CTLA4lg及其衍生物用于抗肿瘤的制作方法

专利名称：：CTLA4lg及其衍生物用于抗肿瘤的制作方法
技术领域：
：本发明涉及已知物质的新药用。具体地，本发明涉及CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在治疗肿瘤中的应用和在制备抗肿瘤药物中的新应用。
背景技术：
：CTLA4Ig活化的T细胞在许多疾病及病理过程中起着十分重要的作用。研究表明，T细胞必须在第一信号(TCR/MHC-Ag)及辅助刺激信号共同作用下才能完全活化C’2’3’4，见后附参考文献列表。以下同)。前者是T淋巴细胞活化的基础，并决定了T细胞反应的特异性；后者是T细胞活化的必要条件，两者缺一不可。缺乏或阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应性(anergy)或细胞凋亡(apoptosis)及克隆丢失(deletion”’3’4’5)。到现在为止已发现多种辅助刺激信号系统，如B7/⑶28-CTLA4系统、⑶40/⑶40L系统、⑶95(Fas)/FasL、CD2/LFA3、ICAM1/LFA1、VCAM1/VLA4系统等(6’7’8’9)。后者为T细胞膜上表面分子，前者为表达于APC膜上的相应配体，二者相互作用发挥辅助刺激作用。研究发现，在所有的辅助刺激信号途径中，B7/CD28-CTLA4系统被认为是最重要的辅助刺激信号系统(6)。CTLA4(CytotoxicLymphocyteAntigen4，CTLA4)是细胞毒性T淋巴细胞中发现的第四种特异性抗原基因编码的糖蛋白。最早由Brimt等在筛选小鼠CTL细胞cDNA扣除文库时发现其编码基因(1°)。在人类，其基因位于2号染色体长臂33带(2q33)(CD28基因也同在此位点)，单拷贝，长约4Kb，含有4个外显子和3个内含子。外显子1含108bp，编码一段含疏水氨基酸的前导链，外显子2含348bp，编码CTLA4V区116个氨基酸，外显子3含lllbp，编码37个氨基酸，包括胞外一部分氨基酸、跨膜区疏水氨基酸和胞浆内功能区开始几个氨基酸，外显子4有102bp，编码CTLA4胞浆段大部分氨基酸，其后是3’非编码区的1150bp，含有约60个AT重复序列辊，可能与控制mRNA的稳定性有关(")。CTLA4是一种跨膜糖蛋白，除信号肽及终止信号外，人CTLA4由187个氨基酸组成，第109至111位为糖基化位点。由膜外区166个氨基酸、跨膜区37氨基酸和胞浆区34个氨基酸组成。主要表达在活化T细胞膜上，并发现，其表达在刺激后48小时左右达高峰(12)。CTLA4可和⑶28分子竞争性抑制与APC膜上的B7分子结合，从而阻断T淋巴细胞活化中的B7-CD28辅助信号途径，进而阻断T细胞的活化。另一方面，当T细胞CTLA4分子与B7分子结合后，致CTLA4胞内段磷酸化，产生负调信号，从而阻断T淋巴细胞活化及功能，因而认为CTLA4是一种T细胞活化的负性调节因子㈦〉。CTLA4胞外段的主要功能是与其相关配体B7分子结合，现在已发现三种以上的B7分子，分别命名为B71(CD80)、B72(CD86)、B73等(14,15)。但CTLA4胞外区与B7分子的结合力比⑶28大20至100倍(16)。跨膜区是将胞外区被B7分子结合的信号传向细胞内。CTLA4胞内区是将外来信号转变成细胞负调信号，而降低T细胞的功能。所以，CTLA4至少通过两条途径发挥着下调T细胞功能的作用(17’18)。一是通过CTLA4胞外区和⑶28竞争性结合，而抑制抗原提呈细胞上的B7分子与T细胞膜上的CD28分子结合，从而使阻断T细胞活化所必须的B7-⑶28辅助信号途径，致使T细胞功能下调。另一方面，当CTLA4与B7分子结合后，直接产生负调信号，同样下调T细胞功能。正如前面所述，国内外学者应用CTLA4与B7分子高亲合力特性，正致力研制阻断B7-⑶28途径的CTLA4胞外段制剂，以阻断T细胞活化中的B7/⑶28途径，进而阻断T细胞的完全活化，最终达到治疗T细胞过度活化相关性疾病的目的。出于纯化方法等方面的考虑，Iinesly等首先将CTLA4胞外段与部分IgGFc段融合，并将其命名为CTLA4Ig(19)。他们将人CTLA4胞外区第1至125氨基酸与人IgGFc段的CH2，CH3及、区的相应基因组融合而成。由于其中含有IgGFc段，能较方便地应用蛋白A层析纯化(19)。另外，因CTLA4为免疫球蛋白超家族成员，当其胞外段与IgGFc段融合后，还能较好地维持分子的完整性及空间构象，从而保证与B7分子结合等功能良好。现在研究发现，CTLA4Ig不仅对与T细胞过度活化有关的多种自身免疫性疾病及移植后免疫排斥反应有一定的治疗及预防作用，它还在减轻休克损伤、延长基因治疗中转基因表达等方面发挥着重要作用。例如，CTLA4Ig对缺血再灌注损伤具有治疗作用，可应用于自身免疫性疾病的治疗中，可延长异基因移植物存活期，可促进转基因表达等。CTLA4Ig的衍生物CTLA4Ig已被广泛证明能结合其配体⑶80和⑶86分子，并由此阻断⑶80/CD86-CD28共刺激通路导致T细胞的凋亡(apoptosis)或无应答(anergy)。但CTLA4Ig结合⑶80及⑶86分子的能力有差别，即CTLA4Ig与⑶80的亲和力更强，其阻断CD80-CD28共刺激通路的效能是阻断CD86-CD28通路的100倍[LinsleyPS,Greene几，BradyW,BajorathJ,LedbetterJAandPeachR.HumanB7-1(CD80)bindwithsimilaraviditiesbutdistinctkineticstoCD28andCTLA4receptors.Immunity1994,1=793-801]也正是因为由于CTLA4Ig不能有效阻断⑶86-⑶28共刺激通路，故动物模型显示CTLA4Ig不能完全阻断T细胞激活[RoncheseF,HausmannB,HubeleS,LaneP.MicetransgenicforasolubleformofmurineCTLA4showenhancedexpansionofantigen-specificCD4+Tcellsanddefectiveantibodyproductioninvivo.J.Exp.Med.1994，179:809-817.SayeghMH,AkalinE,HancockWW,etal.CD28-B7blockag\deafteralloantigenicchallengeinvivoinhit\bitsThlcytokinesbutsparesTh2.J.Exp.Med.1995,1811869-1874.KhourySJ,AkalinE，ChandrakerA,etal.CD28-B7costimulatoryblockadebyCTLA4Igpreventsactive\elyinducedexperimentalautoimmuneencephalomyelitisandinhibitsThlbutsparesTh2cytokinesinthecentralnervoussystem.J.Immunol.1995,155:4521-4524.GriggsND,AgersborgSS,NoelleRJ,LedbetterJA,LinsleyPSandTungKS.TherelativecontributionoftheCD28andgp39costimulatorypathwaysintheclonalexpansionandpathogenicacquisitionofself-reactiveTcells.J.Exp.Med.1997,185:393-403·]。为了能同时有效阻断⑶80-⑶28和⑶86-⑶28通路以增强CTLA4Ig的生物功能，Bristol-MyersSquibb公司以CTLA4Ig为母分子，选择20个氨基酸进行点突变(site-directedmutagenesis)，筛选了2300个子代CTLA4Ig融合蛋白，发现在104位用亮氨酸替代谷氨酸可显著降低(2倍)CTLA4Ig突变体与⑶86的解离速率(与野生型CTLA4Ig比较)，生物学功效更优，该蛋白取名L104E[LarsenCP,PearsonTC，AdamsAB,TsoP,ShirasugiN,StrobertΕ,AndersonD,CowanS,PriceK,NaemuraJ,EmswiIerJ,GreeneJ,TurkLA,BajorathJ,TownsendR,HagertyD,LinsleyPSandPeachRJ.RationaldevelopmentofLEA29Y(balatacept),ahigh-affinityvariantofCTLA4_Igwithpotentimmunosuppressiveproperties.AmericanJTransplant.2005，5:443_453]。再以L104E-Ig为PCR模版，发现A29突变的蛋白与⑶86的离解速率比母代分子CTLA4Ig下降4倍，并取名LEA29Y，但单独突变A29则对离解速率无影响。实验证明，LEA29Y比CTLA4Ig有更强的与⑶80和⑶86的亲和力，而且，其抑制⑶86调控的T细胞增殖的能力是CTLA4Ig的10倍。LEA29Y在活体实验表明，它能有效抑制体液免疫，单独或联合常规免疫抑制剂能显著延长动物的异体肾脏移植物的存活时间。该研究还证明CTLA4Ig氨基酸序列的第24和104位对与配体的结合至关重要[LarsenCP,PearsonTC,AdamsAB,TsoP,ShirasugiN,StrobertΕ,AndersonD,CowanS,PriceK,NaemuraJ,EmswiIerJ,GreeneJ,TurkLA,BajorathJ,TownsendR,HagertyD,LinsleyPSandPeachRJ.RationaldevelopmentofLEA29Y(balatacept),ahigh-affinityvariantofCTLA4_Igwithpotentimmunosuppressiveproperties.AmericanJTransplant.2005,5443-453；Bristol-MyersSquibbCo.:W00202638.EngineeringhighavidityCTLA4Igfortherapyofrheumaticdiseases.ExpertOpin.Ther.Patents2002，12:1455—1457]。此外，研究者还对CTLA4Ig的Fc部分进行了突变，S卩把IgG恒定区的第130，136和139位的半光氨酸(cysteine)用丝氨酸(serine)替代，148位的脯氨酸(proline)用丝氨酸替代，并取名Abatac印t。实验表明，Abatacept不再具有结合CD16和CD32的能力，并只具有较弱的结合⑶69的能力。这些特点使得Abatac^pt不再有ADCC和⑶C作用[PM.Davis,R.Abraham,L.Xu,STNadlerandSJSuchard.AbataceptbindstotheFcreceptorCD64butdoesnotmediatecomplement-dependentcytotoxicityorantibody-dependentcellularcytotoxicity.JRheumatology2007,34:2204-10]。综上所述，迄今为止，CTLA4Ig及其所有功能衍生物，包括但不限于Abatac印t，Belatac印t，LEA29Y等，都是通过与CD80和CD86分子结合，从而阻断CD80-CD28和⑶86-⑶28共刺激通路，达到控制免疫应答的作用。因此，有理由认为，凡是能结合⑶80和CD86分子的CTLA4Ig及其功能衍生物，包括但不限于Abatac印t，Belatac印t，LEA29Y等，都具有相同或相似的生物学功能，能用于相关的疾病的治疗，并能达到相同或相似的疗效。AbataceptAbatacept是临床用于治疗类风湿性关节炎的CTLA4Ig，是由CTLA4胞外区和人IgGl的CH2、CH3区组成的融合蛋白，对⑶80/⑶86分子亲和力高于CTLA4本身。而对Fc段的修饰使其与细胞表面CD16/CD32不接合，从而避免ADCC作用的发生。在动物实验中，CTLA4Ig的用量较大。因此Abatac印t无论从经济角度考虑还是其作用的特点考虑，无疑是最好的CTLA4Ig的替代品。NK细胞(naturalkillercell,自然杀伤细胞)NK细胞是与Τ、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞数量较少，在外周血中约占淋巴细胞总数的15%，在脾内约有3%4%，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。NK细胞较大，含有胞浆颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。NK细胞杀伤的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、较大的病原体(如细菌，真菌和寄生虫)、同种异体移植的器官、组织等，但不伤及正常细胞。NK细胞表面受体(NKR)可以识别被病毒感染的细胞表面表达的多糖分子。NK细胞的杀伤效应是由其活化后释放出的毒性分子介导，如穿孔素、颗粒酶和TNFa(肿瘤坏死因子)等。NK细胞作用机理NK细胞抗肿瘤的机理可能经过三个步骤(I)NK细胞与靶细胞结合，NK细胞表面有识别靶细胞的受体，而靶细胞表面有被受体识别的决定簇；(2)靶细胞刺激NK细胞释放NK细胞毒性因子；(3)NK细胞毒性因子与靶细胞结合，促使某些酶发生变化，导致靶细胞溶解。此外，NK细胞通过自然杀伤和ADCC发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。(1)抗病毒感染NK可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。由辅佐细胞或NK细胞所产生的IFN可协同NK的抗病毒作用，而对正常细胞有保护作用。另一方面，病毒感染细胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其对NK的杀伤细胞作用变得更加敏感。在体外，NK可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。体内试验表明，NK低活性小鼠品系对某些病毒感染更加敏感；注射抑制NK细胞的抗AsialoGMl抗体可加重小鼠流感病毒性肺炎。此外，NK细胞在体外还可杀伤细菌、真菌、原虫等，可能与NK细胞释放某些杀伤介质有关。(2)NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。某些疾病如Chediak-Higashi或X性联淋巴增殖综合征患者，由于NK功能缺陷对恶性淋巴细胞增殖疾病特别易感。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应(graft-versus-leukemiaeffect,GVL)在体外NK细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。骨髓移植后数周内，来自供体的NK细胞在PBL中占相当高的比例。此外，在体内NK细胞还可杀伤某些不成熟细胞如胃髓干细胞、胸腺细胞亚群等。NK细胞表面受体NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NKG2D为NK细胞的激活性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要激活性受体。NKG2D的配体为MHCI类链相关基因产物(MICA，MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBPl，ULBP2,ULBP3)，NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达。NKG2D影响NK细胞对靶细胞的杀伤活性，提高NKG2D的表达有可能提高NK细胞的抗肿瘤活性。NK细胞受体还包括NKp46、NKp44和NKp30等，其中NKp46和NKp30表达于所有静止和活化的NK细胞，而NKp44则选择性的表达于活化的NK细胞。靶细胞上的配体分子与NK细胞受体的结合(交联)引发NK细胞的激活导致靶细胞的裂解和大量细胞因子的产生。目前已经确认NKp46和NKp44可以识别病毒上的配体分子红血球凝聚素，而NKp46则能识别肿瘤细胞上的乙酰硫酸多聚糖。
发明内容本发明人经过深入研究，意外地发现CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物(包括但不限于Abatac印t，Belatac印t，LEA29Y等，优选Abatac^ptfPBalatac印t)对NK细胞(自然杀伤细胞)的细胞毒性具有显著的激活作用，并且证实CTLA4Ig提高NK细胞毒性的分子机制是显著提高了NK细胞膜表面的激活受体如NKG2D，NKp44等的表达。实验证明，通过提高机体NK细胞的细胞毒性，CTLA4Ig可以用于抗肿瘤治疗。具体地，本发明提供以下各项1.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatac^pt和Balatac印t。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合⑶80及⑶86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatac^pt。2.根据以上1的应用，其中所述肿瘤是上皮组织肿瘤、间叶组织肿瘤、神经组织肿瘤或其它类型肿瘤。上皮组织肿瘤是来自被复上皮(鳞状上皮、移行上皮和柱状上皮等)及腺上皮的肿瘤。间叶组织肿瘤是来自胚胎时中胚叶所分化发育的各种组织，又可分为以下主要几类(1)结缔组织肿瘤，来自纤维组织、脂肪组织、软骨和骨组织等肿瘤；(2)骨肉组织肿瘤，来自平滑肌和横纹肌的肿瘤；(3)脉管组织肿瘤，来自血管和淋巴管的肿瘤；(4)造血组织肿瘤，来自淋巴组织和骨髓组织的肿瘤。神经组织肿瘤是来自神经细胞、神经胶质细胞、神经鞘膜细胞等的肿瘤。其它类型肿瘤是有些来自上述两种以上的组织、还有些来自胎盘等特殊组织的肿瘤。3.根据以上2的应用，其中所述肿瘤选自乳头状瘤，腺瘤，囊腺瘤，混合瘤，移行上皮癌，基底细胞癌，脂肪瘤，平滑肌瘤，纤维瘤，横纹肌瘤，血管瘤，淋巴管瘤，骨瘤，软骨瘤，滑膜瘤，星形细胞瘤，多形胶质母细胞瘤，成髓细胞瘤，神经鞘瘤，神经节细胞瘤，脑膜瘤，淋巴瘤，白血病，多发骨髓瘤，绒毛上皮癌，精原细胞瘤，恶性畸胎瘤和黑色素瘤。4.根据以上3的应用，其中所述肿瘤是黑色素瘤。5.根据以上1-4任一项的应用，其中所述肿瘤是转移瘤。6.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有激活NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatac^pt和Balatac印t。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合⑶80及⑶86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatac印t。7.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于提高生物体(人体或动物体)的NK细胞的激活性受体的表达的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有提高NK细胞的激活性受体的表达的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合⑶80及⑶86的能力的Abatac^pt和Balatacept0所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合⑶80及⑶86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatac印t。8.根据以上7的应用，其中所述NK细胞的激活性受体是NKG2D和/或NKp44。9.一种抗肿瘤药物组合物，其包含CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物和药用辅剂，所述CTLA4Ig衍生物具有激活生物体(人体或动物体)的NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatac^pt和Balatac印t。所述衍生物还包括其中CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。本发明的CTLA4Ig衍生物可以在保留结合⑶80及⑶86的能力的同时而在CTLA4Ig的Fc片段被修饰以避免Fc段介导的ADCC作用，如Abatac印t。药物组合物的配制是本领域技术人员所公知的，例如参见Remington’sPharmaceuticalSciencesiMackPublishingCo.(A.R.Gennaro片反本1985)。10.根据以上9的药物组合物，其还含有另外的抗肿瘤活性成分。11.一种治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述受试者是人或动物。本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定CTLA4Ig和药物组合物的剂量水平。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。12.根据以上11的方法，其中所述受试者的肿瘤选自以上2或3中列出的肿瘤。13.根据以上11或12的方法，其中所述肿瘤是转移瘤。14.根据以上11-13任一项的方法，其中所述受试者还同时接受另一种抗肿瘤疗法。所述抗肿瘤疗法包括但不限于化学疗法、冷冻疗法、高热、抗体疗法、放射疗法和抗_血管发生疗法。15.一种激活受试者中NK细胞的细胞毒性功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述受试者是人或动物。16.一种提高受试者中NK细胞的激活性受体的表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用CTLA4Ig或上述CTLA4Ig衍生物或根据以上9或10的药物组合物的步骤。优选所述激活性受体是NKG2D或NKp44。优选所述受试者是人或动物。应当理解，本发明意欲包括上述各项的任意组合。图1.CTLA4Ig对人外周血单个核细胞(PBMC)毒性调节作用。A加入的CTLA4Ig浓度对PBMC细胞毒性的影响；B:CTLA4Ig(在本文和附图中有时也表示为CTLA_4Ig或CTLA4-Ig)的调节作用的激活率；图2.CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(彡1μg/ml)；图3.CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(<1μg/ml)；图4A:CTLA4Ig对NK细胞表面NKG2D受体表达的影响；图4B:CTLA4Ig对NK细胞表面NKP44受体表达的影响；图5.抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)在CTLA4Ig激活NK细胞功能中可能的作用。A:CTLA4Ig可增强NK92的细胞毒性；B:CTLA4Ig增强人NK细胞毒性部分是ADCC非依赖的；图6.CTLA4Ig与IL-2对于NK细胞杀伤毒性的影响；图7.CTLA-4Ig体内促进NK细胞杀伤肿瘤细胞；图8.CTLA-4Ig的衍生物Abatac^pt体内促进NK细胞杀伤肿瘤细胞；图9.CTLA4Ig在病毒源性肿瘤(EB病毒源性人B细胞淋巴瘤)模型中的作用。A:实验方法；B:实验结果；图10.CTLA4Ig对B16淋巴瘤细胞转移、定植的影响；图11.Abatacept的CTLA4区域和Fc区域的氨基酸序列；图12.CTLA4Ig的CTLA4区域和Fc区域的氨基酸序列。具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例lCTLA4Ig对人外周血单个核细胞(PBMC)毒性调节作用研究1.试剂和材料人PBMC来源于重庆西南医院输血科，手工分浓缩白细胞；CTLA4Ig,RecombinantHumanCTLA-4/FcChimera,CatalogNumber:325_CT,商购自美国R&Dsystem公司；人淋巴细胞分离液200ml，CatalogNumber:LTS1077，商购自天津市灏洋生物制品有限责任公司(TBD)；CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，CatalogNumber:ALX-610-030,商购自Alexisbiochemicals；PropidiumIodide/碘化丙啶，CatalogNumber:537059，商购自Calbiochem，SanDiego,CA；K562(人慢性粒细胞白血病细胞系)购自中科院上海细胞库；流式细胞仪，美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckmancoyltercell)型号商购自CellLabQuantaSC。2.实验方法人PBMC分离将手工分浓缩白细胞缓慢加至等体积淋巴细胞分离液面上，室温离心，3000rpm/min,20min,取中间白膜层，大量PBS洗涤细胞，计数备用(参考文献:Ulmer,A.J.,W.Scholz,Μ.Ernst,Ε.Brandt,andH.D.Flad.1984.IsolationandsubfractionationofhumanperipheralbloodmononucIearcells(PBMC)bydensitygradientcentrifugationonPercoll.Immunobiology166238-250)；细胞毒性检测方法(参考文献Marcusson-Stahl，Μ.，andK.Cederbrant.2003.Aflow-cytometricNK-cytotoxicityassayadaptedforuseinratrepeateddosetoxicitystudies.Toxicology193:269_279)用CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562用DMSO溶解活细胞绿色荧光染料(CFSE)成5mmol/L的储存液，于-20°C避光保存。使用时，用无血清RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺，#C11875500BT,Invitrogen)稀释成5μmol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5XIO6个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37°C孵育lOmin，用1640+10%体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的RPMI1640(+10%胎牛血清)重悬细胞。效应细胞、靶细胞共培养106个人PBMC+2X104个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞的自然死亡对照。PI(碘化丙啶)标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg/1111，工作液5(^8/1111。取出培养板中的细胞，离心后用100μIPI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中带CFSE/PI双标记的细胞即为死亡的Κ562细胞。PBMC的杀伤效率可用下列公式计算细胞毒性(cytotoxicity)100X(加入PBMC的K562死亡率-自然死亡率)/(100-自然死亡率)在共培养体系中加入不同浓度CTLA4Ig(终浓度分别为0.1，0.5，2，5，10和20μg/ml)，检测其对PBMC毒性的影响。统计方法单因素方差分析，P<0.05确定为有显著性差异。所用软件为spss13.0。3.实验结果(见图1和表1)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注各表中数值为P值(以下同)。结论从图1和表1可以看出，CTLA4Ig促进人PBMC杀伤NK细胞敏感靶细胞，其最低有效浓度为0.5μg/ml，超过该浓度后，激活能力与剂量无关。实施例2CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(≥1μg/ml)1.试剂和材料人NK细胞分离试剂盒(NKCellIsolationKithuman)，CatalogNumber130-092-657，商购自miltenyibiotec公司(德国)。LDcolumns,CatalogNumber130-042-901,miltenyibiotec其余材料同实施例Io2.实验方法人PBMC分离同实施例1；人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；细胞毒性检测方法CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。效应细胞、靶细胞共培养105个人NK细胞+2XIO3个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。PI标记死亡细胞、流式细胞仪检测和NK细胞的杀伤效率的计算方法同实施例1。在共培养体系中加入不同浓度的CTLA4Ig(分别为1，5，10和20μg/ml)，检测其对NK细胞毒性的影响。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。3.实验结果(参见表2和图2)表2Γ~0~51020~~~00.0020.0010.0020.002~I0.0020.4740.965~1.000~0.0010.4740.7770.436~100.0020.9650.7770.946200.002~1.0000.4360.946结论从表2和图2可以明显看出，CTLA4Ig有效地促进人NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力。在浓度大于ιμg/ml时，CTLA4Ig促进NK细胞杀伤靶细胞的能力为非剂量依赖性。实施例3CTLA4Ig有效的促进入NK细胞杀伤敏感靶细胞的能力(<1μg/ml)1.试剂和材料同实施例2。2.实验方法人PBMC分离同实施例1；人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；细胞毒性检测方法CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。效应细胞、靶细胞共培养IO5个人NK细胞+2XIO3个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。加入IL-2的K562作为阳性对照。PI标记死亡细胞、流式细胞仪检测和NK细胞的杀伤效率的计算方法同实施例1。在共培养体系中加入不同浓度的CTLA4Ig(分别为0.01，0.1，0.5和1μg/ml)，检测其对NK细胞毒性的影响。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。3.实验结果(参见表3和图3)表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论从表3和图3可以明显看出，CTLA4Ig促进人NK细胞杀伤NK细胞敏感靶细胞的最低有效浓度为0.1μg/ml，且激活能力随浓度增加而增强，超过0.5μg/ml后，激活能力与剂量无关。IL-2是公认的NK细胞强有力的激活剂，在文献中_经常用于做NK细胞激活的阳性对照，此处主要用于明确CTLA4Ig对NK细胞激活作用与IL-2相比较的程度，最终得出CTLA4Ig对NK细胞激活能力与IL-2相当的结论，在后面的研究中专门提到。实施例4CTLA4Ig对NK细胞表面激活受体表达的影响1.试剂和材料赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hlgGl)；(上海罗氏生产用于预防肾移植后急性排斥反应的药品，赛尼哌为商品名，Daclizumab为药品名，其中含hlgGl片段可作为本试验的对照)Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-humanCD56(N-CAM,NCAM),CatalogNumber:ll-0569-71/25tests，商购自eBioscience(美国)；PEanti-humanCD56(NCAM)，CatalogNumber318305/25tests,Biolegend(_国)PEanti-humanCD336(NKp44)，CatalogNumber325107/25tests,BiolegendFluoresceinisothiocyanate(FITC)antihumanNKG2D/CD314(activating)，CatalogNumber:ll_5878/25tests，eBioscience其余试剂和材料同实施例2。2.实验方法人PBMC分离同实施例1；人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；分离NK细胞后，立即加入96孔板，IO5个/孔，并分别加入CTLA4Ig2.5μg/ml，hlgGl(体外试验中使用的纯化的CTLA4Ig中Fc段可能与NK细胞表面⑶16等分子结合，介导ADCC作用从而增加NK细胞活性，加入hlgGl的目的是为了排除ADCC作用的影响)2.5μg/ml,IL-2(注射用重组人白介素_2，商购自北京双鹭药业，文献报道认为IL-2能作用于NK细胞)1000U/ml(参考文献=Lin,S.J.，R.L.Roberts,B.J.Ank,Q.H.Nguyen,Ε.K.Thomas,andE.R.Stiehm.1997.Humanimmunodeficiencyvirus(HIV)type-lGP120-specificcell-mediatedcytotoxicity(CMC)andnaturalkiller(NK)activityinHIV-infected(HIV+)subjects!enhancementwithinterleukin-2(IL-2),IL-12,andIL-15.Clinicalimmunologyandimmunopathology82:163-173),相互作用16小时后，取出细胞按文献(Dasgupta,S.,M.Bhattacharya-Chatterjee,B.W.0'Malley,Jr.,andS.K.Chatterjee.2005.InhibitionofNKcellactivitythroughTGF-beta1bydown-regulationofNKG2Dinamurinemodelofheadandneckcancer.JInmunol1755541-5550；禾口Mavoungou,Ε.,Μ.K.Bouyou-Akotet,andP.GKremsner.2005.EffectsofprolactinandCortisolonnaturalkiller(NK)cellsurfaceexpressionandfunctionofhumannaturalcytotoxicityreceptors(NKp46,NKp44andNKp30).Clinicalandexperimentalimmunology139:287_296)方法标记细胞表面受体，PBS洗去抗体后用流式细胞仪检测。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。3.实验结果A:CTLA4Ig对NK细胞表面的激活性受体NKG2D的表达的影响(参见图4A和表4)表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结论CTLA4可上调NK细胞表面NKG2D的表达。应当指出，体外试验中使用的纯化的CTLA4Ig中Fc段可能与NK细胞表面⑶16等分子结合，从而活化NK细胞的细胞毒性功能。因为CTLA4Ig的Fc段与hlgGl的Fc段是一样的，故加入hlgGl目的是为了证明CTLA4Ig对NK的作用不是Fc段的作用，而是CTLA4的作用。B:CTLA4Ig对NK细胞表面的激活性受体NKP44的表达的影响(参见图4B和表5)表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论CTLA4可上调NK细胞表面NKp44的表达。实施例5抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)在CTLA4Ig激活NK细胞功能中可能的作用A.CTLA4Ig可增强NK92细胞毒性1.试剂和材料CTLA4Ig,RecombinantHumanCTLA-4/FcChimera,CatalogNumber:325-CT,R&Dsystem；赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hlgGl)；NK92细胞株购自中科院上海细胞库；CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，CatalogNumber:ALX_610-030，Alexisbiochemicals；PropidiumIodide/W^^Pg,CatalogNumber:537059,Calbiochem,SanDiego,CA；K562(人慢性粒细胞白血病细胞系)购自中科院上海细胞库；流式细胞仪美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckmancoyltercell)型号CellLabQuantaSC；2.实验方法细胞毒性检测方法CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于_20°C避光保存。使用时，用无血清1640培养液稀释成5ymol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5XIO6个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37°C孵育lOmin，用1640+10%体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。效应细胞、靶细胞共培养106个NK92细胞+2XIO4个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养4h。未加NK92的K562作为靶细胞自然死亡对照。PI标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50yg/mL·取出培养板中的细胞，离心后用100μ1PI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的Κ562细胞。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>在共培养体系中分别加入CTLA4Ig，hIgGl2.5μg/ml，检测其对NK92细胞毒性的影响。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。实验结果(参见图5A和表6)表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结论由于NK92细胞表面不存在CD16/CD32/CD64(Maki，G,H.GKlingemann,J.A.Martinson,andY.K.Tam.2001.Factorsregulatingthecytotoxicactivityofthehumannaturalkillercellline,NK-92.Journalofhematotherapy&stemcellresearch10369-383)，可认为其不具备ADCC作用。故CTLA4Ig对NK92细胞毒性增强作用是非ADCC介导的。B.CTLA4Ig增强人NK细胞毒性部分是ADCC非依赖的1.试剂和材料同上述实施例。2.实验方法人PBMC分离同实施例1；人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作；细胞毒性检测方法CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562的方法同实施例1。效应细胞、靶细胞共培养105个人NK细胞+2XIO3个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5小时。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。PI标记死亡细胞、流式细胞仪检测和NK细胞的杀伤效率的计算方法同实施例1。hlgGl包被96孔板10μg/mlhlgGl加入PBS中配成2.5μg/ml，200μ1加入96孔板，3个平行孔，4°C，12小时(Dubois,S.，H.J.Patel,M.Zhang,Τ.A.ffaldmann,andJ.R.Muller.2008.PreassociationofIL_15withIL-15Ralpha_IgGl_FcenhancesitsactivityonproliferationofNKandCD8+/CD44highTcellsanditsantitumoraction.JImmunol180:2099_2106)。在共培养体系中分别加入CTLA4Ig，hlgGl2.5μg/ml,同时在包被孔中加入混合细胞，检测CTLA4Ig对人NK细胞毒性的影响。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。实验结果(参见图5B和表7)表7<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(SolubleIg是指在培养体系中加入可溶性的hlgGl，模拟细胞微环境中的游离作用状态，而boimd-Ig则是在试验前12小时利用文献报道方法模拟膜表达的状态将hlgGl固定在细胞培养板上)3.结论hlgGl可通过ADCC作用显著增强人NK细胞毒性，CTLA4Ig对NK细胞毒性激活作用与hlgGl所介导的ADCC作用相比有显著性差异，即具对NK细胞毒性激活作用部分是非ADCC依赖的。由此，CTLA4Ig对NK细胞毒性激活作用的活性部分主要是在于其CTLA4部分。因此，可以对CTLA4Ig的Fc部分进行修饰，以获得避免了Fc段介导的ADCC作用的CTLA4Ig衍生物。实施例6CTLA4Ig与IL_2对于NK细胞杀伤毒性的影响1.试剂和材料人PBMC西南医院输血科手工分浓缩白细胞CTLA4Ig,RecombinantHumanCTLA-4/FcChimera,CatalogNumber:325-CT,R&Dsystem人淋巴细胞分离液200ml，CatalogNumber:LTS1077,TBDNKCellIsolationKithuman,CatalogNumber:130-092—657,miltenyibiotecLDcolumns,CatalogNumber:130-042_901，miltenyibiotec注射用重组人白介素-250万IU/瓶，北京双鹭药业CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，CatalogNumber:ALX_610-030，AlexisbiochemicalsPropidiumIodide/Ift^MPg,CatalogNumber:537059,Calbiochem,SanDiego,CAK562(人慢性粒细胞白血病细胞系)购自中科院上海细胞库流式细胞仪美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckmancoyltercell)型号CellLabQuantaSC2.实验方法1，人PBMC分离手工分浓缩白细胞缓慢加至等体积淋巴细胞分离液面上，3000rpm/min,室温，20min，取中间白膜层，大量PBS洗涤细胞，计数备用；2，人NK细胞分离，严格按试剂盒说明书操作3，细胞毒性检测方法(I)CFSE标记人NK细胞敏感靶细胞K562用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于_20°C避光保存。使用时，用无血清1640培养液稀释成5umol/L的工作液备用。制作K562细胞悬液2-5X106个/ml，加入等体积CFSE工作液，于37°C孵育lOmin，用1640+10%体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。(2)效应细胞、靶细胞共培养105个人NK细胞+2XIO3个CFSE标记的K562加入96孔板，共培养2.5h。未加PBMC的K562作为靶细胞自然死亡对照。PI标记死亡细胞，用流式细胞仪检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50yg/mL·取出培养板中的细胞，离心后用100μ1PI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的Κ562细胞。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算cytotoxicity^=100X(加入人NK细胞的K562死亡率-自然死亡率)/(100_自然死亡率)4，在共培养体系中分别加ΛCTLA4Ig2.5μg/ml和IL_21000U/ml(3)，比较CTLA4Ig和IL-2对人NK细胞毒性的影响。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。实验结果(参见图6和表8)表8<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(hlgGl是对照，用于排除ADCC作用的影响)结论CTLA4Ig对NK细胞毒性功能激活的能力与IL_2相当。实施例7静脉注射小剂量的CTLA_4Ig能够在体内促进NK细胞杀伤肿瘤的功能试剂和动物CTLA-4Ig,RecombinantHumanCTLA-4/FcChimera,CatalogNumber:325_CT，R&Dsystem红细胞裂解液配制首先配制储存液，即0.16M氯化铵8.3g/L，0.17MTris将20.6gTris溶于900ml的双蒸水中，调整pH值至7.65后，补足至1000ml。工作液将90ml0.16M氯化铵和IOml0.17MTris(pH7.65)混合，调整pH值至7.2,0.22微米过滤除菌备用。CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)，CatalogNumber:ALX_610-030，AlexisbiochemicalsPropidiumIodide/Ift^MPg,CatalogNumber:537059,Calbiochem,SanDiego,CAYAC-I(鼠T淋巴瘤细胞系)购自中科院上海细胞库流式细胞仪美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪(Beckmancoyltercell)型号CellLabQuantaSCBalb/c小鼠购自第三军医大学动物所赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含人IgGl)实验方法小鼠尾静脉注射CTLA4Ig；酒精消毒小鼠尾静脉后，用Iml注射器将200μ1(含IOygCTLA4Ig)沿小鼠尾静脉，小于30°进针，注射入小鼠体内。24h后，杀死小鼠，取脾脏，加小牛血清研磨制成细胞悬液后350g，离心6min。弃上清加入IOml以上制备的红细胞裂解液，静置2-4min后离心，弃上清后计数备用。细胞毒性检测方法CFSE标记小鼠NK细胞敏感靶细胞YAC-I用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于-20°C避光保存。使用时，用无血清RPMI1640培养基稀释成5μmol/L的工作液备用。制作YAC-I悬液2-5XIO6个细胞/ml，加入等体积CFSE工作液，于37°C孵育lOmin，用RPMI1640+10%体积的冷小牛血清立即终止标记。离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。效应细胞、巴细胞共培养将IO6个小鼠脾脏淋巴细胞+2XIO4个CFSE标记的YAC-I加入96孔板，共培养3h。未加效应细胞的YAC-I作为靶细胞自然死亡对照。PI标记死亡细胞，上机检测；用PBS配成PI储存液250mg./ml，工作液50μg/ml。取出培养板中的细胞，离心后用οομPI工作液标记死亡细胞。流式细胞仪中CFSE/PI双标细胞即为死亡的YAC-I。则NK细胞的杀伤效率可用下列公式计算cytotoxicity^=100X(加入小鼠脾脏淋巴细胞的YAC-I死亡率-自然死亡率)/(100_自然死亡率)。将未注射CTLA4Ig和注射人Ig的小鼠脾脏淋巴细胞列为对照组，检测脾脏淋巴细胞(即NK细胞)毒性有无差异。统计方法单因素方差分析，ρ<0.05有显著性差异。实验结果(参见图7和表9)表9<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结论小鼠尾静脉注射小剂量CTLA4Ig可显著提高其脾脏NK细胞对于靶肿瘤细胞YAC-I的毒性。实施例8静脉注射CTLA4Ig的衍生物Abatac^pt能够在体内促进NK细胞杀伤肿瘤的功能除了用Abatac印t(商品名是Orencia，购自美国施贵宝公司(Bristol-Myers-Squibb))替换CTLA4Ig以外，本实施例中使用的其余试剂和动物、实验方法(检测注射Abatac^pt(300μg/只)48小时后Balb/c脾脏细胞对靶细胞的杀伤毒性)、统计方法都与实施例7相同。实验结果见图8。结论小鼠尾静脉注射CTLA4Ig的衍生物Abatac^pt可显著提高其脾脏NK细胞对于靶肿瘤细胞YAC-I的毒性。实施例9CTLA4Ig在病毒源性肿瘤(EB病毒源性人B细胞淋巴瘤)模型中的作用动物和试剂SCID(重症联合免疫缺陷小鼠)小鼠商购于第三军医大学动物所；EB病毒感染人B细胞来源于第三军医大学新桥医院血液科；CTLA4IgRecombinantHumanCTLA-4/FcChimeraCatalogNumber:325-CTR&Dsystem赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含人IgGl)ASGMl(AsialoGMl，#LSALX-302-013_M001，商购自Alexis)，可增强PBMC在SCID小鼠体内定植，来源于第三军医大学新桥医院血液科。实验方法(图9(A))(Murphy,W.J.，S.Funakoshi，M.Beckwith,S.E.Rushing,D.K.Conley,R.J.Armitage,W.C.Fanslow,H.C.Rager,D.D.Taub,F.W.Ruscetti,andetal.1995.AntibodiestoCD40preventEpstein-Barrvirus-mediatedhumanB-celllymphomagenesisinseverecombinedimmunedeficientmicegivenhumanperipheralbloodlymphocytes.Blood861946-1953)实验结果参见图9(B)。结论CTLA4Ig通过对NK细胞毒性功能的激活，显著延长EB病毒诱导的B细胞淋巴瘤小鼠的生存时间。实施例10CTLA4Ig对B16淋巴瘤细胞转移、定植的影响动物和试剂SCID小鼠商购于第三军医大学动物所B16小鼠黑色素瘤细胞，购自中科院上海细胞库CTLA4IgRecombinantHumanCTLA-4/FcChimeraCatalogNumber:325-CTR&Dsystem赛尼哌(抗Tac单抗注射液(Zenapax)抗Tac单抗Daclizumab，上海罗氏(含hlgGl)实验方法SCID鼠尾静脉分别注射200μ1CTLA4Ig，hlgGl10μg/只，各10只。同时注射B16细胞2XIO5个(Kawada,M.，M.Kawatsu,T.Masuda,S.Ohba,M.Amemiya,T.Kohama,M.Ishizuka,andΤ.Takeuchi.2003.Specificinhibitorsofproteinphosphatase2Ainhibittumormetastasisthroughaugmentationofnaturalkillercells.Internationalimmunopharmacology3:179-188)，以后每隔一天注射一次CTLA4Ig,hlgGl。第十天颈椎脱白处死小鼠，观察肺部肿瘤定植情况。实验结果参见图10。结论CTLA4Ig通过对NK细胞毒性功能的激活，能显著减少B16黑色素瘤细胞在肺组织中的转移和定植。参考文献1.BluestoneJA.Costimulationanditsroleinorgantransplantation.Clin-Transplant.1996；10(1Pt2)104-92.LenschowDJ,WalunasTL,BluestoneJA.CD28/B7systemofTcellcostimulation.AnnuRevImmunol.1996；14:233_583.GuerderS,FlavellRA.Costimulationintoleranceandautoimmunity.IntRevImmunol.1995；13(2)135-464.CroftM,DubeyC.AccessorymoleculeandcostimulationrequirementsforCD4Tcellresponse.Crit-Rev-Immunol.1997；17(1):89_118)5.LinH，WeiRQ,GordonD，etal.ReviewofCTLA4Iguseforallograftimmunosuppression.TransplantProc.1994；26(6)3200-16.JuneCH,etal.ImmunolToday1990；11；2117.ShimizuY,vanSeventerGA,HorganKJ,etal.RolesofadhesionmoleculesinT-cellrecognitionfundamentalsimilaritiesbetweenfourintegrinsonrestinghumanTcells(LFA-1,VLA-4,VLA-5,VLA-6)inexpression,binding,andcostimulation.ImmunolRev.1990；11:4109_43·8.GuerderS,FlavellRA.Costimulationintoleranceandautoimmunity.IntRevImmunol.1995；13(2)135-46.9.MondinoA，JenkinsMK.SurfaceproteinsinvolvedinTcellcostimulation.JLeukocBiol.1994；55(6):805_15·10.BrunetJF,DenizotF，LucianiMF，etal.Anewmemberoftheimmunoglobulinsuperfamily—CTLA-4.Nature,1987；328:267_7011.DariavachP，MatteiMG,GolsteinP，etal.HumanIgsuperfamilyCTLA~4genechromosomallocalizationandidentityofproteinsequencebetweenmurineandhumanCTLA-4cytoplasmicdomains.EurJImmunol.1988Dec；18(12)1901-512.ThompsonCB,AllisonJP.TheemergingroleofCTLA4asanimmuneattenuator.Immunity1997；7(4)445-45013.WaterhouseP，etal,CTLA-4,anegativeregulatorofT-Iymphocyteactivationlmmunol)Rew1996；153；183-20714.HarrisNL,RoncheseF，etal.TheroleofB7costimulationinT-cellimmunity.ImmunolCellBiol.1999；77(4):304_1115.VanGoolSW,VandenbergheP，deBoerM，etal.CD80,CD86andCD40provideaccessorysignalsinamultiple-stepT-cellactivationmodel.ImmunolRev.1996；153:47_8316.EllisJHiBurdenMN，VinogradovDV,etal.InteractionsofCD80andCD86withCD28andCTLA4.JImmunol.1996；156(8)2700-9.17.CarrenoBM，BennettF，ChauTA,etal.CTLA-4(CD152)caninhibitTcellactivationbytwodifferentmechanismsdependingonitslevelofcellsurfaceexpression.JImmunol.2000；165(3):1352_618.WalunasTL,LenschowDJ,BakkerCY,etal.CTLA-4canfunctionasanegativeregulatorofTcellactivation.Immunity.1994；1(5)405-1319.LinsleyPS，WallacePM，JohnsonJ，etal.ImmunosuppressioninvivobyasolubleformoftheCTLA4Tcellactivationmolecule·Scicence·1992；257(5701)792-79权利要求CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有激活NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合CD80及CD86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。2.根据权利要求1的应用，其中所述肿瘤是上皮组织肿瘤、间叶组织肿瘤、神经组织肿瘤或其它类型肿瘤。3.根据权利要求2的应用，其中所述肿瘤选自乳头状瘤，腺瘤，囊腺瘤，混合瘤，移行上皮癌，基底细胞癌，脂肪瘤，平滑肌瘤，纤维瘤，横纹肌瘤，血管瘤，淋巴管瘤，骨瘤，软骨瘤，滑膜瘤，星形细胞瘤，多形胶质母细胞瘤，成髓细胞瘤，神经鞘瘤，神经节细胞瘤，脑膜瘤，淋巴瘤，白血病，多发骨髓瘤，绒毛上皮癌，精原细胞瘤，恶性畸胎瘤和黑色素瘤。4.根据权利要求3的应用，其中所述肿瘤是黑色素瘤。5.根据权利要求1-4任一项的应用，其中所述肿瘤是转移瘤。6.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于激活NK细胞的细胞毒性功能的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有激活NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatac^pt和Balatac印t。7.CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备用于提高NK细胞的激活性受体的表达的试剂中的应用，所述CTLA4Ig衍生物具有提高NK细胞的激活性受体的表达的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatac^pt和Balatac印t。8.根据权利要求7的应用，其中所述NK细胞的激活性受体是NKG2D和/或NKp44。9.一种抗肿瘤药物组合物，其包含CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物和药用辅剂，所述CTLA4Ig衍生物具有激活NK细胞的细胞毒性功能的活性，优选所述CTLA4Ig衍生物是保留结合⑶80及⑶86的能力的CTLA4Ig衍生物，更优选所述CTLA4Ig衍生物是保留并增强结合CD80及CD86的能力的Abatacept和Balatacept。10.根据权利要求9的药物组合物，其还含有另外的抗肿瘤活性成分。全文摘要本发明公开了CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物在制备抗肿瘤药物中的新应用。本发明首次发现CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物对NK细胞(自然杀伤细胞)的细胞毒性具有显著的激活作用，并且证实CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物提高NK细胞毒性的分子机制是显著提高了NK细胞膜表面的激活受体如NKG2D，NKp44等的表达。实验证明，通过提高机体NK细胞的细胞毒性，CTLA4Ig或CTLA4Ig衍生物可以用于抗肿瘤治疗。文档编号A61K38/17GK101804192SQ20091000490公开日2010年8月18日申请日期2009年2月16日优先权日2009年2月16日发明者吴军,王晓娟,罗高兴,胡婕,贺伟峰申请人:重庆西南医院