专利名称：一种免疫增强剂与重组猪α-干扰素的组合用药物的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种重组猪a-干扰素和对重组猪a-干扰素有 增效作用的组合用药物。
背景技术：
猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)是两种严重威胁养猪业的病毒性传 染病，其病原猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)同属于冠状病毒，形 态相似，繁殖的靶器官相同。这两种病暴发流行常常造成初生仔猪的大批死亡。现有的普 遍的解决方法就是打疫苗，然而由于种种原因，有时难免会造成免疫失败，爆发疾病，给诊 断和治疗带来一定困难。在免疫失败后往往依赖抗生素治疗，造成了耐药菌株的增加和交 叉感染的产生。因此找到一种更好的治疗预防药很重要。干扰素(英文简称IFN)是一种临床上广泛使用的具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免 疫调节功能的生物药品，按其抗原性不同分为a、0和Y三类，并且a-干扰素有20个以 上的亚型，如干扰素a-2a、干扰素a-lb和干扰素a-2b等，0 -干扰素有4个亚型，干 扰素有1个亚型。猪干扰素是被研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有猪干扰素的相关 报道。近年来，对猪干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对猪白细胞干扰 素进行了大量的临床试验。研究表明，它对猪的许多病毒性传染病，如流行性腹泻、猪瘟、传 染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟，羔羊腹泻等都具有不错的疗效，试验证实猪 干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。最近几年，猪干扰素a、0、Y基因的分子克隆与 序列分析获得成功。谢海燕等采用PCR技术克隆得到的IFN-a基因由501个核苷酸组成， 共编码166个氨基酸；夏春等克隆得到的猪0干扰素IFN-0基因片段有668个核苷酸， 编码186个氨基酸。曹瑞兵等从经ConA诱导培养的猪外周血白细胞中扩增出猪IFN-Y基 因，经改造后插入原核表达载体PRLG，并实现了在大肠杆菌中的高效表达，表达产物以包涵 体形式存在，经变性、复性、脱盐、凝胶层析纯化处理，重组猪IFN-Y具有较高的干扰素活 性。同时，万建青、陈涛等分别成功地在毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统中表达出重 组干扰素基因，表达产物占菌体总蛋白的比率在20% 35 %之间，表达产物具有的抗病毒 活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了可能。然而，在用干扰素治疗疾病过程中，能刺激机体产生干扰素抗体(抗-IFN)，使得 治疗效果下降或病情反弹，有临床研究表明，较长时间的使用干扰素可使机体产生干扰素 抗体的几率在40%以上，使得治愈率和有效率并不是很高的干扰素的治疗率显著降低。为 了解决上述问题，本发明提供了一种重组猪干扰素的复方制剂，比单独使用猪干扰 素进行治疗具有更好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组猪a -干扰素的复方制剂。
—种重组猪a -干扰素的复方制剂，其特征在于其主要成分为猪a -干扰素和免 疫增强剂。一种重组猪a-干扰素的复方制剂，其特征在于免疫增强剂选用维生素C、聚肌 胞、乳酸杆菌和猪用转移因子中的一种或几种。一种重组猪a-干扰素的复方制剂，其特征在于它们的组合配比为每100万IU 重组猪a “干扰素与200 500毫克的维生素C组合；每100万IU重组猪a -干扰素与 0. 01 1毫克的聚肌胞组合；每100万IU重组猪a -干扰素与40 100毫克的乳酸杆菌 组合；每100万IU重组猪a -干扰素与40 100毫克的猪脾转移因子组合；其中优选于每100万IU重组猪a -干扰素与200毫克的维生素C组合；每100 万IU重组猪a -干扰素与1毫克的聚肌胞组合；每100万IU重组猪a -干扰素与40毫克 的乳酸杆菌组合；每100万IU重组猪a -干扰素与40毫克的猪脾转移因子组合。维生素C能提高白细胞和吞噬细胞功能，促进网状内皮系统和抗体形成，增强抗 应激的能力，维护肝脏解毒，改善心血管功能。聚肌胞又称为聚肌胞苷酸、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸，由多分子核苷酸组合而成，在 体内能诱生干扰素，是一种高效干扰素诱导剂，对多种病毒引起的疾病有较好的疗效，并能 增强抗体形成和刺激巨噬细胞吞噬作用。乳酸杆菌制品可产生非特异性免疫调节因子，提高动物的免疫力。直接饲喂乳酸 杆菌制品可提高机体的抗体水平，产生干扰素，提高免疫球蛋白浓度和巨嗜细胞的活性，增 强机体免疫功能和抗病力。猪脾转移因子是从猪脾中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，具有激发免疫细 胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发 剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子分子量小、无毒、无 抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。自美国著名的免疫 学专家Lawrence发现和研究转移因子以来，世界各国不但进行了许多理论研究，而且进行 了大量的临床应用研究，使得转移因子成为目前应用广泛的增强免疫制剂。本发明的第一个目的是提供一种重组猪a-干扰素的复方制剂，其特征在于由重 组猪a-干扰素和免疫增强剂组成。其中免疫增强剂选用维生素C、聚肌胞、乳酸杆菌和猪 用转移因子中的一种或几种。本发明的第二个目的在于本发明药物可以根据需要做成各种剂型，在具体实施方 案中，其中所述的剂型包括喷雾剂、注射剂、冻干粉、口服粉剂等剂型。下面以重组猪a -干扰素与免疫增强剂针剂为例进行如下说明1.重组猪a -干扰素与维生素C的组合用水针剂处方重组猪a -干扰素3 X 104万IU
15ml 60. 0g
约 7. 2g (调 pH5. 0-7. 0) 0. 015g 0. 6g
甘露醇 维生素C碳酸氢钠EDTA焦亚硫酸钠
注射用水加至300ml
重组猪a-q扰素与维生素C的组合用水针剂工艺流程
搅拌NaHC03 pH5．0—7．0 焦亚硫酸钠、甘露醇260ml新沸水+Vc--->溶液-----十溶液------------>分次缓慢加入 室温后加入重组猪0-干扰素溶液->注射用水至300ml-)测pH-个溶液-)微孔滤膜过滤(0．45pm)---．通COz祈燥(40℃>-个去离子水洗2件，灌装(30ml 十通C02叫过滤除菌(0．25pm封口
本发明提供的重组猪a-q扰素与维生素C的组合用药中，每毫升含有。
2．重组猪。-干扰素与聚肌胞的组合用针剂
聚肌胞注射液的制备工艺
(1)氯化钠-磷酸盐缓沖液，准确称取NaH，P。+．2H。oOo．262g，Na，HPO+-[2H。oO1．546g，Na(l8．’768g，加适量注射用水使溶解，并用注射用水定容至1000m]。取约500ml，45℃保温lo分钟；
(2)准确称取聚肌苷酸o．5g，聚胞苷酸o．5g，分别加入已保温好的氯化钠-磷酸盐缓沖液60ml，搅拌使溶解。密封，于45℃保温20分钟；
(4)上述已保温好的混合溶液加氯化钠-磷酸盐缓沖溶液定容至1000m]，灌装，灭菌，即得；
重组猪a-q扰素。t~lo~．7j．I[J
聚肌胞注射液1000ml
甘油5％o
氯仿o．3％
硬脂酸锌1％
NaHCO，缓冲剂适量(调pH6．0-7．o)
重组猪a-q扰素与聚肌胞的组合用水针剂工艺流程
搅拌NaHC03 pH6．0~7．0甘油、氯仿、甘露醇900ml聚肌胞注射液叫溶液------->溶液-----------十重组猪0．干扰素 分次缓慢加入硬脂酸锌溶液->剩余聚肌胞注射液至1000ml->测．ptt----~透析溶液-十微孔滤膜过(0．45pm)
去离子水洗2次-个灌装(10m1)过滤除菌(0．25pm)-)封口
本发明提供的重组猪a-q扰素与聚肌胞的组合用药中，每毫升含有100万重组猪a-干扰素IU与1毫克的聚肌胞。
3.重组猪a-干扰素与乳菌t杆菌的组合用针剂
处方
重组猪a“干扰素1X104 万 IU
乳酸杆菌4. 0g
甘露醇5ml
甘油5%
氯仿0. 3%
硬脂酸锌1%
NaHC03缓冲剂适量(调 PH5. 0-6. 5)
注射用水加至100ml
重组猪a-干扰素与乳酸杆菌的组合用针剂工艺流程
搅拌NaHC03pH6.0~7.0 甘油、氯仿、甘露醇
50ml水- 溶液- 溶液- 溶液
乳酸杆菌、重组猪a-干扰素分次缓慢加入 硬脂酸锌 注射用水至100ml—+测pH—透析溶液~~H散孔滤膜过(0.45卩m”去离子水洗2次 灌装(1ml) 过滤除菌(0.25jjm)~ 封口本发明提供的重组猪a-干扰素与乳酸杆菌的组合用药中，每100万重组猪 a -干扰素IU与40毫克的乳酸杆菌组合。4.重组猪a-干扰素与猪脾转移因子的组合用水针剂猪脾转移因子的制备工艺(1)将冷冻的猪脾脏1kg，去除脂肪、被膜和大的血管，用去热原蒸馏水洗净后切 成小块，加入1L无菌生理盐水；(2)用高压勻制机进行细胞破碎，同时加入200mL的1 %壳聚糖溶液作为絮凝剂， 混勻后制成勻浆；(3)置-20°C冷冻和室温融化，反复冻融10次；(4)然后在4°C，以lOOOOrpm离心并取上清液，反复3次后，将上清置于透析袋中 并将透析袋放入盛有无菌生理盐水的容器内，置于0-4°C透析48h ；(5)用10% NaHC03调整透析液PH值至中性，并加入0. 3%的氯仿作防腐剂；(6)将透析液通过微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子 的原液；(7)检测原液猪脾转移因子含量为40mg/mL。处方重组猪a -干扰素1 X 105万IU猪脾转移因子溶液1000mL甘露醇50ml甘油5%氯仿0.3%
本发明提供的重组猪a-干扰素与猪脾转移因子的组合用药中，每毫升含有100 万重组猪a “干扰素IU与40毫克的猪脾转移因子。下面以重组猪a-干扰素与猪脾转移因子组合用水针剂为例，用实验说明本发明 药物在临床上的治疗效果按照农业部公告第442号发布的兽用生物制品临床试验研究资料要求进行以下 研究1、试验动物3日龄健康仔猪28头，分为4组，每组7只，空白组，本发明用药组， 单用重组猪a-干扰素药物对照组，发病不给药阳性组。中和试验证实为猪传染性胃肠炎 抗体阴性，常规方式饲喂。见下表表1试验分组及处理 2、攻毒对21头仔猪攻100TCID5。猪传染性胃肠炎病毒，均致发病；空白组不攻3、试验方法待症状出现，立即进行临床治疗试验。本发明用药组肌注转移因子与 重组猪a-干扰素复方制剂，0. 5ml/头；药物对照组肌注重组猪a-干扰素50万单位/头； 每日一次，连用3日。4、试验结果药物对照组在连用3日药后症状稍减轻，精神不振，食欲减少，愈后 不良；本发明用药组用药后病猪精神恢复良好，食欲恢复正常，愈后良好。本发明的有益效果本发明的目的在于提供一种由重组猪a-干扰素和免疫增强 剂组合的复方药物。本发明采用维生素C、聚肌胞、乳酸杆菌和猪用转移因子中的一种或者 几种作为重组猪a “干扰素的免疫增强剂，并添加适当的药用辅料经过一定工艺制成复方 制剂。采用本发明药物进行治疗，在使用干扰素治疗疾病的同时药物中的免疫增强剂能够 诱导机体产生干扰素，从而形成持续的治疗过程，达到彻底治愈疾病的目的。药物之间相互 作用，促使机体持续性产生干扰素，有效治疗疾病，增强机体的抵抗力，起到预防疾病的发生和防止继发感染的效果，适于在畜牧业中推广应用。
具体实施例方式实施例一重组猪a -干扰素与维生素C的组合用水针剂取重组猪0-干扰素3\105万1仏维生素〔60.0克，药用辅料选用EDTA、焦亚硫 酸钠和碳酸氢钠缓冲剂适量，加适量水溶解，调节PH值在5. 0 7. 0之间，滤过灭菌，分装 成10瓶，每瓶30mL，封口即制得每瓶含重组猪a-干扰素100万IU和维生素C 200毫克的 复方水针剂。应用主要用于治疗猪传染性胃肠炎病、猪流行性腹泻病。用法与用量肌内注射，一次量，小猪(30kg以下)本品0. 5mL,中(30_60kg)本品 1. OmL，大猪(60kg以上)本品1. 5mL,每日1次，连用2-3天。实施例二 重组猪a -干扰素与聚肌胞的组合用水针剂取重组猪a -干扰素1 X 105万IU，聚肌胞注射液1000ml (聚肌胞含量lmg/ml)， 药用辅料选用氯仿、硬脂酸锌和碳酸钠盐缓冲剂适量，调节PH值在6. 0 7. 0之间，滤过灭 菌，分装成100瓶，每瓶10mL，封口即制得每瓶含重组猪a -干扰素100万IU和聚肌胞1毫 克的复方水针剂。应用广谱抗病毒药。主要适用于治疗各种动物病毒性疾病，尤其是畜禽免疫失败 后诱发的病毒性疾病的治疗，如猪瘟、猪水疱病、口蹄疫、猪传染性胃肠炎等以及免疫缺陷 或免疫力低下症。本品对侵染到宿主细胞内的某些细菌、立克次体、衣原体和某些原虫也具 有良好的杀灭作用。用法与用量肌肉注射，一次量，每lkg体重，本品0.02ml，隔3日注射一次。实施例三重组猪a -干扰素与乳酸杆菌的组合用水针剂取重组猪a -干扰素1 X 104万IU，乳酸杆菌4克，药用辅料选用甘油、氯仿、硬脂 酸锌和磷酸盐缓冲剂适量，加注射水溶解，调节PH值在5. 0 6. 5之间，滤过灭菌，分装成 100瓶，每瓶lmL，封口即制得每瓶含重组猪a -干扰素100万IU和乳酸杆菌40毫克的复 方水针剂。应用用于治疗仔猪黄痢、白痢，断奶仔猪腹泻，猪传染性胃肠炎病、猪流行性腹泻 病。用法与用量肌内注射，一次量，小猪(30kg以下)本品0. 5mL,中(30_60kg)本品 1. OmL,大猪(60kg以上)本品1. 5mL,每日1次，连用2-3天。实施例四重组猪a _干扰素与猪用转移因子的组合用水针剂取重组猪a -干扰素1 X 104万IU，猪脾转移因子溶液1000ml (猪脾转移因子含量 40mg/ml)，药用辅料选用氯仿、硬脂酸锌、甘油和碳酸盐缓冲剂适量，调节pH值在6. 0 7. 0 之间，滤过灭菌，分装成100瓶，每瓶10mL，封口即制得每瓶含重组猪a-干扰素100万IU 和猪用转移因子40毫克的复方水针剂。应用治疗猪的各类病毒病，如猪瘟、猪传染性胃肠炎病、猪流行性腹泻病等病。用法与用量肌内注射，一次量，小猪(30kg以下)本品0. 5mL,中(30_60kg)本品 1. OmL,大猪(60kg以上)本品1. 5mL,每日1次，连用2-3天。
8
权利要求
一种重组猪α-干扰素的复方制剂，其特征在于由以下成分组成重组猪α-干扰素和免疫增强剂。
2.根据权利要求1所述的一种重组猪α-干扰素和免疫增强剂的复方制剂，其特征在 于免疫增效剂包括维生素C、聚肌胞、乳酸杆菌及猪脾转移因子中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1或2所述的包含重组猪α-干扰素和其免疫增强剂的组合用药物， 其特征在于它们的组合配比为每100万IU重组猪α -干扰素与200 500毫克的维生 素C组合；每100万IU重组猪α -干扰素与0. 01 1毫克的聚肌胞组合；每100万IU重 组猪α “干扰素与40 100毫克的乳酸杆菌组合；每100万IU重组猪α -干扰素与40 100毫克的猪脾转移因子组合；其中优选于每100万IU重组猪α -干扰素与200毫克的维生素C组合；每100万IU 重组猪α “干扰素与1毫克的聚肌胞组合；每100万IU重组猪α -干扰素与40毫克的乳 酸杆菌组合；每100万IU重组猪α -干扰素与40毫克的猪脾转移因子组合。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种重组猪α-干扰素和免疫增强剂的复方制剂，其 特征在于可以根据需要做成喷雾剂、注射剂、冻干粉、口服粉剂等剂型。
全文摘要
本发明涉及一种免疫增强剂与重组猪α-干扰素的组合用药物。一种重组猪α-干扰素和对重组猪α-干扰素有增效作用的复方制剂，免疫增强剂选用维生素C、聚肌胞、乳酸杆菌及猪脾转移因子的一种或几种组合。在治疗疾病的同时能够刺激机体持续产生干扰素，从而形成持续的治疗过程，达到彻底治愈疾病的目的，同时能够增强机体的抵抗力，起到预防疾病的发生和防止继发感染的效果。
文档编号A61K35/74GK101874896SQ20091006869
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者王小娥 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司