专利名称：海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物酶工业保存领域，特别是涉及均一、稳定、高活性的海洋微
生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法。
背景技术：
浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖地球表面积的71%，海水总量占地球 总水量97%，尚未被利用的海洋与海岸的有效面积比陆地大5-10倍。海洋微生物是 海洋生物的重要成员。
海洋的生态环境十分独特，包罗了高盐、高压、低温(尤其是深海)、低光照、寡 营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境。来自海洋的微生物都是适应了 极端环境的极端微生物，往往能产生不同于陆地来源的分子结构新颖独特的新活性 物质，而且其活性一般大大超过陆栖微生物。海洋微生物所产生的酶例如海洋溶菌 酶具有一些较之相应的陆生动、植物和微生物产生的酶更为独特的性质，如在低温 条件下具有相对高的活力，最适pH和反应温度适中，作用pH范围宽，在碱性环境 下稳定等，这些结构和功能新颖的酶类具有独特的生理、药理及生化活性，在医药、 食品和酶工业等领域中有着广阔的应用前景和开发潜力。
在过去，生物工程和食品加工业用溶菌酶，都是从蛋清中分离获得。鸡蛋清溶 菌酶最适作用温度为5(TC，在室温下活性较低，制成各种酶制剂具体表现产品生物 活性低，易失活，要保存在低温下，这给运输储存带来诸多问题，能耗高，成本高， 价格昂贵。例如美国Sigma公司及丹麦sanoyo公司已溶菌酶结晶出售，价格昂贵6000 美元/Kg。
由中国水产科学研究院黄海水产研究所开发一种新的海洋微生物溶菌酶，海洋 微生物溶菌酶(Marine MicroorganismLysozyme)是一种新型的海洋微生物酶，来自海 洋微生物，具有嗜低温、抗氧化作用及溶菌谱广等优点。这种结构和功能新颖的酶 类具有独特的生理、药理及生化活性，在医药、食品和酶工业等领域中有着广阔的
应用前景和开发潜力。但目前，关键的问题在于如何得到一个稳定而高活性的酶制 剂。
在生物药品领域，冷冻干燥技术是一项极为重要的制剂工艺。据文献报道，约 有14%的抗生素类药品、92%的生物大分子类药品、52%其它生物制剂需要冻干。在生物药品冷冻干燥过程是将含水药品冻结成固态后，在低温、真空状态下，使其 中的水分升华或解吸排除，以达到药品能长期保存的一种方法，对提高医药工业技 术水平具有特殊重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足之处，在已开发具有独特生理、药理 及生化活性的新的海洋微生物溶菌酶基础上，开发提供一种稳定、活性高的海洋微 生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法。
本发明提供的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，包括下列步骤 ①预冻
将浓度为0.1-0.9mol/L，优选为0.3-0.7mol/L，更优选为0. 5 mol/L的二糖，例 如麦芽糖、蔗糖或海藻糖，优选为海藻糖，与质量浓度为0. 5-25g/L，优选为15-25 g/L，更优选为20 g/L的吐温80 (聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯或聚氧乙烯山 梨糖醇酐单油酸酯)等体积于预冷容器中混合，再以体积比(上述混合液与溶菌酶 溶液体积比)为1: 1加入海洋微生物溶菌酶溶液(简称溶菌酶溶液)，混合均匀后 于预冻温度-70 -90'C，优选为-80'C进行预冻，预冻时间3 5小时，优选3小时； ②二级冷冻升华干燥
将步骤①预冻物料转移至冷冻干燥机的筛盘中，于冷冻室内进行初级冷冻升华 干燥，初级冷冻升华干燥温度为-40至-50°C，优选为-45°C,真空压力为10-15Pa， 优选为13Pa，冷冻时间25至35小时，优选为30小时，使物料中水份直接升华至基 本上完全升华后转入次级冷冻升华干燥，在次级冷冻升华干燥中，使温度在5-8小 时，优选6小时内以0.2'C/分的加热速度由-40至-5(TC升至2(TC，压力保持不变， 冷冻升华干燥后得到海洋微生物溶菌酶保护冻干粉，然后于4'C保存贮放。
按照本发明提供的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法中，所述海洋微生物 溶菌酶由中国水产科学研究院黄海水产研究所从东海海域底泥中分离得到的芽孢杆 菌S-12高产海洋微生物溶菌酶菌株，现已由此菌株(200410097081.8)生产出售各 种含量浓度的海洋微生物溶菌酶溶液。该海洋微生物溶菌酶SDS-PAGE电泳确定该酶 的分子量为17. lkD;等点聚焦电泳得到该酶等电点为8. 55;其最适作用pH为8. 0， 最适作用温度为35°C;具有嗜低温、抗氧化作用及溶菌谱广等特点，比活达 3987. 7u/mg;海洋微生物溶菌酶与其他来源溶菌酶基本性质有较大不同的优异特征，如动物溶菌酶的分子量一般在14. 0 kD-20. 5 kD，植物溶菌酶的分子量一般在25. 0 kD-28. 0 kD，微生物溶菌酶13. 0 kD-93. 0 kD，以上溶菌酶的最适温度一般在50 °C-70 °C之间，海洋微生物溶菌酶为35'C。动植物溶菌酶的最适pH偏酸，微生物来源的 溶菌酶最适pH范围较广，等电点基本上都在8.0以上。海洋微生物溶菌酶最适作用 pH偏碱性。
由于海洋微生物溶菌酶具有许多特殊的性质，使其在医药、食品工业及生物高 新技术等领域的应用有着独特优势。
本方法中采用二糖与吐温80组成的复合保护剂，其中所述复合保护剂中二糖 为麦芽糖、蔗糖、或海藻糖，优选为海藻糖，在保护冻干粉中浓度为0. 1-0.9mol/L， 优选为0. 3-0. 7 mol/L，更优选为0. 5 mol/L。
三种糖对溶菌酶都有良好的冷冻保护效果，其中以海藻糖的效果最为显著，当 海藻糖浓度为0.5mol/L时，冷冻干燥后的溶菌酶活性维持在88%以上。海藻糖能替 代更多的水分子从而能在蛋白表面产生更多的氢键，从而在蛋白表面形成更加坚固 的海藻糖保护膜，有效防止了冷冻干燥过程中蛋白质的变性；另外，海藻糖比麦芽 糖、庶糖拥有更高的玻璃化温度，因此更容易形成碳水化合物玻璃体，更能使蛋白 质维持较低的泳动度，因此蛋白质的伸展和聚合作用受到抑制，从而达到维持其自 然的分子空间结构的目的。
所述吐温80是一个典型的非离子型表面活性剂，其特有疏水片段使其与蛋白表 面的疏水区域特异结合，从而避免冻干过程引起的蛋白聚合作用。吐温80表面的疏 水片段使其更容易与溶菌酶表面的疏水基团结合，从而保护溶菌酶免于伸展和聚合； 同时，吐温80能特异性地吸附于变性蛋白表面的疏水区，改变其局部的疏水作用和 表面张力，从而促进蛋白更好的解聚和折叠，维持其原有的空间结构。其浓度为 0.5-25g/L，当吐温80浓度为5 mg/ml时，复合保护的效果较单独使用海藻糖没有 明显提高；且同一吐温80浓度下，海藻糖浓度为0.5mol/L时，活性维持最高；当 吐温80浓度达到20rag/ml，海藻糖浓度为0. 5 mol/L时，冷冻保护效果最佳，活性 维持达到95%，比单独使用海藻糖提高了 7个百分点。
冻干样品中的水分残余对溶菌酶的活性维持及冻干赋型均会产生影响(于表1)。
表1
Sii 海藻糖 吐温80 海藻糖+吐温
80水分含量(％，12±0.8 5±0.4 7±0.5 3±0.2
w/w)
残余活性(％)69±2.9 86±1.2 82±1.8 93±1.5
表观结构 饼状 粉末 絮状 粉末
由表l可以得出无保护剂的溶菌酶冻干品水分含量维持在12± 0.8%，随着
保护剂的加入，其水分含量明显降低，残余活性明显提高。其原因可能与海藻糖替
代蛋白质表面的水分子以及吐温80的疏水作用有关。并且，水分含量的降低对于冻 干样品的结构也起到一定的影响，无保护剂时冻干样品集结形成饼状，随着海藻糖 和吐温80的加入，溶菌酶更容易形成松散的粉末状，这对储存都有重要的意义。
采用复合保护剂的冻干工艺下的溶菌酶在储存过程中的残余酶活均高于直接冻 干的溶菌酶；并且，固态下溶菌酶的稳定性均明显高于液态酶，同一条件下经过30
天的储存，固态酶比液态酶残余活性提高近20个百分点；在复合保护剂冻干条件下，
溶菌酶在4'C下经过30天的储存，活性丧失仅为6%;在25°。下经过30天的储存活 性丧失为8%，由此从经济性来说，冻干的溶菌酶可以直接于室温下密封储存，避免 了创造低温环境而带来的额外造价。
本发明的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法采用均有嗜低温、抗氧化作 用及溶菌谱广等诸多特殊性质的新的海洋微生物溶菌酶(高产海洋微生物溶菌酶的 芽孢杆菌S-12菌株)，复合保护剂及冻干工艺，使得到的保护冻干粉稳定、均一、 活性高、呈松散的粉末状，储存使用有重要意义。
采用复合保护剂二糖与吐温80，优其海藻糖的独特保护冻干方法，使保护冻干 粉中水份含量大大降低，海洋微生物溶菌酶活性维持达到95%，不单独使用海藻糖 提高了7个百分点，溶菌酶稳定性明显高于液态酶，在4'C储存30天，活性丧失仅 6%， 25i:保存30天活性丧失为8%，所以保护冻干粉可直接于室温下密封保存，无需 低温环境保存运输，保存方便，节省大量额外造价，给后来制造剂大大降低成本。
具体实施方案
本发明将用于下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于 下列实施例。 实施例1
将浓度为0.5mol/L的海藻糖，与质量浓度为20g/L的吐温80于预冷容器中等体积混合，再以体积比(上述混合液与溶菌酶溶液体积比)为l: l加入海洋微生物溶 菌酶溶液，混合均匀后于预冻3小时；海洋微生物溶菌酶溶液浓度100g/L;
将上述预冻物料转移至冷冻干燥机的筛盘中，于冷冻室内进行初级冷冻升华干
燥，初级冷冻升华干燥温度为-45'C，真空压力为13Pa，冷冻时间30小时，使物料 中水份直接升华至基本上完全升华后转入次级冷冻升华干燥，在次级冷冻升华干燥 中，使温度在5-8小时内以0.2'C/分的加热速度由-45'C升至20。C，压力保持不变， 冷冻升华干燥后得到海洋微生物溶菌酶保护冻干粉。
实施例2-3
冷冻干燥步骤相同于实施例1，不同是由麦芽糖及蔗糖分别代替海藻糖，分别得 到麦芽糖-吐温80及蔗糖-吐温80复合保护剂的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉。
实施例4、步骤相同于实施例l，不同是海藻糖摩尔浓度为0.7mol/L，海洋微生物溶 菌酶溶液50g/L。
权利要求
1.一种海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，其特征在于包括下列步骤①预冻将浓度为0.1-0.9mol/L的二糖，与质量浓度为0.5-25g/L的聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯或聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯等体积于预冷容器中混合，再以上述混合液与海洋微生物溶菌酶溶液体积比为1∶1加入海洋微生物溶菌酶溶液，混合均匀后于预冻温度-70～-90℃进行预冻，预冻时间3～5小时；其中海洋微生物溶菌酶溶液浓度为50～100g/L；②二级冷冻升华干燥将步骤①预冻物料转移至冷冻干燥机的筛盘中，于冷冻室内进行初级冷冻升华干燥，初级冷冻升华干燥温度为-40至-50℃，真空压力为10-15Pa，冷冻时间25至35小时，使物料中水份直接升华至基本上完全升华后转入次级冷冻升华干燥，在次级冷冻升华干燥中，使温度在5-8小时内以0.2℃/分的加热速度由-40至-50℃升至20℃，压力保持不变，冷冻升华干燥后得到海洋微生物溶菌酶保护冻干粉。
2. 根据权利要求1的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，其特征在于步 骤O中所述二糖为麦芽糖、蔗糖或海藻糖，其浓度为0. 3-0. 7mol/L;所述聚氧乙烯 山梨糖醇酐单油酸酯或聚环氧乙垸失水山梨糖醇单油酸酯的质量浓度为15-25g/L; 预冻温度-8(TC，预冻时间3小时；步骤(2)中初级冷冻升华干燥温度为-45'C，真空压力为13Pa，冷冻时间30小时 次级冷冻升华干燥使温度在6小时内以0.2'C/分的加热速度由-40至-5(TC升至20 。C。
3. 根据权利要求2的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，其特征在于所 述二糖为海藻糖，其浓度为0. 5 mol/L，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或聚环氧乙垸 失水山梨糖醇单油酸酯的质量浓度为20g/L。
4. 根据权利要求1-3任一海洋微生物溶齒酶保护冻干粉的制造方法得到的海洋 微生物溶菌酶保护冻干粉。
全文摘要
本发明涉及海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，包括将二糖与吐温80的复合保护剂与海洋微生物溶菌酶按特定浓度和一定体积比于预冷容器中混合均匀于-70～-90℃预冷冻3-5小时，然后于冷冻干燥机的冷冻室内进行初级和次级冷冻干燥得保护冻干粉。该方法得到稳定、均一、活性高、运输储存(室温)极方便、成本低的保护冻干方法，可用于制造各种各样的海洋微生物溶菌酶制剂。
文档编号A61K47/34GK101642572SQ20091009167
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者刘均忠, 谧 孙, 王跃军, 纪存鹏, 媛 郑, 郝建华 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所