专利名称：旋毛虫与肿瘤相关抗原蛋白及其制备方法和医用用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了旋毛虫与肿瘤相关抗原蛋白及其制备方法，本发明还提供了该蛋 白的医用用途，属于生物制药领域。
背景技术：
旋毛虫是一种寄生于人和多种动物体内的线虫，近年来研究发现其具有较强的 抗肿瘤活性，但对其抗肿瘤活性成分尚不清楚。据报导恶性肿瘤细胞对异体鉴识物比 较敏感，异体抗原物所产生的免疫细胞对恶性肿瘤具有抵抗力。旋毛虫与肿瘤细胞相 关抗原能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应.
发明内容
本发明提供了旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原蛋白，为一种新的蛋白物质，具有医 药活性。
本发明还提供了该相关抗原蛋白的制备方法，适用于工业化生产。 本发明进一步公开了该蛋白的医用用途，用于制备治疗肿瘤的药物。 本发明公开的旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原蛋白，具有以下表证
分子量是33.211ku， pl是4.64，共由以下284个氨基酸组成
本发明相关抗原蛋白的制备方法如下
利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿 瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用超滤及透析技术对相关抗原进行分离得到抗原 蛋白。
下述的药理实验证实了本发明抗原蛋白具有显著的抑制肿瘤生长的作用，可以作 为制备抗肿瘤药物被应用。
旋毛虫与肿瘤相关抗原抗肿瘤效果
将18 22g的BalB/C小鼠随机分为活虫免疫组、ES抗原免疫组、相关抗原免疫组、佐剂免疫对照组，每组10只。将相关抗原与ES抗原各lOCmg (化gA4J加入等 量的弗氏完全佐剂乳化均匀，腹腔免疫。两周后，以8(^g(l^/叱)加入等体积的弗氏 不完全佐剂进行第二次腹腔免疫。在相关抗原与ES抗原组第一次免疫的同时，给活 虫免疫组小鼠按400条/只灌胃投服旋毛虫肌幼虫活虫。佐剂对照组则以佐剂加等量 的灭菌生理盐水进行首免和第二次免疫。按分组情况，第二次免疫后三天于小鼠的右 后肢皮下注射接种lX106个细胞/只。荷瘤30d后，颈椎脱臼处死各个实验组小鼠， 并进行肿瘤体积、重量等物理指标的测定以及CD3+、 CD4+、 CD8+、 CD19+等免疫指标的 检测。所有结果数据均利用SPSS 14.0 for Windows软件进行分析，检验差异显著性。
抗肿瘤试验结果 结果表明
活虫免疫组、粗抗原免疫组、ES抗原免疫组、相关抗原免疫组的体内平均抑瘤率 分别为50.53%， 36.95%， 44.49%， 45.34%。接种相关抗原实验组的瘤重显著低于空 白对照组(P〈0. 01),各组抗原的抗肿瘤情况见表1，表2)。方差分析，「=34. 265， p=0. 000， 表明各组瘤重有显著差异。LSD检验结果显示，活虫与相关抗原组抗瘤率没有显著差 异。
表1各种抗原对SP2/0骨髓瘤细胞荷瘤小鼠肿瘤重量的影响(x ±s，n=10)
组别数量肿瘤重量(g)抑瘤率(%)
佐剂105. 06±0. 089
ES抗原102. 83±0. 178*44. 14
相关抗原102. 766±0. 150*45. 35
鹏102. 53±0. 196*50. 07
P*<0. 001
表2各种抗原对SP/20骨髓瘤细胞荷瘤小鼠肿瘤体积的影响(S±s, n=10)
组别数量肿瘤重量(g)抑瘤率(%)
佐剂104. 216±0. 098
粗抗原102. 657±0. 253*36. 98
ES抗原102. 35±0. 035*44. 84
相关抗原102. 305±0. 165*45.33
激102. 108±0. 216*51. 00
P*〈0. 001本发明的积极效果在于肿瘤细胞对异体鉴识物比较敏感，旋毛虫与肿瘤细胞 相关抗原能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应，同时旋毛虫与肿瘤细胞相 关抗原易于制备和工业化。
图1旋毛虫肌幼虫总蛋白双向电泳图谱； 图2双向电泳后的免疫印迹。
图3 Western-blot鉴定旋毛虫与H印al-6肝癌细胞间相关抗原成分
具体实施方法-
实施例1
1. 旋毛虫与骨髓瘤细胞相关抗原确定
首先制备旋毛虫可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤细胞抗原并分别免疫BalB/C小鼠制 备两种抗原的阳性血清。按常规操作步骤包被旋毛虫可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤细胞 抗原并使其分别与SP2/0骨髓瘤细胞阳性血清、旋毛虫阳性血清、健康鼠血清反应， 酶标仪测得OD490值，以P/N》3为判定标准，ELISA结果显示旋毛虫肌幼虫抗原与 SP2/0骨髓瘤细胞抗体以及SP2/0骨髓瘤细胞抗原与旋毛虫抗体均具有较好的免疫交
叉反应，所获得的最佳抗体效价分别是骨髓瘤细胞高免血清l: 6 400;旋毛虫高免
血清l: 3 200，同时两种抗原都不与健康小鼠血清反应。
2. 旋毛虫与骨髓瘤细胞相关抗原蛋白氨基酸测定
提取旋毛虫肌幼虫总蛋白制备双向电泳上样蛋白。利用双向电泳起始试剂盒完成 等点聚焦过程，将聚焦好的胶条继续进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据同一块胶上的标 准分子量蛋白的电泳迁移率(Rf)，建立回归方程，进而求出各蛋白点的分子量。取 双向分离后的凝胶中的一块进行考染并脱色，其余凝胶与筛选好的旋毛虫阳性血清进 行免疫印迹杂交。严格参照免疫印迹结果，分别于三张凝胶上同时选取能够与骨髓瘤 细胞高免血清杂交的旋毛虫肌幼虫蛋白点，进行串联质谱分析。以Typsin酶解考染 样品，并用50%乙腈与0. P/。无水三氟乙酸(TFA)混合液提取肽段，并在N2流下吹干浓 縮。将完全干燥的肽段重新溶解于0.7叱，0.5g/L的a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA 溶齐l」，0. 1%TFA+50%ACN)溶液中，并将其全部点到192-well靶板上，室温下自然干燥， 采用正离子模式、反射式飞行时间方式检测，采用Myoglobin的标准胰蛋白酶酶解肽 段做外标校正，质量误差小于5X 10 — 5,加速电压20 kV，激光源为波长355 nm、脉冲 200 Hz的Nd:YAG固体紫外激光器。采集质谱(MS)图条件 一级质谱扫描范围1000
54000 /27/z,选择符合要求的离子作为母离子继续二级质谱，在上述各主要参数固定的 前提下，获得一系列串联质谱图。MALDI-TOF/TOF-MS得到的谱图用Applied Biosysteras公司的专用谱图处理软件Data Explorer 4. 5和4700Explorer 2. 0分析， 并运用MASCOT引擎检索数据库。数据库检索条件为肽谱、串级质谱图质量偏差分 别为0. 1和0. 5 Da，选择N端乙酰化修饰，电荷选择MALDI为+ 1。结果发现旋毛虫 肌幼虫总蛋白经pH3 10胶条等电聚焦和SDS-PAGE分离后，再经考马斯亮兰R-250 染色后得到二维图谱。蛋白点主要分布于pH4 7、分子量14 100ku的范围(如图l 所示)。通过IraageMaster5. 0软件分析，5张胶同一样本蛋白点匹配率91%，图谱重 复性很好。①通过自动点检测(Auto detection)获得蛋白质检测图；②利用背景扣 除(background duduction)消减部分背景条纹；③选取其中的一张凝胶作为参考凝 胶(refrence gel),其余图谱与之匹配，生成凝胶报告，并进行修正，从而在凝胶 报告中获得蛋白点的等电点、分子量、凝胶之间的点匹配率等信息。软件分析显示， 考染后的凝胶共有288±12个蛋白点。将双向电泳分离后的旋毛虫总蛋白与Sp2/0骨 髓瘤高免血清进行免疫杂交，得到了三种不同分子量和等电点的相关抗原蛋白。分别 是分子量为33ku、 pl是4. 6和6. 8的蛋白以及分子量为66 ku、 pl是6. 9的蛋白 (如图2所示)。经过飞行时间串联质谱分析，最终确定这种与骨髓瘤细胞相关的抗原 成分主要是旋毛虫的原肌球蛋白(Tr叩omyosin， TM)，其精确分子量是33. 211ku， pl 是4.64，共由284个氨基酸组成
实施例2
旋毛虫与肝癌细胞相关抗原确定
首先制备旋毛虫可溶性抗原和Hepal-6肝癌细胞抗原并分别免疫BalB/C小鼠制备 两种抗原的阳性血清。按常规操作步骤包被旋毛虫可溶性抗原和H印al-6肝癌细胞抗原 并使其分别与H印al-6肝癌细胞阳性血清、旋毛虫阳性血清、健康老鼠血清反应，酶 标仪测得0D490值，以P/N》3为判定标准，ELISA结果显示，旋毛虫与H印al-6肝癌 细胞之间存在相关抗原，所获得的交叉反应的最佳抗体效价分别是H印al-6肝癌细胞抗原免疫血清1:400;旋毛虫虫体抗原免疫血清1:800。旋毛虫可溶性粗抗原在20 130kDa蛋白分子量范围内存在可以与H印al-6肝癌细胞高免血清反应的蛋白条带，反 应条带的相对分子量为26. OkDa左右和130kDa。而H印al-6肝癌抗原在14. 4 94. OkDa 蛋白分子量范围内有可以与旋毛虫高免血清反应的蛋白条带，反应条带的相对分子量 为94. OkDa， 35. OkDa和14. 4kDa (如图3所示)。 实施例3
旋毛虫与乳腺癌细胞相关抗原确定
首先通过ELISA来确定旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞之间存在相关抗原，再进行 SDS-PAGE, Western-bloting确定其分子量.结果发现ELISA方法确定了旋毛虫抗原与 MCF-7乳腺癌细胞间存在能够产生免疫交叉反应的相关抗原；SDS-PAGE结果表明 MCF-7乳腺癌细胞抗原与旋毛虫抗原之间至少存在6条具有分子量相似的蛋白带 分别是6条具有分子量相似的蛋白带分别是66.2 90 (2条)、52、 45、 26 35 (2 条)kDa,其中最明显的是52、 45kDa的这两条蛋白带；Westem-bloting结果表明旋毛 虫可溶性抗原在23 97.4kDa蛋白分子量范围内可以与MCF-7乳腺癌细胞高免血清 反应，反应条带的相对分子量分别为97、 66、 42、 33、 23kDa，其中42kDa的抗原带 交叉免疫反应最强烈。
权利要求
1、一种旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原蛋白，其特征在于分子量是33.211ku，pI是4.64，其氨基酸序列为MDAIKKKMQAMKIEKDNAMDRADAAEEKARQQQERVEKLEEELRDTQKKMMQVENELDKAQEELTGANAQLEEKEKKVQEAEAEVAALNRRIQLLEEDFERAEERLIIATEKLGEASQTADESERVRKVMENRSLQDEERVYQLEAQLKEAQLLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAEAGENKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKALQREDSYEEQIRLLTQRLKEAETRAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVHEKEKYKAISEELDQTFQELSGY。
2.权利要求l所述抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤 利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用超滤及透析技术 对相关抗原进行分离得到抗原蛋白。
3.权利要求1所述抗原蛋白在制备治疗肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明提供了旋毛虫与肿瘤相关抗原蛋白及其制备方法，该抗原蛋白分子量是33.211ku，pI是4.64，共由284个氨基酸组成；旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应，同时旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原易于制备和工业化。本发明还提供了该蛋白用于制备治疗肿瘤的药物。
文档编号A61K39/00GK101671387SQ20091016377
公开日2010年3月17日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年12月31日
发明者宫鹏涛, 楠 张, 张景芝, 张西臣, 李建华, 举 杨 申请人:吉林大学