对阿尔茨海默氏症的新一代基因疗法·免疫疗法的开发的制作方法

专利名称：对阿尔茨海默氏症的新一代基因疗法·免疫疗法的开发的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能用于阿尔茨海默氏症的基因疗法.免疫疗法的导入了抗P -淀粉样蛋白的抗体基因或其改良型的载体。
背景技术：
人类阿尔茨海默病(AD )的主要病理特征有老年斑和神经纤维改变，一旦它们进一步发展，则可观察到神经细胞的减少和脑萎缩。众所周知老年斑是由于从细胞膜上的受体淀粉样前体蛋白(APP )切断出的P -淀粉样蛋白(AP )的积累所造成。此外，近年来，不仅是不溶性A(3,可溶性AI3聚集体的神经细胞毒性也被确认，引起了极大的关注(非专利文献1 )。在日本得到批准的一种AD治疗药，只是一种胆;咸酯酶抑制剂的前体，该药物弥补损失的神经传输，只抑制症状，但达不到根治。
因此，为了达到减少造成AD根本原因的A P为目的，设想把自身的A (3蛋白质依靠抗体除去的"A (3疫苗疗法"(非专利文献2 )。该疫苗疗法是把合成的AP42肽与佐剂一起肌肉给药。在2001年，这种疫苗的临床试验(II期)已经开始。结果证实了老年斑消失，确认具有一定的作用，但另一方面也确认了有6%的患者发生了脑膜脑炎的副作用，有1例患者死亡。由于这种副作用的出现，临床试验被停止。目前，疫苗的副作用被认为是两个原因。其一认为给药的AP抗体激活了小神经胶质细胞，也许这与脑膜脑炎相关联。另一个认为由于疫苗中所含的佐剂中具有强的免疫激活作用，而引起T细胞等细胞性免疫，结果在一些患者中反应AP及APP反应性Thl型CD4+T细胞渗透到脑中，这一事实也许与脑膜炎相关(非专利文献3)。因此，开发安全性高且能有效地减少AP的疫苗是所期望的。
Tamura等，用经合成的A P肽免疫的小鼠，制备产生针对A (3的各
3个表位的抗体的杂交瘤细胞(非专利文献4)。 4巴杂交瘤细胞生产的抗体用胃蛋白酶切断，除去与激活小神经胶质细胞相关的Fc区域，纯化出
F(ab，)2。 4巴这个抗A(3F(ab，)2抗体隔一周给药到A (3抗体过量表达的AD模型小鼠(Tg2576)的腹腔中，进行AD预防和治疗效果的研究。使用该抗体后，根据小鼠大脑切片的免疫染色，证实老年斑消失。此外，用sandwich ELISA法，对可溶性 不溶性的脑内AP定量的结果确定脑内A(3由于抗体而减少。根据以上内容，通过Fc受体而不通过细胞吞噬，成功地清除了 AP。然而，通过被动免疫进行的疗法，为了有持续的效果必须不断地加入抗体，这是Tamura课题研究的一个难点。
此外，据报道，把带有编码抗A (3轻链抗体的腺相关病毒投入AD模型小鼠脑内，淀粉样蛋白的沉积减少，而且即使在给药一年后还观察到抗A (3轻链抗体的表达(非专利文献5 )。不过， 一般来说，轻链抗体和完整的抗体的比较，抗体能力要低。
Rakez Kayed et al，. Science (2003) 300 : 486-489[非专利文献2]
Dale Schenk et al.， Nature (1999) 400 : 173-177[非专利文献3]
James A. R. Nicoll et al.， Nature med (2003) 9 : 448-452[非专利文献4]
Y. Tamura et al.， Neurobiology of Disease 20 (2005) 541-549[非专利文献5]
K. Fukuchi et al.， Neurobiology of Disease 23 (2006) 502-51
发明内容
本发明目标是使比抗体给药功效更持续、比单抗体更高的抗体强度的阿尔茨海默氏病的基因治疗和免疫治疗成为可能。
因此，要解决上述问题，本发明第一，着眼于可以期待长期基因表达的腺相关病毒(AAV)。由于AAV可以在细胞中可以稳定地基因表达，因此即使单次给药也可以预期具有长期的功效。此外，AAV已经对嚢肿性纤维化，血友病和其他的疾病进行临床研究，作为安全性很高的基因治疗的载体被广泛使用。此外，由于不需要佐剂，可以期望病毒载体或
许能抑制Thl型CD4+T细胞活化。其次，注意AAV的血清类型。根据发明者的长年关于AAV载体研究的实际成果，清楚了不同血清型的腺相关病毒载体对细胞的亲和性不同。本发明者决定使用在肌肉细胞表达效率最高的AAV1型载体。
本发明人从产生抗A |3抗体杂交瘤细胞提取mRNA并通过逆转录，获得抗AP抗体cDNA (图l)。为了抑制小神经胶质细胞的活性，从完整抗体基因除掉CH3区域，制备CH3缺陷型抗AP抗体基因。此外，为了确认在末端表达的抗体向脑内的移行性，在抗体基因C末端添加组氨酸标记(图2)。将这些抗体基因克隆到转运载体上，基因导入于培养细胞，抗AP抗体的表达及功能用Western blot法和ELISA法证实。将制作的抗AP抗体基因导入AAV基因组，制备带有抗A(3抗体的AAV载体(图1)。将AAV载体给小鼠的肌肉给药，表达出的血液中抗A(3抗体能和AP肽结合，用ELISA法证实了这一点。本发明，通过这些i人识而完成。
本发明要点如下。
(1 )表达完整的抗P -淀粉样蛋白抗体或片段的载体，该载体含有启动子序列，抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或片段的编码序列，以及编码自我加工肽的序列以及编码抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的序列。
(2 )还含有polyA序列的(1 )记载的载体。
(3) 还含有ITR序列的(1)或(2)记载的载体。
(4) 在编码自我加工肽的序列的5 '末端连接有加工蛋白酶酶切部分的(1) - ( 3 )任一项记载的载体。
(5) 加工蛋白酶为furin的(4)记载的载体。
(6) 自我加工肽为码是2A的(1) - (5)任一项记载的载体。
(7 )编码抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片段的序列以及编码抗(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的序列均含有分泌信号序
列的(1 ) - (6)任一项记载的载体。
(8 )抗P-淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链的片段包含可变区域， 含有部分恒定区域或完全不含恒定区域的(1 )至(7 )任一项记载的载 体。
(9 )含有从抗P-淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链去除CH3区域 的片段的编码序列的表达CH3缺陷型抗体的(8)记载的载体。
(10 )载体为腺相关病毒载体的(1) - ( 9 )任一项记载的载体。
(11) 腺相关病毒为1型的(IO )记载的载体。
(12) 包含(1 ) - ( 1 1 )任一项记载的载体作为有效成分的阿尔茨 海默氏症预防和/或治疗药物。
发明的效果
本发明开发了采用重组AAV载体的AD治疗和/或预防性疫苗。该 疫苗对模型动物的有效性可以确定。此外，在体内高效价的抗体的持续 表达是可能的。


图1表示实施例的实验过程。
图2表示实施例中制作出的由重组AAV表达的抗体结构。图3由导入抗体基因的293T检测出抗AP抗体。 发现纯化出的IIA2的H《连单体位于约50KDa， L《连单体位于约 30KDa附近。细胞溶解液和细胞上清都发现H链、L链，如果去除CH3 的pWl HF2AL中，H链带位于45KDa左右，比对照组的分子量要小。 因而，根据由去除了 CH3区域的基因也说明抗体的表达。在细胞溶解液 的上清中没有发现，但在80KDa左右确认了条带。这被预测是，H链 Furin2AL链按连接的状态表达，向细胞外分泌过程中受到自身的加工、 形成二聚体后分泌到细胞。
图4表示实施例中制作出的重组AAV的结构
图5表示给重组AAV向Balb/C鼠的给药以及小鼠的采血的计划。
图6从投入了 AAV HF2AL的Balb/c的血清中进行了 A (3特 异的IgGl抗体的检测。依赖于病毒载体投入量，血中抗A(3抗体浓度 上升。在3.0x 10uvgAAVHF2AL感染组中、给药4周后血中的抗A (3抗 体量渐渐地上升，最高值达到939n g/mL。之后，抗体浓度緩慢地降低， 不过即使给药后24周还能维持在432 m g/mL 。此外，在3.0 x 101Qvg HF2AL 感染组中，8周后最高值只达到222jag/mL 、 24周变为157p g/mL。在 3.0x 109vgHF2AL感染组中、24周后最高值只达到28ia g/mL。
图7使用了抗A (3抗体的老人斑的;f企测 (结果)在使用13个月大的Tg2576的脑切片的免疫染色中，通过使 用了兔抗A (3 1-40多克隆抗体、兔抗A P 1-42多克隆抗体或IIA2的 免疫染色，在海马 大脑皮质附近检测出了老人斑。并且，使用了 AAV HF2AL感染HEK293的上清，通过免疫染色，在相同的部位检出了老 人斑。从而，可认为通过AAV被表达出的抗体与杂交瘤衍生的抗体具有 同等的抗原特异性。
序列表
<序列号1〉
序列号1表示小鼠的免疫球蛋白重链的全长的DNA序列。 <序列号2 >
序列号2表示小鼠的免疫免疫球蛋白重链的全长的氨基酸序列。 <序列号3 〉
序列号3表示小鼠的免疫球蛋白重链的全长中除去CH3区域的DNA序列。<序列号4 〉
序列号4表示小鼠的免疫球蛋白重链的全长中除去CH3区域的氨基 酸序列。
<序列号5 〉
序列号5表示小鼠的免疫球蛋白轻链的全长的DNA序列。 <序列号6 〉
序列号6表示小鼠的免疫球蛋白轻链的全长的氨基酸序列。 <序列号7 〉
序列号7表示小鼠的免疫球蛋白重链的分泌信号的DNA序列。 <序列号8 〉
序列号8表示小鼠的免疫球蛋白重链的分泌信号的氨基酸序列。 <序列号9 〉
序列号9表示小鼠的免疫球蛋白轻链的分泌信号的DNA序列。 <序列号1 0 〉
序列号1O表示小鼠的免疫球蛋白轻链的分泌信号的氨基酸序列。 <序列号11>
序列号1 1表示编码口^帝疫病毒来源的2A的DNA序列。 <序列号1 2 〉
序列号l 2表示口蹄疫病毒来源的2A的氨基酸序列。 <序列号1 3 >
序列号1 3表示Furin酶切部位的DNA序列。 表示Furin酶切部位的氨基酸序列。RAKR <序列号1 4 〉
序列号14表示人AI3的氨基酸序列。 <序列号1 5 ~ 3 6 〉
8序列号1 5 ~ 3 6表示在实施例中使用的引物的DNA序列。
具体实施例方式
下列对本发明实施方式进行详细说明。
本发明提供了表达完整的抗(3 -淀粉样蛋白抗体或片段的载体，该载 体含有启动子序列，编码抗(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片 段的序列，编码自我加工肽的序列以及编码(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球 蛋白轻链的序列。
插入本发明载体的启动子序列，只要能表达完整抗|3 -淀粉样蛋白的 抗体或其片段，任何启动子序列都是可以的，例如，可以是哺乳类用的 启动子。可以例举许多应用的如CMV启动子和CAG启动子等。此外， 也可以是细胞特异性启动子。
插入本发明的载体的抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片 段的编码序列，可以是含有编码抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链 可变区中的抗体结合部位的区域的序列，可以例示编码免疫球蛋白重链 的全长，Fab区域，由全长去除CH3区域的区域，轻《连抗体等的序列。 为了避免因小神经胶质细胞活性化而导致的脑膜脑炎，优选除去编码与 激活小神经胶质细胞相关的Fc区域(全部或部分)的免疫球蛋白重链的 片段的序列。编码小鼠的抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链的全长 的一个例子示于序列号l 。其氨基酸序列示于序列号2 。此外，乂人小鼠 的抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链总长度中除去CH3区域(注 免疫球蛋白重链CH区域分为CH1—CH3这三个部分。CH3区域位于 重链的C-末端。)的片段的编码序列的一个例子示于序列号3 。其氨基 酸序列示于序列号4 。通过在本发明的载体中插入抗l3-淀粉样蛋白抗体 的免疫球蛋白重链的全长去除CH3区域的片段的编码序列，可以使CH3 区域缺失型的抗(3 -淀粉样蛋白抗体表达。
插入本发明载体的抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的编码序 列可以是编码抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋轻链的全长的序列。编码小鼠的P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的全长的序列的一个例子 示于序列号5 。其氨基酸序列示于序列号6 。
优选编码抗(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片段的序列以
及编码抗(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的序列均含有分泌信号序 列。小鼠的抗(3 -淀粉样蛋白抗体免疫球蛋白重链分泌信号序列的一个例 子示于序列号7 。其氨基酸序列示于序列号8 。此外，小鼠的抗(3-淀 粉样蛋白抗体免疫球蛋白轻链的分泌信号序列的一个例子示于序列号9。 其氨基酸序列示于序列号10 。
编码抗(3 -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片段的序列以及编 码轻链的序列可以按下列步骤制备。首先，制备产生抗(3-淀粉样蛋白抗 体的杂交瘤细胞，从该杂交瘤细胞中提取总RNA。用商业试剂盒 (SMART RACE cDNA Amplification Kit末端基因扩增试剂盒 (Clontech.Mountain View.USA )制备含全长抗体基因的cDNA文库，利 用与添加在mRNA3，的polyA互补的引物寡dT和与mRNA5，互补的引物 通过PCR进行抗体的基因片段扩增(RACE法)。这样，可以获得编码免 疫球蛋白重链和轻链的全长的序列。此外，为了得到免疫球蛋白重链片 段的序列，利用所要的区域的5'末端互补的引物以及与3'末端互补的 引物，可以通过PCR进行抗体基因片段扩增。按这种方式得到的编码免 疫球蛋白重链或其片段的序列以及编码免疫球蛋白轻链的序列也含有常 规分泌序列。分泌的信号序列可用信号序列的预测软件 (http:〃bp.nuap.nagoya-u.acjp/sosui /)来检索。
抗P -淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片段可以是IgG、 IgM、 IgD 、 IgE或IgA中的任何一类，不过优选IgG 。此外，通过本发明的 载体表达的抗体或其片段来自人类，小鼠，兔，羊和其他动物都是可以 的，而且还可以是来自于人和人以外动物的嵌合抗体，人源化抗体。嵌 合抗体和人源化抗体的制备方法是众所公知的。
插入本发明载体的编码自我加工肽的序列，只要可以表达完整抗(3 -淀粉样蛋白抗体或其片段，可以是编码任意自我加工肽的序列，例如， 可用编码2A的序列例示。2A，通常为了两种基因同时表达较多采用内核糖体进入位点(IRES)。然而，通过利用IRES的基因表达，位于IRES 下游的基因，比位于上游的基因的表达水平低。
因为IgG抗体在生物体内存在重链 轻链两个完整的形式，使抗体 基因表达时，在细胞内链H和L链必须是等量表达。此外，通过在2A序 列前后配置H链和L链，可以使等量抗体基因同时表达(Jianmin Fang et al.， nature biotechnology (2005) 23 : 584-589 )。所谓2A，是来自口蹄疫 病毒(FMDV)的自我加工肽。已知的是在病毒中P1和P2蛋白质之 间存在，参与生产成熟酶P1和P2的产生。P1和P2同时作为l个ORF 表达后，在2A型的C-端侧的发生自我加工。(详细情况还不清楚)。 各种2A序列以及2A样序列已知的，口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)的2A序列示于图11。其氨基酸序列示于序列号12。
与自我加工多肽的编码序列相邻，连接加工蛋白酶酶切部分比较好。 加工蛋白酶酶切部分优选连^妄在自我加工多肽的编码序列的5'端。加工 蛋白酶酶切部位只要可以表达完整的抗(3 -淀粉样蛋白抗体或其片段，则 编码任意加工蛋白酶酶切部位的都可以，例如，可以例举furin酶切位点。 Furin是识别切断碱基氨基酸的蛋白酶家族中的一员，局部存在于高尔基 体内。Furin酶切部位的DNA序列示于序列号13 。
本发明载体，再插入一个polyA序列是比较好的。依赖插入polyA 序列，能够使转录的mRNA稳定化。
本发明载体，按在启动子等调控元件的控制下，可以使完整的抗(3-淀粉样蛋白抗体或其片段进行表达的方式，在载体中插入抗(3 -淀粉样蛋 白的抗体的基因。
载体是把作为目标的不同DNA转运到宿主的核酸分子，质粒，粘粒， 噬菌体，嗟菌粒，病毒，YAC和BAC等媒体作为载体。载体用于文库 的制作，克隆的实施，把插入的DNA产物在宿主细胞中表达。依据插 入的DNA大小和插入的目的，可以选择适当的媒介。为了表达完整的抗 P-淀粉样蛋白抗体或片段，优选质粒(在宿主细胞表达用)和病毒(基 因疗法用)。
作为表达用质粒载体，可以是具有哺乳动物用启动子，多克隆位点，
ii多聚腺苷酸，ITR的载体，可以例举pWl等。
在基因治疗中使用载体时，优选病毒载体。作为病毒载体有腺相关
病毒(AAV), 逆转录病毒载体，腺病毒载体，慢病毒载体，仙台病毒
载体等。
AAV对囊泡性纤维症，血友病等疾病正在进行临床研究，作为安全 性高的基因治疗载体被广泛运用。此外，该病毒载体，因为不需要佐剂， 因此期望也许能抑制Thl型CD4+T细胞能的活化。AAV不被认为是病 源性的病毒，缺乏独立的增殖能力，复制依赖于腺病毒和疱瘆病毒等的 辅助功能。已知，对于腺病毒的辅助功能而言，E1A , E1B, E2A, E4， VA基因是必需的。已知能感染人类的AAV有1到9型的血清型。2,3,5 和9型都来自于人类，2型有深入的研究，作为载体被充分利用。本发 明人清楚了不同血清型的AAV载体对细胞的亲和力不同(Xin， K-Q. et al.， J.Virol. 80:11899-910, 2006 )。在下面的实施例中，使用在肌肉细胞中表 达最高的AAV1型载体。AAV基因组是具有约5kB的单链的DNA , 大约一半的病毒粒子具有(+ )链DNA的基因组，其余具有(-)DNA 链。5'端的大约一半是称为"rep"的区域，编码与病毒复制和转录相关的 Rep蛋白质。rep编石马乂人p5启动子开始转录和翻i奪的大Rep ( Rep78和 Rep68 ) 和乂人pl9启动子的转录，翻i奪的小Rep ( Rep52和Rep40 ) 典的四个蛋白。3 '端约一半是被称为"cap"区域，编码结构蛋白质 VP1 ， VP2和VP3这三个衣壳蛋白。衣壳蛋白的mRNA由p40启动子 的转录。AAV基因组的两末端存在^皮称为145核苷酸的ITR (逆向末 端重复)发夹结构，人们认为这个ITR区域在向宿主细胞染色体整合时 十分重要。
为了制作重组AAV载体，可以对通过磷酸钩法转化HEK293细胞 (经腺病毒的E1AE1B转化的人类胚胎肾组织来源的细胞)进行转染。例 如，制备l)保留在野生型AAV的两端的ITR， 在其间插入目的异种 DNA (本发明中，启动子序列，编码抗(3-淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋 白重链或其片段的序列，加工蛋白酶酶切部位，编码自我加工肽的序列 和编码抗P-淀粉样蛋白抗体和免疫球蛋白轻链的序列)的质粒(AAV质粒载体)，2 ) 具有编码病毒复制和病毒粒子形成所必需的病毒蛋白
(Rep、 Cap)的序列的质粒(AAV辅助质粒)，3 )具有AAV的增殖所 必需的承担腺病毒辅助作用的基因区域(E1A、 E1B、 E2A、 VA、 E4或 f6)中，HEK293细胞具有的E1A和E1B以外的区域的质粒(腺病 毒辅助质粒)，通过转染将这三个质粒导入到HEK293细胞中，产生重 组AAV载体。这样重组AAV的制作4吏用商业试剂盒(例如， STRATAGENE公司的AAV helper-free system ), 就可以完成。
本发明的载体，作为AD的预防和治疗性疫苗有用。因此，本发明 还提供了含有把表达完整的抗(3 -淀粉样蛋白抗体或其片段的载体作为活 性成分的阿尔茨海默病(AD)预防和/治疗药。
表达完整的抗(3-淀粉样蛋白的抗体或其片段的载体，可以例如，溶 解于PBS等緩冲液，生理盐水，无菌水等，根据需要通过过滤器等过滤 消毒后，通过注射对实-验者给药。此外，在溶液中可以加入添加剂(例 如，非活化剂，防腐剂，佐剂，乳化剂等)。然而，是表达完整的抗(3-淀粉样蛋白抗体或其片段的载体是病毒载体的情况下，不需要添加辅剂。 表达完整的抗P-淀粉样蛋白的抗体或其片段的载体可以静脉，肌肉，腹 腔，皮下，皮内等方式给药，也可以通过鼻，口给药。
表达完整的抗(3 -淀粉样蛋白抗体或其片段的载体的给药量，给药次 数和频率，根据被验者的症状，年龄，体重，给药方式，给药形态等的 不同而不同，例如重组AAV载体的情况是，通常每个成年人人均至少一 次10""Vg的给药量，可以按所希望的效果持续的频率给药。
下面通过实施例详细地说明本发明，本发明并不限于这些实施例。 [实施例1 ] 材料和方法 实验过程用图l表示。
(1 )产生抗A P抗体的杂交瘤细胞的制备
人A P 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA)(序列号14)，使用自动化的1430A肽合成器(AppliedBiosystems,CA,USA) 合成。将肽用完整的Freund，佐剂乳化，通过每 只Balb/c小鼠皮下皮下给药100ug进行免疫。给药2周后，和不完整的 弗氏佐剂一起等量追加免疫AP肽。此外，给药三个星期后单独给药 100ug肽。摘取小鼠脾细胞，按下列方法制备杂交瘤细胞。 C2)抗体基因的分离
为了得到对A (3抗体的H链 L链的基因，进行mRNA的分离。从 抗A (3抗体产生的杂交瘤IIA2中，使用TRIzol试剂(GIBCO BRL. N.Y. USA )提取总R NA。用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒 (Clontech.MountainView.USA)、分别RACEH链 L链的5， 3'末端，制 备cDNA。顺序按使用手册进行。使用作为编码5，-RACE的反义的一部 分的GSPl的H链(5， CCC AAG CTT TTT ACC AGG AGA GTG GGA GA 3，)(序列号1 5 ) (RIKAKEN.Nagoya. Japan) 、 L链(5'ATA AGA ATG
号1 6 ) (RIKAKEN),作为编码3，-RACE的有义的一部分的GSPl的 H链(5 CGG GGT ACC ATG GGC AGG CTT ACT TCT TC 3,)(序列号 1 7 ) (RIKAKEN) 、 L链(5, CCG GAA TTC ATG GAG ACA GAC ACA CTCCT3，)(序列号l 8 ) (RIKAKEN),得到H链.L4连的5， 3，片
段。下划线部分是限制性内切酶识别序列。
1) H链
为了扩增H链的ORF，制备与含限制性酶位点的H链互补的引物 [有义(5， CGG GGT ACC ATG GGC AGG CTT ACT TCT TC 3，)(序列号 1 9 )反义(5'CCCAAGCTTTTTACCAGGAGAGTGGGAGA3，)](序 列号2 0 ) (RIKAKEN)。反义引物，除去H链3，末端的终止密码，进 行设计。使用这些引物，以通过RACE法制作的H链片段作为模板，通 过聚合酶链反应(PCR)进行H链的扩增。
2) L链
为了扩增L链的ORF，制备与含有限制性酶位点的L链的5， -3， 末端互补的引物{有义(5， CCG GAA TTC ATG GAG ACA GAC ACA CTCCT3，)(序列号2 1 )反义(5，ATAAGAATGCGGCCGCAGTCGACGCTAACACTCATTCCTGTTGA3')}(序列号2 2 ) (RIKAKEN)， 通过RACE法制作出的L链片段作为模板，与1)同样地扩增。
(3) Furin2A基因的制作
制作连接Furin和口蹄疫病毒的自我加工肽2A的DNA序列的寡 DNA(5， CGC GCC AAG CGC GCC CCC CGT GAA GCA GAC CCT GAA CTT CGA CCT GCT GAA GCT GGC CGG CGA CGT GGA GTC CAA CCCCGGCCCC3，)(序列号2 3)。制作与含限制性酶位点的F2A 互补的引物[有义(5， CTA GCT AGC CGC GCC AAG CGC GCC CCC GT 3，)(序列号2 4 )反义(5' CCG CTC GAG GGG GCC GGG GTT GGA CTCCA3，)(序列号2 5 ) ](RIKAKEN)。把寡DNA作为模板，使用 这些引物通过PCR进行F2A的扩增。制作与5， 、 3，末端互补的引物 {有义(5'CCCAAGCTTCGCGCCAAGCGCGCCCCCGT3，)(序列 号2 6 )反义(5, CCG GAA TTC GGG GCC GGG GTT GGA CTC CA3，) (序列号2 7)} (RIKAKEN), 和H链 L 4连同样扩增Furin 2A。
(4) 质粒的制作
用HindIII和EcoRI进行限制性酶处理将(2)制作出的Furin 2ADNA 片段，同样地导入于pBluescript II KS(-) phagemid的HindIII和EcoRI 位点。把这个质粒作为pBlue F2A。使用KpnI,HindIII限制性酶处理(2) 中制作出的H链片段，导入于位于pBlue F2A的F2A基因上游的 KpnI，HindIII位点。把这个质粒作为pBlue HF2A。并且，用EcoRI,NotI限 制性酶处理(2)制作出的L链片段，导入于pBlue HF2A的F2A基因下游 的EcoRI，NotI位点。并且、把这个质粒作为pBlueHF2AL。
(5) 碱基序列的确认
把(4)制作出的质粒，使用特异于pBluescript的HF2AL基因插入部 分的5，侧T3区域的引物(5'AATTAACCCTCACTAAAGGG3，)(序 列号2 8 )、特异于H链350bp附近的序列的引物(5，TCG ACTTGG TAGGAGGTATG3，)(序列号2 9 )、特异于1100bp附近的序列的 引物(5，GGTGGAATGGTGTACACCTG3，)(序列号3 0 )， 确认H 链、F2A的碱基序列。而且，在L链端，使用与p Bluescript的HF2AL基因插入部分的3，侧T7区域特异的引物(5' TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG3，)(序列号3 1 )、与Ml3-20区域特异的引物(5， GTAAAA CGACGGCCA3，)序列3 2)、与L链340bp附近的配列特异的引物 (5'CAGCACAGTTGGGAGATTCC3，)(序列3 3 )、与400bp附 近的序列特异的的引物(5， CCG TTT GAT TTC CAG TTT GG 3，)(序列 3 4), 确定L链、F2A的碱基序列。用ABI PRISM 310 (ABI)测定 质粒DNA、确定H《连 L链的石威基序列。
(6) 抗体基因的亚克隆
为了确认抗体基因在培养细胞内的表达，用(4)制作出的pBlue HF2AL把抗体基因整合到表达载体pWl。制备与H链5，末端互补的 引物(H.有义(5， ATA AGA ATG CGG CCG CA G TCG ACA ATG GGC AGG CTT ACT TC3，)(序列号3 5 )。使用该引物和与L链3，末端 互补的引物进行，进行H链 Furin 2A L链一 系列的ORF DNA片段 的扩增。将这个DNA片段用Notl限制性酶处理、同样的导入pWI的 Notl位点，制成pWl HF2AL。
(7) 抗体基因的改变
为了确认在末端表达出的抗体向脑的移行性、用组氨酸蛋白标记标 识抗体。制备在3，末端添加了组氨酸基因的L链互补的引物。使用这个 引物和与H链5，的末端互补的引物，进行H链'Furin. 2A L链 组氨酸蛋白 一 系列的ORF DNA片段的扩增。把这个DNA片段用Notl 限制性酶处理，同样地导入pWI的NotI位点，形成pWl HF2ALHis。
在不引起由Fc受体介导的吞噬作用而让脑内A (3的减少作为目的。 为了抑制小神经胶质细胞的活性，制作了从全长的抗体基因除去了 CH3 区域的CH3缺失型抗体的基因。制备与H链CH2区域的3'末端制作互 补的引物[反义(5， CCC AAG CTT GCC TTT GGT TTT GGA GAT GG 3，) (序列号3 6 ) ](RIKAKEN)，使用该引物和与H链5，末端互补的引 物，进行H链的ORF DNA片段的扩增。把这个DNA片段用Sail HindIII进行限制性酶处理，更换为pWIHFL的全长H链。把这个质粒 作为pWl HF2AL deleted CH3。而且，抗体的CH2 CH3区域的推测按一下方式进行。把H链的 DNA碱基序列转换为氨基酸序列。使用在氨基酸序列数据库的 Swiss-Prot上的同源性#全索BLAST(http:〃au.expasy.or g/tools/blast/)，才企索 与制作的H链氨基酸序列存在同源性的序列。因此，选择出与制作的抗 体相同的小鼠IgGl的序列同源性高的序列(登录号:P01868)。因为对数 据库中的序列中由蛋白质的功能、区域结构等的高水平的说明，因此根 据P01868的信息预测制作出的抗体的CH2CH3区域等。
(8)Western blot
把用(6)(7)作成了的pWl HF2AL、 pWlHF2ALHis和作为阴性对照 的pWl用LipofectamineTM2000 (Invitr ogen )转染293T纟田月包。24小時 后将细胞用PBS(-)洗净1次后，将培养基换为无血清。然后，在48小时 时回收细胞，进行离心分离。以该上清作为细胞上清样品，通过在细胞 团中添加NP-40溶胞緩沖液，于冰上静置分钟使细胞可溶。静置后的样 品再离心分离，这个上清作为细胞溶解液。在细胞上清 细胞溶解液中 分另'J力口入2x SDS,加热10分钟，作为western 样品。把这个样品使用 12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，迁移到在Immobilon 膜。把 膜在阻断緩冲液[5%脱脂乳、PBS(-)]中，4。C震荡12小时，进行阻断。 然后，将膜用PBST[PBS(-)、 0.1 % Tween 20]洗浄。为了检测H链 L链， 使之分另ll与作为原发性抗体的 Anti mouse IgGl conjugated horseradish peroxidase (Southern Biotechnology Asociates， Alabama,USA) 、 HRP conjugatedantimousekappa light chainantibody (BETHYL laboratories.Montgmery.USA)反应，用PBST清洗4次。并且使之在膜上 与Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE, MA,USA)反应，在Hyperfilm (Amersham. Buckinghamshire.UK)下感。 结果示于图3 。
pWl LacZ的制作
为了扩增LacZ的ORF ,制备包含限制性酶位点的与LacZ的5， 3 ，末端制作互补的引物{sense (5，ACG CGT CGA CAC TAT CCC GAA CTTACT3》反义(5'CGCGGATCCATGCGGCTGATGTTGAACTG
173，)} (RIKAKEN)，把pSV國P -Galatsidase control vector(promega, W isconsin USA)作为模板，通过PCR进行扩增。
将LacZ DNA片段用Sail和BamHI进行限制性酶处理，导入于 pWl的Sail和B amHI位点，制成pWl LacZ。
(9) 重组AAV载体的制作
使用Calcium phosphate transfection kit(invitrogent)，通过石岸酸4丐法将 用(6)(7)制作出的pWl HF2AL, pWl HF2AL His,去除CH3的pWl HF2AL， pWllacZ ，带有病毒复制和粒子的形成所必需的病毒蛋白的基 因的AAV辅助质粒，带有AAV的增殖所必需的腺病毒的基因E2A . VA.E4或6的腺病毒辅助质粒同时基因导入于HEK293。然后，将细 胞静置72小时。将该细胞。在干冰和设定为37。C的孵化器中，反复冷 冻溶解，回收细胞内的重组病毒。再把这个病毒溶液用CsCl超离心法纯 化病毒(AAVHF2AL 、删除了 CH3的AAVHF2AL 、 AAVHF2ALHis 、 AAVLacZ)。制作出的重组AAV载体的结构示于图4 。图4从上起依次 表示AAVHF2AL、删除了 CH3的AAV HF2AL、 AAV HF2AL His的结 构。
(10) BALB/c鼠的给药
对2个月的BALB/c雄性老鼠，给药(9)的重组腺相关病毒(AAV)。 把AAV HF2AL分别以每只3.0 x 10uvg， 3.0 x 1010vg,3.0x I09vg进行肌 肉注射，各组5只(图5 ) 。 AAV LacZ作为阴性对照按每只1.0 x 10 g,对5只给药。肌肉内给药，在背侧皮下给药在氯胺酮中(三共工 一乂k药品.Tokyo.Japan)按终浓度达到0.4 %加入曱苯谨」秦溶液(乂《4工A 爿f、力A.Tokyo.Japan)形成的溶液，给药在麻醉下进行。
(11) 酶-联免疫吸附试,验(ELISA)
给药后，l周.2周'3周'4周，以后每4周用肝素处理処理后， 用毛细管(Drummond.Broomall.USA)采血。采集的血液在4。C静置16小 时后，离心分离，回收上清，调制血清样本。用这个血清进行"ELISA"。 在96孔微量滴定板(Nunc. N.Y. USA)上，用碳酸盐緩冲液(0.1MNaHCO3) 溶解的A(3 1-13肽涂层，于4。C静置16小时。然后，加入阻断緩沖液(l
18%牛血清白蛋白(BSA) (SIGMA)、 0.05% Tween 20、 PBS(-)}，在37°C 下阻断2小时。阻断后，用PBST清洗3次，把血清用阻断緩冲液稀释， 添加到板上。把板在37。C下静置2小时。静置后，用PBST清洗3次， 再加入用阻断緩沖液稀释的结合了抗小鼠IgGl的辣根过氧化物酶 (SouthernBiotechnologyAsociates) , 37°C,静置2小时。静置后，用PBST 清洗3次，添加发色液[lTab/10mL o-phenylen dehydrochiolide (OPD) (Wako)， 0.1M 一宁檬酸、1 juL/mLH202]发色。R.T.、静置30分钟后，加 入 IN H2S04 停止发色。停止后，用 Benchmark Plus (BIO-RAD.California.USA)测定O.D.405nm。结果如图6所示。 (12)脑样品的准备
在麻醉下切出13个月大的Tg2576的脑。将摘出的脑浸入10%中性 緩冲的福尔马林(Sigma，MO,USA),静置48小时固定组织。
(13>[吏用Tg2576小鼠的脑切片的免疫组织化学
用xylene ethanol将Tg2576的石蜡切片脱去石蜡。添加100%曱酸 (Wako,Osaka，Japan),在烘箱中加热，激活抗原。再用0.3%H2O2抑制内 因性过氧化物酶的活性，用 10%Normal Goat Searum(Vector La bomtories，CA，USA)防止抗体的非特异结合。作为1次抗体，使用兔抗A P 1-40多克隆抗体、兔抗A (3 1-42多克隆抗体或者IIA2, AAV HF2AL感 染HEK293的上清。力口入2次抗体envision + Dual Link System Peroxidase(Dako，,Denmark), 用 Dako Envision + "^式剂/HRP(DAB) (Dako，，Denmark)发色，通苏木精进行核染色。结果如图7所示。
工业上利用的可能性
本发明的载体，能作为阿尔茨海默氏症的予防以及/或者治疗疫苗 来利用。SEQUENCE LISTING 〈110〉 浙江海正药业股份有限公司
〈120>对阿尔茨海默氏症的新一代基因疗法 免疫疗法的开发
<130> FP1F090006ZX/CNZJHZ/MY
<150> JP2008-012393 <151> 2008—01—23
<160> 36
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 1329
<212> 腿
<213> 小鼠(Mus musculus)
〈400> 1
aaagagtctg gccctgggat attgcagccc tcccagaccc tcagtctgac ttgttctttc 60
tctgggtttt cactgagcac ttctggtatg ggtgttggct ggattcgtca gccatcaggg 120
aagggtctag agtggctggc acacgtttgg tgggatgatc tcaagcgcta taacccagcc 180
ctgaagagcc gactgactat ctccaaggat acctccagca gtcagatatt tctcaggatc 240
gccagtgtgg acactgcaga tactgccaca tactactgtg ctcgacttgg taggaggtat 300
ggtaaccctc cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420
gtgaccctgg gatgcctggt casgggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600
aacgttgccc acccggccag cagcaccsag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720
aagcccaagg atgtgctcac caittactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780
atcagca3gg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020
ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080
acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcscctgc 1260
tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320 ggtaastga 1329
〈210〉 2 〈211〉 442 〈212〉 PRT
<213〉 小鼠(Mus musculus) 〈400〉 2
Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val 20 25 30
Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 35 40 45Val Trp Trp Asp Asp Leu Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg 50 55 60
Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin lie Phe Leu Arg lie 65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Uu 85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220
22Cys lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255
Val Val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp 260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu 275 280 285
Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met 290 295 300
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin 340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe 355 360 365
Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu 370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410
415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Uu His Asn His His Thr 420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440
〈210〉 3 〈211〉 1008 〈212〉 DNA
<213〉小鼠(Mus musculus) 〈400〉 3
aaagagtctg gccctgggat attgcagccc tcccagaccc tcagtctgac ttgttctttc 60
tctgggtttt cactgagcac ttctggtatg ggtgttggct ggattcgtca gccatcaggg 120
aagggtctag agtggctggc acacgtttgg tgggatgatc tcaagcgcta taacccagcc 180
ctgaagagcc gactgactat ctccaaggat acctccagca gtcagatatt tctcaggatc 240
gccagtgtgg acactgcaga tactgccaca tactactgtg ctcgeicttgg taggaggtat 300
ggtaaccctc cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420
gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600
aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780
24atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggc 1008
<210> 4 <211> 336 <212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus) <400〉 4
Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu 15 10 15
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val 20 25 30
Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 35 40 45
Val Trp Trp Asp Asp Leu Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg 50 55 60
Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin lie Phe Leu Arg lie 65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu 85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110<formula>formula see original document page 26</formula>Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met 290 295 300
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335
〈210〉 5 〈211〉 654 〈212〉 DNA
<213〉小鼠(Mus musculus) 〈400〉 5
attgtgctga cacagtctcc tccttcctta
tC3tgC3ggg CC3gCC333g tgtC3gt3C3
cagaaaccag gacagccacc caaagtcctc gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct
gtgg3gg3gg 3gg3t3CtgC 33C3tatt3C
ttcggtggag gcaccaaact ggaaatcaaa ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag ggcgtcctga ac3gttgg3c tg3tc3ggac
3CCCtC3Cgt tg3CC33gg3 Cg3gt3tg33
cacaagacat caacttcacc cattgtcaag
〈210〉 6 〈211〉 217 〈212〉 PRT
27
gctgtttctc tggggcagag ggccaccgtc 60
tctaagtata gttatctgca ctggtaccaa 120
atcgagtatt catccaacct agaatctggg 180
gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240
tgtcagcaca gttgggagat tccgtggacg 300
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 360
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 420
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 480
8gc333g3C3 gc3cctac3g catg3gc3gc 540
cgacataaca gctatacctg tgaggccact 600
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 654<213> 小鼠(Mus musculus) <400> 6
lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin 15 10 15
Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Lys 20 25 30
Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys 35 40 45
Val Leu lie Glu Tyr Ser Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro 65 70 75 80
Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Trp Glu 85 90 95
lie Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala 100 105 110
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin Leu 115 120 125
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140
Lys Asp lie Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn 145 150 155 160
28<formula>formula see original document page 29</formula><212> 腿
〈213>小鼠(Mus musculus) <400> 9
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63
〈210〉 10 〈211〉 21 <212> PRT
<213〉 小鼠(Mus musculus) <柳> 10
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp 20
〈210> 11 <211> 72 <212〉 腿
<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus) <400> 11
gcgcccgtga agcagaccct gaacttcgac ctgctgaagc tggccggcga cgtggagtcc 60 aaccccggcc cc 72
<210> 12 〈211〉 24 <212〉 PRT
<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus) 〈400〉 12
Ala Pro Val Lys Gin Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 15 10 15Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20
<210> 13
<211> 12
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> furin cleavage site
<400> 13
cgcgccaagc gc 12
<210> 14 <211> 42 〈212〉 PRT
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 14
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40
<210> 15
<211> 29
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer<400> 15
cccaagcttt ttaccaggag agtgggaga 29
<210〉 16
<211〉 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> primer <400〉 16
ataagaatgc ggccgcagtc gacgctaaca ctcattcctg ttga 44
<210> 17
<211〉 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial)
<220>
<223〉 primer
<400> 17
cggggtacca tgggcaggct tacttcttc 29
<210> 18
<211> 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer
<400〉 18
ccgg3attca tgg3g3C3ga cacactcct 29
<210> 19 <211〉 29 <212> DNA<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223> primer
〈400〉 19
cggggtacca tgggcaggct tacttcttc 29
<210> 20
<211> 29
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer
<400> 20
cccaagcttt ttaccaggag agtgggaga 29
<210> 21
〈211〉 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223> primer
<400〉 21
ccggaattca tggagacaga cacactcct 29
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220〉
<223> primer
<400〉 22
ataagaatgc ggccgcagtc gacgctaaca ctcattcctg ttga 44<210> 23 <211〉 85 〈212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer <400> 23
cgcgccaagc gcgccccccg tgaagcagac cctgaacttc gacctgctga agctggccgg 60 cgacgtggag tccaaccccg gcccc
〈210> 24
<211> 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 primer
<400> 24
ctagctagcc gcgccaagcg cgcccccgt
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400> 25
ccgctcgagg gggccggggt tggactcca
<210> 26
<211〉 29
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial)
85
29
29
34<220>
<223〉 primer 〈400〉 26
cccaagcttc gcgccaagcg cgcccccgt 29
<210〉 27
<211> 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer
<400> 27
ccggaattcg gggccggggt tggactcca 29
〈210〉 28
<211> 20
〈212〉 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer
<400〉 28
aattaaccct cactaaaggg 2(
<210> 29
<211> 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 primer
<400> 29
tcgacttggt aggaggtatg 》
<210> 30<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400〉 30
ggtgg33tgg tgt3C3CCtg 20
<210〉 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer <柳〉31
taatacgact cactataggg 20
<210> 32
<211> 15
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223〉 primer
〈400> 32
gt333acgac ggccs 15
<210> 33
<211〉 20
<212〉 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400> 33<formula>formula see original document page 37</formula>
权利要求
1、表达完全型抗β-类淀粉体抗体或其片段的载体，该载体含有启动子序列、编码抗β-类淀粉体抗体的免疫球蛋白重链或其片段的序列、编码自我加工肽的序列和编码抗β-类淀粉体抗体的免疫球蛋白轻链的序列。
2、 4又利要求1所述的载体，其含有polyA序列。
3、 权利要求1或2所述的载体，其含有ITR序列。
4、 权利要求1 3任一项所述的载体，加工蛋白酶酶切部位与编码 自我加工肽的序列的5'末端侧相连接。
5、 权利要求4所述的载体，所述加工蛋白酶是Furin。
6、 权利要求1 ~ 5任一项所述的载体，所述自我加工肽是2A。
7、 权利要求1 ~ 6任一项所述的载体，编码抗P -类淀粉体抗体的免 疫球蛋白重链或其片段的序列和编码抗P -类淀粉体抗体的免疫球蛋白轻 链的序列均含有分泌信号序列。
8、 权利要求1 7任一项所述的载体，抗P-类淀粉体抗体的免疫球 蛋白重链的片段含有可变区域，含有恒定区域的一部分或完全不含恒定 区域。
9、 权利要求8所述的载体，该载体表达CH3缺陷型抗体，其含有 编码从抗(3-类淀粉体抗体的免疫球蛋白重链中除去CH3区域的片段的 序列。
10、 权利要求1 9任一项所述的载体，所述载体是腺相关病毒载体。
11、 权利要求10所述的载体，所述腺相关病毒载体为1型。
12、 阿耳茨海默氏病的预防和/或治疗药，其含有权利要求1~11 任一项所述的载体作为有效成分。
全文摘要
比抗体投入有持续的效果，比单链抗体有更高抗体能力，使阿尔茨海默氏病的基因治疗·免疫治疗成为可能。表达完整型抗β-淀粉样蛋白抗体或片段的载体，该载体含有启动子序列，抗β-淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白重链或其片段的编码序列，编码自我加工肽的序列以及编码抗β-淀粉样蛋白抗体的免疫球蛋白轻链的序列。包含以上载体作为有效成分的阿尔茨海默氏症的预防以及治疗的药物。
文档编号A61K48/00GK101491683SQ20091000113
公开日2009年7月29日 申请日期2009年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者奥田研尔, 岛田胜, 浜岛健治, 高桥透 申请人:浙江海正药业股份有限公司