专利名称：隐丹参酮在肿瘤治疗中作为放射治疗增敏药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药药理实验研究技术领域，涉及隐丹参酮在肿瘤治疗中作为放射治疗增敏药物的应用。更具体的说是隐丹参酮在宫颈癌、肝癌、乳腺癌、肺癌治疗中作为放射 治疗增敏药物的应用。
背景技术：
近年来，随着放射肿瘤学的不断发展，放疗在肿瘤治疗中的地位愈显重要，放疗已 成为当今治疗恶性肿瘤最常用的方法之一中国肿瘤患者中约有70%接受放疗。但传统放 疗对一些肿瘤，尤其是一些中晚期肿瘤的疗效并不理想。这是因为实体瘤生长在一个独特 的微环境中，同时由于增殖过快，从而导致肿瘤细胞内部的氧气及养分供应不足，产生乏氧 细胞。这些乏氧细胞不仅限制了放、化疗的疗效，也成为肿瘤复发、放射抗拒、化学耐药等问 题的根源。而放射增敏剂则是能够增强实体肿瘤中乏氧细胞敏感性的一类物质，它可增强 射线对肿瘤的杀伤能力，对于临床提高放射治疗的效果有重要意义。可以说肿瘤放疗的一 个关键问题是如何提高瘤体内乏氧细胞的放射敏感性。多年来，各国学者一直致力于寻找高效低毒的放射增敏剂，具有放射增敏作用的 化合物类型较多。在已研究的各种不同类型的放射增敏剂中，以亲电子化合物硝基咪唑类 化合物为主。大量实验证明硝基咪唑类化合物有放射增敏作用，其强电子亲和力使之能从 放射作用的靶分子上夺去电离产生的电子，减少了靶分子复原的几率，并形成DNA自由基， 造成稳定损伤。增敏剂还可以进一步与产生的DNA自由基结合，形成稳定的加成物，导致 细胞死亡，但同时对正常组织的影响也较大，主要表现为神经毒性。代表药物是米索硝唑 (MISO)，但由于其周围神经毒性限制了使用剂量，致使肿瘤中的药物浓度达不到增敏的有 效浓度而限制了增敏活性。由于肿瘤的微环境极其复杂，经数十年的研究，尽管已合成了大量不同类型的化 合物，但迄今国际上尚未找到公认的低毒有效的放射增敏剂，寻找高效低毒的乏氧细胞放 射增敏剂仍是继续努力的目标。从中草药中寻找理想的放射增敏剂，是一个有前途的方向。现代医学研究表明，活 血化瘀类方药可改善肿瘤细胞的微循环，提高肿瘤的氧供应，减少乏氧肿瘤细胞，使细胞存 活曲线的肩区变窄，有较好的乏氧增敏作用。丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根，性味 味苦、微寒。归经心、心包络、肝。功效活血祛瘀、除烦热、扩张血管。主治痛经、产后恶 露、心绞痛、肠鸣腹痛、恶疮肿毒。现代医学认为丹参具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、 防止心肌缺血和心肌梗死等心血管作用。隐丹参酮是丹参中脂溶性菲醌类成分，体外试验证明，其对金葡菌及其耐药菌株、 链球菌、分枝杆菌等病源菌有较强的抑杀作用。迄今为止，未见隐丹参酮作为肿瘤放射治疗 增敏剂的应用。
发明内容
本发明的一个目的在于公开了隐丹参酮在制备治疗肿瘤的药物中作为放射治疗 增敏药物的应用。本发明另一个目的在于公开了隐丹参酮在制备治疗宫颈癌的药物中作为放射治 疗增敏药物的应用。本发明还一个目的在于公开了隐丹参酮在制备治疗肝癌药物中作为放射治疗增 敏药物的应用。本发明还一个目的在于公开了隐丹参酮在制备治疗乳腺癌的药物中作为放射治 疗增敏药物的应用。本发明还一个目的在于公开了隐丹参酮在制备治疗肺癌的药物中作为放射治疗 增敏药物的应用。本发明进一步提供了含有作为放射增敏剂的隐丹参酮的药物组合物，它包含隐丹 参酮以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。含有本发明所述作为活性成分的隐丹参酮药物组合物可以按照常规药物配制技 术，通过将隐 丹参酮成分与可药用载体组合来制备。载体可以采用各种各样的形式，这取决 于希望的给药途径(例如口服、肠胃外给药)。因此对于口服液体制剂，合适的载体和添加 剂包括水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等等；对于口服固体制剂如散 齐U、胶囊剂或片剂，合适的载体和添加剂包括乳糖、淀粉、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等稀释剂、 润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。口服固体制剂也可以用如丙烯酸树脂等物质包衣或包肠溶衣 以便调整吸收的主要部位。对于肠胃外投药，如局部给药、透皮给药和粘膜给药等制剂，载 体通常包括高分子材料如卡波姆、吸收促进剂氮酮等等。注射液也可利用水载体与适当添 加剂如支架剂甘露醇、甘氨酸、增溶剂丙二醇、抗氧剂焦亚硫酸钠等等制备。因为易于给药， 片剂和胶囊剂代表最方便的口服单元剂量形式。本发明的药物组合物每剂量单位例如片、胶囊、注射剂等等应包含必需释放如上 所述的有效剂量的丹参提取物隐丹参酮。例如普通压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨 醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶、以及其他药用稀释剂。例如与水混合，以形成 包含本发明隐丹参酮的固体处方设计组合物。对于液体形式包括水溶液、适当的增香的糖 浆齐U、水或含有食用油，例如棉花子油、芝麻油的增香的乳剂、以及酏剂和相似的药用载体。为解决上述问题，本发明提供如下的技术方案本发明通过体内外实验，证实了隐丹参酮具有放射治疗增敏作用。体外采用克隆 形成实验，对隐丹参酮对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用进行观察，结果表明，隐丹参酮 对宫颈癌Hela细胞增敏比为1.4。整体动物体内实验，采用高、中、低三个剂量对荷EMT6乳 腺癌、Lewis肺癌、H22肝癌小鼠的放射增敏作用进行观察，采用肿瘤生长延迟法观察增敏 作用，结果表明，隐丹参酮对H22肝癌小鼠增敏系数高达1. 91 ；对EMT6乳腺癌小鼠增敏系 数高达1. 78 ；对Lewis肺癌小鼠增敏系数高达1. 58 ；与对照组相比，有统计学意义。结论 隐丹参酮对宫颈癌Hela细胞和荷乳腺癌、肺癌和肝癌小鼠均有较好的放射增敏作用。
图1为多靶单击模型拟合的细胞存活曲线。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供下述实施例。这些实施例仅仅是解释、而不 是限制本发明的范围。本发明人先后完成了隐丹参酮作为放射增敏剂在治疗宫颈癌、肝癌、 乳腺癌、肺癌等方面的药理实验，下面是隐丹参酮的药理实验研究及结果。其中的隐丹参酮 由中国药品与生物制品检定所提供。实施例1 隐丹参酮对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用材料和方法 1.试剂与药品DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle Medium)购自 Gibco 公司；MTT (四氮唑噻 唑兰，四甲基偶氮唑盐)购自上海生物工程有限公司；牛血清购自中国协和医科大学血研 所；隐丹参酮由中国药品与生物制品检定所提供，溶解于适量的二甲亚砜(DMS0)，终浓度 为0. 1%，过滤除菌，4°C冰箱密封避光保存。2.仪器与器材CO2培养箱美国Thermo Electron Corporation ；超净工作台苏州精华设备公 司；倒置相差显微镜日本Olympus公司；BIO-RAD MODE 1680型酶标仪；细胞培养板日本 IffAKI。3.细胞株与细胞培养人宫颈癌细胞株Hela购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。Hela细胞 接种于DMEM培养液(含10%新生牛血清及青霉素、链霉素各100U/ml)，置于37°C，5% CO2 饱和湿度的孵箱中培养，Hela细胞为梭形，呈贴壁生长，孵育2-3d后用0. 25%胰蛋白酶消 化传代，选对数生长期细胞进行实验。4. MTT法检测隐丹参酮对Hela细胞增殖的抑制作用取对数生长期的Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液后，细胞计 数，将细胞浓度调整为2X104/ml，接种于96孔培养板中，空白对照组给予等体积的PBS ；给 药组分别加入不同浓度的隐丹参酮。给药组的浓度依次为0. 5、1、2、4、8、10、16μ g/ml，每 个浓度设6个复孔。分别培养24h、48h、72h后，加入5mg/ml的MTI液(20 μ 1/孔)，继续 在5% CO2培养箱孵育4h，吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 μ 1/孔，微型震荡器震荡 IOmin,使完全混勻溶解结晶，在酶标仪上于波长492nm处测其吸光度，每个剂量设平行重 复6孔，实验重复3次。按以下公式计算抑制率，拟合后求IC50值及IC20值。细胞抑制率(％ ) = (1 —试验组OD平均值/对照组OD平均值)X 100%。5.克隆形成实验药物作用后，细胞生长抑制率在20%以内时，药物对细胞的毒性作用可相对忽略， 故选择隐丹参酮作用24h时，抑制细胞增殖20%的浓度(IC20)进行试验。设加药照射组和 单纯照射组，照射剂量分别为0，1，2，3，4，6，8Gy。根据不同的照射剂量调整接种的细胞数， 接种于6孔细胞培养板中(2ml/孔)，37°C、5% CO2饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后，力口 药(隐丹参酮4. 0 μ g/ml)。照射4h后更换无药培养基，置培养箱中继续培养8-10d，甲醇 固定后Giemsa染色，计数各组细胞数> 50个细胞的克隆数。计算集落形成率(PE)和细胞存活分数(surviving fraction，SF)。每个剂量点设3个平行样本，取均数。集落形成率(PE)=集落数/接种细胞数X 100% ；细胞生存分数(SF)=各照射剂量PE/未照射PEX 100%。应用多靶单击模型SF = 1- (1-e-D/DO) N拟合细胞存活曲线，计算各组放射敏感性 参数终斜率DO值、准阈剂量Dq值、外推值N和放射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER)。放射增敏比(SER)=单纯照射的SF2值/照射加药的SF2值。6.统计学处理采用SPSS13. 0软件进行统计分析。MTT法中每份标本平行测定6孔，重复试验3 次。以(S± s )表示，组间比较采用One-way ANOVA检验。实验结果1.隐丹参酮对Hela细胞增殖的抑制作用MTT法检测，不同浓度的隐丹参酮(0. 5、1、2、4、8、10、16μ g/ml)分别给药24h、48h 和72h后，对Hela细胞的生长呈明显抑制作用。药物作用24h、48h和72h的IC50值分别为 17. 8μ g/ml、8. 17μ g/ml、6. 55μ g/ml，IC20 值分别为:4· 0μ g/ml、l. 17μ g/ml、0. 96 μ g/ ml。结果表明细胞抑制率与药物浓度及作用时间相关，多因素方差分析结果表明不同药物 浓度处理组间细胞抑制率有显著统计学差异(P < 0. 01)，不同作用时间处理组间也有显著 统计学差异(P < 0. 05)。(见表1)表1 不同浓度的隐丹参酮对Hela细胞的生长抑制作用(η = 6) 注与对照组相比*P < 0· 05，**P < 0.012.隐丹参酮对Hela细胞的放射增敏作用克隆形成分析应用于隐丹参酮对宫颈癌细胞系Hela放射增敏作用的研究，设单 纯照射组和给药照射组，给药组为隐丹参酮4. 0 μ g/ml (抑制细胞增殖20%的药物浓度 IC20)。给药后孵育Hela细胞24h后进行不同剂量射线照射，计数8_12d后克隆形成率，计 算各组细胞存活分数，绘制细胞存活曲线(见图1)。SigmaplotlO. 0软件计算出其DO值、Dq值、N值(见表2)。放射增敏比=SF2 (对照组)/SF2 (照射加药组)=0. 49/0. 35 = 1. 4。 与单纯照射组相比，隐丹参酮(IC20)的放射增敏比为1. 4，说明隐丹参酮增加了 Hela细胞 的放射敏感性。表2各组放射生物学参数 3.结论隐丹参酮对宫颈癌细胞系Hela有较好的细胞毒性和放射增敏作用。实施例2隐丹参酮对荷Η22肝癌小鼠的放射增敏作用1材料与方法1. 1 材料(1)动物和瘤株健康昆明种小鼠48只，雌雄各半，体重18 22g，由中国医学科 学院放射医学研究所实验动物中心提供。小鼠H22肝癌细胞由放射医学研究所实验动物中 心提供。(2)药物隐丹参酮由中国药品与生物制品检定所提供，吐温-80(25% )溶解，超 声30min ；甘氨双唑钠为山东绿叶制药有限公司生产(批号200811162)，用生理盐水配成 l.Ommol/kg，现用现配。1. 2实验方法1. 2. 1肿瘤接种无菌条件下抽取6-8d传代接种的H22肝癌小鼠腹水，用生理盐 水稀释细胞悬液。用细胞计数板计数肿瘤细胞，将细胞浓度调整为1.0X107/ml，每只小鼠 右下脚掌皮下接种0. 2ml。1.2.2动物分组及给药方法动物接种后一周，按照肿瘤生长的大小均勻分组。分成5个组空白对照组、单 纯照射组、阳性对照组(甘氨双唑钠)、隐丹参酮高浓度组(20mg/kg)、隐丹参酮中浓度组 (10mg/kg)、隐丹参酮低浓度组(5mg/kg)，每组8只，雌雄各半且分笼饲养。空白组腹腔 注射生理盐水0. 3ml/只；阳性对照组腹腔注射1. Ommol/kg甘氨双唑钠生理盐水溶液 0. 3ml/只；隐丹参酮给药组用25%的吐温-80和生理盐水溶解，超声30min，配制高剂量 组(20mg/kg)，后依次稀释到中剂量(10mg/kg)和低剂量(5mg/kg)。阳性对照组和给药组 (高、中、低)，分别在照射前30min腹腔注射(0. 3ml/只)。照射后隔一天测量肿瘤爪的长、 宽、高，计算肿瘤的相对体积。1.3试剂及仪器吐温-80 购自北京鼎国生物技术有限责任公司(Genview分装)；照射设备加拿 大Gamma II 40由放射医学研究所提供，以137Cs为照射源，照射剂量率0. 78Gy/min ；游标 卡尺上海量器具厂。1. 4照射方法
每次4只小鼠，清醒状态下照射。照射时将小鼠固定，将接种肿瘤的后爪暴露于照 射野中，非照射部位用铅板遮蔽。照射剂量为5Gy。1. 5观察指标照射后荷瘤鼠一般情况，如进食、活动；每隔一天测量肿瘤爪的长、宽、高，计算肿 瘤体积；照射后22天处死小鼠，剥取肿瘤并称重。计算抑瘤率、肿瘤生长延缓时间、增敏系 数(EF)。肿瘤生长延迟时间(TCD):肿瘤体积生长至放射治疗前3倍所需时间为肿瘤3倍 倍增时间(TGT3)，对照组(或实验组)不同剂量亚组的TGT3与空白对照组的TGT3之差为 TCD。增敏系数(EF)=给药照射组TCD/单纯照射组TCD，EF > 1提示有放射增敏效应。1. 6统计学处理采用SPSS13. 0软件进行统计分析。各组数值以S)表示，组间比较采用One-way AN0VA检验。2 结果2. 1不同剂量的隐丹参酮对荷H22肝癌小鼠的放射增敏作用肿瘤体积3倍增时间和肿瘤生长延迟时间见表3。表3荷H22肝癌小鼠肿瘤生长的延迟时间(s± n = 8) 结果表明隐丹参酮对荷H22肝癌小鼠有较好的放射增敏作用。实施例3隐丹参酮对荷EMT6乳腺癌小鼠的放射增敏作用实验方法同实施例2，实验结果见表4 表4荷EMT6乳腺癌小鼠肿瘤生长的延迟时间(S±s , n = 8) 结果表明隐丹参酮对荷ΕΜΤ6乳腺癌小鼠有较好的放射增敏作用。实施例4隐丹参酮对荷Lewis肺癌小鼠的放射增敏作用实验方法同实施例2，实验结果见表5 表5荷Lewis肺癌小鼠肿瘤生长的延迟时间(5f±s, η = 8) 结果表明隐丹参酮对荷Lewis肺癌小鼠有较好的放射增敏作用。实施例5 (1000 片)隐丹参酮100g，加乳糖397g，预凝胶化淀粉93g，羟丙基纤维素15g，交联羧甲基纤 维素钠29. 8g，硬脂酸镁7. 5g，混合均勻，纯水制粒，干燥压片，包薄膜衣。实施例6 隐丹参酮100g，加糊精100g，乳糖270g，用70%乙醇制粒，干燥，装胶囊，制得1000
粒胶囊剂。实施例7 (1000 粒)隐丹参酮40g，加入IOOg熔融的聚乙二醇4000中，搅拌使全部溶解并混合均勻，保 持60°C恒温条件下，滴入液体石蜡(5 10°C)中，冷凝成滴丸，吸尽液体石蜡，选粒，即得。实施例8
隐丹参酮80g，加入2M NaOH调节pH8. 0，加注射用水至2000ml ,0. 22um微孔滤膜 微滤，分装(每瓶5ml)，灭菌即得隐丹参酮注射液。实施例9隐丹参酮40g，加入2M NaOH调节pH8.0，加甘氨酸200g，加注射用水至1000ml， 0. 22um微孔滤膜微滤，无菌条件下分装(每瓶2ml)，冷冻干燥，压盖，即得含隐丹参酮的冻 干粉针。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述 申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明 书中所举实例实施方式的限制。
权利要求
隐丹参酮在制备治疗肿瘤药物中作为放射治疗增敏剂方面的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于隐丹参酮在制备治疗宫颈癌药物中作为放射 治疗增敏剂的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于隐丹参酮在制备治疗肝癌药物中作为放射治 疗增敏剂的应用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于隐丹参酮在制备治疗乳腺癌药物中作为放射 治疗增敏剂的应用。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于隐丹参酮在制备治疗肺癌药物中作为放射治 疗增敏剂的应用。
6.权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于将隐丹参酮与一种或多种药学上可接 受的载体、赋形剂或稀释剂混合后制成片、胶囊或注射剂。
全文摘要
本发明公开了隐丹参酮在肿瘤治疗中作为放射治疗增敏剂的应用。本发明的隐丹参酮具有提高肿瘤细胞对射线的敏感性，增强射线对肿瘤的抑制作用。隐丹参酮为常用中药丹参中提取的单体化合物，具有毒性低、提取工艺简单等优点；其原材料资源广阔，与常规药用辅料混合，可制成各种剂型。具有很好的应用与开发前景，是一种比较理想的新型肿瘤放射治疗增敏药。
文档编号A61K31/58GK101862339SQ20091006849
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月17日 优先权日2009年4月17日
发明者叶因涛, 徐文清, 杨福军, 沈秀 申请人:中国医学科学院放射医学研究所