专利名称：一种有抑菌、抗炎和止血作用的黎药提取物及组合物和其制备方法
技术领域：
本发明属于民族药领域，具体涉及一种黎药裸花紫珠提取物及组合物和制备方法 及其应用。
背景技术：
裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook. Et Arn.)，叶入药，其味微苦、濯，性平；有抗菌、止血、消炎解毒和散瘀消肿的功能，是我国黎族 同胞的一种常用药。国内外对紫珠属植物包括裸花紫珠化学成分研究的报道较少，其化学成分主要有 黄酮类、萜类和挥发油类等。目前技术是将裸花紫珠叶采用水煎煮提取的方法得到浸膏后 加入辅料制成片剂或者胶囊等口服制剂，用于治疗细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎， 呼吸道及消化道等腔道出血等症，疗效确切。但存在服用剂量大，有效成分不明确、质量标 准可控性差等缺点，难于满足药物“安全、有效、可控、稳定”的要求。目前，尽管有多种剂型 方便了患者的使用，但仅是简单的剂型转换，在技术上未有实质上的创新之处，尚不能用科 学的方法揭示其药效物质基础与作用机理，难于被国际市场所接受。
发明内容
为解决该成药存在的上述缺陷，本发明对裸花紫珠叶中的有效部位进行了提取。 并对该黎药提取物的化学成分进行了分析。实验表明，使用本发明方法所提取的裸花紫珠 叶活性提取物，具有止血、抑菌、抗炎的功效，且无毒副作用，该提取物对细菌感染引起的炎 症，急性传染性肝炎，子宫、阴道、呼吸道及消化道等腔道出血具有确切的疗效。因此，本发明目的之一在于，提供裸花紫珠叶的提取物，该提取物对细菌感 染引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸道及消化道出血具有治疗作用。该提取物主 要化学成分为5，4' - 二羟基-3，7，3'-三甲氧基黄酮(5，4' -dihydroxy-3, 7, 3 ‘ -trimethoxyflavone) ( I )、5_ 羟基 _3，7，3 ‘ ,4'-四甲氧基黄酮(5_hydroxy-3， 7,3 ‘，4 ‘ -tetramethoxyflavone) ( II )、木犀草素(Iuteolin) ( III )、木犀草 素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷(luteolin-7-Ο-β -D-glucopyranoside) ( IV )；香草酸 (vanillic acid) ( V )、ρ-香豆酸(p-coumaric acid) ( VI )、咖啡酸(caffeic acid) (ΥΠ )、阿魏酸(ferulic acid) ( VDI)、原儿茶酸(protocatechuic acid) ( IX )、原儿茶醛 (protocatechuicaldehyde) ( X )等，允许有少量杂质存在。其结构式分别为 5，4' - 二羟基_3，7，3'-三甲氧基黄酮 4f _四甲氧基黄酮(5,4 ‘ -dihydroxy-3,7,3 ‘ -trimethoxyflavone) 4' -tetramethoxyflavone) 木犀草素(Iuteolin) 素-7-0-β-D-吡喃葡萄糖苷 香草酸(vanillicacid) (caffeic acid) 阿魏酸(ferulic acid) (protocatechuic aldehyde)
原儿茶酸(protocatechuic acid) 原儿茶酸该发明的另一目的是提供一种黎药提取物的制备方法。本发明是通过以下技术方案予以实施
本发明中所述的裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(Callicarpa nudifloraHook. Et Arn.)的叶。本发明的黎药提取物是通过以下步骤制成将裸花紫珠叶或经粉碎粉碎的叶，用溶剂提取法提取，提取液合并滤过后浓缩，得 粗提物。该粗提物使用吸附树脂进行柱色谱，首先以水为洗脱剂进行洗脱，浓缩、干燥，得水 洗脱部分，然后以醇为洗脱剂进行梯度洗脱，对所得醇洗脱液减压浓缩、干燥，得醇洗脱物， 即为本发明黎药裸花紫珠提取物。优选地，裸花紫珠叶用溶剂提取的次数为3次。每次提取时间为0. 5-3小时，提取 溶剂可以为水或一定浓度的乙醇。优选的水洗脱剂的用量为药材重量的10-20倍，优选醇洗脱剂的用量为药材重量 的10-30倍。更为优选地，本发明所述黎药提取物的制备方法包括以下步骤将裸花紫珠叶粉碎后，用溶剂提取3次，每次加入的溶剂用量为药材重量的10-20 倍，每次提取时间是3小时。提取液合并滤过，滤液减压浓缩，得到粗提物；将该粗提物用吸 附树脂进行柱色谱，先以10-20倍重量的水进行洗脱得水洗脱部分；之后再以10-30倍重 量的10%-90% (体积比)的醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩、干燥即 得本发明黎药提取物。洗脱溶剂为C1 C4的低级醇，最优选的为乙醇，浓度优选为30% 80% (体积比)。所用的吸附树脂为大孔吸附树脂，包括极性、中等极性至弱极性吸附树脂，如 D101、D101B、D312、DM130、DM131、LK002、XDA-l、XDA-lB、AB-8、ZTC-I 等型号大孔吸附树脂， 也可用类似性能的其他型号树脂。本发明采用的制备方法优点是，除掉了大量的水溶性杂质，从而提高活性，降低毒 性，使活性成分更加集中，方法科学稳定，工艺简单，适合工业化生产。本发明黎药提取物的止血、抗菌等活性通过下述动物药效学试验得到证明。1.通过对小鼠凝血时间影响，对上述提取物的止血活性进行评价1. 1试验材料裸花紫珠片(阳性对照药物，每片相当于生药材3. 68g)；水洗物(每克相当于生 药材7. 76g)；裸花紫珠提取物(每克相当于生药材10. 25g)。1. 2试验仪器分析电子天平(北京瑞利，精密度0. Img)、注射器、毛细玻璃管(内 径1mm、长IOcm)；载玻片、大头针；滤纸；秒表。1. 3试验动物昆明种小鼠1. 4试验方法对小鼠凝血时间的影响(毛细玻管法).在室温15°C下，取昆明种小白鼠，体重18_22g，雌雄各半，随机分为4组，每组10 只。随机分为空白、片剂、水洗物、裸花紫珠提取物，分别按0.5ml/20g灌胃给药，空白对照 组给与同体积盐水，1次/天，连续给药7天，末次给药后lh，小鼠夹固定，用内径Imm的毛细 玻璃管(或一次性定量取血管)插入小鼠内眦球后静脉丛取血，深约4-5mm，轻轻转动，再回 缩。自血液流入管内开始计时，血注满后取出毛细玻管平放于桌上，每隔30s从两端折断毛 细管一小段约0. 5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝，直至出现血凝丝为止，一旦出现血凝丝，从另一端折断进行验证，平均两端出现血凝丝的时间，即为凝血时间。所 历时间即为血凝时间。每组毛细管两端数据平均值即为该鼠的血凝时间，计算缩短率。结 果见表1。1. 5试验结果结果表明和空白对照组小鼠凝血时间相比，裸花紫珠片和水洗物、醇物组小鼠凝 血时间均有明显缩短(P <0.01)。凝血时间缩短依次为裸花紫珠提取物、水洗物。结果提 示水洗物、裸花紫珠提取物均能促进小鼠血液的凝固，又以裸花紫珠提取物的效果较好。观察结果见表1。表1 对小鼠凝血时间的影响 注:***P< 0. 012.通过采用纸片法测定抑菌圈，对上述提取物的抗菌活性进行评价2. 1试验材料2. 1. 1药物本发明所述粗提物(每克相当于生药材4. 27g)；水洗物(每克相当于 生药材7. 76g)；裸花紫珠提取物(每克相当于生药材10. 25g)。2. 1. 2菌种金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌，购自沈阳军区总医院药剂科药检室。2. 2试验仪器灭菌的滤纸、灭菌环、培养皿、游标卡尺、无菌镊子。2. 3 方法2. 3. 1菌液的制备分别刮取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的培养基斜面用 0. 9%的无菌氯化钠溶液稀释成105-106cfu/ml的菌液备用。2. 3. 2供试品溶液的制备每份样品分别按低浓度10mg/ml、中浓度50mg/ml、高浓 度100mg/ml加入无菌水或甲醇溶液备用。2. 3. 2试验方法采用纸片法测定抑菌圈。分别吸取上述2种菌液各1ml，加到平皿 中，然后加入培养基制成含菌平板，将灭菌的滤纸片分别浸入到以上三种浓度的供试品中 及灭菌水和甲醇中制成供试液组和空白对照组，然后用无菌镊子夹出平贴于含菌平板上， 每皿放滤纸片4片，分别为空白组、低、中、高浓度组，然后置37°C恒温培养箱中培养24小时 后观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈大小。2. 4抑菌圈大小以从滤纸片边缘开始计算，以毫米微单位，抑菌圈边缘距离滤纸片 边缘大于Imm即为有抑菌作用。试验结果见表2.
表2.各样品的抑菌结果 试验结果表2可以看出(1)裸花紫珠提取物对金黄色葡萄球菌敏感，其他样品均不敏感，裸花紫珠提取物 在中浓度时(50mg/ml)就显示抑菌作用。(2)裸花紫珠提取物对枯草芽孢杆菌敏感，其他样品均不敏感，裸花紫珠提取物在 高浓度(100mg/ml)时有抑菌作用。3.药物一次口服最大耐受量试验3. 1试验材料裸花紫珠粗提物、水洗物、裸花紫珠提取物3. 2试验仪器电子天平(北京瑞利，精密度0. Img)；3. 3试验动物健康昆明种小鼠，体重18_22g，购自广州实验动物中心，分4组，13 只/组，以清洁固体饲料饲养，自由饮水，实验前饲养2天，以适应实验环境。3. 4试验方法最大耐受量试验根据动物预试验结果提示该药毒性较低，无法测出半数致死量 (LD 50)，故对受试药物进行其最大耐受量(MTD)测定。取健康小鼠共52只，随机均勻分为 4组。实验前禁食不禁水12h。给药组以0.5ml/20g体重一次性灌胃给药，空白组用等量蒸 馏水灌胃，给药后24h内密切观察小鼠是否出现中毒反应，随后每天观察2次，直至10天结 束，观察期保证喂养条件不变，发现死亡小鼠及时剖检。3. 5试验结果3. 5. 1 一般反应给药后除空白对照组外，其它组小鼠出现轻度活动减少、闭眼倦 缩，个别表现来回走动，但无其他表现。3. 5. 2小鼠最大耐受量倍数2. 4g/20g X 50000g/30g = 200 (倍)3. 5. 3死亡情况表3实验中各组小数死亡情况(只) 3. 5. 4解剖对实验中途死亡的小鼠进行剖检，肉眼观察各主要脏器(心、肝、脾、 肺、肾、胃、肠、胸腺、睾丸、卵巢等)未见异常。3. 6 讨论实验结果表明当给药量为120g/kg(以生药材计)时，粗提物死亡2只，其余均未 见死亡。小鼠对粗提物的最大耐受量倍数小于200倍，而对水洗物和裸花紫珠提取物的最 大耐受量倍数均大于200倍，以上可看出水洗物和裸花紫珠提取物安全范围比粗提物大， 安全性较好。上述药理实验结果表明按本发明技术方案制得的黎药提取物(裸花紫珠提取 物)具有止血、抗菌的功能，且无毒副作用，对细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸 道及消化道出血有明显的治疗作用。此外，本发明的目的还在于提供一种黎药裸花紫珠提取物用于制备治疗细菌感染 引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸道及消化道出血的药物的应用。本发明的另一个中药组合物含有本发明所述的裸花紫珠提取物，以及可药用载 体。本发明药物组合物的制备方法包括，将本发明所述的黎药提取物与可药用载体混合。本 发明所述的药物组合物可以被制成片剂、胶囊剂、散剂和分散片等口服制剂。根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方 案，下述实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改 变和改进。这些改变和改进均应在本发明的保护范围之内。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例1裸花紫珠提取物的制备例将裸花紫珠叶粉碎后，用溶剂提取3次，每次加入的溶剂用量为药材量的10-20 倍，每次提取时间是3小时。提取液合并滤过，滤液减压浓缩，得到粗提物；将该粗提物进行 DlOl吸附树脂柱色谱，先以10倍量的水为洗脱剂进行洗脱得水洗脱部分；之后再以15倍 量的10% -90%的醇为洗脱剂进行梯度洗脱，收集醇洗部分洗脱液，减压浓缩、干燥即得醇 洗脱物，即为裸花紫珠的提取物。实施例2本发明药物组合物片剂制备的具体实施例。将实施例1所得的黎药提取物1份，加入0. 5-1份淀粉，混勻，制粒，干燥，整粒，加 入硬脂酸镁，压片，即得片剂。实施例3本发明药物组合物分散片的制备将实施例1所制得的黎药提取物1份，加入0. 5-1份的淀粉作稀释剂，加入0. 5-1 份的微晶纤维素作崩解剂，将上述混合物制粒(过20-12目)，烘干，加入适量硬脂酸镁作助 流剂，混合均勻后将粉末直接压制成片剂，即制得分散片。实施例4本发明药物组合物胶囊剂的制备将实施例1所制得的黎药提取物，喷雾干燥成干浸膏粉。干浸膏粉经粉碎，过 60-100目筛，取已过筛的该黎药提取物细粉1份，加入淀粉0. 01-6. 5份作为充填剂，加入 1-3%硬脂酸镁作助流剂，混合均勻后用空心胶囊充填，制得硬胶囊剂。实施例5本发明药物组合物散剂的制备
将实施例1所制得的黎药提取物，喷雾干燥成干浸膏粉。干浸膏粉经粉碎，过 60-100目筛，取已过筛的该黎药提取物细粉1份，加入可溶性淀粉1-10份，加入1-10%甜 蜜素，按等量递加混合法混合均勻，按容量法分剂量制得散剂。
权利要求
一种黎药裸花紫珠提取物，其特征是通过以下步骤制得(1)将裸花紫珠叶粉碎后，用溶剂提取法提取，提取液合并滤过浓缩，得粗提取物；(2)使用吸附树脂将所述粗提取物进行柱色谱，首先以水为洗脱剂进行洗脱，然后以醇为洗脱剂进行洗脱；(3)对所得醇洗脱液减压浓缩，干燥，即得裸花紫珠提取物。
2.按照权利要求1所述黎药裸花紫珠提取物，其特征在于所述步骤(1)中裸花紫珠 溶剂提取的次数为3次，每次提取时间为0. 5-3小时。
3.按照权利要求1所述黎药裸花紫珠提取物，其特征在于所述步骤(2)中使用水洗 脱剂的用量为药材重量的10-20倍，醇洗脱剂的用量为药材重量的10-30倍。
4.按照权利要求1-3任一项所得该黎药提取物含有以下化学成分5，4'-二羟 基_3，7，3'-三甲氧基黄酮、5-羟基_3，7，3'，4' _四甲氧基黄酮、木犀草素、木犀草 素-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、香草酸、ρ-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸和原儿茶醛等， 允许有少量杂质存在，其化学结构式分别为
5.一种黎药裸花紫珠提取物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)将裸花紫珠叶粉碎后，用溶剂提取法提取，提取液合并滤过浓缩，得粗提取物；(2)使用吸附树脂将所述粗提取物进行柱色谱，首先以水为洗脱剂进行洗脱，然后以醇 为洗脱剂进行洗脱；(3)对所得醇洗脱液减压浓缩，干燥，即得中药裸花紫珠提取物。
6.按照权利要求5的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中裸花紫珠溶剂提取的次 数为3次，每次提取时间为0. 5-3小时。
7.按照权利要求5的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中使用水洗脱剂的用量为 药材重量的10-20倍，醇洗脱剂的用量为药材重量的10-30倍。
8.含有权利要求1-7任一项所述的裸花紫珠提取物在制备治疗细菌感染引起的炎症， 急性传染性肝炎，子宫、阴道、呼吸道及消化道等腔道出血药物中的应用。
9.一种裸花紫珠组合物，含有权利要求1-4任一项所述黎药裸花紫珠提取物以及可药 用载体。
10.根据权利要求9的组合物，其特征在于将所述组合物制成片剂、胶囊剂、散剂和分 散片等口服制剂。
全文摘要
本发明提供了一种有抗菌、抗炎及止血作用的黎药裸花紫珠提取物及其制备方法以及含有该活性提取物的药物组合物。该提取物以及含有该提取物的药物组合物用于治疗细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸道及消化道等腔道出血，并且无毒副作用。用它可以制备成任何一种用来治疗细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎，子宫、阴道、呼吸道及消化道等腔道出血的口服制剂。
文档编号A61K127/00GK101890114SQ20091014277
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月23日 优先权日2009年5月23日
发明者刘明生, 张俊清, 张鹏威, 董琳 申请人:海南省南药黎药研究院