一种治疗肿瘤的药物及其应用的制作方法

专利名称：一种治疗肿瘤的药物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有生物活性和代谢稳定性的含有血管内皮抑制素的 复合物和缓释制剂以及它的制备方法'本发明还提供含有这种血管内皮抑 制素复合物和緩释制剂的药物组合物以及含有这种血管内皮抑制素复合物 的试剂盒。本发明还提供使用本发明中的血管内皮抑制素复合物、緩释制 剂、药物纽合和试剂盒来预防、诊断、治疗肝瘤，及制备抗肿瘤药物的方 法。
背景技术：
新生血管形成是指新的毛细血管在原有的血管上的生成。肿瘤的生长和 迁移依赖于新生血管的生成，将肿瘤中的微血管内皮细胞作为癌症治疗的 靶点为治疗肿瘤提供了 一种治疗方式(Folkman J. N Engl J Med 1971; 285:182-186)。
血管内皮抑制素(Endostatin)是胶原XVDI羧基端的一段分子量大小为20 kDa的酶切产物。1997年美国哈佛大学Judah Fo!kman教授等人在血管内皮 瘤细胞的培养基中发现此蛋白，它具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移，和 体内血管生成的活性。进一步实验发现重组血管内皮抑制素可以抑制老鼠 体内多种胂瘤的生长、转移，甚至能完全治愈肿瘤，而且不产生耐药性。 其发挥活性的机理在于它通过抑制血管内皮细胞的生长，抑制了肿瘤组织 附近的新生血管的生成，使得肿瘤组织得不到生长所必需的大量营养和氧 气，最后停止生长或坏死(Folkman丄et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。通过基因工程制备的重组人血管内皮抑制 素可以作为肿瘤治疗药物，其临床试-睑表明它可以有效的抑制肝瘤生长。 在中国，以非小细胞肺癌为主要适应症的临床试验表明它对于肿谢的治疗 效果比较突出。
发明概述多肽和蛋白质类药物相比于化学药具有毒副作用小，不产生耐药性等优 点。为了达到最高的体内活性，提高生物利用度，减少药物体内降解，通 常蛋白药物采用静脉给药方式。但是对于分子量小的蛋白来说，通常静脉 给药以后的体内半衰期4艮短。除了体内的蛋白降解过程以外， 一个重要的 方面是小分子蛋白能够通过肾过滤的途径从体内很快的被消除。在血液中，
水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66,000道尔顿(66 kDa)的蛋白通 常可以稳定的保留在循环系统中.但是小分子却会通过肾小球过滤被很快 的从血液中消除。所以，为了维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度， 需要进行频繁的注射或点滴。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是 却给病人带来了严重的不便与痛苦，提高了用药成本，对某些药物长期的 使用还有可能产生一些副作用，例如免疫反应。
作为蛋白药物的血管内皮抑制素同样存在半衰期短，体内清除率高的缺 点。目前的临床用药手段主要为频繁的静脉注射或点滴，通常为每天给药， 而且需要长期用药，这使得病人的精神和经济负担都比较大。本发明的目 的就在于改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和较长的体 内半衰期，甚至具有更高疗效，从而达到可以减少用药频率，降低用药成 本，减轻病人的经济负担的目的。
用高分子聚合物对蛋白进行修饰，它是改变和控制药物的动力学特性如 半衰期、免疫学特征、毒理特性的常用方法。用来修饰蛋白的高分子聚合 物具有水溶性好、生物相容性好、无或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇 (polyethyleneglycol, PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。聚乙二醇 分子具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂，具 有无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA、 中国SFDA在内的很多国家的药品管理机构批准的可用于药物制备的高分 子。将蛋白质与亲水性的高分子如聚乙二醇偶联，可增加蛋白稳定性、减 少非特异性吸附和抗原性。当偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏 的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法(Frokjaer S. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 2005 Apr 4(4): 298-306; Harris JM. et al, Nat. Rev. Drug Discov. 2003 Mar 2(3): 214-21)。最初的聚乙二醇修饰都是以氨基作为反应位 点，主要包括蛋白的N端a-氨基和赖氨酸残基侧链上的s-氨基。这一类反 应的产物是一个蛋白分子与一个或多个PEG分子偶联。对于赖氨酸残基侧链e-氨基上的修饰也往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。 目前，针对蛋白N端a-氨基和赖氨酸残基侧链e-氨基的等电点差异，又新 开发出了只针对蛋白N端修饰的聚乙二醇修"饰试剂，^使得修饰位点一致， 修饰产物组成均一.另一种可用于聚乙二醇修饰的蛋白位点是半胱氨酸的 巯基。由于巯基在蛋白中的数目通常少于氨基，所以这类修饰的位点更加 特异。利用基因工程技术，现在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作为特 异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性， 因为对某些本身带有半胱氨酸的蛋白可能会造成二硫键的错配或无法复 性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(Veronese FM et al. Drug Discov. Today. 2005 Nov 1;10(21):1451-8.)。聚乙二醇修饰技术已经成功地运 用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)(Graham ML Adv. Drug Ddiv. Rev. 55， 1293—1302 Avramis Vassilios I. et al. W09939732 and US6689762)、 PEG-腺酐脱氨酶(PEG-adenosine deaminase)( Levy Y et al. J. Pediatr. 113， 312—317; Davis S et al. ClinExp. Immunol, 46: 649-652; Hershfield MS et al. N Engl J Med 316: 589-596)和PEG-干扰素(PEG-interferon a2a、 PEG-interferon a2b等)(Bailon P et al. C. Bioconjug. Chem. 12， 195—202， Wang YS et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54， 547—570, Meng Xiantai et al. WO2005077421, Van Vlasselaer Peter et al. WO2004076474, Ballon Pascal Sebastian et al. US2004030101, Karasiewicz Robert etal.EP0593868)等等。
其他代表性的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二 酸和丙二酸的共聚物、羧曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚l，3-乙二醇次甲 基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。
将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到 增加蛋白分子量的目的，是另一种延长药用半衰期的方法，例如用免疫球 蛋白的Fc片段和目的蛋白偶联以延长其半衰期，例如将此方法用在Notch 1 受体蛋白(Kitajewsky Jan et al. WO2005U1072)、促红细胞生成素(EPO) (Gillies Stephen D et al. WO2005063808)、人生长激素(Kim Young Min et al. WO2005047337)等蛋白上。血浆白蛋白也是一种常用的偶联载体，可以运 用在抗生素类，消炎类，抗氧化物等蛋白上(EzrinAlanMetal. WO0117568, Otagiri Masaki et al. EP1571212)。
10对于某些血液栽体蛋白除了在体外将其与药物蛋白偶联在一起外，还可 以先将蛋白药物在体外进行修饰，使之具有化学反应的活性或是对体内其 他分子具有较高的亲和力，能够在进入体内以后和血液某些成分进行反应， 形成半衰期较长的大分子或是复合物。 一个实例是将此技术运用在抗病毒
的小肽分子anti-RSV上，将其修饰上带有马来酰亚胺的活性基团，它可以 和血液蛋白或是细月包表面蛋白中的巯基反应(Bridon Dominique P et al. WO0069卯2)。另一个实例是利用酰化反应，在蛋白表面的氨基酸残基上引 入脂肪酸，增加蛋白对体内白蛋白的亲和力，使得蛋白进入血液后可以和 白蛋白形成较大的复合物，从而达到延长半衰期的目的，这一方法曾用于 长效胰岛素上(Kurtzhals P et al. Biochem. J. (1995) 312, 725-731; Frokjaer S et al. Nat Rev Drug Discov. 2005 Apr;4(4):298-306)。
另一种延长蛋白体内半衰期的方法是将蛋白做成緩释剂型。将蛋白药物 放入一种药用栽体中，使得蛋白从栽体中緩慢释放，在体内维持一种稳定 的药物浓度。常用的方法有水凝胶、微胶囊、微球、微型渗透泵、脂质体 等(Peppas NA et al. Eur.丄Pharm. Bioph咖.50， 27~46 (2000); Packhaeuser CB et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58， 445~455 (2004); Metselaar JM et al. Mini Rev. Med. Chem. 4， 319~329 (2002))。脂质体是一种具有双层膜结构的空球形 态的超显微粒子。该双层膜由两亲分子多为磷脂构成并有水性的内腔。将 亲水性的蛋白药物包裹在脂质体的内腔中，在体内緩'It释放，可以维持蛋 白的血药浓度，达到增加半衰期的作用， 一些实例包括用在神经生长因子 (Hou Xinpu et al. CN1616087)、血红蛋白(Farmer Martha C et al. US4911929) 等。
本发明结合现有的一些主要药物修饰技术，提供一种具有较长半衰期的 血管内皮抑制素产品，其在保持抑制血管生成的活性的同时，比未修饰的 血管内皮抑制素在代谢上具有更高的稳定性和更长的体内半衰期，本发明 中的血管内皮抑制素优选人血管内皮抑制素。
本发明的一个具体实施方案涉及一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复 合物。血管内皮抑制素与修饰物通过共价键相连，或是通过非共价键相互 作用形成稳定的复合物。修饰物可以是通过化学偶联的方法连接到血管内 皮抑制素上的，也可以是通过融合表达的方式和血管内皮抑制素连接到一 起的。优选的方案中这种修饰是位点特异性的，不会影响血管内皮抑制素的生物活性，例如与受体的结合。该修饰产物具有抗新生血管生成的活性 但相比于未修饰的血管内皮抑制素在代谢上更稳定，具有更长的血液半衰 期，可以作为抗新生血管生成或抗肿瘤的药物。用于修饰的分子可以是一 种或多种生物相容，能增加血管内皮抑制素的血液半表期的高分于聚合物、 蛋白质分子或其片段、肽链、或者是其他任何形式的化学物质。
这里的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以没有生物活性。 合适的聚合物包括，但不仅限于聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚乙烯
吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-幾丙基-甲基 丙烯酰胺(N- (2-Hydroxypropyiymethacrylamide)、多聚糖类、聚氧乙基多醇 (polyoxyethylatedpolyol)、肝素或肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚 烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺 (a，P-Poly ((2勿droxyethyl)"DL-aspartamide))、 聚羧酸月旨(polycarboxylates)、 氧化乙烯和曱醛的共聚物(poly oxyethylene"oxymethylenes)、聚丙烯酰吗啉 (polyacryloyl morpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、 聚环氧化物(polyoxiranes)、乙二酸与丙二酸的共聚物、聚1,3-乙二醇次甲基 醚、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。
上述的聚烯醇类化合物包括，但不仅限于聚乙二醇(包括单甲基聚乙二 醇、单羟基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及它们的衍 生物。在一个优选的方案中，修饰物是聚乙二醇， 一个更优选的方案中， 聚乙二醇选用单甲基聚乙二醇。
上述的聚醚类化合物包括，但不仅限于聚烷撑二醇(HO((CH2)xO)。H)、聚
丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)等以及它们
的4汙生物。
上述的聚氨基酸包括，但不仅限于同种氨基酸的聚合物，两种或两种以 上的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸。
上述的多聚糖类包括，但不仅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚 糖、纤维素及纤维素的衍生物(包括曱基纤维素和羧曱基纤维素)、淀粉 及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
这里适合用作修饰栽体的蛋白分子优选天然存在的蛋白或是其片段，包 括但不仅限于甲状腺结合蛋白(thyroxine-binding protein )、转甲状腺蛋白 (transthyretin)、转铁蛋白(transferring纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它们的片段。上述的栽体蛋白优选为人源的。上述蛋白的片段是 指任何比该蛋白小但是保持了栽体功能的部分。
血管内皮抑制素与上述修饰物直接或间接共价相连，直接连接指的是血 管内皮抑制素的某一个氨基酸和栽体蛋白的某一氨基酸直接相连，可以通 过肽键或二石克键。间接相连指的血管内皮抑制素和载体蛋白通过一定的化 学基团或几个基团的组合连接。
本发明的一个具体实施方案涉及聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素，其特 征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个聚乙二醇分子偶联。偶联的位
点是蛋白的N端a-氨基、赖氨酸残基側链的e-氨基、半胱氨酸的巯基、天 冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一种或是他们的组合。 所有用于偶联的聚乙二醇分子可以是线性的，也可以是分叉的，分子量位 于1,000到100,000道尔顿之间，优选5,000到40,000道尔顿。本发明中所 述的聚乙二醇的分子量是指大约的平均的分子量. 一个优选的方案是用聚 乙二醇特异的修饰血管内皮抑制素N端的a-氨基，形成单一位点修饰的产 物。
本发明的一个具体实施方案涉及血管内皮抑制素和蛋白或肽链的偶联， 其特征为血管内皮抑制素与 一个或多个蛋白或肽链直接或间接相连，当与 多个栽体蛋白相连时，所选的栽体蛋白之间可以相同也可以是不同的。其 中的栽体蛋白优选天然存在的蛋白或是其片段。 一个优选的方案中用于修 饰的栽体蛋白为人血清白蛋白或其片段，在另一个优选的方案中的栽体蛋 白为人免疫球蛋白IgG的Fc片段.
本发明的另 一个具体实施方案中的修饰物为小分子或是小肽或是其他化 合物，其特征为能使含有内皮抑制素的复合物具有和血液某些成分反应的 能力或是和血液某些成分有较强的亲和力. 一种具体化的产物是它具有一 个反应活性的基团，可以和血液成分的氨基、羟基、巯基反应形成共价鍵， 另一个具体化产物的活性基团是一个马来酰亚胺，它可以和血液蛋白，例
如白蛋白中的巯基反应.另一个具体化产物是具有和血液某些成分，例如 白蛋白、免疫球蛋白等有较强的亲和力，可以与之形成一种更大的复合体。 本发明的另一个具体实施方案中的复合物，是其他小分子或是小肽修饰 的血管内皮抑制素，可以是血管内皮抑制素被糖基化、磷酸化、酰基化等 后的产物。其中修饰的位点可以是原来蛋白序列中存在的氨基酸，也可以是通过突变产生的氨基酸残基。该复合物虽然没有很大的分子量，但是因 为修饰改变了血管内皮抑制素的性质从而延长了其半衰期。
本发明的另一个具体的实施方案涉及一种含有内皮抑制素的复合物，它 是由血管内皮抑制素和其他分子通过非共价键形成的具有特定组成的复合 物分子，其中的修饰物可以是蛋白，小分子等。该复合物具有抑制血管生 成的活性，并且在体内有比血管内皮抑制素更长的半衰期。
本发明的另 一个具体的实施方案涉及一种含有血管内皮抑制素的緩释制 刑，它是由血管内皮抑制素或上迷的任一复合物和生物相容的物质形成的。 该组合物中的血管内皮抑制素仍然具有生物活性，但是却可以依靠该载体 改变药物代谢特征达到延长体内保留时间的目的。所述的緩释制剂为但不 仅限于微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵、脂质体等。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物或緩释制剂与药学 上可接受的栽体形成的药物组合物。本发明还提供一种上述含有血管内皮 抑制素的复合物或緩释制剂和使用说明组成的试剂盒。
本文4吏用的药学上可接受的栽体包括对于以所用剂量和浓度与其接触的 细胞或哺乳动物无毒的药用上可接受的栽体、赋形剂、或稳定剂。通常生
理学上可接受的栽体是含水的pH緩冲溶液。生理学上可接受的栽体的例子 包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有;f几酸在内的緩冲液；包括抗坏血酸 在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明 胶、或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖、二糖和 包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘 露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如TWEEN^、聚乙二 醇(PEG)、和？0;110> 05*等非离子表面活性剂.赋形剂优选是无菌的且一 般不含不良物质.这些组合物可通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌.
本发明还涉及到制备上述血管内皮抑制素产品的方法。特别的，制备聚 乙二醇^^饰的血管内皮抑制素的方法，即将活化的聚乙二醇与血管内皮抑
制素混合，在适当的溶液、温度、pH、摩尔比下反应，并用阳离子柱或是 分子筛纯化偶联产物.其中反应的pH优选pH 3-10之间。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制剂、药物 组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途。本方法适合的癌症包说明书第8/19页
括但不仅限于肺癌、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、 口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、 肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤等.
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、药物组合物或緩 释制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制剂、药物 组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗其他疾病和制备治疗这些疾病的药物 中的用途，所述疾病的特征为但不限于新生血管异常生成而导致人的组织 或器官病变。
在上述的治疗肿瘤或其他疾病的用途中，其中的给药方式选自静脉注射、 静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮吸收、皮下包埋、肝动 脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道 给药或其他临床给药方式.
本发明还提供一种延长血管内皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含将 修饰物与血管内皮抑制素形成复合物的步骤和制备含有血管内皮抑制素的 緩释制剂的步骤。
实验表明，本发明中的一个产品聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端 偶联的复合物，具有抑制血管内皮细胞迁移和小鼠肿瘤生长的活性，与未 修饰的人血管内皮抑制素相比，活性明显提高，并且体内药代学研究表明 修饰产物能有效的减緩药物在体内的代谢，延长体内半衰期.
本发明中提到的血管内皮抑制素，除了特别说明以外，其来源可以是人， 鼠，或其他哺乳动物，其中的优选方案是人血管内皮抑制素.发明中提到 的血管内皮抑制素，除特殊说明以外，包括野生型的血管内皮抑制素，即 体内自然存在的形式，或是其具有活性的突变体、片^:、异构体、衍生物 等或是它们的組合.血管内皮抑制素的来源可以是但不仅限于动物细胞表 达的，也可以是从酵母或大肠肝菌中发酵純化而来的。其中来源于动物细 胞表达的野生型的人血管内皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示； 来源于酵母表达的重组人血管抑制素具有SEQ ID NO.l的序列，或是在此 序列的N端有IO个氨基酸以内的增加或缺失；来源于大肠肝菌表达的重组 人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.2的序列，但其N末端的Met在表达后 有时会-皮部分删除，若此情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内
15皮抑制素将具有SEQIDNO.l的序列。
血管内皮抑制素的突变体指的是通过氨基酸的取代、缺失、增加而得到 的血管内皮抑制素分子。血管内皮抑制素的片段是指序列属于SEQ ID NO.l 或SEQ ID NO.2的任何更小的部分，可以是但不限于通过酶切得到的，或 是基因工程表达的，或是通过多肽合成的方法得到的。例如具有SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO.5序列的片段曾被报道具有抑制小鼠实体 瘤的活性(Cattaneo MG et al. Experimental Cell Research 283 (2003) 230~236; Tjin Tham Sjin RM et al. Cancer Research (2005) 65(9) 3656-3663 )。血管内皮 抑制素的异构体是指具有和野生型血管内皮抑制素相同的氨基酸序列或分 子式，但是却有不一样的构象，包括蛋白二级或三级结构的不同或是局部 氨基酸旋光性的改变，异构体的来源可以是天然存在的突变或是通过人为 设计而得到的.血管内皮抑制素的衍生物是指在野生型血管内皮抑制素的 基础上进行修饰的产物，其中的修饰是指在蛋白上共价连接一个或多个其 他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是20个氨基酸以内的小肽链，连 接位点可以是蛋白内的任意一个氨基酸.在一个优选的方案中，可以是N 端附加一段9个氨基酸组成的含有His-tag的肽链MGGSHHHHH的人血管 内皮抑制素，其具有SEQ ID N0.6的序歹'J (Luo Yongzhang et al. US2004110671)，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met在表达后有时会被部 分删除。血管内皮抑制素具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物的组 合是指同时具有两种或两种以上上述特征的变化的产物，例如但不仅限于 片段的突变体、突变体的修饰产物等.
附围说明


图1:显示野生型人血管内皮抑制素的氨基酸序列SEQIDNO.l, 图2:显示一种大肠杆菌表达的野生型重组人血管内皮抑制素的氨基酸 序列SEQIDN0.2。这里N末端的Met在表达后有时会被部分删除'若此 情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内皮抑制素将具有SEQ ID NO.l的序列。
图3:显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQIDNO.3. 图4:显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQIDNO.4. 图5:显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQIDNO.5,图6:显示一种具有活性的N端附加氨基酸的重组人血管内皮抑制素 的氨基酸序列SEQ ID NO. 6。这里N末端的Met在表达后有时会被部分删 除.
图7: 20 kDa聚乙二醇与具有SEQ ID N0.2序列的重组人血管内皮抑 制素的N端的偶联。反应前后溶液用SDS-PAGE检测，泳道l: 20kDa聚 乙二醇修饰的血管内皮抑制素；泳道2:未修饰的血管内皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量标准.
图8: 20 kDa聚乙二醇与具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑 制素的N端的偶联。修饰前后溶液用SDS-PAGE检测，泳道1:未修饰血 管内皮抑制素；泳道2: 20kDa聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量标准.
图9: 20 kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮 抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化，使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯 化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道1:纯化前； 泳道2:上样穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脱液。
图10: 20kDa聚乙二醇修饰具有SEQIDNO.6序列的重组人血管内皮 抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化，使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯 化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果，泳道1:纯化前； 泳道2:上样穿透的溶液；泳道3 8:分布收集的洗脱液，
图11: 40kDa聚乙二醇修饰具有SEQIDNO.2序列的重组人血管内皮 抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化.使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯 化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道1:纯化前； 泳道2:上样穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脱液.
图12: 20kDa聚乙二醇与重组Ajk管内皮抑制素N端偶联的产物抑制 血管内皮细胞迁移的活性.SEQ2:具有SEQIDN0.2的血管内皮抑制素； PEG-SEQ 2: 20 kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.2的血管内皮抑制素； SEQ6:具有SEQIDNO,6的血管内皮抑制素；PEG-SEQ6: 20kDa聚乙二 醇修饰的具有SEQIDNO.6的血管内皮抑制素。
图13: 20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物抑制 小鼠S180肉瘤的活性.SEQ2:具有SEQ ID NO.2的血管内皮抑制素每天 给药；PEG-SEQ2-1: 20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQIDN0.2序列的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ 2-2: 20 kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID N0.2序列的血管内皮抑制素每两天给药；PEG-SEQ2-3: 20kDa聚乙二醇 修饰的具有SEQIDN0.2序列的血管内皮抑制素每三天给药；SEQ6:具有 SEQIDN0.6的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ6-1: 20kDa聚乙二醇 修饰的具有SEQIDN0.6序列的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ6-2: 20 kDa聚乙二醇^^饰的具有SEQ ID NO.6序列的血管内皮抑制素每两天给 药；PEG-SEQ6-3: 20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQIDN0.6序列的血管内 皮抑制素每三天给药。
图14: 20 kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮 抑制素赖氨酸残基侧链的e-氨基后用分子筛纯化，泳道1:上样；泳道2 10: 分布收集的洗脱液.
图15: 20kDa聚乙二醇修饰具有SEQIDN0.6序列的重组人血管内皮 抑制素赖氨酸残基侧链的e-氨基后用阳离子柱CM纯化。泳道l:上样；泳 道2:穿透；泳道3 8:分布收集的洗脱液。
具体实施例方式
实施例l、 20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端的偶联。
本实施例涉及的重組人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重组人血管内皮抑制素，具体实施方式
为将重组人血管内皮 抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸钠溶液中。用紫外分光光度计在280 nm 波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2 mg/ml。与20 kDa的特异修饰 蛋白N端的聚乙二醇偶联时，取20ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg)，加 入20 kDa聚乙二醇固体80 mg，并室温搅拌，直到完全溶解，使得聚乙二 醇与血管内皮抑制素的摩尔比为2:1.加入还原剂CH3BNNa，浓度为20 mM，并最后调节溶液的pH值为5,室温静置10小时以后大于80%的血 管内皮抑制素被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与一个血管内皮抑制 素分子偶联，并且偶联的位点是血管内皮抑制素N端的a-氨基，少量血管 内皮抑制素会被非特异性的多位点修饰。这时反应液可直接用于上柱純化。 反应前后溶液电泳结果如附图7和8所示.
实施例2、 20 kDa聚乙二醇修饰重组AA管内皮抑制素N端后用阳离 子柱SP纯化.本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重组人血管内皮抑制素。
具体实施方式
为将20 kDa聚乙二 醇修饰的血管内皮抑制素用SP层析柱(Amersham)纯化。将反应后的混合 液调节pH为6,层析柱用含有10 mM磷酸盐，pH值为6.0的平衡緩冲液 平衡后上样。上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.0的洗脱 緩沖液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗 的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素、单修饰的血 管内皮抑制素、未修饰的血管内皮抑制素.根据280nm的紫外检测可以收 集不同的分离组分。純化结果如附图9和IO所示。
实施例3、 40kDa聚乙二酵与重组人血管内皮抑制素N端的偶联，
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重组人血管内皮抑制素.具体实施方式
为将重组人血管内皮 抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸钠溶液中。用紫外分光光度计在280 nm 波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2.5mg/m1.与40kDa的特异修饰 蛋白N端的聚乙二醇偶联时，取20 ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg),加 入40kDa聚乙二醇固体160mg,并室温搅拌，直到完全溶解，使得聚乙二 醇与血管内皮抑制素的摩尔比为2:1.加入还原剂CH3BNNa,浓度为20 mM，并最后调节溶液的pH值为5.室温静置10小时以后大于80%的血 管内皮抑制素被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与 一个血管内皮抑制 素分子偶联，并且偶联的位点是蛋白N端的a-氨基，少量血管内皮抑制素 会被非特异性的多位点修饰.这时反应液可直接用于上柱纯化。
实施例4、 40kDa聚乙二醉修饰重组人血管内皮抑制素N端后用阳离 子柱SP纯化.
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管内皮抑制素.具体实施方式
为将40kDa聚乙二 醇血管内皮抑制素偶联物用SP层析柱(Amersham)纯化.将反应后的混合 液调节pH为6.层析柱用含有10 mM磷酸盐，pH值为6.0的平衡緩沖液 平衡后上样。上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.0的洗脱 緩冲液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗 的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素、单修饰的血 管内皮抑制素、未修饰的血管内皮抑制素.根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。具有SEQ ID N0.2序列的重组人血管内皮抑制素纯化 结果如附图11所示，具有SEQIDN0.6序列的纯化结果与SEQIDNO,2序 列的纯化结果类似，在此省略。
实施例5、 20 kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物 在血液中的长效效应。
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.6序列的重组人血管内皮抑制素.测量聚乙二醇修饰和未修饰的 重组人血管内皮抑制素在小鼠体内的半衰期来检验聚乙二醇修饰后的长效 效益。选用6只25g左右体重的健康昆明种小鼠，分为两组，每组3只， 分别尾静脉注射未修饰的重组人血管内皮抑制素和20 kDa聚乙二醇与重组 人血管内皮抑制素N端偶联的产物，剂量为15mg/kg体重。按照2、 10、 30分钟、1、 2、 4、 8、 16、 24、 36、 48、 72小时的时间间隔尾静脉取血. 收集血浆，用夹心法ELISA分别测血管内皮抑制素和聚乙二醇修饰的血管 内皮抑制素的浓度。体内药代动力学显示20 kD聚乙二醇修饰后，具有SEQ IDNO,2序列的重组人血管内皮抑制素在小鼠体内的半衰期从平均4.8小时 增加到平均16小时.具有犯QIDN0.6序列的重组人血管内皮抑制素经修 饰以后在小鼠体内的半衰期从平均7.5小时增加到平均16小时这表明偶联 高分子量的聚乙二醇能有效的增加重组人血管内皮抑制素的体内代谢的半 衰期，达到长效的目的.
实施例6、 20 kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物 抑制血管内皮细胞迁移的活性.
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.6序列的重组人血管内皮抑制素.具体实施方案为将人血管内皮细胞 (HMEC )在含10%血清的DMEM培养基中培养至对数生长期.然后饥饿 细胞12小时，将细胞用胰酶消化以后，加入测细胞迁移的Jtt中，每孔细 胞数10000个.迁移条件为DMEM培养基、1%血清、10ng/ml bFGF和双 抗，对于加药组分别加入血管内皮抑制.素和修饰后的血管内皮抑制素，浓 度为30ug/ml。 37。C培养8小时以后，取出小皿，用1%戊二醛固定细胞， 刮掉膜上层的未迁移细胞，用苏木精对下层细胞染色.最后在显微镜下， 取相同大小视野数细胞数，同一块皿中选取三个不同视野，最后算出抑制 率。结果显示具有SEQ ID NO,2序列的重组人血管内皮抑制素对细胞迁移的抑制率为42%, f斧饰后对细月包迁移的抑制率达到90%。具有SEQIDNO.6 序列的重组人血管内皮抑制素对细胞迁移的抑制率为45%,修饰后对细胞 迁移的抑制率达到88%。以上结果表明经过聚乙二醇修饰后的血管内皮抑 制素不仅保持而且还大大增强了生物活性。实验结果如图12所示。
实施例7、 20 kDa聚乙二酵与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物 在小鼠肿瘤模型治疗中的活性.
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQIDN0.6序列的重组人血管内皮抑制素。实验观察了 20kDa聚乙二醇 修饰的血管内皮抑制素对小鼠S180肿瘤的体内抑制活性。实验材料选用20 g体重的昆明小鼠，分别腋下接入S180肉瘤细胞，每只接入细胞数2xi06 个。第二天随机分组，每組8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)、阳性 对照组(血管内皮抑制素1.5mg/kg体重，每天给药)、三组给药组(聚乙 二醇修饰的血管内皮细胞1.5mg/kg体重，分别为每天，每两天，每三天给 药)。分组后开始给药，给药方式为尾静脉注射.给药周期为10天，第11 天处死小鼠，称瘤重，以抑瘤率来评价药效，计算方法为抑瘤率-(阴性 对照组瘤重-给药组瘤重)/阴性对照组瘤重x 100°/。.对于具有SEQ IDN0.2 序列的重组人血管内皮抑制素，实验结果显示阳性对照组的抑瘤率为 34%,给药組每天，每两天，每三天给药的抑瘤率分别为47%, 53%， 40%. 对于具有SEQ ID NO.6序列的N端附加氨基酸的重组人血管内皮抑制素， 实验结果显示阳性对照组的抑瘤率为40°/。，给药组每天，每两天，每三 天给药的抑瘤率分别为45%, 57°/。， 50%.表明修饰后的重组人血管内皮 抑制素具有体内的抑瘤活性，而且由于其体内代谢速度减慢，使得药效优 于未修饰的重组人血管内皮抑制素，并且在延长给药间隔的情况下仍能保 持药效优于未修饰的重组人血管内皮抑制素。实验结果如图13所示。
实施例8、 20kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基側 链的e-氨基。
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重组人血管内皮抑制素。
具体实施方式
为将重组人血管内皮 抑制素透析到pH 7.8的30 mM磷酸緩冲液中。用紫外分光光度计在280nm 波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2mg/ml。加入20kDa的修饰赖氨 酸残基侧链e-氨基的聚乙二醇分子，使得聚乙二醇分子与蛋白的摩尔比分别为8: 1。室温放置，重组人血管内皮抑制素能被较快的修饰，30分钟以 后80%的血管内皮抑制剂能被修饰，随着反应时间增长，修饰物产量增多， 但反应速度在1小时以后减慢。反应产物主要有单分子聚乙二醇修饰和多 分子聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素.这时反应液可直接用于上柱纯化，
实施例9、 20kDa聚乙二酵修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基側 链的s-氨基后用分子筛纯化.
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重组人血管内皮抑制素.具体实施方式
为将20 kDa聚乙二 醇血管内皮抑制素偶联物用分子筛纯化。将反应后的混合液调节pH为7.4, 层析柱用含有20 mM磷酸盐，100 mM氯化钠，pH值为7.4的平衡緩沖液 平衡后上样，根据280nrn的紫外检测可以收集不同的分离组分。具有SEQ ID N0.6序列的血管内皮抑制素的修饰产物的纯化结果如附图14所示。
实施例10、 20 kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基 側链的E-氨基后用离子柱纯化.
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.6序列的重组人血管内皮抑制素。
具体实施方式
为将20 kDa聚乙二 醇血管内皮抑制素偶联物用CM层析柱纯化。将反应后的混合液调节pH为 6.5。层析柱用含有10mM磷酸盐，pH值为6.5的平衡緩冲液平衡后上样。 上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.5的洗脱緩沖液梯度洗 脱.未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和沖洗的过程中出现， 洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素，单修饰的血管内皮抑制素， 未修饰的血管内皮抑制素.根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组 分.具有SEQ ID N0.6序列的血管内皮抑制素的修饰产物的纯化结果如附 图15所示.
22序列表
<160> 6
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens)
<400> 1
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn
1 5 10
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly 20 25
Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly 35 40
Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie 50 55 60
Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp 65 70 75
Pro Ser Ti:p Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly 85 90
Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val 100 105
Ala Asp 30
Thr Phe 45
15
Phe Gin Arg Als
Val Arg Arg Ala
Glu Leu
Pro Leu
Leu Phe 80
Lys Pro 95
Leu Arg His Pro 110
Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gljr Ser Asp Pro Asn Gly Arg
115 120
Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr 130 135
Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu 145 150
Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr 165
Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 2
125
Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser 140
Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin 155 160
lie Val Leu Cys lie Glu Asn 170 175<211〉 184 <212〉 PRT
<213〉 人(Homo sapiens) < 2
Met His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Uu His Leu Val Ala Uu 15 10 15
Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe 20 25 30
Gn Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg 35 40 45
Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg 50 55 60
Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu 65 70 75 80
Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys 85 90 95
Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe、sp Gly Lys Asp Val Leu Arg His 100 105 110
Pro Thr T卬Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly 115 120 125
Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp—Arg Thr Glu Ala Pro 130 135 M0
Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu Gly Gly Arg Uu Leu Gly 145 150 155 160
Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr lie Val Leu Cys'lie Glu 165 170 175
Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 3 <211> 44 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <400〉 3
Phe Glrv Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly 15 10 15Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala
20 25 30
Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe 35 40
<210〉 4 <211〉 45 <212> PRT
<213〉 人(Homo sapiens) <400〉 4
Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala 15 10 15
Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys 20 25 30
His His Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe 35 40 45
<210〉 5 <211〉 27 <212〉 PRT
<213〉 人(Homo sapiens) <400> 5
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 15 10 15
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg 20 25
<210> 6 <211> 192 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <德6
Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe Gin 15 10 15
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met 20 25 30Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala 35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Uu Ser Ser Arg Leu Gin 50 55 60
Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie 65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe 85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe 100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val 115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser 145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His 165 170 175
Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180 185 190
2权利要求
1.一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物，所述复合物具有比血管内皮抑制素更长的体内半衰期。
2. 权利要求l的复合物，所述修饰物与血管内皮抑制素通过共价 键连接。
3. 权利要求2的复合物，所述修饰物选自高分子聚合物、蛋白质 分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。
4. 权利要求3的复合物，所述高分子聚合物选自聚烯醇类化合 物、聚醚类化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸(包括聚丙氨酸)、 二乙烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺 (N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、葡聚糖及葡聚糖衍生物如疏酸 葡聚糖、纤维素及纤维素的衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、 淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、 肝素或肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇和其衍生 物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺 (a,P-Poly((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸月旨(polycarboxylates)、 氧化乙烯和甲醛的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯醜吗 淋(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透 明质酸，聚环氧化物(polyoxiranes)、乙二酸与丙二酸的共聚物、聚l， 3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环 糊精或其他药学上可接受的高分子聚合物。
5. 权利要求4的复合物，所迷聚醚类化合物选自聚烷撑二醇 (HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯 醇((CH2CHOH) J或它们的衍生物。
6. 权利要求4的复合物，所述聚烯醇类化合物选自聚乙二醇(包 括单甲基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁 烯醇或它们的衍生物。
7. 权利要求6的复合物，所述聚烯醇类化合物为聚乙二醇。
8. 权利要求7的复合物，所述聚乙二醇优选单甲基聚乙二醇。
9. 权利要求7或8的复合物，其特征为一个血管内皮抑制素分子 和一个或多个聚乙二醇分子偶联。
10. 权利要求7-9任一项的复合物，血管内皮抑制素与聚乙二 醇偶4笑的位点是血管内皮抑制素的N-末端oc-氨基、赖氨酸残基侧链 的s-氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷 氨酸残基侧链的羧基、C-末端羧基中的一种或是它们的組合。
11. 权利要求7-IO任一项的复合物，其特征为一个血管内皮抑 制素分予与一个聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管内皮抑制素N-末端的a-氨基。
12. 权利要求7-IO任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素 分子N-末端的a-氨基或野生型血管内皮抑制素75、 95、06、 117、 183位的赖氨酸残基侧链上的s-氨基或其组合。
13. 权利要求7-10任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素 分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联方法为在血管内皮抑制素 分子内部或其N-末端或C-末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽 链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸残基侧链上的巯基。
14. 权利要求7-10任一项的复合物，其特征为血管内皮抑制素 分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸残基侧链上的羧基或C-末端的羧基。
15. 权利要求7-14任一项的复合物，所述聚乙二醇分子是线性 的或是分叉的。
16. 权利要求7-14任一项的复合物，所述聚乙二醇分子的平均 分子量位于1,000到IOO，OOO道尔顿之间，优选5，000到40,000道尔顿 之间。
17. 权利要求3的复合物，所述蛋白选自血管内皮抑制素、白 蛋白、免疫球蛋白、甲状腺结合蛋白、转甲状腺蛋白、转铁蛋白、纤 维蛋白原或它们的片段及其组合。
18. 权利要求17的复合物，所述复合物是血管内皮抑制素和一 个或多个血管内皮抑制素偶联形成二聚体或多聚体，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法 得到的，其中的血管内皮抑制素优选人血管内皮抑制素或其片段。
19. 权利要求17的复合物，所述复合物是白蛋白偶联的血管内 皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个白蛋白偶 联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的， 或是通过其他方法得到的，其中的白蛋白优选人血清白蛋白或其片段。
20. 权利要求17的复合物，所述复合物是免疫球蛋白Fc片段 偶联的血管内皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或 多个免疫球蛋白Fc片段偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的， 或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的Fc片 段优选人免疫球蛋白IgG中的Fc区域的片段。
21. 权利要求3中的复合物，所述复合物是小分子或是小肽或 是其他化合物修饰的血管内皮抑制素，其特征是该复合物具有同体内 其他分子或成分反应或结合的活性，使得该聚合物可以在体内和其他 成分形成更大的复合物。
22. 权利要求20中的复合物，所述复合物带有具有反应活性的 基团，可以和血液成分的氨基、羟基、巯基反应形成共价键。
23. 权利要求21中的复合物，所迷具有反应活性的基团是马来 酰亚胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巯基反应。
24. 权利要求20中的复合物，和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有较强的亲和力，能相互形成更大的复合物。
25. 权利要求3中的复合物，所迷复合物是其他分子或是小肽 修饰的血管内皮抑制素，例如血管内皮抑制素被糖基化、磷酸化或酰 基化的产物，其中修饰的位点是原来蛋白序列中存在的氧基酸残基， 或是通过突变产生的氨基酸残基。
26. 权利要求l的复合物，所述修饰物与血管内皮抑制素通过 非共价键相互作用，该复合物具有特定的组成式，其中的修饰物可以 是蛋白、小分子或其他化学物质。
27. 血管内皮抑制素或4又利要求1 -26任一项的复合物和生物相容的物质形成的緩释制剂。
28. 权利要求27的緩释制剂，所述的緩释制剂选自微胶嚢、水 凝胶、徵球、微型渗透泵或脂质体。
29. 权利要求28的緩释制剂，其中所述的水凝胶包括 P(MAA-g-EG)水凝胶(由甲基丙烯酸methacrylic add (MAA)和 poly (ethylene glycol) ether monomethacryiate (PEGMA)组成)或由水溶性 聚合物chitosan与deacylated gellan gum组成的聚合物(DGG)形成的原 位(yn"to)水凝胶，且该种水凝胶可在生物体内緩慢降解。
30. 权利要求28的緩释制剂，其中所述的微胶嚢包括由纳米材 料及其他生物相容物组成的"f效胶囊，且该种微胶嚢可在生物体内緩慢
31. 权利要求28的緩释制剂，其中所述的微球包括由 poly(ethylene glycol) (PEG)和生物可降解聚合物如polylactide (PLA)、 polyglycolide (PGA) 、 PLGA、 poly(-capi:olactone) (PCL) 、 poly oi:tho esters (POE)或poly(ethylene terephthakte) (PET)以任意组合方式形成的原位(hs/fti)共聚物微球体，且该种微球体可在生物体内緩慢降解。
32. 权利要求1-26任一项中的复合物以及4又利要求27-31任一 项中的緩释制剂，其中血管内皮抑制素是人、鼠、或其他哺乳动物来 源的。
33. 权利要求1-26任一项中的复合物以及权利要求27-31任一 项中的緩释制剂，其中血管内皮抑制素是野生型的人血管内皮抑制 素，其天然形式具有SEQIDNO. l所示的序列。
34. 权利要求1-26任一项中的复合物以及4又利要求2"7-31任一 项中的緩释制剂，其中所述血管内皮抑制素当由大肠肝菌表达时，其 野生型的人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO. 2的序列，其中N末 端的Met在大肠肝菌表达时有时会被部分删除。
35. 权利要求1-26任一项中的复合物以及4又利要求27-31任一 项中的緩释制剂，其中血管内皮抑制素可以是血管内皮抑制素的具有 活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。
36. 权利要求35中的复合物或緩释制剂，其中血管内皮抑制素片,殳是具有SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、或SEQ ID NO. 5序列的肽链。
37. 权利要求35中的复合物或緩释制剂，其中血管内皮抑制素 衍生物是在野生型血管内皮抑制素的N端或C端附加一段长度为 1-15个氨基酸的肽链形成的。
38. 权利要求37中的复合物或緩释制剂，其中血管内皮抑制素 衍生物是在野生型人血管内皮抑制素的N端附加一段9个氦基酸组 成的含有His-tag的肽链MGGSHHHHH ，该衍生物具有SEQ ID No. 6 的序列，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。
39. 权利要求l-38中任一项的含有血管内皮抑制素的复合物或 緩释制剂与药学上可接受的载体形成的药物組合物。
40. 权利要求39的药物组合物，其中的药学上可接受的载体为 含水的pH緩冲溶液，包括磷酸盐、柠檬酸盐、或其他有机酸的緩冲 液、抗坏血酸或其他抗氧化剂，低分子量(不超过10个残基)多肽、血 清白蛋白、明胶、免疫球蛋白或其他蛋白质、聚乙烯吡咯烷酮或其他 亲水性多聚体、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或其 他氨基酸、单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖类、EDTA 或其他螯合荆、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、钠离子或其他成盐反离 子、TWEEN 、聚乙二醇(PEG)、 PLURONICS⑧或其他非离子表面 活性剂。
41. 一种试剂盒，其包含权利要求l-40的含有血管内皮抑制素 的复合物、緩释制剂或药物組合和使用说明。
42. —种试剂盒，其包含权利要求7-16的聚乙二醇修饰的血管 内皮抑制素和使用说明。
43. 制备权利要求7-16中的含有血管内皮抑制素的复合物的方 法，其特征是用活化的聚乙二醇与血管内皮抑制素混合，在适当的溶 液、温度、pH、摩尔比下反应。
44. 权利要求43的方法，其中pH为pH3-10。
45. 制备权利要求7-16中的含有血管内皮抑制素的复合物的方 法，其特征是将偶联产物用阳离子柱纯化。
46. 制备权利要求7-16中的含有血管内皮抑制素的复合物的方 法，其特征是将偶联产物用分子筛纯化.
47. 权利要求1-42的含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制齐'J、 药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途。
48. 4又利要求47的用途，所述肺瘤选自肺癌、神经内分泌瘤、 结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、 淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶 性黑色素胂瘤或其他胂瘤。
49. 权利要求1-42的含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制剂、 药物組合物或试剂盒在预防、it断或治疗其他疾病中的用途，所述疾 病的特征为新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变。
50. 权利要求47-49的用途，其中的给药方式选自静脉注射、 静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、 肝动脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给 药、阴道给药或其他临床给药方式。
51. 权利要求l-40的含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制剂 或药物組合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
52. 权利要求l-40的含有血管内皮抑制素的复合物、緩释制剂 或药物組合物在制备治疗其他疾病的药物中的用途，所述疾病的特征 为新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变。
53. —种延长血管内皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含将 修饰物与血管内皮抑制素形成复合物的步骤。
54. —种延长血管内皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含将 血管内皮抑制素或含有血管内皮抑制素的复合物与生物相容的物质 形成緩释制剂的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤药物及含有这种药物的药物组合物和试剂盒，同时也公开了制备这种抗肿瘤药物的方法。本发明中的抗肿瘤药物具有体内代谢的稳定性，可用于治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物。
文档编号A61K38/17GK101596320SQ20091013221
公开日2009年12月9日 申请日期2006年1月20日 优先权日2006年1月20日
发明者彦 付, 常国栋, 罗永章, 雷清新, 庆 韩 申请人:清华大学;北京普罗吉生物科技发展有限公司