一种用于胃癌诊断的药物及其制备方法

专利名称：一种用于胃癌诊断的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于胃癌诊断的药物及其制备方法，该药物通过一个双功 能连接剂将放射性核素间接标记到单克隆抗体3H11 ，由于肿瘤细胞表面表达特 异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，使标记的抗体注入体内后浓聚于肿瘤 部位，通过核医学的单光子断层显像技术，对胃癌进行诊断。
背景技术：
肿瘤是危害人类生命和健康的主要疾病之一，如何进行早期诊断和治疗是 生物医学工作者长期以来不懈努力追求的目标。肿瘤细胞表面表达特异抗原， 单克隆抗体具有识别抗原的特异性，因而可以利用单克隆抗体诊断疾病。由于 放射性核素标记的单克隆抗体对肿瘤具有特异性和高亲和力，同时也由于抗体 工程技术的快速发展，近年来放射免疫显像成为肿瘤诊断的一个新的方法和手 段，并在临床上取得了引人注目的诊断效果。
中国专利97108618.4公开了一种抗人肝癌单克隆抗体HAbl8放射免疫诊断 剂，而国内外尚未有放射性核素通过间接法标记的用于胃癌诊断的药物。
3H11是我国研制的抗胃癌单克隆抗体，并用99mTc、 188Re和1311标记进行 了动物实验和临床研究。上述研究采用的标记方法均为直接标记法，由于在标 记过程中加入了还原剂或氧化剂，因此对抗体活性产生相对较大的影响。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于胃癌诊断的药物及其制备方法，该药物通 过一个双功能连接剂用放射性核素间接标记单克隆抗体3H11，使标记的抗体注 入体内后浓聚于肿瘤部位，通过核医学的单光子断层显像技术，对胃癌进行诊 断；通过间接标记法制备的药物既可减小对抗体活性的影响，又可增强放射性 药物的稳定性，同时提高肿瘤对放射性药物的摄取。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的 一种用于胃癌诊断的药物，包 括抗体及放射性核素，所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体 3H11为无色液体针剂。
一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下-
I 、将0.9 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液与5 浓度为 1.55xl(y2 mg/mL的S-HYNIC溶液加入反应管中，在避光(C条件下进行反应5 小时；该反应中S-HYNIC与单克隆抗体3H11的摩尔比为8:1;反应完成后获得 反应溶液；
II 、将所述反应溶液使用pH值为7.4、浓度为20 mM的柠檬酸缓冲液透析 处理2次，每次透析时间为8小时，所用柠檬酸缓冲液中含100 mM NaCl;将 经过2次透析处理后的所述反应液使用pH值为5.2、浓度为20 mM的柠檬酸缓 冲液再透析处理2次，每次透析时间为8小时，所用柠檬酸缓冲液中含100 mM NaCl，透析处理完成后，获得偶联物HYMC-3H11溶液；
III、 将0.2 mg浓度为3.0 mg/mL的所述偶联物HYNIC-3H11 、 20.0 mg浓度 为100.0 mg/mL的Tricine、 20.0昭浓度为3.0 mg/mL的SnCl2和1110 MBq的 Na"mTc04依次加入反应管中，室温反应30分钟；将反应物通过PD-10柱纯化， 获得放射化学纯度大于95%的放射性药物99mTc-HYMC-3Hll。
一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下
I 、将1.2 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1 mL浓度为 l.OmM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4'C条件下以每分钟5000转 的速度离心45分钟；
n、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0 mL，第二次在4"C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
m、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0 mL，第三次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
IV、 向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0 mL，第四次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
V、 将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆 抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5 mL，测量该溶液中单克隆抗体 3H11的浓度并保存数据，在4'C条件下保存该抗体溶液；所述Na2HPCV溶液的 pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP(V溶液中含0.15 mMNaCl;VI、 用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45 g/L的溶液；取此溶液10 kiL分两次加入到0.5 mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4"C条件下反应12小时，获得反应溶液；
VII、 将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0LNa2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4。C，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mM NaCl;
\1、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0LNH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4。C;在相同条件下再重复所述透析过程3次;透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液;在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8 mg/mL的偶联物D0TA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05 M;对该溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4"C条件下保存该偶联物溶液；
IX、将50 nL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100 醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2 M，再加入5 mInCl3溶液，所述minCl3溶于0.04 M HC1溶液中；该混和液在43'C条件下反应1小时，然后加入20 |iL EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0 mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99。/c的放射性药物mIn-DOTA-3Hll。
一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下
I 、将1.2 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1 mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4X:条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
n、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第二次在4"C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
in、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第三次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
IV、 向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第四次在4"C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
V、 将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5 mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4"C条件下保存该抗体溶液，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mMNaCl;
VI、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成浓度为33.45 g/L的溶液；取此溶液10 pL分两次加入到0.5 mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4"C条件下反应12小时，获得反应溶液；
VD、将所述反应溶液转移到透析卡中，在L0LNa2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4"C，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mM NaCl;
VD1、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.OLNH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4";在相同条件下再重复所述透析过程3次。透析处理完成后，获得DTPA-3H11溶液;在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8 mg/mL的偶联物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05 M;对该溶液中偶联物DTPA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4'C条件下保存该偶联物溶液；
IX、将50 jiL的所述偶联物DTPA-3H11溶液和100 (iL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2 M，再加入5 pL mIna3溶液，所述mInCl3溶于0.04 M HC1溶液中；该混和液在室温条件下反应30分钟，然后加入20 EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0 mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99%的放射性药物mIn-DTPA-3Hll。
本发明与现有技术相比有如下优点由于肿瘤细胞表面表达特异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，通过抗体将放射性核素载带到肿瘤部位，利用核医学影像技术，对肿瘤进行诊断定位。在已有技术中，对单克隆抗体3H11的标记方法均为直接标记法，由于在标记过程中加入了还原剂或氧化剂，因此对抗体活性产生相对较大的影响。本发明釆用间接标记法，即在单克隆抗体和放射性核素之间引入一个双功能连接剂。这既可减小对抗体活性的影响，又可增强放射性药物的稳定性，同时提高肿瘤对放射性药物的摄取。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明HYNIC偶联单抗3H11的分析图；图2为本发明标记物稳定性比较示意图；图3为本发明标记物稳定性比较的另一示意图；图4为本发明标记物放射免疫活性测定示意图；图5为本发明4小时的Y显像结果图；图6为本发明24小时的Y显像结果图；图7为直接标记法4小时的Y显像结果图；图8为直接标记法24小时的y显像结果图；图9为阴性对照4小时的Y显像结果图；图10为阴性对照24小时的y显像结果图；图11为本发明标记物的血液清除结果比较示意图。
具体实施例方式
实施例一
一种用于胃癌诊断的药物，包括抗体及放射性核素，所述抗体为单克隆抗
体3H11，所述放射性核素通过一个双功能连接剂标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色透明液体针剂。
在本发明中，所述单克隆抗体3H11包括鼠源性抗体及片断，基因工程制备的单链抗体(ScFv)、双链抗体(Diabody)、小型化抗体(Minibody)及嵌合抗体(Chimeric)。
在本发明中，所述放射性核素为99mTc (锝-99m)，所述双功能连接剂为S-HYNIC(琥珀酰亚胺肼基烟酰胺，succinimidyl-hydrazinonicotinamide，简写为S-HYNIC)，所述放射性核素标记的单克隆抗体形成的放射性药物为99mTc-HYNIC-3Hll 。
所述单克隆抗体3H11偶联及纯化采用以下方法
将0.9 mL单克隆抗体3H11 (5.0 mg/mL)与5 S-HYNIC (溶解于无水二甲基甲酰胺中，1.55xl(T2mg/mL)在避光4。C条件下反应5小时。S-HYNIC与抗体3H11的摩尔比为8:1。反应完成后，于pH分别为7.4和5.2，浓度为20 mM的柠檬酸缓冲液(含100mMNaCl)中各透析2次，每次透析时间为8小时，获得偶联物HYNIC-3H11;参见图1，图1为本发明HYNIC偶联单抗3H11在透析前后的HPLC分析图其中，(a)为透析纯化前偶联物的UV28(to吸收曲线，(b)为
透析纯化后偶联物的UV28。nm吸收曲线，HPLC为高效液相色谱。
进一步将获得的偶联物HYNIC-3H11进行放射性核素标记，所述单克隆抗体3H11的99mTc标记及纯化采用以下方法
将0.2 mg HYNIC-3H11(浓度为3.0 mg/mL，溶于pH值为5.2,含0.1 M NaCl的0.02 M柠檬酸缓冲溶液中)、20.0 mg Tricine(浓度为100.0 mg/mL，溶于pH值为6.0， O.IM的琥珀酸缓冲溶液中)、20.0吗SnCl2(浓度为3.0 mg/mL，溶于0.1N HC1中)和1110 MBq (30 mCi) Na"，c04依次加入反应管中，室温反应30分钟。将反应物通过PD-10柱(G-25 Sephadex， Pharmacia)纯化，以PBS (磷酸盐缓冲液)(pH7.5， O.IM)为淋洗液，纯化后收集标记物并测量放射化学纯度。在本发明中，所述放射性药物"mTc-HYNIC-3H11的用药剂量为10-30mCi。对所述放射性药物"mTc-HYNIC-3Hl 1的标记率及纯化后的放射化学纯度进
行测定的方法如下 ，
1. ITLC方法
取lpL标记物点样于ITLC-SG上，然后分别于生理盐水、甲乙酮和水:乙醇:氨水二5:2:1 (V:V:V)混和液中上行展开10cm，其中锝胶体(99mTc02)和游离99mTc04—在三种展开体系中Rf值(比移值)均为0.0和0.9-1.0， 99mTc-(Tricine)2在三种展开体系中Rf值分别为0.9-1.0、 0.0和0.9-1.0， 99mTc-HYNIC-3Hll在三种展开体系中Rf值分别为O.O、 0.0和0.9-1.0。
2. HPLC方法
10 标记物上样HPLC，色谱柱为TSK G3000 WXL (7.8x300 mm，TosoHaas)，磷酸缓冲液(pH6.5， 0.02 M，含有0.9% NaCl及0.05% NaN3)为流动相，流速1.0mL/min。99mTc-HYNIC-3Hll的保留时间为8.2min， 99mTc-(tricine)2和游离"，cOr的保留时间为12.3min。
采用所述方法进行标记和纯化，其测定结果为99mTc-HYNIC-3Hll的标记率大于90%，通过PD-10柱纯化后放射化学纯度大于95X，放射性比活度大于5000MBq/mg。
对于"，c-HYNIC-3H11的体外稳定性测定，可以采用以下方法
a、 将直接标记法制备的标记物("mTc-3Hll)与间接标记法制备的标记物("mTc-HYNIC-3Hll)分别在室温及37。C条件下保存于生理盐水及小牛血清中，并于温育后不同时间(O， 1， 2， 4， 8， 14， 24和48小时)取样测量放射化学纯度。参见图2，图2为本发明标记物在生理盐水和小牛血清中的体外稳定性比较示意图，实验结果显示两种标记物均表现出良好的稳定性。
b、 两种标记物(2.6x10—1C)mol/mL)与不同摩尔倍数的DTPA及L-cysteine室温孵育4h， ITLC方法测定放射化学纯度。参见图3，图3为本发明标记物在DTPA和L-cysteine溶液中的体外稳定性比较示意图，实验结果表明，两种标记物在不同浓度的DTPA溶液中均表现出良好的稳定性。在L-cysteine溶液中，99fflTc-HYNIC-3Hll具有良好的稳定性，而99mTo3Hll的放射化学纯度随着L-cysteine浓度的提高而下降。
对于"，c-HYNIC-3H11的放射免疫活性测定，采用以下方法99mTc-HYNIC-3Hll及99mTc-3Hll的免疫活性检测参照Lindmo方法，即7xl07个BGC823细胞以每分钟1000转的速度离心5分钟，用含有1%BSA的PBS (pH 7.4， O.OIM)洗两遍，再用含有1XBSA的PBS倍比稀释5个滴度；标记物稀释至40吗/L，将细胞和标记物混合，在37'C温育2小时，测量总放射性(T)和沉淀细胞的放射性计数(B)，计算不同浓度细胞数对应的T/B值。以T/B值对细胞浓度倒数(1/F)作图，所得曲线的延长线于y轴的截距的倒数即为标记物保留的放射免疫活性分数。参见图4，图4为本发明标记物放射免疫活性测定结果示意图，计算求得间接标记法和直接标记法制备的标记物的放射免疫活性分数分别为68%和41%，说明间接标记法制备的标记物保持了更好的免疫活性。利用所述放射性核素标记的抗体3H11进行动物实验的方法及结果如下a、荷瘤裸鼠体内分布将16只BALB/C荷人胃癌裸鼠随机分成2组，每组8只。两组裸鼠分别经尾静脉注射100 的99mTc-HYNIC-3Hll和99mTc-3Hll( 370KBq，约含5.6 jiig的3H11抗体)。每组分别在4小时和24小时断颈各处死4只，取主要脏器及血液测量重量和放射性计数，经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(WID/g)。表一列出99mTc-HYNIC-3Hll和99mTc-3Hll在荷瘤裸鼠体内分布数据。注射后24小时肿瘤对99mTc-HYMC-3Hll的摄取明显高于肿瘤对"""Tc-3H11的摄取，说明99mTc-HYNIC-3Hll具有更好的免疫活性，对人胃癌肿瘤细胞具有良好的亲和力。
表一 99mTc-HYNIC-3Hll及""Tc-3H11荷瘤裸鼠分布(if4, %ID/gtSD)
99mTc-HYNIC-3Hll 99mTc-3Hll组织--
4h 24h 4h 24h
血 34.30±3.84 16.79±1.21 29.80±5.42 8.65±2.14
心 6.54±0.11 3.32±0.13 5.37±1.52 1.61±0.20
肝 14.48±1.77 13.71±2.03 12.36±1.50 4.86±1.04
脾 9.96±1.45 9.45±2.02 7.28±2.41 2.87±0.77肾n.25±1.768.59±1,0219.37±3.00",72土2.80
胃3.60±0.372.07±1.394.84±1.17.65±0.41
肠8.06±2.693,86±0.347.26±1.892.74±0.88
肌肉0.97土0.281,46士(U40.98±0.160.83±0.08
骨3.83土0.603.25±(U93.48士0.991.52±0.21
肿瘤12-82±3.5731.23±3.34U.34土3.2815,78±1.47
b、 荷瘤裸鼠Y显像3只BALB/C荷人胃癌裸鼠分别注射25.9 MBq的99mTc-HYNIC-3Hll、 99mTc-3Hll和"，c-IgG(阴性对照)，并于注射后4小时和24小时进行Y显像。参见图5 —图10，图5为荷人胃癌裸鼠注射本发明99mTc-HYNIC-3Hll后4小时的Y显像结果图，图6为荷人胃癌裸鼠注射本发明99mTc-HYNIC-3Hll后24小时的y显像结果图，图7为荷人胃癌裸鼠注射直接标记法制备的99mTc-3Hll后4小时的Y显像结果图，图8为荷人胃癌裸鼠注射直接标记法制备的99mTc-3Hll后24小时的Y显像结果图，图9为荷人胃癌裸鼠注射99mTc-IgG后4小时的Y显像结果图(阴性对照)，图10为荷人胃癌裸鼠注射99mTc-IgG后24小时的Y显像结果图(阴性对照)。注射后24小时，99mTc-HYN!C-3Hll和99mTc-3Hll在肿瘤部位具有较好的浓聚，肿瘤可以清晰显像，而在阴性对照组观察不到放射性的浓聚。说明99mTc标记的单克隆抗体3H11可以作为诊断药物用于胃癌的显像。相对于99mTc-3Hll而言，"mTc-HYNIC-3H11在肿瘤部位的浓聚更加明显。
c、 血液清除参见图11，图11为本发明99mTc-HYNIC-3Hll与直接标记法制备的99mTc-3Hll的血液清除结果比较示意图；取18-22 g的BABL/C小鼠14只，分为2组，每组7只，两组分别经尾静脉注射0.15 mL的99mTc-HYNIC-3Hll和"，c-3H11，并于注射后不同时间点，0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 10、 12、15、 19和24小时剪尾取血，创面用云南白药处理，然后在gamma-counter上测定血样放射性计数，计算。/。ID/g，绘制血液清除曲线，并计算清除参数。99mTc-HYNIC-3Hll的丁1/201和T,分别为1.30小时和22.70小时，99mTc-3mi的T"2a和Ti邻分别为4.0小时和37.52小时。
实施例二
本实施例是用另一种放射性核素标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素为"tln(铟-111)，所述双功能连接剂为DOTA(l，4,7,10-四氮杂环十二垸-N'，N"，N"'，N""-四乙酸，1,4,7,10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，所述放射性核素标记的单克隆抗体形成的放射性药物为mIn-DOTA-3Hll。在本发明中，所述双功能连接剂包括DOTA的衍生物。在本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA(二乙烯三胺五乙酸，diethylenetriaminepenta-acetic acid)。在本发明中，所述双功能连接剂包括DTPA的衍生物
mIn是另一个物理特性优良的放射性核素，适于核医学显像。min标记抗体仍需通过间接标记法，即在抗体和放射性核素之间引入双功能连接剂， 一般为DOTA及其衍生物以及DTPA及其衍生物。以DOTA为例，阐述其制备过程。
所述单克隆抗体3H11偶联及纯化采用以下方法
将1.2 mL抗体3H11(5.0 mg/mL)和1 mL 1.0 mM乙二胺四乙酸(EDTA)分别加入到超滤离心管中(Centricon-30， IOK， Amicon)，在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟，离心管中溶液约剩0.2mL。然后向离心管加入Na2HP04溶液(pH7.5， O.IM，含0.15 mMNaCl) 2.0 mL，在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟，重复该过程3次。将抗体取出加Na2HP04溶液(pH 7.5，0.1 M)稀释至0.5 mL,于紫外280 nm测量抗体浓度后4"C保存。
抗体预处理的目的为调节pH值并去除抗体溶液中的各种杂质。与DOTA-NHS偶联时反应溶液的最佳pH值为7.5。加入1.0 mM EDTA的作用为络合抗体溶液中的其它金属离子，通过超滤离心使其去除。抗体预处理后的收率为83%，抗体浓度为10.0mg/mL。
用无水二甲基甲酰胺(DMF)溶解1,4，7，10-四氮杂环十二烷-N'，N"，N"'，N""-四乙酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(DOTA-NHS, AT-Hydroxysulfosuccinimidyl-1,4，7，10-tetraazacyclododecanetetraacetic acid)，配制浓度为33.45 g/L的溶液。取10 (xL
(0.667 jimol， 0.3345 mg)分两次加入到0.5 mL上述3H11抗体(IO.O mg/mL，0.0333 pmol)中，避光条件下4"C反应12小时。反应结束后转移反应溶液于透析卡(Slide陽A-Lyzer， 10K， Pierce)中，在1.0LNa2HP04溶液(pH7.5， 0.1 M，含0.15 mMNaCl)中4'C条件下透析24小时，然后用1.0 LNH4OAc溶液(pH 7.0，0.05 M) 4"C条件下透析72小时(其中更换5次透析液)。将透析后的3H11偶联物(DOTA-3H11)在紫外280nm测量抗体浓度，并用HPLC方法评价纯度。用NH4OAc溶液(pH 7.0， 0.05 M)稀释DOTA-3H11至2.8 mg/mL，4'C保存待用。
用mIn标记DOTA-3H11及其纯化采用以下方法取50 pL DOTA-3H11加入到100 piL醋酸钠缓冲液(pH 5.2， 0.2 M)中，再加A5.0|iLmInCl3(20mCi，溶于0.04 M HC1溶液中)，室温反应20-30分钟，然后加入20 jiL EDTA (pH 5.0， 6.0 mM)，室温反应10分钟。将反应物通过PD-IO柱(G-25 Sephadex， Pharmacia)纯化，以PBS(pH7.5， 0.1 M)为淋洗液，纯化后收集标记物并测量放射化学纯度。
在本发明中，所述放射性药物min-DOTA-3H11的用药剂量为5-15mCi。
所述放射性药物lllIn-DOTA-3Hll的标记率及其放射化学纯度的测定采用如下方法
l.ITLC方法
将10 pL标记物中加入20 EDTA (pH 5.0， 6.0 mM)，室温反应10分钟，取lpL点样于ITLC-SG上，然后在10.0 mM EDTA展开液中上行展开10 cm,其中川ln-DOTA-3H11保留在原点(R产O.O)， mIn-EDTA展至前沿(R产0.9-L0)。
2. HPLC方法
10 pL标记物中加入20 nL EDTA(pH 5.0， 6.0 mM)，室温反应10分钟，取20[iL上样HPLC，色谱柱为TSKG3000WXL (7.8x300 mm， TosoHaas)，磷酸缓冲液(pH 6.5， 0.02 M，含有0.9% NaCl及0.05% NaN3)为流动相，流速1.0mL/min。 min-DOTA-3H11的保留时间为8.2min， mIn-EDTA的保留时间为12.3min。
对于min-DOTA-3H11的体外稳定性测定，采用以下方法标记物mIn-DOTA-3Hll在室温及37。C条件下保存于生理盐水及小牛血清中，并于温育后不同时间(O， 1， 2， 4， 8， 14， 24和48小时)取样测量放射化学纯度。
对于mIn-DOTA-3Hll的放射免疫活性测定，可以采用以下方法川ln-DOTA-3H11的免疫活性检测参照Lindmo方法，艮卩7xl07个BGC823细胞以每分钟1000转的速度离心5分钟，用含有1 %BSA的PBS (pH 7.4， 0.01M)洗两遍，再用含有1XBSA的PBS倍比稀释5个滴度；标记物稀释至40 pg/L，将细胞和标记物混合，在37'C温育2小时，测量总放射性计数(T)和沉淀细胞的放射性计数(B)，计算不同浓度细胞数对应的T/B值。以T/B值对细胞浓度倒数(1/F)作图，所得曲线的延长线于y轴的截距的倒数即为标记物保留的放射免疫活性分数。实施例三一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下
I 、将0.9 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液与5 浓度为1.55xl0—2 mg/mL的S-HYNIC溶液加入反应管中，在避光4'C条件下进行反应5小时；该反应中S-HYNIC与单克隆抗体3H11的摩尔比为8:1;反应完成后获得反应溶液；
II 、将所述反应溶液使用pH值为7.4、浓度为20 mM的拧檬酸缓冲液透析处理2次，每次透析时间为8小时，所用柠檬酸缓冲液中含100 mM NaCl;将经过2次透析处理后的所述反应液使用pH值为5.2、浓度为20 mM的柠檬酸缓冲液再透析处理2次，每次透析时间为8小时，所用柠檬酸缓冲液中含100mMNaCl，透析处理完成后，获得偶联物HYMC-3H11溶液；
III、将0.2mg浓度为3.0mg/mL的所述偶联物HYNIC-3H11、 20.0 mg浓度为100.0 mg/mL的Tricine、 20.0吗浓度为3.0mg/mL的SnCl2和lllOMBq的Na"，c04依次加入反应管中，室温(20°C—25°C)反应30分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于95%的放射性药物99mTc-HYNIC-3Hl 1 。
在本实施例中，所使用的单克隆抗体3H11是溶于PBS的溶液，其浓度为5.0mg/mL。
所使用的S-HYNIC溶解于无水二甲基甲酰胺试剂中，其浓度为1.55X1(T2mg/mL。
所述偶联物HYMC-3H11溶于pH值为5.2，浓度为20mM的柠檬酸缓冲液中，该柠檬酸缓冲液中含100mMNaCl， HYNIC-3H11的浓度为3.0 mg/mL， 0.2mg表示在本方法中所使用的化学量。
所述Tricine是一种常规试剂，溶于pH值为6.0， 0.1 M的琥珀酸缓冲溶液中，其浓度为100.0 mg/mL， 20.0 mg表示在本方法中所使用的化学量。所述SnCl2是氯化亚锡，溶于0.1NHC1 (盐酸)中，其浓度为3.0 mg/mL， 20.0吗表示在本方法中所使用的化学量。所述Na""^Tc04是高锝酸钠溶液，1110MBq表示在本方法中所使用的放射性活度。
所述PD-10柱是常规实验材料，从Pharmacia公司购买。实施例四 一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下I 、将1.2 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1 mL浓度为l.OmM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
n、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第二次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
in、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HPOt溶液2.0mL，第三次在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
IV、 向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第四次在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
V、 将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5 mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4"C条件下保存该抗体溶液；所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mMNaCl;
VI、 用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45 g/L的溶液；取此溶液10 (oL分两次加入到0.5 mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4。C条件下反应12小时，获得反应溶液；
W、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0LNa2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4'C，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mM NaCl;
VEI、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.OLNH4OAc溶液进行第二次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4。C;在相同条件下再重复所述透析过程3次;透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液;在DOTA-3H11溶液中加入NH40Ac溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8.mg/mL的偶联物D0TA-3H11溶液，所述的NH40Ac溶液的pH值为7.0、浓度为0.05 M;对该溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4"C条件下保存该偶联物溶液；
IX、将50 ^iL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100 醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2 M,再加入5 pL mInCl3溶液，所述minCl3溶于0.04 M HC1溶液中；该混和液在43t:条件下反应1小时，然后加入20 jjL EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0 mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99°/。的放射性药物mIn-DOTA-3Hl 1 。
在本实施例中，所使用的单克隆抗体3H11是溶于PBS溶液，其浓度为5.0
15mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值为5.0，浓度为6.0 mM，是常规试剂。所使用的DMF是无水二甲基甲酰胺溶液，是常规试剂。所使用的DOTA-NHS是双功能连接剂，其中文名称为1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N',N",N"'，N""-四乙酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯，其英文名称为_/V-Hy droxysulfosuccinimidy l誦1 ，4，7 ， 10-tetraazacy clododecanetetraaeetic acid ，购于美国Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常规实验材料，从Pharmacia公司购买。所述超滤离心管是常规实验材料，从Amicon公司购买。
实施例五 一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其步骤如下
I 、将1.2 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1 mL浓度为1.0mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
n、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第二次在4'C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
ni、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP(V溶液2.0mL，第三次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
IV、 向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0mL，第四次在4t条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；
V、 将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5 mL，测量该溶液中单克隆抗体3H11的浓度并保存数据，在4"C条件下保存该抗体溶液，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1M，所述Na2HPO4溶液中含0.15mMNaCl;
W、用DMF溶解DTPA衍生物，配制成浓度为33.45 g/L的溶液；取此溶液10 |_iL分两次加入到0.5 mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中，该混和液在避光4'C条件下反应12小时，获得反应溶液；
W、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0LNa2HPO4溶液中透析处理24小时，透析处理温度为4。C，所述Na2HPCV溶液的pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mMNaCl;
vni、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.0LNH4OAc溶液进行第二
次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4'C;在相同条件下再重复所述透析过程3次。透析处理完成后，获得DTPA-3H11溶液；在DTPA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8 mg/mL的偶联物DTPA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05 M;对该溶液中偶联物DTPA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4'C条件下保存该偶联物溶液；
IX、将50 的所述偶联物DTPA-3H11溶液和100 pL醋酸钠缓冲液加入到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2 M，再加入5 pL mInCl3溶液，所述minCl3溶于0.04MHCl溶液中；该混和液在室温条件下反应30分钟，然后加入20 EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0 mM，在室温条件下反应10分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99。/。的放射性药物mIn-DTPA-3Hll。
在本实施例中，所使用的单克隆抗体3H11是溶于PBS溶液，其浓度为5.0mg/mL。所使用的EDTA是乙二胺四乙酸溶液，其pH值为5.0，浓度为6.0 mM，是常规试剂。所使用的DMF是无水二甲基甲酰胺溶液，是常规试剂。所使用的DTPA衍生物购于美国Macrocyclic公司。所述PD-10柱是常规实验材料，从Pharmacia公司购买。所述超滤离心管是常规实验材料，从Amicon公司购买。
权利要求
1、一种用于胃癌诊断的药物，包括抗体及放射性核素，其特征在于所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素为111In，所述放射性核素111In通过一个双功能连接剂DOTA标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体为111In-DOTA-3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色透明液体针剂。
2、 一种用于胃癌诊断的药物的制备方法，其特征在于I 、将1.2 mL浓度为5.0 mg/mL的单克隆抗体3H11溶液和1 mL浓度为 1.0 mM的EDTA溶液分别加入到超滤离心管中，在4。C条件下以每分钟5000转 的速度离心45分钟；II、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0 mL，第二次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；in、向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1 M的Na2HP04溶液2.0 mL，第三次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；IV、 向所述超滤离心管中加入pH值为7.5，浓度为0.1M的Na2HPCV溶液2.0 mL，第四次在4。C条件下以每分钟5000转的速度离心45分钟；V、 将超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液取出超滤离心管，在该单克隆 抗体3H11溶液中加入Na2HPO4溶液稀释至0.5 mL，测量该溶液中单克隆抗体 3H11的浓度并保存数据，在4'C条件下保存该抗体溶液；所述Na2HP04溶液的 pH值为7.5，浓度为0.1 M，所述Na2HP04溶液中含0.15 mM NaCl;VI、 用DMF溶解DOTA-NHS，配制成浓度为33.45 g/L的溶液；取此溶液 10 ^iL分两次加入到0.5 mL的上述经超滤离心处理的单克隆抗体3H11溶液中， 该混和液在避光4'C条件下反应12小时，获得反应溶液；VE、将所述反应溶液转移到透析卡中，在1.0LNa2HPO4溶液中透析处理24 小时，透析处理温度为4'C，所述Na2HP04溶液的pH值为7.5，浓度为0.1 M， 所述Na2HP04溶液中含0.15 mM NaCl;VID、将经过一次透析处理的所述反应溶液使用1.OLNH4OAc溶液进行第二 次透析处理，透析处理时间为18小时，透析处理温度为4'C;在相同条件下再 重复所述透析过程3次;透析处理完成后，获得DOTA-3H11溶液;在DOTA-3H11溶液中加入NH4OAc溶液进行浓度调节，获得浓度为2.8 mg/mL的偶联物 DOTA-3H11溶液，所述的NH4OAc溶液的pH值为7.0、浓度为0.05 M;对该 溶液中偶联物DOTA-3H11的浓度进行测量并保存数据，在4"C条件下保存该偶 联物溶液；IX、将50 piL的所述偶联物DOTA-3H11溶液和100 醋酸钠缓冲液加入 到反应管中，所述醋酸钠缓冲液的pH值为5.2、浓度为0.2 M，再加入5 mL mInCl3 溶液，所述minCl3溶于0.04 M HC1溶液中；该混和液在43"C条件下反应1小 时，然后加入20 pL EDTA，所述EDTA的pH值为5.0、浓度为6.0 mM，在室 温条件下反应IO分钟；将反应物通过PD-10柱纯化，获得放射化学纯度大于99% 的放射性药物mIn-DOTA-3Hll。
全文摘要
本发明涉及一种用于胃癌诊断的药物及其制备方法，该药物包括抗体及放射性核素，所述抗体为单克隆抗体3H11，所述放射性核素为¹¹¹In，所述放射性核素¹¹¹In通过一个双功能连接剂DOTA标记所述单克隆抗体3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体为¹¹¹In-DOTA-3H11，所述放射性核素标记的单克隆抗体3H11为无色透明液体针剂。由于肿瘤细胞表面表达特异抗原，利用抗体和抗原的特异性结合，通过抗体将放射性核素载带到肿瘤部位，利用核医学影像技术，对肿瘤进行诊断定位。本发明采用间接标记法，即在单克隆抗体和放射性核素之间引入一个双功能连接剂。这既可减小对抗体活性的影响，又可增强放射性药物的稳定性，同时提高肿瘤对放射性药物的摄取。
文档编号A61K103/20GK101670120SQ20091017673
公开日2010年3月17日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者志 杨, 凡 王, 兵 贾 申请人:北京大学