的损伤是肺充血 (congestion pulmonar),出血(hemorragias)禾口水月中(edemas)。一旦VIA进入家禽饲养所，就可通过粪便和呼吸道飞沫向该环境排菌。病毒向其它禽类的传播和扩散主要是通过直接接触受染禽类的分泌物，尤其是被污染的粪便，食物， 水，器材和衣物。该疾病的易感性和临床表现非常多样化。对于这类难以控制、而且当用药过程中失控可能导致活病毒疫苗对动物甚至人类健康产生危险的疾病而言，优选应用失活病毒的疫苗，通常是经乳化的。现有技术已开发了数种疫苗来预防多种病毒性疾病，如上述IA。对于这后一种疾病，已有经乳化的含IA全病毒的疫苗，是从鸡胚制得的。该病毒已被灭活，在水-油中乳化， 以便经皮下或肌肉途径施用给商用禽类(Officelnternational des Epizooties (2008). Avian influenza. OIE Manual of DiagnosticTest and Vaccines for Terrestrial Animals, Office International des EpizootiesFrance, p.465-481)。更具体地，用失活的IA病毒制得的疫苗在全身刺激出强免疫应答，对控制全部两种IA形式都有积极效果。该免疫接种被用于预防该疾病的临床症状，以及可能地话，减少受染禽类向环境排毒。病毒排出的减少降低了病毒从接种后又被感染的禽类向未被感染过白勺胃胃白勺丰/H (Swayne, D, y Kapczynski, D (2008), Vaccines, Vaccination and Immunology for avianinfluenza viruses in poultry. In Avian Influenza. Ed by David Swayne. BlackwellPublishing, USA, p.407-451)。此外，经过乳化的失活病毒疫苗稳定性增加，能更好地管理疫苗，并延长疫苗的货架期。因此，ENC疫苗已被配制为乳化的失活病毒。重要的考虑是，活病毒疫苗与失活病毒疫苗之间的一个主要区别是用药后实现抗原反应所需的病毒量。由于活病毒具有在细胞中复制自身的完整能力，疫苗中所需相关病毒的量低于引起抗原反应的剂量，这避免了接种疫苗的个体产生不适，考虑到病毒能天然复制，一旦进入机体，能达到实现所需抗原反应的量。另一方面，失活病毒需要比活病毒更高的病毒浓度，通常至少高10-倍，才能达到相同的抗原活性，因为这种病毒经过处理去掉了它的复制能力，致使施用疫苗时必需有足以引起免疫应答的抗原总量，因为该机体不能正常地复制该病毒，病毒量不会增加。另外，生物技术领域最重大的进步之一是重组疫苗的应用。在基因水平分离并剪接(或重组)生物的特定DNA片段，利用载体或DNA质粒将所述片段转移到另外的生物中， 产生抗原，从而诱导保护性抗体的生成，这样的能力导致研发出新的疫苗。与传统疫苗不同，重组技术给诸如IA等因为高突变能力而不能应用活病毒、以及完整失活病毒的应用总是会因灭活操作不当而引起风险的这类疾病带来非常重要的利好。活化的重组疫苗插入了表达抗目标疾病的抗原的必需核苷酸后，可以在具有低致病性的活病毒载体中安全地施用，以诱导呼吸道粘膜局部的免疫力，这在非重组的活病毒情形下是不可能实现的，因为有相关风险。重组疫苗的另一好处是，所用的病毒载体通常不对应于保护作用要针对的疾病，这有利于它们用于兽医诊断和预防技术领域以区分接种过的动物和被感染的动物， 艮口所谓 DIVA (Capua，I et al. , "Development of a DIVA (differentiating infected from vaccinated animals)strategy using a vaccinecontaining a heterologous neuraminidase for the control of avian influenza". Avian Pathology 32(1) pp. 47-55)。可是，目前用于控制IA的疫苗(在油中乳化，完整的失活病毒)和控制其它类似疾病的疫苗防止了由VIAAP引起的死亡，但不能避免VIA在禽类中感染和复制，因此，仅部分地实现了减少排毒和病毒传播。因此，本领域已从低致病性疾病如新城疫中研发出了病毒载体，其中插入了编码难于控制的疾病如禽流感的抗原性位点的基因，例如Ge，Deng，Tianet al. "Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protectschickens and mice",J.Vir. Vol. 81,No. l，p. 150-158”披露的活化重组疫苗。具体地，该文献披露了用带有禽流感亚型H5W基因的LaSota毒株进行临床试验的结果。才目胃令页 白勺 — i ■ : Park, Man Seong et al. "Engineered viral vaccineconstructs with dual specificity :Avian Influenza and Newcastle disease". PNASVo 1. 103, No. 21, May 12，2006p. 8203-8208。该文献涉及增加禽流感基因表达的技术，这种技术在后文称“锚定”。虽然由于上述优势导致一些重组疫苗替代了活病毒疫苗，但重组疫苗尚未实现失活的全病毒疫苗的优势，而且重要的是，它们还未能针对插入的外源基因提供正确的免疫力，这主要是由于，诸如上述新城疫加流感这样的重组疫苗，它们引起抗两种疾病的抗原活性，但要求对插入载体中的外源抗原性位点有更多的接触。结果是，人们继续研发新技术， 如锚定技术，其利用遗传修饰，在上述流感的情况下，在所述病毒载体中得到了更好的抗原表达。但这样的技术尚未取得完全的成功。
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因此，来自活病毒的重组疫苗通常用比来自活病毒的非重组疫苗高出大约10倍的所用病毒载体浓度来配制，以便达到合适的目标微生物抗原性位点暴露量。同样地，重组疫苗尚未用于失活形式中，因为这可能意味着病毒载体的浓度要比正常病毒所需浓度高出100倍(比重组活病毒高出10倍)，这在产业方面会非常复杂。结果是，总体上，这些重组活病毒疫苗从未被作为乳液来用，因为其稳定性有限，而且因为乳液在这方面没有优势，这归因于活病毒载体的活性特征。综上可知，目前非常需要通过重组技术、以安全且有效的方式提供的、具有较高的稳定性、合适的控制和效力结果的抗多样化疾病的疫苗。发明简述研发本发明过程中意外发现，当疫苗包含重组失活的病毒载体，其中插入编码目标疾病之抗原性位点的外源核苷酸序列；且疫苗还包含可药用的经乳化的媒介物、佐剂或赋形剂时，用与基于相同病毒载体的重组活病毒疫苗所需滴度相似的病毒载体滴度，提供抗该目标疾病的预期保护作用。在本发明一个实施方案中，所述外源核苷酸序列选自抗流感(influenza)，传染性喉气管炎(laringotraqueitis infecciosa)，7I专染f生支气管炎(bronquitisinfecciosa), 法氏囊感染(infeccion de la bolsa de Fabricio，Gumboro)，月干炎(hepatitis)，病毒性鼻气管炎(rinotraqueitis viral)，流行性感冒(corizainfecciosa)，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae),巴斯德氏菌病(pasterelosis)，猪呼吸生殖综合征 (Sindrome Reproductivo y RespiratorioPorcino, PRRS),环状病毒(circovirus),博德特氏菌病(bordeteliosis)，副流感病毒(parainfluenza)的抗原位点序列，或，具有能插入相应病毒载体中的大小的任何其它抗原。优选地，采用选自禽流感(influenza aviar), 喉气管炎，传染性支气管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，PRRS，和环状病毒的抗原。在本发明的具体实施方案中，所述外源核苷酸序列由编码禽流感病毒血凝素(HA) 的基因组成，其选自这种流感病毒的16种血凝素亚型或免疫原性变体，更优选编码所述蛋白的Hl，H2，H3，H5，H6，H7或H9亚型中的至少一种。在本发明一具体实施方案中，所述H5基因得自Mexican禽流感病毒亚型H5N2，或得自亚洲起源的亚型H5m，观察到对这两种亚型的非常好的保护作用，抵抗由VIAAP亚型 H5N2所致的死亡率。就本发明的病毒载体而言，在优选实施方案中，新城疫病毒(Newcastledisease virus, rNDV)对应于具有插入的外源核苷酸序列的病毒载体，所述病毒载体优选选自以下疫苗株，如 LaSota，Ulster, QV4, Bi, CA 2002，Roakin, Komarov, Clone 30，或 VGGA 株，或来自新城疫遗传组I至V的株。优选地，所述重组病毒是LaSota株(rNDV/LS)。同样地，在另一具体实施方案中，所述病毒载体是腺病毒，该腺病毒选自禽和猪的腺病毒，更优选来自禽腺病毒9型(rFAdV/9)和猪腺病毒5型(rSAdV/5)。根据下文详述的结果可知，借助本发明，能够用位于病毒载体中的编码目标疾病之特异性抗原决定簇的外源核苷酸序列，在乳液或在其它可药用佐剂中产生重组的失活病毒疫苗。用本发明的疫苗(rNDV/LS_H5)所得的结果是意外的，因为传统上认为，在病毒载体中重组疫苗的情形下，所述病毒载体在宿主细胞中的复制要求重组蛋白的足够表达来刺激合适的免疫应答，但是，在本发明中，所得结果显示，目标疾病的抗原性蛋白在载体病毒表面足量且正确地表达，并且它仅存在于失活形式中，这使得能产生抗所述目标疾病的合适的抗原性和保护性反应。具体地，在高致病性和难于控制的疾病如禽流感中，本发明重组疫苗的一个优势在于，不使用完整病毒，从而减少了疫苗病毒不当失活引起爆发流行的风险。而且，本发明的疫苗在禽类的呼吸道粘膜实现了局部免疫应答，在全身也实现了免疫应答，能通过特定的实验室测试区分禽类与完整病毒(用作疫苗的病毒或野生型病毒)接触引起的免疫应答，代表了流行病学领域的重要进展。所述疫苗被配制成皮下用药；但任何系统性途径如肌肉或皮内给药也可以成功应用。优选给所述疫苗应用液体媒介物，更优选应用油包水乳液，但也能成功应用其它的免疫应答佐剂或调节剂。用本发明的重组疫苗能减少野生型病毒向环境的排毒，从而大大减少病毒的传播。
本发明各个新方面考虑的特征具体如权利要求所述。但是，本发明的疫苗，及其另外的目标和优势，将从以下一些具体实施方式
的详细描述、并结合附图而很好地理解。在附图中图1显示实施例6A的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用强毒型ENC病毒 (VVENC)进行攻击得到的。图2显示实施例6A的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用高致病性IA病毒 (VIAAP)亚型H5N2进行攻击得到的。图3显示实施例6B的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VVENC进行攻击得到的。图4显示实施例6B的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VIAAP亚型H5N2 进行攻击得到的。图5显示实施例6C的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VVENC进行攻击得到的。图6显示实施例6C的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VIAAP亚型H5N2 进行攻击得到的。图7显示实施例6D的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VVENC进行攻击得到的。图8显示实施例6D的死亡率结果(M)和发病率指数(IM)，是用VIAAP亚型H5N2 进行攻击得到的。发明详述研发本发明过程中意外发现，当疫苗包含失活的病毒载体，其中插入编码目标疾病的核苷酸序列；且疫苗还包含可药用媒介物、佐剂或赋形剂时，用与基于相同病毒载体的活病毒疫苗所需滴度相似的病毒载体滴度，提供抗该目标疾病的预期保护作用。本发明的一个基本点是，所述病毒载体是失活的，失活是指，所述重组病毒起病毒载体的作用、并含有编码目标疾病的抗原性位点的核苷酸序列，它失去了复制特性。失活是通过本领域已知的物理或化学方法实现的，优选用甲醛或beta-丙内酯进行化学灭活(Office International des Epizooties(2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for TerrestrialAnimals. Office International des Epizooties. France, p. 576-589)。相反，活病毒是指保持其复制能力。所述病毒载体，优选选自腺病毒或巴拉米哥病毒(paramixovirus)的那些，已失活且插入了编码目标疾病的至少一种抗原性位点的外源核苷酸序列，优选至少一种选自流感，传染性喉气管炎，传染性支气管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，病毒性鼻气管炎，流行性感冒，肺炎支原体，巴斯德氏菌病，猪呼吸生殖综合征(PRRQ，环状病毒，博德特氏菌病， 副流感病毒的抗原性位点，或任何其它具有能插入相应病毒载体的大小的抗原。更优选地， 可以采用选自禽流感，喉气管炎，传染性支气管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，PRRS，和环状病毒的抗原。在本发明的具体实施方案中，所述外源核苷酸序列由编码禽流感病毒血凝素(HA) 的基因组成，其选自该流感病毒的16种血凝素亚型或免疫原性变体，更优选编码所述蛋白的Hl，H2, H3, H5, H6, H7或H9亚型中的至少一种。就本发明的病毒载体而言，在优选实施方案中，新城疫病毒(rNDV)对应于具有插入的外源核苷酸序列的病毒载体，所述病毒载体优选选自以下疫苗株，如LaSota，Ulster, QV4, Bi, CA 2002，Roakin, Komarov, Clone 30，VGGA 株，或来自新城疫遗传组 I 至 V 的株。 优选地，所述重组病毒是LaSota株(rNDV/LS)。同样地，在另一具体实施方案中，所述病毒载体是腺病毒，该腺病毒选自禽和猪的腺病毒，更优选来自禽腺病毒9型(rFAdV/9)和猪腺病毒5型(rSAdV/5)。就抗原性位点而言，当流感是目标疾病时，优选对应于禽流感血凝素(HA)蛋白的抗原性位点，优选得自禽流感病毒的基因，且编码现有16种亚型中的任一种，优选H5，H7和 H9，优选编码亚型H5，其优选得自Bive，435 *Viet(VT)株，如下述。在这方面可以指出， 编码HA亚型H5的基因来源病毒株并非本发明的关键，因为实验表明，任何病毒株都能提供用于实现本发明目的的遗传物质。就优选的基因来源而言，值得一提的是，来自Bive株的H5基因对应于1994年在墨西哥从嫩鸡生物标本分离出的VIABP-H5N2，墨西哥政府将其鉴定为(A/chi cken/ Mexico/232/CPA) ο 该病毒株已被"Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y AlimentacWn (SAGARPA) ”批准用于大规模生产乳化的失活疫苗，因此，用目标基因对该病毒进行重组也确保了本发明重组疫苗的安全性。第二优选的遗传物质是H5-435基因，它来自2005年在墨西哥从嫩鸡生物标本分离出的 VIABP-H5N2。本发明疫苗的病毒载体可以如下制得对目标核苷酸序列进行PCR扩增，从起始病原体的分离物鉴定出抗原性位点，将其插入所述病毒载体(优选选自腺病毒或巴拉米哥病毒)，在该载体中扩增。所述插入用常规分子生物学技术，如限制酶和DNA连接酶等来实现。根据所述病毒载体，将所得感染性克隆引入用于制备该重组病毒的细胞系。根据病毒载体的特性，使所述病毒在任何合适的生长系统中复制，如SFP鸡胚，或市售细胞系，或为培养病毒而特别设计的系统。
实现抗原性反应所需的病毒浓度优选是102-10%150% /ml，这取决于所用的病毒载体，一旦达到该浓度，就将病毒灭活。优选地，所述灭活通过本领域已知的物理或化学方法来进行，优选用甲醛或beta-丙内酯进行化学灭活。本发明疫苗的可药用媒介物优选含水的溶液或乳液。更优选采用油包水乳液媒介物。疫苗的具体配制取决于所用的病毒载体、以及所插入的外源核苷酸序列。但在优选实施方案中，当病毒载体是新城疫病毒时，优选剂量为Io4-IokiDIEPSo^ /ml。在以腺病毒作为病毒载体的实施方案中，优选剂量为102-108DIEP50% /ml。就疫苗给药而言，优选在禽的脖子背面中部皮下给药。本发明的疫苗对家禽施用， 如嫩鸡，母鸡，种鸡，火鸡，斗鸡，珍珠鸡，鹧鸪，鹌鹑，鸭，鹅，天鹅或鸵鸟。优选地，所述疫苗皮下施用，但在一些物种中，可以对任何年龄的禽类进行肌肉给药。当所述疫苗乳化在新城疫载体中对小鸡给药时，该疫苗优选含有108-1(ΛΠΕΡ50% /0. 5ml/小鸡，更优选108 5DIEP50% /0. 5ml/小鸡。对10日龄的小鸡很可以容易地实施接种。本发明提供了非常重要的竞争性优势。本发明的重组失活疫苗使得有可能仅仅用病毒载体中的、插入了来自难以控制的致病生物的基因的重组疫苗就建立起接种计划，这导致了将受感染的动物与仅接种疫苗的动物区分开来(DIVA)的方法，其可以有效用于疾病的控制和根除，该方法包括a)对至少一个接受了失活病毒载体的重组疫苗的动物，取至少一份样品进行第一种抗体检测方法，其中所述病毒载体具有插入的编码致病病原体之抗原的外源核苷酸序列，以检测所述样品中是否存在对应于所述抗原的抗体；b)对已取样进行第一种抗体检测的同一动物，取至少一份样品进行第二种抗体检测方法，以检测所述样品中是否存在对应于引起该疾病的病原体的抗体；c)根据第一和第二种抗原检测方法的结果，确定所述动物是被感染了还是被接种了。例如，当病原体难以控制，如VIA，主要是H5和H7，在家禽中引起高死亡率时，用本发明的重组失活疫苗可以实现非常优秀的系统性保护作用，并具有较高的生物安全性，是与使用IA全病毒、但又未正确灭活的情形下引起重大风险相比。这种风险在大规模生产或病毒的过程中将增加。本发明还能在流行病学水平区分接种的禽类与其它那些暴露于全病毒的禽类(DIVA系统)，因为当仅仅插入禽流感病毒血凝素(HA)基因时，用于检测抗该禽流感的被疫苗诱导的抗体的实验室测试是血凝抑制(HI)。现有的免疫学测试，如ELISA以及其它测试如琼脂凝胶扩散等，在检测本发明重组疫苗诱导的抗禽流感抗体时都是阴性，因为它们被设计为检测由全病毒中其它抗原诱导的抗体。当被本发明的重组疫苗接种过的禽类被野生病毒感染时，这些测试对于抗禽流感的抗体检测是阳性的，从而可以区分出被感染的禽类。相应地，本发明允许建立仅仅使用失活的和活的重组疫苗的联合项目，前者将产生上述系统性免疫力，而重组活疫苗将补充粘膜水平的免疫力，最终产生的保护作用等于或接近于100%野生水平。在该项目中，也用到了上述DIVA系统。在本发明优选实施方案中，乳化失活疫苗的重组载体是插入了流感基因的新城疫，用于VVENC和VIAAP两种攻击，可以同时施用具有相同载体和抗原的活疫苗，直接施用到呼吸道粘膜，通过经眼途径、喷雾、或在饮用水中来施用，使得局部应答水平被大大刺激 (在呼吸道和消化道粘膜)，产生分泌型免疫球蛋白A(IgA)，从而显著减少野生型病毒复制，因此显著减少其排毒和传播。另一方面，本发明的疫苗允许建立控制计划，有可能通过区分被接种的禽类和被感染的禽类而实现根除，因为当施用本发明的重组失活疫苗时，有可能将被接种的禽类与被野生型病毒感染的禽类区分开来(DIVA系统)，由于重组疫苗仅含VIA血凝素作为抗原， 允许应用诸如ELISA这样的诊断性测试，其检测被其它病毒抗原诱导的抗体，而不仅仅是被血凝素诱导的抗体。本发明抗流感的重组疫苗用以下的具体实施例进行更清楚的举例说明，但这些实施例仅用于举例的目的，不对本发明进行限制。实施例实施例1产生新城疫-LaSota载体为了克隆新城疫病毒LaSota株基因组并因此制备病毒载体，先制得中间载体 “pNDV/LS”。用三唑法提取新城疫LaSota株的病毒总RNA。用此前纯化的总RNA作为模板，从所述病毒基因组的纯化RNA合成cDNA (互补DNA)。为了克隆新城疫基因组的所有基因(15，183碱基对(bp))，用PCR扩增7种具有“重叠”末端和粘性限制性位点的片段。片段 1 (Fl)包含核苷酸(nt) 1-1755，F2 包含 nt 1-3321，F3 包含 nt 1755-6580，F4 包含 6， 151-10,210, F5 包含 nt 7，381-11，351，F6 包含 11，351-14，995，F7 包含 nt 14,701-15, 186。在克隆化载体pGEM-T中用标准连接技术装配所述7种片段，以此重建新城疫LaSota 基因组，其经过该克隆后仅具有单个限制性位点hell，位于P基因和M基因之间，起到将任何目标基因克隆至该载体病毒区域的作用。实施例2从VIA亚型Η5Ν24!35株435克隆HA基因用三唑法提取病毒总RNA，以便克隆VIA 435株的HA基因。然后用该纯化的总RNA 合成cDNA (互补DNA)，并通过PCR技术用特异性寡核苷酸扩增IA病毒的HA基因。接着用标准克隆化技术将435的HA基因插入pGEM-T载体，得到质粒p-GEMT_435。实施例3克隆带有pNDV/LS载体的SacII位点的IA 435HA基因以制得质粒pNDV/LS_435L 制得中间载体 pSacIIGE/GS 构建中间载体pSacIIGE/GS，以便在HA 435基因的5，端引入新城疫的转录序列 GE/GS，方法是，以新城疫基因组为模板对GE/GS序列进行PCR初始扩增，然后将这些序列插入 pGEM-T。B.将HA基因亚克隆至p&icIIGE/GS载体中质粒pGEMT_4;35用Hpal-Ndel消化后，克隆至pSacIIGE/GS中，得到质粒 pSacIIGE/GS-HA435。C.将 GE/GS-HA435 亚克隆至 pNDV-LS 载体中两种质粒PSacIIGE/GS-HA435和pNDV/LS都用SacII消化，将消化产物纯化，将 GE/GS-HA435区纯化并插入pNDV/LS的SacII位点，得到感染性克隆pNDV/LS_435。
实施例4在细胞培养中制得重组病毒rNDV/LS_HA435Hep-2和A-549细胞最初用MAV-7病毒以感染复数(MOI)为1的水平进行感染。 在37°C 5% CO2的环境中保温1小时后，细胞用pNDVLS-435克隆的1微克(μ g)DNA、以及来自表达质粒pNP，pP和pL (分别编码病毒蛋白P，NP和L，它们是在上述两种细胞中产生重组体所需要的)的0.2yg DNA进行转染。转染12小时后，收获这两种细胞中产生的重组病毒，注射到10日龄SPF鸡胚中，以扩增所得病毒。48小时后，收获尿囊液，在平板上用 Vero细胞进行滴定，由此产生最终的重组病毒，用于制备疫苗。如上述制得具有来自Bive和Viet株的基因的重组病毒。实施例5用具有禽流感病毒H5插入子的新城疫LaSota重组病毒rNDV/LS_H5生产乳化失活疫苗的方法产牛抗原从生产育种开始，不含特异性病原体(SPF)的鸡胚受精卵用预定的感染剂量接种。将胚在37°C保温72小时，每日检查死亡率。该阶段之后，将活胚冷藏1天，优选M小时，无菌收获羊水(FAA)。离心使FAA澄清，用甲醛灭活，也可以用任何其它已知常用于制备这种疫苗的灭活剂。对FAA进行测试，以确认其被灭活，并确认其纯度、无菌性、DIEP滴度和HA滴度。制备乳液将疫苗制成油包水乳液。在油相中用矿物油和表面活性剂Span 80和Tween 80。 为制备水相，将FAA与保存液(硫柳汞)混合。为制备乳液，通过恒定搅拌将所述水相缓缓加入所述油相。用勻浆器或胶体磨碎机达到特定的粒径。抗原含量配制疫苗，产生最小量108 5DIEP50% /0. 5ml,以便使用0. 5ml/禽的剂量。按照上述方法，制得6种重组疫三种有新城疫LaSota株载体(rNDV/LQ并具有 IA病毒的HA锚(称为Rd)，另三种具有相同载体但无锚(称为Re)；将Rd和Re基因组分别用三种不同的HA基因克隆，得到6种疫苗1. H5-Bive 基因得自 VIABP 亚型 H5N2 株(A/chicken/Mexico/232/CPA)，是 1994 年在墨西哥从嫩鸡生物学标本中分离的，对应于由SAGARPA批准用于生产乳化失活疫苗的
病毒株。2. H5-435基因得自VIAAP亚型H5N2的分离，是2005年在墨西哥从嫩鸡生物学标本中分离的。435株与Bive株在血凝抑制(HI)实验显示不同的抗原特性，以及在核苷酸测序中的重要变化。3. H5-Vt基因从越南分离，对应于IA病毒亚型H5W的H5基因。实施例5A按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LQ载体中具有锚(Rd)和H5-Bive基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为EmiRd-Bive。实施例5B按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LQ载体中具有锚(Rd)和H5-435基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为EmiRd-435。实施例5C按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LQ载体中具有锚和H5-Vt基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为Emi Rd-Vt0实施例5D按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LQ载体中不具有锚(Rd)和H5-Bive基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为Emi Re-Bive0实施例5E按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LQ载体中不具有锚(Rd)和H5-435基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为EmiRe-435。实施例5F按照实施例5所述方法制得乳化失活的重组实验性疫苗，其在(rNDV/LS)载体中不具有锚和H5-Vt基因，该疫苗被配成水/油药物制剂，称为EmiRe-Vt。实施例6ENC-LaSota载体中重组疫苗的体内效力评价，所述载体有和无针对IA病毒HA基因的锚为确定本发明乳化重组失活疫苗的效力，并证实这些效力可以用IA病毒不同抗原亚型和变体的不同克隆化血凝素基因实现，测试了这些疫苗阻止IAAP病毒亚型H5N2和 VVENC在SPF禽中、以及在具有抗VIA和ENCV的母体免疫力的市售嫩鸡中引起死亡的效力。在测量疫苗效力的不同攻击实验中用到的病毒株如下1.禽流感(VIAAP-H5N2)高致病性病毒亚型 H5N2，A/chicken/ Queretaro/14588-19/95 株，滴度 108 CIDIEP50% /ml，等同于 100DLP50% /0. 3ml/ 小鸡。2. VVENC 病毒Chimalhuacan 株含 108 CIDIEP50 % /ml,等同于 106_5DIEP50 % /0. 03ml/ 小鸡。在INIFAP-CENID-Microbiologia的丙烯酸隔离单元(生物安全性水平为3)中， 对35日龄小鸡(-DPV-接种后21天)进行攻击。为进行所述攻击，每个实验组进一步分为两个亚组，按事先确立的生物安全性程序，将每个亚组分配至相应隔离单元。VIAAP-H5N2用PBS pH 7. 2进行1 10稀释，每只小鸡在每只眼施用0. 06ml (2 滴)，并在每个鼻孔施用0. 09ml (3滴)，相当于0. 3ml或100DLP50%。每只鸡经眼部给予VVENC病毒进行攻击，用的是0. 03ml病毒悬液，其含 108 5DIEP50% /ml，等同于 106 5DLP50% / 禽。为进行攻击后(PD)评估，所有组每日进行检查以记录死亡率和发病率，包括临床症状严重程度，对每个组的每一只鸡在每个PD日(DPD)进行监控，按照表1的标准给它们分配一个数值表1-死亡率和发病率记录值
权利要求
1.重组疫苗，包含病毒载体和可药用媒介物、佐剂或赋形剂，其特征在于，所述病毒载体是失活的，且具有插入的编码目标疾病之抗原的外源核苷酸序列。
2.权利要求1的重组疫苗，进一步地特征在于，所述外源核苷酸序列编码选自下组的抗原流感，传染性喉气管炎，传染性支气管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，病毒性鼻气管炎，流行性感冒，猪肺炎支原体，巴斯德氏菌病，猪呼吸生殖综合征(PRRS)，环状病毒，博德特氏菌病或副流感病毒。
3.权利要求2的重组疫苗，进一步地特征在于，所述外源核苷酸序列由编码禽流感病毒血凝素(HA)的基因组成。
4.权利要求3的重组疫苗，进一步地特征在于，所述编码血凝素(HA)的基因选自禽流感病毒血凝素(HA)亚型Hl，H2，H3，H5，H6，H7或H9中的至少一种。
5.权利要求4的重组疫苗，进一步地特征在于，所述编码血凝素(HA)的基因是H5亚型。
6.权利要求1的重组疫苗，进一步地特征在于，所述病毒载体选自腺病毒或巴拉米哥病毒。
7.权利要求6的重组疫苗，进一步地特征在于，所述病毒载体选自巴拉米哥病毒。
8.权利要求7的重组疫苗，进一步地特征在于，所述巴拉米哥病毒是新城疫病毒。
9.权利要求8的重组疫苗，进一步地特征在于，所述新城疫病毒选自LaSota，Ulster, QV4，B1，CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30，或 VGGA 毒株，或来自新城疫遗传组 I 至 V 的毒株。
10.权利要求6的重组疫苗，进一步地特征在于，所述病毒载体选自腺病毒。
11.权利要求10的重组疫苗，进一步地特征在于，所述腺病毒选自禽或猪的腺病毒。
12.权利要求11的重组疫苗，进一步地特征在于，所述腺病毒是禽腺病毒9型。
13.权利要求11的重组疫苗，进一步地特征在于，所述腺病毒是猪腺病毒5型。
14.权利要求1的重组疫苗，进一步地特征在于，所述疫苗的可药用媒介物优选含水溶液或乳液。
15.权利要求14的重组疫苗，进一步地特征在于，用水-油乳液作为媒介物。
16.权利要求1的重组疫苗，进一步地特征在于，所述病毒载体的所需滴度类似于重组活病毒疫苗的所需滴度。
17.权利要求16的重组疫苗，进一步地特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度是 102-101CIDI50% /ml。
18.权利要求7的重组疫苗，进一步地特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度是 104-101CIDIEP50% /ml。
19.权利要求18的重组疫苗，进一步地特征在于，当所述疫苗被制备为对鸡用药时，所述病毒浓度为 108-109DIEP50% /0. 5ml/ 鸡。
20.权利要求19的重组疫苗，进一步地特征在于，所述疫苗具有1085DIEP50% /0. 5ml/鸡。
21.权利要求10的重组疫苗，进一步地特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度是 102-108DIEP50% /ml。
22.权利要求1的重组疫苗，进一步地特征在于，实现抗原反应所需的病毒浓度是，所述疫苗被制备为皮下用药或肌肉用药的疫苗。
23.免疫接种以抵抗动物疾病的方法，其特征在于，包括对动物施用重组疫苗，所述疫苗包含失活的病毒载体，其中插入了编码所述疾病的抗原的外源核苷酸序列。
24.权利要求23的免疫接种以抵抗动物疾病的方法，进一步地特征在于，还对所述动物施用另一种重组疫苗，所述疫苗包含与所述失活的病毒载体相同但已活化的病毒载体， 其具有插入的编码所述疾病之抗原的外源核苷酸序列。
25.可用于控制和根除疾病的鉴定被感染的动物和被接种的动物的方法，包含a)对至少一个接受了失活病毒载体的重组疫苗的动物，取至少一份样品进行第一种抗体检测方法，其中所述病毒载体具有插入的编码致病病原体之抗原的外源核苷酸序列，以检测所述样品中是否存在对应于所述抗原的抗体；b)对已取样进行第一种抗体检测的同一动物，取至少一份样品进行第二种抗体检测方法，以检测所述样品中是否存在对应于引起该疾病的病原体的抗体；c)根据第一和第二种抗体检测方法的结果，确定所述动物是被感染了还是被接种了。
全文摘要
本发明描述了一种疫苗，其包含失活的病毒载体和可药用媒介物、佐剂或赋形剂，该载体中插入了编码目标疾病的外源核苷酸序列，所述疫苗通过用与基于相同病毒载体的活病毒疫苗所需滴度相似的病毒载体滴度来提供抗所述目标疾病的预期保护作用。主要地，本发明描述了巴拉米哥病毒或腺病毒的病毒载体。
文档编号A61K39/145GK102281896SQ200880132687
公开日2011年12月14日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者B.洛扎诺-杜伯纳德, D.萨法蒂-米兹拉西, E.索托-普里安特, J.A.苏亚雷斯-马丁内兹, M.J.盖伊-古蒂雷兹 申请人:阿维-梅克斯实验室公司