专利名称：：蛹虫草总生物碱的提取方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药活性成分分离提取及中药药理
技术领域：
。涉及一种蛹虫草总生物碱的提取方法及该总生物碱的用途，
背景技术：
：冬虫夏草为虫草菌的子座与其寄主蝙蝠蛾幼虫尸体的复合物，俗称虫草。据中医药书籍和文献记载，冬虫夏草具有强肾、润肺、益精气、理诸虚百损的功效。由于特殊而严格的寄生条件和生长环境，冬虫夏草的天然资源十分有限，加之近年来采挖过度以及需求的不断增长，使得冬虫夏草资源短缺，价格昂贵，因此用人工培养和工业化产品替代天然冬虫夏草成为必然的趋势。蛹虫草(Cbroyc印s肌7"ahs)别名北虫草，与冬虫夏草同属于子囊菌亚门麦角菌科虫草属。蛹虫草的食用和药用价值与天然冬虫夏草相近，历来被中医认为是天然冬虫夏草理想的替代品。近年来，已经筛选出能够进行人工发酵生产蛹虫草的菌种，并已经大规模生产。目前人们所使用的蛹虫草仍为初始的原始产品，缺少对此进行深加工的先进技术和新产品，从而致使未能合理利用蛹虫草资源和充分发挥蛹虫草的食用和药用功效。因此，研发一种能从蛹虫草中进一步分离出其有效组分的方法，阐明其用途，进一步合理使用蛹虫草资源，充分发挥其食用和药用功效，已成为相关领域的技术人员一直以来关注的重要科研课题。另外，近年来，全球酒精消费量快速上升，伴随而来酒精性肝损伤。长期大量饮酒或含乙醇的饮料会造成的肝脏疾患，包括轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化。随着我国经济的快速发展，国人酒精消费量也快速上升，并导致酒精性肝损伤的发病率呈快速上升趋势。但在日常生活中，禁止饮酒是不现实的，因此探索和研制一种减轻酒精对肝脏损伤的方法是解决问题的有效途径之一。大量研究表明，乙醇对肝细胞的损伤是通过自由基介导的脂质过氧化作用实现的。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基，自由基可抑制还原性谷光甘肽(GSH)的合成，减弱谷胱甘肽过氧化酶(GSH-px)的抗氧化能力，引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常，肝细胞代谢紊乱，肝功能异常，肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性，最终导致细胞肿胀死亡。因此，清除自由基、抑制脂质过氧化反应，能够保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的完整性。本发明通过大量试验证明，从蛹虫草中提取的总生物碱具有清除自由基、抑制脂质过氧化反应，能够保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的功效。这种能减轻酒精致肝脏损伤的物质，可作为主要成分用于解酒类保健品的开发源料。
发明内容本发明的目的是为了克服现有技术的不足，满足现有技术的需要，而提供一种蛹虫草总生物碱的提取方法，同时提供一种总生物碱的新用途。为了达到上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是一种蛹虫草总生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将蛹虫草子实体经干燥至含水率为5%以下，粉碎，过80目筛；(2)将经粉碎过的蛹虫草粉末浸泡于55%95%的乙醇溶液中，蛹虫草重量与溶液体积比为1:25，在2060。C条件下，用20kHZ超声波辅助提取4080min，离心取上清液，重复3次，合并三次上清，减压浓縮得浸膏；(3)用pH2-4的HC1溶液溶解浸膏，取上清液，先后分别按上清液与乙醚体积比为100:30加入乙醚，按上清液与氯仿体积比为100:30加入氯仿，进行充分振荡、洗涤，分层后去除脂溶性物质；(4)用10。認aOH调节步骤(3)所得水相溶液至pH8-12.0，加入30%体积的氯仿萃取，取氯仿层，共3次，合并、浓縮干燥，得总生物碱。为了达到上述目的，本发明解决其技术问题的另一个技术方案是一种蛹虫草总生物碱的用途，其特征在于，用作对乙醇所致肝细胞损伤的保护，应用于解酒类保健品的开发源料。本发明的一种蛹虫草总生物碱的提取方法，工艺成本低、提取率高、简便易行。另外，本发明的从蛹虫草中提取的总生物碱具有清除自由基、抑制脂质过氧化反应，能够保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的功效和疗效好、毒副作用小的特点。这种能减轻酒精致肝脏损伤的物质，可作为主要成分用于解酒类保健品的开发源料，在逆转乙醇致肝细胞损伤的药物中的新用途前景广阔。图1为蛹虫草总生物碱提取工艺流程图。具体实施例方式一、蛹虫草总生物碱的提取方法的实施例实施例1(1)蛹虫草子实体经干燥至含水率为5%以下，粉碎，过80目筛；(2)将粉碎的蛹虫草，按表l参数进行20kHZ超声波辅助萃取，重复提取3次；离心取上清，合并三次上清；减压蒸馏回收溶剂，得浸膏；(3)按表1加的HC1溶液溶解浸膏，取上清液，定容至100ml;先后在滤液中加入30ml乙醚、30ml氯仿进行充分地振荡、洗涤，分层后去除有机相(含有非生物碱的有机杂质)；(4)用10%NaOH调节步骤(3)所得水相溶液至表1所示pH，用30ml氯仿萃取3次，合并、浓縮干燥，得总生物碱，提取得率见表l。表1蛹虫草生物提取条件与提取得率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>二、蛹虫草总生物碱的新用途的实施例实施例1蛹虫生物碱对乙醇损伤原代肝细胞的保护作用(l)大鼠肝细胞分离培养用1%戊巴比妥钠0.lmgg—i体重、肝素0.2Ug—'体重分别腹腔注射达麻醉大鼠和血液抗凝目的。消毒皮肤，取腹部正中切口进入腹腔。显露门静脉后，在距肝门2cm处插入18号钝头针头，针头与导管相接，连接恒流泵。夹闭肝上下腔静脉，在肝下下腔静脉插入16号导管放出积血积液，先以30mlmin—1的速度输注无钙镁的Hanks液(含EDTAl腿olL_1)500ml，再输注0.25%胰蛋白酶液100ml，流速10mlmin—'。取下肝脏置于含4。CHanks液的平皿中，去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织，多层纱布过滤，过200目铜网，制成细胞悬液。4°C700r'mirf'速度低速离心2min，吸弃上清再加入少许D-Hanks洗涤，反复3遍(后2次离心速度分别为600rmin—、500rmin—》，去除胰蛋白酶及非肝细胞。用0.4%台盼蓝进行染色，细胞计数板计数细胞浓度，判断细胞活率。将分离、纯化的肝细胞用合成培养基(含DMEM90ral，新生小牛血清10ml，地塞米松l(TmolL-、青霉素lOO^gL-1，链霉素100PgL—')稀释成1X106个-ml—'的细胞悬液，于24孔培养板中加入lml'肝细胞悬液，96孔培养板中加入0.1ml*L—'肝细胞悬液。置37'C、5%0)2培养箱中培养，1216h后可见肝细胞贴壁于培养板底生长。(2)乙醇对原代肝细胞的损伤作用不同浓度乙醇(O，25，50，100，200，400醒o1L—》与原代肝细胞作用12h。结果见表2，随乙醇浓度的增大，肝细胞的脂质过氧化代谢产物丙二酸(MDA)含量增加和GSH-px活力下降，当乙醇浓度为lOOmmolL—'时GSH-px活力快速下降，在400mmo1I/1时急剧下降，可能是细胞损伤过度。表2乙醇致大鼠肝细胞的损伤作用组别MDA(nmo1/106)GSH-px(活力)正常组1,2692.5乙醇(25mmol/L)1.4982.5乙醇(50mmol/L)1.7473.75乙醇(100mmol/L)1.9567.5乙醇(200mmol/L)1.9833.75乙醇(400mmol/L)1.951.25(3)蛹虫生物碱对乙醇致肝细胞损伤的影响肝细胞预培养12h后吸弃上清，更换培养液，并加入蛹虫草生物碱，终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8mgm1—1,培养6h后加入乙醇至终浓度为100mmolL—、继续培养12h。测定24孔培养板上清液中MDA含量及GSH-PX的活性。弃96孔培养板的培养液上清，在避光的条件下每孔加5mg'mr的MTTIOW，继续培养4小时，每孔加二甲亚砜IOOW，充分摇匀，10min后，用酶标仪在570nm测定吸光度值，结果见表3。由表3可见加入蛹是草总生物碱后，MDA下降，GSH-PX和细胞活性上升。表明蛹虫草生物碱对乙醇所致大鼠肝损伤有保护作用。6表3蛹虫生物碱对乙醇致肝细胞损伤的影响组别MDA(nmo1/106)GSH-px(活力单位)细胞活性(MTT法)(u)正常对照组2.96302.540.272乙醇(100mmol/L)20.3076.060.185乙醇(100imnol/L)+生物碱(0.lmg/ml)13.22253.520.396乙醇(100mmol/L)+生物碱(0.2mg/ml)12.41270.560.494乙醇(100mmol/L)+生物碱(0.4mg/ml)12.40280.560.577乙醇(100mmol/L)+生物碱(0.8mg/ml)12.36282.250.590实施例2含蛹虫草生物碱血清对乙醇致肝细胞损伤的保护作用中药血清药理学作为一种实验技术和研究方法，在中药药理学的研究中具有独特的优点可以排除中药复方粗制剂本身理化性质的干扰；避免直接体外实验可能得出的错误结论；可以真实的反映体内血药浓度及其变化；实验结果与在体实验有较好的一致性。给大鼠灌胃蛹虫草总生物碱lmg'kg—'，每天一次，共3天，未次灌胃2小时后，腹腔注射PMW/V)的戊巴比妥钠20ml，kg—1，腹正中切口，下腔静脉采血，置无菌试管内。37。C水浴lh，3000r'min—'离心15min，分离得到含蛹虫草生物碱的血清，-20'C保存备用。肝细胞预培养12h后吸弃上清，更换培养液，并加入含药大鼠血清，终体积分数依次为4.9%、7.0%、10.0%，培养6h后加入乙醇至终浓度为100mmo1L—、12h后，测定上清液中MDA及GSH-PX的含量，MTT法测定肝细胞活性，结果见表4。表4含蛹虫生物碱血清对乙醇致肝细胞损伤的影响组别MDA(nmo1/106)GSH-px(活力单位)细胞活性(MTT法)(u)正常组2.96302.530.272乙醇(100咖o1L—》20.3076.050.185乙醇(100mmo1L。+含药血清(4.9%)14.81233.230.218乙醇(100ramo1L—0+含药血清(7呢)13.41246.760.231乙醇(100mmo1L—')+含药血清(10%)12.21253.520.248由表4可见，乙醇对大鼠肝细胞产生损伤作用，表现为MDA上升，GSH-PX下降，细胞活性下降。而加入蛹是草总生物碱后，MDA下降，GSH-PX和细胞活性上升。表明含蛹虫草生物碱的大鼠血清对乙醇所致大鼠肝损伤有保护作用。权利要求1、一种蛹虫草总生物碱的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将蛹虫草子实体经干燥至含水率为5％以下，粉碎，过80目筛；(2)将经粉碎过的蛹虫草粉末浸泡于55％～95％的乙醇溶液中，蛹虫草重量与溶液体积比为1∶25，在20～60℃条件下，用20kHZ超声波辅助提取40～80min，离心取上清液，重复3次，合并三次上清，减压浓缩得浸膏；(3)用pH2-4的HCl溶液溶解浸膏，取上清液，先后分别按上清液与乙醚体积比为100∶30加入乙醚，按上清液与氯仿体积比为100∶30加入氯仿，进行充分振荡、洗涤，分层后去除脂溶性物质；(4)用10％NaOH调节步骤(3)所得水相溶液至pH8-12.0，加入30％体积的氯仿萃取，取氯仿层，共3次，合并、浓缩干燥，得总生物碱。2、用权利要求1所述的提取方法提取的蛹虫草总生物碱的用途，其特征在于，用作对乙醇所致肝细胞损伤的保护，应用于解酒类保健品的开发源料。全文摘要本发明公开了一种蛹虫草总生物碱的提取方法及用途。该提取方法包括蛹虫草乙醇溶液温浸，并采用超声波辅助提取总生物碱，所得提取液进行减压浓缩得浸膏，HCl溶液溶解浸膏，分别加入乙醚、氯仿去除脂溶性物质，NaOH调节溶液pH，加入氯仿萃取，浓缩氯仿层，干燥得总生物碱。本发明工艺成本低、得率高、简便易行。本发明的蛹虫草总生物碱在逆转乙醇致肝细胞损伤的药物中具有广泛的新用途。文档编号A61K36/06GK101584717SQ20091003209公开日2009年11月25日申请日期2009年6月30日优先权日2009年6月30日发明者张九成,徐大宝,朱冬吉,边旭云,星陈,辉颜申请人:江苏科技大学