专利名称：一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱缩的方法
技术领域：
本发明涉及微囊化细胞工程的生物医药领域，更具体地说，涉及一种防止载细胞
海藻酸钠微囊皱縮的新方法。
背景技术：
利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，以此植入患 病动物或病人体内，可补充疾病体内缺乏的生理活性物质，从而达到治疗疾病的目的。
采用海藻酸钠-聚赖氨酸_海藻酸钠(APA)或海藻酸钠_壳聚糖_海藻酸钠(ACA) 制作的三层结构膜微囊，具有体积小(粒径大小200-1000 m)，生物相容性好，表面积大， 有利于微囊化细胞在动物体内较长时间存活。大量的实验表明，APA微囊的囊膜可截留分 子量大于11万的分子，从而使免疫球蛋白分子和免疫活性细胞不能透过囊膜而进入囊内 破坏其中的动物细胞，因而具有较好的免疫保护作用。 APA或ACA微囊包裹细胞或组织的微囊化细胞制备工艺，主要包括细胞与海藻酸 钠溶液混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠、微囊液化等步骤。首 先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用高压静电液滴法或气流切割 法将混合液滴至固化溶液中(等渗的CaC^溶液)形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后 投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液(或壳聚糖溶液)和海藻酸钠溶液中包覆聚赖氨酸(或壳 聚糖溶液)和海藻酸钠，最后将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微 球的核心，即可获得APA、 ACA微囊的细胞或组织。 关于APA、 ACA微囊化的细胞或组织的制备工艺，目前文献和专利报道的APA， ACA 微囊的制备方法，一般采用高压静电液滴法(Electrostatic droplet generation)。例 如，文献报道中，杨晓明等(杨晓明，毕好生，杨茂元等，微囊化人嗜铬细胞体外培养的研究 [J].中华麻醉学杂志，2001 ;21(7) :410-413.)利用加拿大产微囊静电仪，采用高压静电法 制备了人的肾上腺嗜铬细胞的海藻酸钠微囊。专利文献报道中，薛毅珑(CN1345234，用于 治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物；CN1242197用于治疗帕金森病的微囊化牛 肾上腺髓质嗜铬细胞药物)采用高压静电液滴法制备了微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞，该 细胞药物能在人体内长期地分泌镇痛物质和多巴胺，植入一次可以止痛数个月以上，可用 于治疗疼痛和帕金森病。李涛(CN1454995，利用海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊包埋细 胞或组织的方法)采用高压静电液滴法制备不同孔径的ACA微囊化细胞或组织。该法制备 的ACA微囊孔径容易控制且分布均匀，通透性能好，故可广泛用于包埋肝、肾上腺、甲状腺、 甲状旁腺、性腺等细胞或胰岛等组织。 高压静电液滴法的原理如下在高压静电场下，海藻酸钠液滴表面带静电，由于电 荷的排斥作用，可使注射器针头生成的液滴大小均匀，表面张力变大而使液滴收縮更为圆 整，滴入CaCl2溶液的固化液后，就可获得粒径大小均匀的海藻酸钙微球，从而最终能够制 备大小均匀的APA、 ACA微囊。 近来，为适应工业化生产要求，采用其他原理进行细胞微囊化的工艺应运而生。其中振动喷嘴法(Vibrating jet breakup)因具有生产效率高，粒径分布窄的优 点，越来越广泛应用于细胞微囊化的实验应用和工业化生产中。例如，Wei Ouyang等 (Wei 0uyang， HongmeiChen， Mitchell L. Artificial cell microcapsule for oral delivery of live bacterial cells for ther即y :design， preparation, and in-vitro characterization [J] J Pharm Pharmaceut Sci， 2004 ;7 (3) :315-324)采用振动喷嘴法， 利用Inotech Enc即sulator IER-20型微囊仪，制备包封人工细胞APA微囊，口服给药用来 治疗肠道疾病。 振动喷嘴法的原理同样也是利用了液体的表面张力作用和高压静电作用，但是为 了加快液滴生产的速率，提高微囊的制备效率，利用电磁振动原理，快速生产液滴。这样海 藻酸钠液滴，在电磁振动作用下快速生成液滴；高压静电场的作用下，液滴荷电，静电排斥 力使液滴表面张力增大。在电磁振动和静电场的双重作用下，液滴的生成更加均匀，大小更 为集中，这样就大大提高了微囊的制备效率。 高压静电液滴法、振动喷嘴法在APA微囊的制备中得到广泛的应用，微囊的制备 工艺日趋成熟，但是APA微囊在制备过程中，海藻酸钙微球在与聚赖氨酸或壳聚糖络合反 应，形成复合膜后，很容易发生微囊的皱縮、变形，使所获得的微囊形状不规则，表面不光 滑，从而影响微囊复合膜的分子截留性能，并且还会影响在体内的生物相容性。
发明内容
本发明的目的是要提供一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱縮的新方法，从而为细胞
微囊化工程提供一种囊形圆整，生物相容性好的海藻酸钠微囊技术平台。 本申请发明人针对现有的载细胞的海藻酸钠微囊技术状况进行了深入研究，通过
大量的实验结果发现，采用下述技术方案即可达到上述目的，从而完成了本发明。 —种防止载细胞海藻酸钠微囊皱縮的方法，是一种采用海藻酸钠-聚赖氨酸或壳 聚糖_海藻酸钠为复合包裹材料，制备海藻酸钠微囊，包裹细胞的方法，其创新之处在于， 采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海藻酸钙微球，从而避免所制备的海藻酸钠微囊发 生皱縮。 前述的方法，优选的技术方案是，所述多元醇溶液的浓度调整为生理等渗浓度范 围。以减少对微囊包封过程中对细胞活性的损害。 前述的方法，优选的技术方案是，所述多元醇溶液为甘露醇溶液、山梨醇溶液、蔗 糖溶液或果糖溶液。 前述的方法，优选的技术方案是，采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海藻酸 钙微球的时间为5-20min。更为优选为10min。时间控制很重要，目的是减少对微囊包封过 程中对细胞活性的损害。 本发明利用文献中常见报道的方法，如高压静电法(杨晓明，毕好生，杨茂元等， 微囊化人嗜铬细胞体外培养的研究[J].中华麻醉学杂志，2001 ;21(7) :410-413.)，振动喷 嘴法(Wei0uyang， Hongmei Chen， Mitchell L. Artificial cell microcapsule for oral delivery of live bacterialcells for ther即y :design， preparation, and in-vitro characterization[J]. J Pharm Pharmaceut Sci， 2004 ;7 (3) :315-324)，利用APA或ACA 微囊包裹动物细胞。在海藻酸钙微球与聚赖氨酸或壳聚糖反应前，把海藻酸钙微球放置于浓度为生理等渗(0.3mol/L)的多元醇溶液中，例如甘露醇溶液、山梨醇溶液、蔗糖溶液、 果糖溶液等，处理5-20min，静置，取下层海藻酸钙微球沉淀，进一步与聚赖氨酸或壳聚糖反 应，其余操作同文献报道。即可防止微囊在聚赖氨酸或壳聚糖包覆时的皱縮，从而得到囊形 圆整，粒径均匀的APA或ACA微囊。该处理过程条件温和，对囊的形态、大小、通透性能以及 对细胞的活性、功能，都没有影响。
图1.海藻酸钠微囊显微照片(标尺200 y m)，其中，A.经甘露醇处理的微囊，B.未
用甘露醇处理的微囊。 图2. APA微囊圆整率变化情况示意图。
具体实施例方式
以下结合实施例、实验例和附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本 发明不受这些具体实施例的限制。 利用海藻酸钠_聚赖氨酸_海藻酸钠包裹细胞或组织的微囊化细胞工艺，主要包
括细胞与海藻酸钠混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠等以下5
个步骤，即可获得APA或ACA微囊化的细胞或组织。
(1)首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀。 (2)用高压静电液滴法或振动喷嘴法将混合液滴至固化溶液中(等渗的氯化钙溶 液)形成海藻酸钙微球。
(3)将微球投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液(或壳聚糖溶液)。
(4)将微球投入到适当浓度的海藻酸钠溶液中包覆(包被)海藻酸钠。
(5)将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微球的核心。 以上载细胞海藻酸钠微囊的制备工艺常见于文献报道(杨晓明，毕好生，杨茂元
等，微囊化人嗜铬细胞体外培养的研究[J].中华麻醉学杂志，2001 ;21(7) :410-413.薛毅
珑(CN1345234，用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物)，不属本发明内容。 本发明提供一种防止海藻酸钠微囊皱縮的新方法，即在海藻酸钠溶液包封细胞，
形成海藻酸钙微球后(第2步后)，也就是在包覆聚赖氨酸或壳聚糖之前(第3步前)，把
海藻酸钙微球放置于多元醇溶液中处理，静置，取下层海藻酸钙微球沉淀，进一步与聚赖氨
酸或壳聚糖反应，其余操作同上面微囊化细胞工艺。 实施例1 :制备包覆牛肾上腺髓质嗜铬细胞BCC的APA微囊 (1)将细胞总数为IX 106个牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)与lml浓度为1. 5%海 藻酸钠溶液混合，用搅拌法将其制成混悬液。 (2)用高压静电微囊发生器(Electrostatic droplet generator)将混悬液喷至 50ml浓度为100mmol/L的氯化钙溶液中，静置lOmin后获得直径在180-500 y m范围内的海 藻酸^微球沉淀，待沉淀完全后除去上清液。 (3)然后将海藻酸钙微球加入到50ml浓度为0. 3mol/L的甘露醇溶液中，室温下放 置5-10min，待沉淀完全后除去上清液。 (4)然后将沉淀0. 05%的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10min，待沉淀完全后除去上清液。 (5)然后将沉淀物加入到50ml浓度为0. 15%的海藻酸钠溶液中，混合均匀，在室 温下放置10min，待沉淀完全后除去上清液。 (6)然后将沉淀物加入到50ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，室温下放置 lOmin，待沉淀完全后除去上清液，即获得含有BCC的APA微囊。 将本方法获得APA微囊和未用甘露醇处理的微囊进行显微镜观察，其显微镜照片 见图1。由图1可见，采用本方法处理后微囊没有明显皱縮，囊形圆整。
实施例2 :制备包覆大鼠胰岛组织的APA微囊。步骤等同于实施例l，但与实施 例1不同的是步骤(3)所用的多元醇溶液为浓度为生理等渗的山梨醇溶液中，室温下放置 20min，待沉淀完全后除去上清液。 实施例3 :制备包覆大鼠肝细胞的APA微囊。步骤等同于实施例l，但与实施例1 不同的是步骤(3)所用的多元醇溶液为浓度为生理等渗的蔗糖溶液(或果糖)中，室温下 放置lOmin，待沉淀完全后除去上清液。
实验例4 : 按实施例1方法制备APA微囊，聚赖氨酸的浓度分别为0. 05%和0. 1 % ，反应时间 分别为3，5，9，13min，取适量微囊，于显微镜下观察，考察微囊的圆整率。结果见图2。
由图2可见，采用甘露醇处理组，微囊的圆整率高，受反应时间的影响较小；而 对照组微囊的圆整率收反应时间和聚赖氨酸浓度的影响较大(l)在0.05%的聚赖氨酸 (PLL)中反应时间在5min内时，可得到较高圆整率的微囊，随着反应时间的延长，圆整率迅 速下降；(2)在O. 1%的聚赖氨酸(PLL)中，反应时间即使在3min以内也不能得到圆整率高 的微囊。
权利要求
一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱缩的方法，是一种采用海藻酸钠-聚赖氨酸或壳聚糖-海藻酸钠为复合包裹材料，制备海藻酸钠微囊，包裹细胞的方法，其特征在于，采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海藻酸钙微球，从而避免所制备的海藻酸钠微囊发生皱缩。
2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多元醇溶液的浓度调整为生理等渗浓度 范围。
3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多元醇溶液为甘露醇溶液、山梨醇溶 液、蔗糖溶液或果糖溶液。
4. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海 藻酸钙微球的时间为5-20min。
5. 权利要求4所述的方法，其特征在于，采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海藻 酸牵丐微球的时间为10min。
全文摘要
本发明公开了一种防止载细胞海藻酸钠微囊皱缩的方法，是一种采用海藻酸钠-聚赖氨酸或壳聚糖-海藻酸钠为复合包裹材料，制备海藻酸钠微囊，包裹细胞的方法，其创新之处在于，采用多元醇溶液处理微囊制备过程中的海藻酸钙微球，从而避免所制备的海藻酸钠微囊发生皱缩。
文档编号A61K47/34GK101721391SQ20091023031
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者刘善奎, 张爱兵, 景颖, 龚非 申请人:济南大学