多孔组织工程支架及其制备方法

专利名称：多孔组织工程支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及组织工程支架及其制备方法。
技术背景 -
组织工程支架作为人工细胞外基质是组织工程研究的重要内容之一，它具 有将细胞传递到体内的特定位置，然后为再生的组织预先占据一定的空间，并 引导组织发展的作用。目前所应用的组织工程材料主要有两大类天然生物大 分子材料和合成聚合物材料。天然材料价格昂贵、不同批次材料之间的性质差 异大，而且无法满足根据组织工程需要对降解时间等性能进行设计的要求；合 成聚合物虽然可以改善天然材料的这些缺点，但缺乏细胞识别信号，与细胞间 缺乏生物相互作用是其在组织工程方面进一步应用的瓶颈。
聚乳酸和聚羟基乙酸是经美国FDA批准的、最早也是最广泛应用的可体内 降解的生物材料，这两种材料在体内可以完全降解成为对人体无害的物质，同 时这两种材料还具有降解时间可调，物理机械性能优良等特点，因而成为目前 组织工程研究领域的首选材料，但是它们作为组织工程支架材料进行细胞的培 养时，首先遇到的问题就是材料与细胞相容性差，不利于细胞在材料上粘附、 铺展、迁移、增殖，因而无法大面积推广和应用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有组织工程支架与细胞相容性差的问题； 而提供了多孔组织工程支架及其制备方法。
本发明的多孔组织工程支架主要由(x-羟基酸和氨基酸的共聚物和致孔剂 制成，多孔组织工程支架的孔隙率为92.5%~98.5%(体积)、孔径为200 ~250pm， 所述的(x-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2%~40%， 所述致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4~9: 1。本发明多 孔组织工程支架中还包括活性粒子和/或生长因子；其中活性粒子占共聚物总 质量的5%~30%，生长因子占共聚物总质量的0.5%~10%。另外，可在共聚物 表面接枝多肽。本发明制备多孔组织工程支架的方案一，具体制备方法如下a、将a-羟 基酸与氨基酸在110 13(TC及辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚合24h，然后 溶于三氯甲垸后用甲醇萃取，再在35 45-C条件下烘干，得到共聚物；b、将 共聚物溶于三氯甲烷或乙醚中配成质量浓度为5% 30%的溶液，再加入致孔 剂，超声振荡至均匀后浇铸于模具型腔内，在室温中放置24h 48h，然后在 35 45"C条件下干燥24h 48h;即制得孔隙率为92.5%~98.5% (体积)、孔径为 200~25(^m的多孔组织工程支架；其中步骤a所述的a-羟基酸是乳酸和/或羟 基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2%~40%;步骤b所述的致孔剂为氯化钠或 蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4 9: 1。
方案一的步骤b还能按下述步骤进行将共聚物放入模具型腔内，再加入 致孔剂，然后在160~180°C、压力为8MPa 15MPa条件下模压成型 10min 20min，再冷却到室温，用蒸馏水洗涤4至8次，再冻干即可。
方案一的在步骤b中，加入致孔剂的同时再加入活性粒子和/或生长因子， 其中活性粒子占步骤a共聚物总质量的5%~30%;生长因子占步骤a共聚物总 质量的0.5%~10%。
在方案一的步骤b之后还可按下述步骤在共聚物表面接枝多肽，具体操作 如下先进行紫外消毒，然后放入PBS溶液中，再加入交联剂，在室温下放 置12h 48h;取出后放入浓度为lg/L多肽溶液中，在室温下放置10h 15h即 完成在共聚物表面接枝多肽；其中所述的交联剂为Sulfo-LC-SPDP，交联剂用 量是PBS溶液质量的3%~10%，所述的多肽溶液是由多肽干粉与PBS溶液配 制的。
本发明制备多孔组织工程支架的方案二，具体制备方法如下 一、将(X-羟基酸在110 130°C、辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚合24h，然后溶于三 氯甲烷后用甲醇萃取，再在35'C 45'C条件下烘干得到聚合物；二、然后将步 骤一得到的聚合物、二环己基碳二亚胺与N-羟基-琥珀酰亚胺按l: 5: 5的摩 尔比混合，对聚合物表面进行活化l~9h;三、将氨基酸环化得到聚氨基酸， 将聚氨基酸与表面活化的聚合物加入二甲亚砜中，聚氨基酸和表面活化的聚合 物总质量与二甲亚砜质量比为1~2: 6~5，常温震荡2 5h后放置去离子水中，
混匀后过滤，冻干得到共聚物(梳状共聚物)；四、将共聚物溶于三氯甲烷或乙醚中配成质量浓度为5%~30%的溶液，再加入致孔剂，超声振荡至均匀后浇 铸于模具型腔内，室温中放置24 48h，然后在3.5 45'C条件下干燥24 48h， 得到孔隙率为92.5%~98.5%(体积)、孔径为200~250pm的多孔组织工程支架； 其中步骤三所述的ct-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的 2% 40%;步骤四中致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4~9: 1。
方案二的步骤四还能按下述步骤进行将共聚物放入模具型腔内，再加入 致孔剂，然后在160 180°C、压力为8MPa 15MPa条件下模压成型 10min 20min，再冷却到室温，用蒸馏水洗涤4至8次，再冻干即可。
方案二的在步骤四中，加入致孔剂的同时再加入活性粒子和/或生长因子， 其中活性粒子占步骤三共聚物总质量的5%~30%;生长因子占步骤三共聚物总 质量的0.5°/。~10%。
在方案二的步骤四之后还可按下述步骤在共聚物表面接枝多肽，具体操作 如下先进行紫外消毒，然后放入PBS溶液中，再加入交联剂，在室温下放 置12h 48h;取出后放入浓度为lg/L多肽溶液中，在室温下放置10h 15h即 完成在共聚物表面接枝多肽；其中所述的交联剂为Sulfo-LC-SPDP，交联剂用 量是PBS溶液质量的3% 10%，所述的多肽溶液是由多肽干粉与PBS溶液配 制的。
上述的活性粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、海 藻酸盐、羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合；上述的生长因子为 骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子中的一种或其 中几种的混合。上述的多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
本发明具有的优点 (l)本发明的多孔组织工程支架含有氨基酸单元，具有良好的生物相容 性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而 影响新组织的功能，有助于细胞的粘附、铺展、迁移、增殖。
将本发明的多孔组织工程支架植入脊髓半离断后的小鼠体内，30天后进 行组织观察，移植处无明显炎症反应，组织和细胞长势良好，由此可见本发明的多孔组织工程支架的细胞相容性良好，并对神经细胞生长具有明显的接触诱 导作用。
(2) 本发明的多孔组织工程支架具有可降解性及合适的降^速率，当移植 的细胞或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解，降解吸收速率能与细胞、 组织生长速率相匹配。
(3) 本发明的多孔组织工程支架具有合适的孔尺寸、高的孔隙率和相连通 的孔形态，利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧 气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内长入，最大限度地适应骨 细胞、软骨细胞等硬组织细胞，胰腺细胞、甲状腺细胞等内分泌组织细胞以及 肌肉、血管、上皮等各种组织细胞培养的目的。
(4) 本发明的多孔组织工程支架具有高的表面积、合适的表面理化性质和 良好的细胞界面关系，利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信 号分子。
(5) 本发明的多孔组织工程支架与植入部位组织的力学性能相匹配的结 构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞 提高合适的微应力环境。
(6) 本发明产品的性能参数可根据细胞进行设计通过针对人体不同组织 细胞对支架的要求，混入活性粒子、生物因子或多肽，可在较大范围内调节其 生物相容性，力学性能和体内的降解性能，使其更适用于组织工程支架材料的 要求，来满足临床医学的应用。
(7) 本发明工艺简单、便于操作、容易加工，可加工成理想的二维或三 维结构，可以获得所需的组织或器官形状，易于重复制作，而且移植到体内后 能保持原有形状。


图1是具体实施方式
七十七的多孔组织工程支架植入脊髓半离断后的小 鼠体内30天后的小鼠组织观察照片，图中箭头指的是植入小鼠体内的多孔组 织工程支架。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方
7式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式多孔组织工程支架由a-羟基酸和氨基酸的 共聚物和致孔剂制成，多孔组织工程支架的孔隙率为92.5%~98.5% (体积)、 孔径为200 250nrn，所述的a-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物 总质量的2%~40%，其余为a-羟基酸，所述致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与 共聚物的质量比为4 9: 1。
本实施方式a-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比组合。本实 施方式的多孔组织工程支架含有氨基酸单元，具有良好的生物相容性，无明显 的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而影响新组织 的功能，有助于细胞的粘附、铺展、迁移、增殖；并可自行降解，降解吸收速 率能与细胞、组织生长速率相匹配；而且具有合适的孔尺寸、高的孔隙率和相 连通的孔形态，利于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、 氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内长入，最大限度地适应 骨细胞、软骨细胞等硬组织细胞，胰腺细胞、甲状腺细胞等内分泌组织细胞以 及肌肉、血管、上皮等各种组织细胞培养的目的。本实施方式多孔组织工程支 架具有高的表面积、合适的表面理化性质和良好的细胞界面关系，利于细胞黏 附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号分子。本实施方式的多孔组织工 程支架与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环 境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是氨基酸占共聚 物总质量的5%~35%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是氨基酸占共聚 物总质量的10 30%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是氨基酸占共聚 物总质量的15%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是氨基酸占共聚 物总质量的20%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是氨基酸占共聚 物总质量的25%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六不同的是共聚物表 面还接枝有多肽。其它与具体实施方式
一至六相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七不同的是多肽为精氨酸 -甘氨酸-天冬氨酸。其它与具体实施方式
七相同。
具体实施方式
九本实施方式的多孔组织工程支架由(X-羟基酸、氨基酸的
共聚物、活性粒子和致孔剂制成，多孔组织工程支架的孔隙率为92.5%~98.5% (体积)、孔径为200 ~250pm，所述的a-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基
酸占共聚物总质量的2%~40%，活性粒子占共聚物总质量的5%~30%，其余为
a-羟基酸，所述致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4~9: 1。 本实施方式a-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比组合。 本实施方式扩大了生物相容性的范围，力学性能和体内的降解性能，使其
适用于人体不同组织细胞对支架的要求，来满足临床医学的应用。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
九不同的是氨基酸占共聚
物总质量的5%~35%。其它与具体实施方式
九相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
九不同的是氨基酸占共
聚物总质量的10~30%。其它与具体实施方式
九相同。
具体实施方式
十二本实施方式与具体实施方式
九不同的是氨基酸占共 聚物总质量的15%。其它与具体实施方式
九相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
九不同的是氨基酸占共 聚物总质量的20%。其它与具体实施方式
九相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
九不同的是氨基酸占共 聚物总质量的25%。其它与具体实施方式
九相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
九至十四不同的是活性 粒子占共聚物总质量的10% 25%。其它与具体实施方式
九至十四相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
九至十四不同的是活性 粒子占共聚物的20%。其它与具体实施方式
九至十四相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
九至十六不同的是活性 粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、羟基磷 灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合。其它与具体实施方式
九至十六相同。本实施方式中活性粒子为混合物时，各种活性粒子间按任意比混合。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
九至十七不同的是加入 活性粒子的共聚物表面接枝多肽。其它与具体实施方式
九至十七相同。
本实施方式多孔工程支架增强细胞的粘附力，扩大了生物相容性的范围， 力学性能和体内的降解性能，使其适用于人体不同组织细胞对支架的要求，来 满足临床医学的应用。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
十八不同的是多肽为精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。其它与具体实施方式
十八相同。
具体实施方式
二十本实施方式的多孔组织工程支架由(X-羟基酸、氨基酸 的共聚物、生长因子和致孔剂制成，多孔组织工程支架的孔隙率为
92.5%~98.5% (体积)、孔径为200 250pm，所述的a-羟基酸是乳酸和/或羟基
乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2%~40%，生长因子占共聚物总质量的
0.5%~10%，其余为a-羟基酸，所述致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物
的质量比为4 9: 1。
本实施方式cx-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比组合。 本实施方式的多孔组织支架促进细胞与生物材料之间的选择性作用，扩大
了生物相容性的范围，力学性能和体内的降解性能，使其适用于人体不同组织
细胞对支架的要求，来满足临床医学的应用。
体实施方式二十一本实施方式与具体实施方式
二十不同的是氨基酸占
共聚物总质量的5%~35%。其它与具体实施方式
二十相同。
具体实施方式
二十二本实施方式与具体实施方式
二十不同的是氨基酸
占共聚物总质量的10~30%。其它与具体实施方式
二十相同。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施方式
二十不同的是氨基酸 占共聚物总质量的15%。其它与具体实施方式
二十相同。
具体实施方式
二十四本实施方式与具体实施方式
二十不同的是氨基酸 占共聚物总质量的20%。其它与具体实施方式
二十相同。
具体实施方式
二十五本实施方式与具体实施方式
二十不同的是氨基酸 占共聚物总质量的25%。其它与具体实施方式
二十相同。
具体实施方式
二十六本实施方式与具体实施方式
二十至二十五不同的是生长因子占共聚物总质量的2%~8%。其它与具体实施方式
二十至二十五 相同。
具体实施方式
二十七本实施方式与具体实施方式
二十至二十五不同的 是生长因子占共聚物总质量的5%。其它与具体实施方式
二十至二十五相同。
具体实施方式
二十八本实施方式与具体实施方式
二十至二十七不同的 是生长因子为骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因 子中的一种或其中几种的混合。其它与具体实施方式
二十至二十七相同。
本实施方式中生长因子为混合物时，各种生长因子间按生物体不同组织的 要求混合。
具体实施方式
二十九本实施方式与具体实施方式
二十至二十七不同的 是加入生长因子的共聚物表面接枝多肽。其它与具体实施方式
二十至二十七 相同。
具体实施方式
三十本实施方式与具体实施方式
二十九不同的是多肽为 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。其它与具体实施方式
二十九相同。
具体实施方式
三十一本实施方式的多孔组织工程支架由(X-羟基酸、氨基 酸的共聚物、活性粒子、生长因子和致孔剂制成，多孔组织工程支架的孔隙率 为92.5%~98.5% (体积)、孔径为200 ~250pm，所述的a-羟基酸是乳酸和/或 羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2%~40%，活性粒子占共聚物总质量的 5% 30%，生长因子占共聚物总质量的0.5%~10%，其余为a-羟基酸，所述致 孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4~9: 1。
本实施方式a-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比组合。
本实施方式扩大了生物相容性的范围，力学性能和体内的降解性能，使其 适用于人体不同组织细胞对支架的要求，来满足临床医学的应用。
具体实施方式
三十二本实施方式与具体实施方式
三十一不同的是氨基 酸占共聚物总质量的5%~35%。其它与具体实施方式
三十一相同。
具体实施方式
三十三本实施方式与具体实施方式
三十一不同的是氨基 酸占共聚物总质量的10~30%。其它与具体实施方式
三十一相同。
具体实施方式
三十四本实施方式与具体实施方式
三十一不同的是氨基 酸占共聚物总质量的15%。其它与具体实施方式
三十一相同。
具体实施方式
三十五本实施方式与具体实施方式
三十一不同的是氨基 酸占共聚物总质量的20%。其它与具体实施方式
三十一相同。
具体实施方式
三十六本实施方式与具体实施方式
三十一不同的是氨基 酸占共聚物总质量的25%。其它与具体实施方式
三十一相同。
具体实施方式
三十七本实施方式与具体实施方式
三十一至三十六不同的 是活性粒子占共聚物总质量的10%~25%。其它与具体实施方式
三十一至三 十六相同。
具体实施方式
三十八:本实施方式与具体实施方式
三十一至三十六不同的 是活性粒子占共聚物总质量的20%。其它与具体实施方式
三十一至三十六相 同。
具体实施方式
三十九本实施方式与具体实施方式
三十一至三十八不同的 是生长因子占共聚物总质量的2%~8%。其它与具体实施方式
三十一至三十 八相同。
具体实施方式
四十本实施方式与具体实施方式
三十一至三十八不同的 是生长因子占共聚物总质量的5%。其它与具体实施方式
三十一至三十八相 同。
具体实施方式
四十一本实施方式与具体实施方式
三十一至四十不同的 是活性粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、 羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合。其它与具体实施方式
三十一 至四十相同。
本实施方式中活性粒子为混合物时，各种活性粒子间按任意比混合。
具体实施方式
四十二本实施方式与具体实施方式
三十一至四十一不同的 是生长因子为骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因 子中的一种或其中几种的混合。其它与具体实施方式
三十一至四十一相同。
本实施方式中生长因子为混合物时，各种生长因子间按生物体不同组织的 要求混合。
具体实施方式
四十三:本实施方式与具体实施方式
三十一至四十二不同的 是加入活性离子和生长因子的共聚物表面接枝多肽。其它与具体实施方式
三 十一至四十二相同。
具体实施方式
四十四本实施方式与具体实施方式
四十三不同的是多肽 为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。其它与具体实施方式
四十三相同。
具体实施方式
四十五本实施方式中多孔组织工程支架的制备方法如下
a、将a-羟基酸与氨基酸在110 130。C及辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚合 24h，然后溶于三氯甲烷后用甲醇萃取，再在35 45。C条件下烘干，得到共聚 物；b、将共聚物溶于三氯甲垸或乙醚中配成质量浓度为5%~30%的溶液，再 加入致孔剂，超声振荡至均匀后浇铸于模具型腔内，在室温中放置24h 48h， 然后在35 45-C条件下干燥24h 48h;即制得孔隙率为92.5%~98.5% (体积)、 孔径为200~250pm的多孔组织工程支架；其中步骤a所述的a-羟基酸是乳酸 和域羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2%~40%;步骤b所述的致孔剂为 氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4 9: 1。
本实施方式辛酸亚锡用量是a-羟基酸与氨基酸总质量的2~6%。
本实施方式步骤a中的a-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比 组合。本实施方式制得的多孔组织工程支架用紫外消毒后密封保存。
本实施方式的多孔组织工程支架含有氨基酸单元，具有良好的生物相容 性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而 影响新组织的功能，有助于细胞的粘附、铺展、迁移、增殖；并可自行降解， 降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配。
具体实施方式
四十六本实施方式与具体实施方式
四十五不同的是步骤 a中氨基酸占共聚物总质量的5%~35%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十 五相同。
具体实施方式
四十七本实施方式与具体实施方式
四十五不同的是步骤 a中氨基酸占共聚物总质量的10~30%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十 五相同。
具体实施方式
四十八本实施方式与具体实施方式
四十五不同的是步骤 a中氨基酸占共聚物总质量的15%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十五相 同。
具体实施方式
四十九本实施方式与具体实施方式
四十五不同的是步骤 a中氨基酸占共聚物总质量的20%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十五相
13同。
具体实施方式
五十本实施方式与具体实施方式
四十五不同的是步骤a 中氨基酸占共聚物总质量的25%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十五相 同。
具体实施方式
五十一本实施方式与具体实施方式
四十五至五十不同的 是步骤b还能按下述步骤进行将共聚物放入模具型腔内，再加入致孔剂，
然后在160~180°C、压力为8MPa 15MPa条件下模压成型10min 20min，再冷 却到室温，用蒸馏水洗漆4至8次，再冻干；即制得孔隙率为92.5%~98.5%(体 积)、孔径为200 250^im的多孔组织工程支架。其它步骤及参数与具体实施方 式四十五至五十相同。
本实施方式步骤三冻干是用液氮进行冻干的。
具体实施方式
五十二本实施方式与具体实施方式
四十五至五十一不同的 是步骤b中，加入致孔剂的同时再加入活性粒子和/或生长因子，其中活性 粒子占步骤a共聚物总质量的5% 30%，生长因子占步骤a共聚物总质量的 0.5%~10%。其它步骤及参数与具体实施方式
四十五至五十一相同。
具体实施方式
五十三本实施方式与具体实施方式
五十二不同的是活性 粒子占步骤a共聚物总质量的10%~25%。其它步骤及参数与具体实施方式
五 十二相同。
具体实施方式
五十四本实施方式与具体实施方式
五十二不同的是活性 粒子占步骤a共聚物总质量的20。/。。其它步骤及参数与具体实施方式
五十二相 同。
具体实施方式
五十五:本实施方式与具体实施方式
五十二至五十四不同的 是生长因子占步骤&共聚物总质量的2% 8%。其它步骤及参数与具体实施
方式五十二至五十四相同。
具体实施方式
五十六:本实施方式与具体实施方式
五十二至五十四不同的 是生长因子占步骤a共聚物总质量的5Q/。。其它步骤及参数与
具体实施例方式
五十二至五十四相同。
具体实施方式
五十七:本实施方式与具体实施方式
五十二至五十六不同的 是所述的活性粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐微球、羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合。其它步骤及参 数与具体实施方式
五十二至五十六相同。
本实施方式中活性粒子为混合物时，各种活性粒子间按任意比混合。海藻 酸盐微球为海藻酸钙微球。
具体实施方式
五十八:本实施方式与具体实施方式
五十二至五十七不同的 是所述的生长因子为骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经 生长因子中的一种或其中几种的混合。其它步骤及参数与具体实施方式
五十二 至五十七相同。
本实施方式中生长因子为混合物时，各种生长因子间按生物体不同组织的 要求混合。
具体实施方式
五十九本实施方式与具体实施方式
四十五至五十八不同 的是在步骤b之后还可按下述步骤在共聚物表面接枝多肽，具体操作如下 先进行紫外消毒，然后放入PBS溶液中，再加入交联剂，在室温下放置 12h 48h;取出后放入浓度为lg/L多肽溶液中，在室温下放置10h 15h即完成
在共聚物表面接枝多肽；其中所述的交联剂为Siilfo-LC-SPDP (磺基琥珀酰國2-吡啶二硫-3，丙酰氨基 6-己酸盐，Sulfosuccinimidyl 6画(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate〕，交联剂用量是PBS溶液质量的 3%~10%，所述的多肽溶液是由多肽干粉与PBS溶液配制的。其它步骤及参数 与具体实施方式
四十五至五十八相同。
本实施方式所述的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)的配制方法如下:在800ml 蒸馏水中溶解8g NaCl、 0.2g KC1、 1.44g Na2HPOjfl 0.24g KH2P04，用HC1 调节pH值至7.4加水定容至1L，在1034xl05Pa下蒸气灭菌20min，室温保存。
具体实施方式
六十本实施方式与具体实施方式
五十九为不同的是所述 多肽溶液中多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。其它步骤及参数与具体实施方 式五十九相同。
具体实施方式
六十一本实施方式中多孔组织工程支架的制备方法如下
一、将a-羟基酸在110 13(TC、辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚合24h，然 后溶于三氯甲烷后用甲醇萃取，再在35'C 45。C条件下烘干得到聚合物；二、然后将步骤一得到的聚合物、二环己基碳二亚胺与N-羟基-琥珀酰亚胺按1: 5: 5的摩尔比混合，对聚合物表面进行活化1 9h;三、将氨基酸环化制备聚氨基 酸，将聚氨基酸与表面活化的聚合物加入二甲亚砜中，聚氨基酸和表面活化的
聚合物总质量与二甲亚砜质量比为1~2: 6~5,常温震荡2~5h后放置去离子水
中，混匀后过滤，冻干得到共聚物(梳状共聚物)；四、将共聚物溶于三氯甲
烷或乙醚中配成质量浓度为5%~30%的溶液，再加入致孔剂，超声振荡至均匀 后浇铸于模具型腔内，室温中放置24~48h,然后在35 45'C条件下干燥24~48h， 得到孔隙率为92.5% 98.5%(体积)、孔径为200~250^im的多孔组织工程支架； 其中步骤三所述的a-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的 2%~40%;步骤四中致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4 9:
lo
本实施方式辛酸亚锡用量是a-羟基酸与氨基酸总质量的2~6%。本实施方 式步骤三是采用现有环化工艺将氨基酸制成聚氨基酸的。
本实施方式步骤一中的(x-羟基酸为混合物时，乳酸、羟基乙酸按任意比 组合。本实施方式制得的多孔组织工程支架用紫外消毒后密封保存。
本实施方式的多孔组织工程支架含有氨基酸单元，具有良好的生物相容 性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥，不会因邻近组织的排异反应而 影响新组织的功能，有助于细胞的粘附、铺展、迁移、增殖；并可自行降解， 降解吸收速率能与细胞、组织生长速率相匹配。
具体实施方式
六十二本实施方式与具体实施方式
六十一不同的是步 骤三中氨基酸占共聚物总质量的5%~35%。其它步骤及参数与具体实施方式
六 十一相同。
具体实施方式
六十三本实施方式与具体实施方式
六十一不同的是步 骤三中氨基酸占共聚物总质量的10%~30%。其它步骤及参数与具体实施方式
六十一相同。
具体实施方式
六十四本实施方式与具体实施方式
六十一不同的是步 骤三中氨基酸占共聚物总质量的15%。其它步骤及参数与具体实施方式
六十一 相同。
具体实施方式
六十五本实施方式与具体实施方式
六十一不同的是步骤三中氨基酸占共聚物总质量的20%。其它步骤及参数与具体实施方式
三十四 相同。
具体实施方式
六十六本实施方式与具体实施方式
六十一不同的是步 骤三中氨基酸占共聚物总质量的25%。其它步骤及参数与具体实施方式
六十一相同。
具体实施方式
六十七本实施方式与具体实施方式
六十一至六十六不同 的是步骤四还能按下述步骤进行将共聚物放入模具型腔内，再加入致孔剂， 然后在160~180°C、压力为8MPa 15MPa条件下模压成型10min 20min，再冷 却到室温，用蒸馏水洗涤4至8次，再冻干；即制得孔隙率为92.5% 98.5%(体 积)、孔径为200-250^im的多孔组织工程支架。其它步骤及参数与具体实施方 式六十一至六十六相同。
本实施方式步骤三冻干是用液氮进行冻干的。
具体实施方式
六十八本实施方式与具体实施方式
六十一至四六十七不同 的是步骤四中，加入致孔剂的同时再加入活性粒子和/或生长因子，其中活
性粒子占步骤三共聚物总质量的5%~30%，生长因子占步骤三共聚物总质量的 0.5%~10%。。其它步骤及参数与具体实施方式
六十一至四六十七相同。
具体实施方式
六十九本实施方式与具体实施方式
六十八不同的是活性 粒子占步骤三共聚物总质量的10%~25%。其它步骤及参数与具体实施方式
六
十八相同。
具体实施方式
七十本实施方式与具体实施方式
六十八不同的是活性粒 子占步骤三共聚物总质量的20%。其它步骤及参数与具体实施方式
六十八相同。
具体实施方式
七十一本实施方式与具体实施方式
六十八至七十不同的 是生长因子占步骤三共聚物总质量的2%~8%。其它步骤及参数与具体实施 方式六十八至七十相同。
具体实施方式
七十二本实施方式与具体实施方式
六十八至七十不同的 是生长因子占步骤三共聚物总质量的5%。其它步骤及参数与具体实施方式
六十八至七十相同。
具体实施方式
七十三:本实施方式与具体实施方式
六十八至七十二不同的
17是所述的活性粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚糖、海 藻酸盐微球、羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合。其它步骤及参 数与具体实施方式
六十八至七十二相同。
本实施方式中活性粒子为混合物时，各种活性粒子间按任意比混合。本实 施方式所述的海藻酸盐微球为海藻酸钙微球。
具体实施方式
七十四本实施方式与具体实施方式
六十八至七十三不同的 是所述的生长因子为骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经 生长因子中的一种或其中几种的混合。其它步骤及参数与具体实施方式
六十八 至七十三相同。
本实施方式中生长因子为混合物时，各种生长因子间按生物体不同组织的 要求混合。
具体实施方式
七十五本实施方式与具体实施方式
六十一至七十四不同 的是在步骤b之后还可按下述步骤在共聚物表面接枝多肽，具体操作如下 先进行紫外消毒，然后放入PBS溶液中，再加入交联剂，在室温下放置 12h 48h;取出后放入浓度为lg/L多肽溶液中，在室温下放置10h 15h即完成
在共聚物表面接枝多肽；其中所述的交联剂为Sulfo-LC-SPDP (磺基琥珀酰-2-吡啶二硫-3,丙酰氨基 6-己酸盐，Sulfosuccinimidyl 6國(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate〕，交联剂用量是PBS溶液质量的 3%~10%，所述的多肽溶液是由多肽干粉与PBS溶液配制的。其它步骤及参数 与具体实施方式
六十一至七十四相同。
本实施方式所述的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)的配制方法如下:在800ml 蒸馏水中溶解8g NaCl、 0.2g KC1、 1.44g Na2HPO^n 0.24g KH2P04，用HC1 调节pH值至7.4加水定容至1L，在1034xl05Pa下蒸气灭菌20min，室温保存。
具体实施方式
七十六本实施方式与具体实施方式
七十五为不同的是所 述多肽溶液中多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。其它步骤及参数与具体实施 方式七十五相同。
具体实施方式
七十七本实施方式中多孔组织工程支架的制备方法如下 一、将a-羟基酸在130。C、辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚合24h，然后溶 于三氯甲垸后用甲醇萃取(去除催化剂)，再在40。C条件下烘干得到聚合物；二、然后将步骤一得到的聚合物、二环己基碳二亚胺与N-羟基-琥珀酰亚胺按
1: 5: 5的摩尔比混合，对聚合物表面进行活化2h;三、将赖氨酸环化得到聚 赖氨酸，将聚赖氨酸与表面活化的聚合物加入二甲亚砜中，聚赖氨酸和表面活
化的聚合物总质量与二甲亚砜质量比为1~2: 6~5,常温震荡2~5h后放置去离 子水中，混匀过滤，冻干得到共聚物(梳状共聚物)；四、将共聚物放入模具 型腔中，再加入致孔剂，在60 18(TC、 10MPa条件下模压成型10min，然后 冷却到室温，用蒸馏水洗涤5次(去除致孔剂)，再用液氮冻干；即得到孔隙 率为92.5% 98.5°/。(体积)、孔径为200 250pm的多孔组织工程支架；其中步 骤一所述的a-羟基酸为羟基乙酸，步骤三氨基酸占共聚物总质量的7%;步骤 四中致孔剂为氯化钠，致孔剂与共聚物的质量比为4 9: 1。
本实施方式步骤三得到的梳状共聚物重均分子量为50， 000-100， 000。
将本实施方式的多孔组织工程支架植入脊髓半离断后的小鼠体内，30天 后进行组织观察(见图1)，移植处无明显炎症反应，组织和细胞长势良好，由 此可见本发明的多孔组织工程支架的细胞相容性良好，并对神经细胞生长具有 明显的接触诱导作用。
具体实施方式
七十八本实施方式与具体实施方式
七十七不同的是步骤 一中a-羟基酸为乳酸。其它步骤及参数与具体实施方式
七十七相同。
具体实施方式
七十九本实施方式与具体实施方式
七十七不同的是步骤
一中a-羟基酸为乳酸和羟基乙酸的混合物，乳酸和羟基乙酸摩尔比为8:2。其 它步骤及参数与具体实施方式
七十七相同。
具体实施方式
八十本实施方式与具体实施方式
七十七不同的是步骤四 按下述反应完成将共聚物溶于三氯甲垸中配成质量浓度为5% 30%的溶液， 再加入NaCl，超声振荡至均匀后浇铸于圆柱型模具内，室温中放置24小时， 然后在4(TC条件下干燥24小时，得到孔隙率为92.5%~98.5% (体积)、孔径 为200~250pm的多孔组织工程支架。其它步骤及参数与具体实施方式
七十七 相同。
具体实施方式
八十一本实施与具体实施方式
八十不同的是步骤四中采 用片状模具。其它步骤及参数与具体实施方式
八十相同。
具体实施方式
八十二本实施方式与具体实施方式
八十不同的是在步骤四之后还可按下述步骤在共聚物接枝多肽先进行紫外消毒，然后放入PBS
溶液中，再加入交联剂，在室温下放置12 48h;取出后放入浓度为lg/L多肽 溶液中，在室温下放置12 48h即完成在共聚物表面接枝多肽；其中所述的交 联剂为Sulfo-LC-SPDP 〔磺基琥珀酰-2-吡啶二硫-3,丙酰氨基6-己酸盐， Sulfosuccinimidyl 6-(3'國[2-pyridyldithio]曙propionamido)hexanoate〕， 交联齐ll用量 是PBS溶液质量的3%~10%，所述的多肽溶液是由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD)干粉与PBS溶液配制的。其它步骤及参数与具体实施方式
八十相同。
本实施方式接枝的RGD可以促进受体介导的细胞被固有黏附蛋白受体特 异性结合，在生物材料表面自发形成单分子层，为与受体介导的细胞提供了位 点，进而促进细胞的黏附、伸展。
具体实施方式
八十三本实施方式与具体实施方式
八十二不同的是步骤 四是按下述步骤进行的将共聚物放入模具型腔中，再加入致孔剂，在 60~180°C、 10MPa条件下模压成型10min，然后冷却到室温，用蒸馏水洗涤5 次(去除致孔剂)，再冻干。其它步骤及参数与具体实施方式
八十二相同。
具体实施方式
八十四本实施方式与具体实施方式
八十三不同的是步骤 一中a-羟基酸为乳酸。其它步骤及参数与具体实施方式
八十三相同。
具体实施方式
八十五本实施方式与具体实施方式
八十不同的是步骤四 中，加入致孔剂的同时还加入粒径为100jim 250^im的海藻酸转微球，海藻酸 钙微球占步骤三共聚物总质量的20%。其它步骤及参数与具体实施方式
八十相 同。
具体实施方式
八十六本实施方式与具体实施方式
八十四不同的是步骤
四中乙醚替代三氯甲垸，加入致孔剂的同时还加入粒径为100^im 250^im的海 藻酸钙微球和骨生长因子，海藻酸钙微球占步骤三共聚物总质量的20%，骨生 长因子占步骤三共聚物总质量的5%。其它步骤及参数与具体实施方式
八十四 相同。
权利要求
1、多孔组织工程支架，其特征在于多孔组织工程支架主要由α-羟基酸和氨基酸的共聚物和致孔剂制成，多孔组织工程支架的孔隙率为92.5％～98.5％(体积)、孔径为200～250μm，所述的α-羟基酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的2％～40％，所述致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4～9∶1。
2、 根据权利要求1所述的多孔组织工程支架，其特征在于多孔组织工程 支架还包括活性粒子和/或生长因子；其中活性粒子占共聚物总质量的 5%~30%，所述的活性粒子为明胶、胶原、葡聚糖、透明质酸、甲壳素、壳聚 糖、海藻酸盐、羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几种的混合；生长因子占 共聚物总质量的0.5%~10%,所述的生长因子为骨生长因子、表皮生长因子、 类胰岛素生长因子、神经生长因子中的一种或其中几种的混合。
3、 根据权利要求1或2所述的多孔组织工程支架，其特征在于共聚物表面接枝有多肽。
4 根据权利要求3所述的多孔组织工程支架，其特征在于所述的多肽为精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
5、 多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于多孔组织工程支架的制备 方法如下a、将a-羟基酸与氨基酸在110 130。C及辛酸亚锡的催化下进行熔 融本体聚合24h，然后溶于三氯甲垸后用甲醇萃取，再在35 45。C条件下烘干， 得到共聚物；b、将共聚物溶于三氯甲垸或乙醚中配成质量浓度为5% 30%的 溶液，再加入致孔剂，超声振荡至均匀后浇铸于模具型腔内，在室温中放置 24h 48h，然后在35 45"C条件下干燥24h 48h;即制得孔隙率为92.5%~98.5°/0(体积)、孔径为200-250^im的多孔组织工程支架；其中步骤a所述的a-羟基 酸是乳酸和/或羟基乙酸，氨基酸占共聚物的2%~40%;步骤b所述的致孔剂 为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4 9: 1。
6、 根据权利要求5所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于步 骤b还能按下述步骤进行将共聚物放入模具型腔内，再加入致孔剂，然后在 160~180°C、压力为8MPa 15MPa条件下模压成型10min 20min，再冷却到室 温，用蒸馏水洗涤4至8次，再冻干即可。
7、 根据权利要求5所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于在 步骤b中加入致孔剂的同时再加入活性粒子和/或生长因子，其中活性粒子占 步骤&共聚物总质量的5% 30%;所述的活性粒子为明胶、胶原；葡聚糖、透 明质酸、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、羟基磷灰石、珊瑚礁中的一种或其中几 种的混合；生长因子占步骤3共聚物总质量的0.5%~10%;所述的生长因子为 骨生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、神经生长因子中的一种或其 中几种的混合。
8、 根据权利要求5、 6或7所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征 在于在步骤b之后按下述步骤在共聚物表面接枝多肽，具体操作如下先进行 紫外消毒，然后放入PBS溶液中，再加入交联剂，在室温下放置12h 48h;取 出后放入浓度为lg/L多肽溶液中，在室温下放置10h 15h即完成在共聚物表 面接枝多肽；其中所述的交联剂为Sulfo-LC-SPDP，交联剂用量是PBS溶液质 量的3%~10%，所述的多肽溶液是由多肽干粉与PBS溶液配制的。
9、 根据权利要求8所述的多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于所 述的多肽为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
10、 多孔组织工程支架的制备方法，其特征在于多孔组织工程支架的制备 方法如下 一、将a-羟基酸在110 13(TC、辛酸亚锡的催化下进行熔融本体聚 合24h,然后溶于三氯甲垸后用甲醇萃取，再在35。C 45"C条件下烘干得到聚 合物；二、然后将步骤一得到的聚合物、二环己基碳二亚胺与N-羟基-琥珀酰 亚胺按l:. 5: 5的摩尔比混合，对聚合物表面进行活化l~9h;三、将氨基酸 环化得到聚氨基酸，将聚氨基酸与表面活化的聚合物加入二甲亚砜中，聚氨基 酸和表面活化的聚合物总质量与二甲亚砜质量比为1~2: 6~5，常温震荡2 5h后放置去离子水中，混匀后过滤，冻干得到共聚物；四、将共聚物溶于三氯甲 烷或乙醚中配成质量浓度为5%~30%的溶液，再加入致孔剂，超声振荡至均匀 后浇铸于模具型腔内，室温中放置24~48h，然后在35 45"C条件下干燥24 48h， 得到孔隙率为92.5%~98.5%(体积)、孔径为200~250pm的多孔组织工程支架； 其中步骤三所述的a-羟基酸是乳酸和域羟基乙酸，氨基酸占共聚物总质量的 2%~40%;步骤四中致孔剂为氯化钠或蔗糖，致孔剂与共聚物的质量比为4 9: 1。
全文摘要
多孔组织工程支架及其制备方法，本发明涉及组织工程支架及其制备方法。本发明解决了现有组织工程支架与细胞相容性差的问题。本发明多孔组织工程支架主要由α-羟基酸和氨基酸的共聚物和致孔剂制成；本发明的方法如下将α-羟基酸和氨基酸制成聚合物；模压或浇铸成型即可。本发明多孔组织工程支架与细胞相容性好。本发明的方法工艺简单，便于操作。
文档编号A61F2/82GK101524556SQ20091007175
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者刘丽莉, 伟 蔡 申请人:哈尔滨工业大学