专利名称：一种构建组织工程皮肤的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建组织工程皮肤的方法。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，它由三部分即表皮层、真皮层和皮下层构成。表皮层位于皮肤的最外层，厚度介于0.06-0.8mm之间，其微结构由基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层构成。角质层是表皮细胞分化的最后产物，其组成中75%-80%为蛋白质，5%-15%为脂类，由10-15层细胞构成厚度大约10pm的结构。角质层有着许多重要的生理功能，能够有效阻挡外界毒性化合物对皮肤活性细胞的损伤，特别是对化妆品成分中潜在可能产生的细胞毒性有着极为重要的屏障作用。
组织工程皮肤经历了从表皮替代物、真皮替代物到双层结构的组织工程皮肤替代物的阶段，其基础研究和应用研究有了广泛的进步。应用研究涉及体内应用和体外应用，体内应用集中在各种皮肤创伤的治疗，体外主要运用于化合物的毒性检测，如化合物的腐蚀性、刺激性、光毒性、生殖毒性等的检测。体外毒性检测方面，欧洲替代方法验证中心(ECVAM)主导的对各种动物替代方法进行的验证工作是一项系统工程，引起了世界范围的关注。以组织工程皮肤为例，进行的化合物腐蚀性检测目前只有EpiDerm和EpiSkin两种产品通过验证，刺激性检测目前仅有EpiSkin通过了验证。通过验证的组织工程皮肤产品数量之所以如此少，很大程度上是因为构建的组织工程皮肤与天然皮肤在结构上相差甚远所致。因为结构的不成熟，造成检测化合物对活性细胞产生的毒性与其本身体内产生毒性的数据不符，导致误判率偏高，不能达到在功能检测上要求的预测精确度。
目前，有关提高组织工程皮肤与天然皮肤在结构上的相似性的研究较多，众多研究均有力的证实组织工程皮肤构建过程中的种子细胞与生物支架之间的相互作用对组织工程皮肤的结构有着极为重要的影响。因此，在选择生物支架材料上的一个基本原则是尽可能的接近或者模拟天然皮肤的细胞外基质。而天然皮肤的真皮层主要是由成纤维细胞构成的，其细胞外基质也主要由成纤维细胞分泌得来。所以，培养的成纤维细胞所分泌的细胞外基质在组成和结构上与天然皮肤非常类似。利用这种自分泌细胞外基质构建的组织工程皮肤在结构上更接近天然皮肤的结构，在化合物毒性预测的精确度和灵敏度上必然进一步提高。经检索，有关利用自分泌细胞外基质构建组织工程皮肤的方法，至今尚未见有技术文献公开。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用自分泌细胞外基质构建组织工程皮肤的方法。
一种构建组织工程皮肤的方法，在所述构建方法中，釆用成纤维细胞的自分泌细胞外基质作为组织工程皮肤的生物支架。
本发明的方法，具体包括以下步骤-
(1) 将插入式细胞培养皿放入细胞培养孔板中，将1~10乂105个人源成纤维细胞与l~3mL细胞培养液充分混合，得细胞悬液，将该细胞悬液滴加到插入式细胞培养皿，在37'C，5%0)2培养箱中培养10 30天，每周换液两次，得成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物；
(2) 将步骤(1)得到的成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物浸泡在无菌PBS中，在37°C， 5%<302培养箱中培养48h，使成纤维细胞饥饿而死亡，得不含活细胞的自分泌细胞外基质；
(3) 将歩骤(2)得到的不含活细胞的自分泌细胞外基质紫外线照射0.5 5h;
(4) 在歩骤(3)处理后的基质上面添加l~10X105/mL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养lh后，添加培养液3 5mL，继续培养5天，得到组织工程皮肤雏形；将所得到的组织工程皮肤维形进行气液面培养10 20天结束，即获得利用自分泌细胞外基质构建的组织工程皮肤。
根据本发明的方法构建组织工程皮肤，利用培养的成纤维细胞所分泌的细胞外基质作为生物支架，人源表皮细胞作为种子细胞，培养得到的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，利于提高化合物毒性的预测灵敏度和精确度。
本发明的方法具有以下优点 一是方法简便，所有材料均以液体形式，便于产品的合成和规模生产；二是获得的产品具有更接近天然皮肤的结构，利于提高化合物毒性的预测灵敏度和精确度；三是产品不含有另外添加的生物材料，不会出现人畜共患病交叉感染的风险；四是获得的产品便于质量控制，縮小批次之间变异。
具体实施例方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述-
实施例1:
一种利用自分泌细胞外基质构建组织工程皮肤的方法，包括以下步骤
(1)将插入式细胞培养皿放入细胞培养孔板中，将1乂105个人源成纤维细胞与lmL细胞培养液充分混合，得细胞悬液，将该细胞悬液滴加到插入式细胞培养皿，在37'C， 5%C02培养箱中培养10天，每周换液两次，得成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物；
(2) 将步骤(1)得到的成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物浸泡在无菌PBS中，在37°C， 5%(302培养箱中培养48h，使成纤维细胞饥饿而死亡，得不含活细胞的自分泌细胞外基质；
(3) 将歩骤(2)得到的不含活细胞的自分泌细胞外基质紫外线照射lh;
(4) 在步骤(3)处理后的基质上面添加1X10VmL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养lh后，添加培养液3 5mL，继续培养5天，得到组织工程皮肤雏形；将所得到的组织工程皮肤雏形进行气液面培养10~20天结束，即获得利用自分泌细胞外基质构建的组织工程皮肤。
实施例2:
一种利用自分泌细胞外基质构建组织工程皮肤的方法，包括以下步骤(1 )将插入式细胞培养皿放入细胞培养孔板中，将5 X 105个人源成纤维细胞与2mL细胞培养液充分混合，得细胞悬液，将该细胞悬液滴加到插入式细胞培养皿，在37'C， 5%C02培养箱中培养20天，每周换液两次，得成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物；
(2) 将步骤(1)得到的成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物浸泡在无菌PBS中，在37°C， 5。/。C02培养箱中培养48h，使成纤维细胞饥饿而死亡，得不含活细胞的自分泌细胞外基质；
(3) 将步骤(2)得到的不含活细胞的自分泌细胞外基质紫外线照射3h;
(4) 在步骤(3)处理后的基质上面添加5X105/mL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养lh后，添加培养液3 5mL，继续培养5天，得到组织工程皮肤雏形；将所得到的组织工程皮肤雏形进行气液面培养10~20天结束，即获得利用自分泌细胞外基质构建的组织工程皮肤。、
实施例3:
一种利用自分泌细胞外基质构建组织工程皮肤的方法，包括以下步骤(1)将插入式细胞培养皿放入细胞培养孔板中，将10X 105个人源成纤维细胞与3mL细胞培养液充分混合，得细胞悬液，将该细胞悬液滴加到插入式细胞培养皿，在37°C，
55%<:02培养箱中培养30天，每周换液两次，得成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复
合物；
(2) 将步骤(1)得到的成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物浸泡在无菌PBS中，在 37°C， 5%(:02培养箱中培养48h，使成纤维细胞饥饿而死亡，得不含活细胞的自分泌 细胞外基质；
(3) 将步骤(2)得到的不含活细胞的自分泌细胞外基质紫外线照射5h;
(4) 在步骤(3)处理后的基质上面添加10X 105/mL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养lh 后，添加培养液3 5mL，继续培养5天，得到组织工程皮肤雏形；将所得到的组织工 程皮肤雏形进行气液面培养10 20天结束，即获得利用自分泌细胞外基质构建的组织 工程皮肤。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作 出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1、一种构建组织工程皮肤的方法，其特征在于在所述构建方法中，采用成纤维细胞的自分泌细胞外基质作为组织工程皮肤的生物支架。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 将插入式细胞培养皿放入细胞培养孔板中，将l-10Xl()S个人源成纤维细胞与1 3mL 细胞培养液充分混合，得细胞悬液，将该细胞悬液滴加到插入式细胞培养皿，在37'C， 5%<302培养箱中培养10 30天，每周换液两次，得成纤维细胞与自分泌细胞外基质的 复合物；(2) 将步骤(1)得到的成纤维细胞与自分泌细胞外基质的复合物浸泡在无菌PBS中，在 37°C， 5%<302培养箱中培养48h，使成纤维细胞饥饿而死亡，得不含活细胞的自分泌 细胞外基质；(3) 将步骤(2)得到的不含活细胞的自分泌细胞外基质紫外线照射0.5 5h;(4) 在步骤(3)处理后的基质上面添加l~10X105/mL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养 lh后，添加培养液3 5mL，继续培养5天，得到组织工程皮肤雏形；将所得到的组织 工程皮肤雏形进行气液面培养10-20天结束，即获得利用自分泌细胞外基质构建的组 织工程皮肤。
3、 权利要求1或2所述的方法构建的组织工程皮肤。
全文摘要
一种构建组织工程皮肤的方法，在所述构建方法中，采用成纤维细胞的自分泌细胞外基质作为组织工程皮肤的生物支架。本发明利用培养的成纤维细胞所分泌的细胞外基质作为生物支架，人源表皮细胞作为种子细胞，培养得到的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构；本发明的方法具有以下优点一是方法简便，所有材料均以液体形式，便于产品的合成和规模生产；二是获得的产品具有更接近天然皮肤的结构，利于提高化合物毒性的预测灵敏度和精确度；三是产品不含有另外添加的生物材料，不会出现人畜共患病交叉感染的风险；四是获得的产品便于质量控制，缩小批次之间变异。
文档编号A61L27/60GK101485905SQ20091007835
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者杨晓冉, 王军兵, 艳 程, 董益阳, 邹运动, 郑洪艳 申请人:中国检验检疫科学研究院