专利名称：中华绒螯蟹Crustin-1基因及体外重组表达的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华绒螯蟹Crustin-l基因序列，具体地说是从中 华绒螯蟹cDNA文库中筛选出中华绒螯蟹Crustin-l相关的EST序列，并拼接成全序列，并 进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和 保鲜剂生产中的应用。
背景技术：
抗菌肽是广泛存在于生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体固有免疫的关键因子。 自Steiner发现天蚕素Cecropin以来，到目前为止，在各种生物中总共发现了 800多种抗菌肽。 根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类(1)不含半胱 氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素等；
(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗 菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如鲎的血蓝蛋白。Crustin作为一种针对革兰 氏阳性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中发现的(Rdfetal., 1999)。随后的研究发现其氨基酸序 列在在其C一末端有12个Cys，其中8个位置保守，可形成WAP结构域。
中华绒螯蟹(&/(^/^>"^>^">^)又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，是 我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000 年全国养殖产量已超过100 000t，年产值达120—150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔 朝霞等，2003)。但随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给养殖产业造 成了巨大损失。养殖河蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从河蟹本身的免疫防御因 子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。Crustin作为一种重要的针对革兰氏阳性菌 的抗菌肽必将在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-l，并对其进行原核重组及重组产物的活 性鉴定，为进一步研究中华绒螯蟹防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅 助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
利用构建cDNA文库，釆用RACE技术以及体外重组表达等技术，对中华绒螯蟹Crustin-l进行了研究，首次从中华绒螯蟹中克隆到Cmstin-l，该基因具有序列表中所示的序列。
本发明从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-l基因cDNA全长821bp，有一个315 bp的开放阅 读框，编码104个氨基酸，5'非编码区长239bp， 3'非编码区长267bp，有多聚腺苷酸加尾信 号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒螯蟹免疫防御方面发挥着重要作用。它具有SEQ ID NO. l所示的序列。利用pET30a(+)表达载体在大肠杆菌origami (DE3)重组表达了该蛋白，表达 产物对藤黄微球菌、四联球菌、枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌具有明显的杀菌活性，最小抑菌 浓度分别为0.12 ^M、 0.46 ^M、 0.23 ^M和0.12 而对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌五.co// 和鳗弧菌P%r/o a"gwz7/aww均未检测到杀伤活性。
其编码的蛋白具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列，分子量为11572.58，等电点为8.43， 其中编码序列的1-21为信号肽序列，成熟肽分子量为9319.71，等电点为8.26。具有典型的 WAP结构域(Lys50-Gln101)。
本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从中华绒螯 蟹中克隆到Crustin-l基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码Crustin-l成熟肽的基 因片段并将其克隆到pET30a(+)表达载体中，在大肠杆菌origami (DE3)实现体外重组表达。 重组产物经HiTmp chelating柱纯化和透析后，对藤黄微球菌(Mfo"ococc^ /Wew;y),、枯草芽孢 杆菌(5ac/〃ws st/Z^/to)、 四联j敖球菌CM;'cracO(Xi^ fc^"gemw)禾口苏云金芽孢杆菌CSac/〃M //^/"g/e肌力都具有较强的杀菌活力，最小抑菌浓度分别为O.llpM、 0.23pM、 0.46pM和 O.llpM;对革兰氏阴性菌没有明显的杀菌活力。本发明可以为进一步研究中华绒螯蟹免疫防 御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂奠定基础，同时 为进一步开发为医药产品奠定基础。
具体实施例方式
下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。 实施例1.
一种克隆得到的中华绒螯蟹Crustin-l ，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。 本发明中的中华绒螯蟹Crustin-l的cDNA序列克隆包括下列步骤
a) 中华绒螯蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；
b) 中华绒螯蟹cDNA文库构建；
c) 中华绒螯蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；
d) 中华绒螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-l基因片段的筛选；
e) EST序列拼接获得Crustin-l的全序列；
f) 中华绒螯蟹Crustin-l的体外重组表达及活性分具体操作如下
1. 中华绒螯蟹总RNA的提取及mRNA的纯化利用Invitrogen.公司的Trizol试剂从感染 了鳗弧菌的中华绒螯蟹血淋巴中提取总RNA,利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯 化试剂盒纯化mRNA。
2. 中华绒螯蟹cDNA文库构建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连 接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于lOObp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector 载体连接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进 行文库包装，利用Exassist Helper Phage禾Q SOLR菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切 割pBluescript成为质粒文库。
3. 中华绒螯蟹cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用 引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi， *.abd 文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据 质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序 屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大于95%) 且长度大于lOObp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手 册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。
4. 中华绒螯蟹EST序列的同源性分析及Cmstin-l基因片段的筛选将获得的全部有效的 EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons,分别将所获的Contigs与Singletons 在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，根据相似性分析结果寻找出与Crustin-1基因 同源的EST序列。
5. 中华絨螯蟹Crustin-1基因cDNA全长序列的克隆根据与Crustin-1基因同源的EST 序列设计特异性引物 Fl (5'GCTGCGAAGATGAACGGG3')和 Rl (5'TGACATCCTCCGCCATAGA3')， 分别利用载体通用引物 T3 (5' AATTAACCCTCACTAAAGGG3')禾卩T7 (5' GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3'禾卩5'末端的 扩增。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(北京博大泰克)进 行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然 后转化大肠杆菌感受态细胞Topl0F'，挑选阳性克隆用载体引物M13-47和RV-M进行测 序，所得结果经CLUSTER分析拼接和得到全长序列。
所筛选的EST序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。3，RACE扩增所用反应体系及反应条件
25^1反应体系，包含
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5(il MgCl2 (2.5mM),
1.0 jil引物Fl (lOpmol/pl),
1.0 pi引物T7(10pmol/nl),
2.0dNTP (2.5 mM)，
0.15 jal Taq DNA polymerase (Promega),
l.O^dcDNA模板，
15,85 pi PCR-grade water。
反应在PTC-100PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟， 然后进入35个循环94。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸卯秒。最后进行72°C 延伸10分钟。
5'RACE扩增所用反应体系及反应条件
25 pi反应体系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5nl MgCl2 (2.5 mM)，
1.0 引物R1 (10 pmol/pl),
1.0 pl引物T3(10pmol尔l),
2.0 pl dNTP (2.5 mM),
0.15 (xl Taq DNA polymerase (Promega)，
1.0pIcDNA模板，
15.85 pl PCR-grade water。
反应在PTC-100PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟， 然后进入35个循环94。C变性30秒，59。C退火30秒，72'C延伸60秒。最后进行72°C 延伸IO分钟。
阳性克隆的PCR筛选条件为
25 ^反应体系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1》1 MgCl2 (2.5mM),
1.0 nl引物M13-47 (10 pmol/pl)，1,0 引物RV-M (10 pmol/nl)，
2.0 pl dNTP (2.5 mM),
0.15 fxl Taq DNA polymerase (Promega),
1.0 ^菌液
15.85 jil PCR-grade water 。
反应在PTC-100 PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟， 然后进入35个循环94。C变性30秒，59'C退火30秒，72t:延伸60秒。最后进行72°C 延伸IO分钟。
实施实例2.
根据SEQ ID NO. 2对应的cDNA序歹ij，设计含有限制性内切酶Nde I和Xho I酶切位点 的特异性引物F2(5'CATATGTGTCGATACTGGTGCAAGA3')禾口 R2 (5'
增编码Crustin-l成熟肽的基因片段，反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller cycler (MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟；然后进行35循环包含94°。变性30 秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒；最后72'C延伸10分钟。然后将其克隆到pET30表达 载体中，转化大肠杆菌origami (DE3)，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基 中，37'C振荡培养至O.D.6(W=0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为lmM诱导4小时后离心收集菌 体。菌体在冰浴条件下用超声波200W处理30-60分钟(每次3秒，间隔3秒)。离心收集上 清，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱纯化重组产物。纯化后的产物利用梯度稀释法 进行抑菌活性测定。以藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆 菌和鳗弧菌作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性。接种5nl对数生长期受试菌(浓度为 104-105cfu/ml)，在28'C培养24小时后，600nm测定细菌浓度。发现革兰氏阴性菌在所有 Crustin-l试验浓度下都能正常生长，而革兰氏阳性菌只在含低浓度Crustin-l或者不含 Crustin-l的LB培养基中生长。
实施实例3:重组蛋白可为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育和词料添加剂研制奠 定基础。中华绒螯蟹Crustin-l基因及其体外重组表达.txt SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
〈120〉 中华绒螯蟹Crustin-l基因及体外重组表达
<130〉
<140> 1
<141> 2009-02-24
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 821
<212〉 DNA
〈213〉 中华续螯蟹(Eriocheir sinensis)
〈220〉 <221> CDS 〈222〉 (240).. (554)
<400〉 1 ccccgggctg caggattcga attcctgctt tccacgacgacttttctgct tactcttctt60
cccttgagcg actgaccttt ggagcagcgc犯ggaaaggtccaacaaaac atttcatgea120
cggtggg卿犯cccggccg cgag犯t3ta aggctg財gcaggaagagga actggccaag180
tcttcttgca gcaagagatc gaccactgaa cacacctttcaacttactca ttttcaaag239
atg atg agg cca ctg ctg ctg ctg etc etc gtg Met Met Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10gtg acg etc t3t ggc Val Thr Leu Tyr Gly 化287
gga gga tgt cac gcg acc tgt cga tac tgg tgc Gly Gly Cys His Ala Thr Cys Arg Tyr Trp Cysaag aca cct gaa aac Lys Thr Pro Glu Asn335
20 25 30
cag acg tac tgc tgc gaa gat gaa egg gaa ate cca agt aaa gtg ggt 383 Gin Thr Tyr Cys Cys Glu Asp Glu Arg Glu lie Pro Ser Lys Val Gly 3^ 40 45
ctg aag ccc gga aag tgc cct ccc gtg cgc cct gtg tgt cct cct act 431 Leu Lys Pro Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Pro Val Cys Pro Pro Thr 5b 55 60
agg ggc ttc ttc gaa cca ccc aaa aca tgc tec aac gac ggg tec tgc 479 Arg Gly Phe Phe Glu Pro Pro Lvs Thr Cys Ser Asn Asp Gly Ser Cys 65 70 75 80
tac ggc gcc gac aag tgc tgc ttt gac agg tgt etc ggt gaa cat gtc 527 Tyr Gly Ala Asp Us Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly Glu His Val 8^ 90 95
tgc aag cca ate cag acc aga ggt tga cagtcccatt tttatggctt 574 Cys Lys Pro lie Gin Thr Arg Gly 100
at幼tgtatt"tetceLagtaaataattttcacgaatttccta634
gtattatagaattatatcatacattataaattatgaatatgttgtgtata tcttaagaaa694
cc卿ggccgca3g犯ttttttccggag犯taactacactg犯gatgg犯acsttagcta754
ctctaaactgtagacaataaactgecaaaatt3ttc犯taaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa814 821
<210> 2 <211> 104<212〉 PRT
<213〉 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 〈400> 2
Met Met Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Thr 1 5 10
Leu
Tyr Gly 15
Gly Gly Cys His Ala Thr Cys Arg Tyr Trp Cys Lys Thr Pro Glu Asn
20 25
30
Gin Thr Tyr Cys Cys Glu Asp Glu Arg Glu lie Pro Ser Us Val Gly 3^ 40 45
Leu Lys Pro Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Pro Val Cys Pro Pro Thr 50 55 60
Arg Gly Phe Phe Glu Pro Pro Lys Thr Cys Ser Asn Asp Gly Ser Cys 65 70 75 80
Tyr Gly Ala Asp Lys Cys Cys Phe Asp Arg Cys Leu Gly Glu His Val
85 90
95
Cys Lys Pro lie Gin Thr Arg Gly 100
权利要求
1.一种中华绒螯蟹Crustin-1基因，其特征在于具有序列表SEDIQ No.1中的碱基序列。
2. —种要求1所述的中华绒螯蟹Crustin-l基因编码蛋白，其特征在于具有序列表SEDIQ No.2中氨基酸序列。
3. —种权利要求2所述中华绒螯蟹Crustin-1的应用，其特征在于中华绒螯蟹Cmstin-l基 因的重组表达产物可作为抗菌剂，应用丁人类相关疾病的治疗，还可用于药物生产、词料添 加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中。
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，是中华绒螯蟹Crustin-1的基因克隆及其重组表达技术。本发明利用表达序列标签(EST)技术、3’和5’末端快速扩增技术(RACE)从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-1基因cDNA全长821bp，有一个315bp的开放阅读框，编码104个氨基酸，5’非编码区长239bp，3’非编码区长267bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒螯蟹免疫防御方面发挥着重要作用。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹Crustin-1蛋白，该重组蛋白对革兰氏阳性菌具有较强的抑菌活性，对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌和苏云金芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.12μm、0.23μm、0.46μm、0.12μm；而对革兰氏阴性菌没有明显的抑制作用。本发明可为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂研制奠定基础。
文档编号A61P31/00GK101525617SQ20091001456
公开日2009年9月9日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者宋林生, 母昌考, 王玲玲, 盖云超, 赵建民, 邱丽梅, 郑沛林 申请人:中国科学院海洋研究所